KR101149422B1 - 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우역 바이러스 (RPV), 가성우역 바이러스 (PPRV), 블루텅 바이러스 (BTV), 리프트 계곡열 바이러스 (RVFV)에 특이적인 서열번호 1내지 19의 다중 PCR 프라이머 세트, 이를 이용하여 상기 바이러스들을 동시에 검출할 수 있는 방법 및 키트를 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 한 번의 반응으로 상기 4종 질병을 동시에 진단할 수 있어, 노동력 및 진단 시간 절감 등 질병의 조기 진단이 가능하다.

리프트 계곡열 바이러스, 블루텅 바이러스, 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 프라이머, 다중 RT-PCR법, 단일 튜브-다중 RT-PCR

Description

우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법 {Primers and its application in multiplex PCR to identify Rinderpest, Peste-des-petits-ruminants virus, Bluetongue virus and Rift Valley fever}

본 발명은 임상증상이 유사한 4종의 가축 전염병의 바이러스인 우역 바이러스 (RPV), 가성우역 바이러스 (PPRV), 블루텅 바이러스 (BTV), 리프트 계곡열 바이러스 (RVFV) 에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트 및 상기 프라이머를 이용하여 단일튜브 다중 RT-PCR 방법을 통한 바이러스 검출 방법 및 검출용 키트, 조성물에 관한 것이다.

리프트 계곡열, 블루텅 등의 주요 감수성 숙주는 반추동물이며 주요 임상 증상이 점막출혈, 유산 등으로 유사하다. 리프트 계곡열은 반추류 등 가축뿐만 아니라 사람에도 전파되어 출혈성 증상 또는 뇌염을 일으켜 사망에 이르게 하는 인수공 통 전염병으로 아프리카 풍토병으로 알려져 있으며 기후변화에 따른 매개곤충의 확산 등으로 인해 2000년 이후 아프리카를 뛰어 넘어 새로운 지역인 중동국가로 퍼져나가 많은 인명피해가 발생한 바 있다. 현재에도 케냐, 수단 등에서 지속적으로 발생하고 있다.

블루텅 (Bluetongue)은 면양, 산양 등에서 유사산 등을 일으키는 바이러스성 전염병으로서 세계적으로 문제되고 있으며, 국내 발생시 청정국 지위를 상실하여 축산업에 미치는 영향이 상당한 질병으로, 혈청학적으로 교차반응이 나타나지 않은 혈청형이 총 24종 존재한다. 우리나라 인접국가인 중국은 7종의 혈청형 유행이 확인되었으며, 일본의 경우에는 1종의 혈청형이 분리 보고되었고 약 3종의 혈청형이 유행되는 것으로 확인되고 있어 국내 유입 위험성이 높아지고 있다.

리프트 계곡열 (Rift Valley fever), 블루텅 등과 함께 임상증상이 유사한 우역 (Rinderpest), 가성우역 (Peste-des-petits-ruminants virus) 등은 현재 국내에서는 발생하지 않지만 질병 발생시 반드시 진단이 필요한 질병이다. 하지만 의심축 발생시 기존의 개별 질병별 진단법을 적용할 경우에 검사 지연에 따른 보다 신속한 방역정책 수행이 어려우며, 기존 유전자 증폭기법은 민감도, 특이도가 질병별 프라이머 (Primer) 에 따라 차이가 존재하기 때문에 동시 진단하기에는 여러 가지 어려움이 있다.

우역, 가성우역, 블루텅, 리프트 계곡열 4종의 바이러스는 감염시 임상증상이 유사하여 국제수역사무국(OIE) 진단매뉴얼 등에서도 감별진단이 요구되고 있으나, 현재까지 개발된 PCR 키트를 이용한 진단 방법으로는 거의 모두 한 종류의 바 이러스의 감염여부만을 판독할 수 있을 뿐, 이들 바이러스를 한꺼번에 다중 PCR 방법으로 진단할 수 있는 진단키트는 아직까지 개발되지 있다. 그 이유는 다수의 바이러스를 한번의 다중 PCR 방법으로 검출하기 위해서는 그 PCR 시 각 사이클링 온도, 시간, 완충액의 조건 등이 일치하여야 하나 이러한 특정한 조건을 동시에 충족시키기에는 여러 가지 어려움이 있기 때문이다.

우역, 가성우역, 블루텅, 리프트 계곡열 4종 질병의 정확한 진단을 위해서는 유사 증상에 대한 감별 진단이 필요하나 국내외적으로 현재 우역, 가성우역, 블루텅, 리프트 계곡열 등과 같은 유사 전염병에 대한 동시 감별진단법이 구축되어 있지 않아 국내 유입 발생을 대비한 진단기법 구축이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위해서 예의 연구 노력한 결과, 임상증상이 유사한 우역, 가성우역, 블루텅, 리프트 계곡열과 같은 해외 가축 전염병에 대한 동시 진단기법을 개발하고자, 우역의 원인바이러스인 우역바이러스, 가성우역의 원인바이러스인 가성우역바이러스, 블루텅의 원인 바이러스인 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열의 원인 바이러스인 리프트 계곡열 바이러스를 동시에 검출할 수 있는 특이 프라이머 세트와 이를 이용한 단일튜브-다중 ＲＴ－ＰＣＲ 방법을 개발하고, 바이러스 진단에 있어서의 유용성 및 특이성을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 목적은 우역의 원인 바이러스인 우역 바이러스, 가성 우역의 원인 바이러스인 가성 우역 바이러스, 블루텅의 원인 바이러스인 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열의 원인 바이러스인 리프트 계곡열 바이러스를 동시에 검출하기 위한 상기 바이러스의 특이적인 다중 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 다중 프라이머 세트를 이용하여 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 프라이머 세트를 포함하는 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스를 검출하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스를 검출하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 우역 바이러스 (RPV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트,서열번호 3 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 가성우역 바이러스 (PPRV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트, 서열번호 7내지 15로 표시되는 염기서열 로 이루어진 프라이머를 포함하는 블루텅 바이러스 (BTV)의 VP3 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 서열번호 16내지 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 (VFV)의 NS 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서는 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스를 단층 배양한 세포에 접종하고 세포 병변효과를 관찰하여 분리한 후 이들 각각의 바이러스의 RNA를 추출하고 RT-PCR을 위한 프라이머를 제작하였다. 본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 표와 같다.

타깃바이러스(유전자부위)	프라이머 (5‘→3’) (F:포워드, R:리버스)	서열 번호
우역바이러스 (F gene)	RPVF: TGGCTGGTGCAGCTCTCGIIIIIGCAACCGCAG	1
	RPVR: TGTTTCCAGACTTGCCTRAAGACIIIIIATAGCCTGGG	2
가성우역 바이러스 (F gene)	PPRVF1: TTTGCTGGARCTGTTCTGGCCIIIIIAGCACYTGGAG	3
	PPRVF2: TTTGTYGGAGCTGTTCTGGCCIIIIIAGCACTTGGAG	4
	PPRVR1: GCATGACATTCTATGRACAGAAGGGAIIIIITCATTGTTGA	5
	PPRVR2: ACATGACATTCTATGAACAGAGGGGAIIIIITCATTGTTGA	6
블루텅 바이러스 (VP3 gene)	BTVF1: GGAACAGGATATAATGGTTGGGIIIIIATTGATGTCG	7
	BTVF2: GGAACAGGATATAATGGTTGGGIIIIIATYGATGTTG	8
	BTVF3: GGAACAGGATATAATGGATGGGCIIIIITAGAYGTTGA	9
	BTVF4: CGGGATACAACGGATGGGCIIIIITHGATGTTGA	10
	BTVF5: AACGGGGTAYAACGGTTGGGIIIIIATTGATGTTG	11
	BTVR1: TCTCATTTCTRTGCGTAGGTTCAAIIIIICTGTTGAAAG	12
	BTVR2: TCTCATTCCTATGCGTTGGTTCAAIIIIICTGTTGAAAG	13
	BTVR3: CGATGCGTTGGCTCAAAYGACCIIIIIAAGGCAAACC	14
	BTVR4: GATGCGTTGGCTCRAACGACCIIIIIAAGGCGAAC	15
리프트계곡열바이러스 (NSs gene)	RVFVF1: CCTGGCCTCTTGGAGAACIIIIICTGGCTTTCTT	16
	RVFVF2: CCTGGCCTCTTGGAGAACIIIIICTGGCCTTCTT	17
	RVFVR1: GCACAGGTCAATCCCTCTGAIIIIIGCCTCAGTC	18
	RVFVR2: GCACAGGTCAATCCCTCTGAIIIIIGCCTCGGTC	19

상기 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1및 2의 프라이머는 우역 바이러스의 F 유전자 염기서열에 기초하여 제작되었으며, 서열번호 3내지 6의 프라이머는 가성 우역 바이러스의 F 유전자 염기서열에 기초하여 제작되었으며, 서열번호 7내지 15의 프라이머는 블루텅 바이러스의 VP3 유전자를 기초로 제작되었고, 서열번호 16내지 19의 프라이머는 리프트 계곡열 바이러스의 NS 유전자를 기초로 하여 제작 되었다.

본 발명은 상기의 각 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 2 이상 선택한 바이러스 진단용 다중 RT-PCR 도 포함된다. 예를 들면, 서열번호 1내지 2 로 구성된 우역 바이러스에 특이적인 프라이머와 서열번호 3내지 6으로 구성된 가성 우역 바이러스에 특이적인 프라이머를 한 세트로 한 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스를 동시에 검출해 내기 위한 RT-PCR 용 프라이머 세트일 수 있다.

본 발명은 상기의 프라이머 세트들을 하나의 세트로 한 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 우역 바이러스 (RPV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트; 서열번호 3 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 가성우역 바이러스 (PPRV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트; 서열번호 7내지 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 블루텅 바이러스 (BTV)의 VP3 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 서열번호 16내지 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 (VFV)의 NS 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스에 특이적인 다중 RT-PCR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서 "특이적"이라는 용어는 다른 바이러스에 결합하지 않고 상기 바이러스에만 특이적으로 결합하는 것을 의미한다.

상기 프라이머 염기 서열에서 I는 이노신 (Inosine)을 의미하며 링 커(linker)이다. 낮은 Tm 값을 가지는 이노신 (Inosine)을 넣음으로써, 특정 온도에서 거품 구조 (bubble like structure) 를 형성하게 되고, 그로 인해 프라이머가 유전자에 비특이적으로 결합하는 것을 차단하여 PCR 의 특이성을 극대화 시키는 조절자 역할을 하게 된다.

본 발명의 다중 RT-PCR 프라이머 세트는 그를 구성하는 각 프라이머 사이에 간섭 현상 없이 상기의 바이러스의 특정 영역을 다중 RT-PCR 에 의하여 성공적으로 증폭하는데 사용할 수 있다. 즉, 하나의 PCR 반응에 상기 19개의 프라이머를 사용하여도 프라이머 이량체, 헤어핀 고리 등이 형성되지 않음을 의미한다.

본 발명에 있어서, 우역 바이러스는 NC_006296, AY948426의 2종류의 우역 바이러스가 포함하며, 상기 PCR로 2종류의 우역 바이러스 검출이 가능하다. 가성 우역 바이러스는 NC_006383, AF384687, AY823544, DQ267183, DQ267184, DQ267185, DQ267186, DQ267187 의 8종류의 가성 우역 바이러스가 포함되며, 상기 PCR로 8종류의 가성 우역 바이러스 검출이 가능하다. 블루텅 바이러스는 AF529046, AY322428, AY493688, DQ186790, DQ186792, DQ186793, DQ186798, DQ186807, DQ186810, DQ186811, DQ186815, DQ186816, DQ186818, DQ186820, DQ186822, DQ186826, L19968, L19969, NC_006014, DQ380155 의 19종류의 블루텅 바이러스가 포함되며, 상기 PCR로 19종류의 가성 우역 바이러스 검출이 가능하다. 리프트 계곡열 바이러스는 DQ380155, DQ380156, DQ380157, DQ380158, DQ380159, DQ380171, DQ380172, DQ380173, DQ380174, DQ380175, DQ380176, DQ380177, DQ380178, DQ380179, DQ380180, NC_002045 의 16종의 리프트 계곡열 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 PCR로 16종류의 가성 우역 바이러스 검출이 가능하다. 즉, 본 발명에서 개발되어 사용된 단일 튜브 다중 RT-PCR 진단용 프라이머 세트는 NC_006296, AY948426 서열을 포함하는 우역바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, NC_006383, AF384687, AY823544, DQ267183, DQ267184, DQ267185, DQ267186, DQ267187 서열을 포함하는 가성 우역 바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, AF529046, AY322428, AY493688, DQ186790, DQ186792, DQ186793, DQ186798, DQ186807, DQ186810, DQ186811, DQ186815, DQ186816, DQ186818, DQ186820, DQ186822, DQ186826, L19968, L19969, NC_006014, DQ380155 서열을 포함하는 블루텅 바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트 및 DQ380155, DQ380156, DQ380157, DQ380158, DQ380159, DQ380171, DQ380172, DQ380173, DQ380174, DQ380175, DQ380176, DQ380177, DQ380178, DQ380179, DQ380180, NC_002045 서열을 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트로 구성되어 있으며, 상기의 바이러스 모두를 검출해 낼 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 바이러스를 포함하는 시료로부터 바이러스 RNA을 추출하는 단계; 및 얻어진 RNA 을 상기의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 다중 RT-PCR 을 수행하는 단계를 포함하는, 시료 중에 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 유무를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 시료는 가축으로부터 채취한 시료, 예를 들면 우역 바이러스, 가성 우 역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스에 의하여 감염된 가축으로부터 얻어지는 시료일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기의 "PCR" 은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이 적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다. 상기의 "RT-PCR" 은 역전사 효소 중합 연쇄반응 (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 으로, 특정 부위의 RNA을 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA (complementary DNA) 을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 역전사 효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA 을 제조하는 과정과 cDNA 을 이용하여 특정부위를 증폭하는 과정으로 나누어진다. cDNA을 이용한 증폭과정은 상기의 PCR의 증폭과정과 동일하다. 또한, "다중 RT-PCR" 이란 RT-PCR에 사용되는 프라이머 2세트 이상이 하나의 증폭 반응에 사용되는 것을 의미한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 다중 RT-PCR 산물의 크기를 분석하는 단계를 더 포함한다. 다중 RT-PCR 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다. 상기 다중 RT-PCR 산물의 크기가 115bp인 경우 우역 바이러스 (RPV), 243bp인 경우 가성 우역 바이러스 (PPRV), 440bp인 경우 블루텅 바이러스 (BTV), 205bp인 경우 리프트 계곡 바이러스 (RVFV) 가 존재하는 것으로 판별함을 특징으로 하는 바이러스의 존재 유 무를 검출할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서 상기 다중 RT-PCR은 42℃에서 1시간 정도 1회 역전사 반응을 실시하고 93.5℃ 내지 94.5℃에서 3분간 정도 사전 변성 (predenaturation) 시킨 후,93.5℃ 내지 94.5℃에서 28초 내지 32초 변성(denaturation) 하는 단계; 60.5℃ 내지 61.5℃에서 88초 내지 92초 어닐링 (annealing) 하는 단계; 71.5℃ 내지 72.5℃에서 48초 내지 52초 확장 (extension) 하는 단계를 37회 내지 43회 반복한 후 71.5℃ 내지 72.5℃에서 10분 정도 동안 추가 반응 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 다중 RT-PCR 프라이머 세트; dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); DNA 중합효소; 역전사 효소; 완충액을 포함하는 시료 중에 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 유무를 검출하는 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 다중 RT-PCR 프라이머 세트; dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); DNA 중합효소; 역전사 효소; DNA 염색 시약 및 담체를 포함하는 시료 중에 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 존재 유무를 검출하는 조성물을 제공한다. 여기서, 상기 조성물은 역전사효소, DNA 중합효소, DNA 염색시약 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 점막 병변형 바이러스의 검출을 위 한 임상 검체 및 세포 배양액 등에 적용 가능하다.

상기의 키트 및 조성물의 다중 RT-PCR 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성된 우역 바이러스 (RPV) 에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 3내지 6으로 구성된 가성우역 바이러스 (PPRV) 에 특이적인 프라이머 세트; 서열번호 7내지 15로 구성된 블루텅 바이러스 (BTV)에 특이적인 프라이머 세트; 및 서열번호 16내지 19로 구성된 리프트 계곡열 바이러스 (RVFV) 에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스 진단용 다중 RT- PCR 프라이머 세트를 의미한다. 상기의 DNA 중합효소는 내열성 중합효소로 Taq DNA 중합효소 등을 이용할 수 있다.

또한 본 발명에서는, 본 발명에서 사용한 단일튜브-다중 RT-PCR 프리믹스 키트와 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스에 대한 cDNA를 첨가하여 수행한 결과에서도 상기 4가지 유형의 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에서 단일튜브-다중 RT-PCR 진단법의 유용성은 리프트 계곡열 짐 (Zim) 688/78주 및 스미스번 (Smithburn) 주, 블루텅 바이러스 표준주 24종, 우역바이러스 LATC주, 가성우역바이러스 나이지리아 (Nigeria) 75/1주를 이용하여 확인되었다. 단일튜브-다중 RT-PCR을 수행한 결과는 리프트 계곡열 바이러스, 블루텅 바이러스, 우역바이러스, 가성우역바이러스에 대해 각기 205 bp, 440 bp, 115 bp 및 243 bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 나타내었다. 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 그 결과를 종래 알려진 각 바이러스별 타깃부위의 염기서열과 비교하면, 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치함을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서는 단일튜브-다중 RT-PCR 프리믹스 키트에 대한 특이성을 확인하기 위해 유사한 증상을 나타내어 감별이 필요한 아까바네 바이러스 (Akabane virus), 아이노 바이러스 (Ainovirus), BEFV, 츄잔 바이러스 (Chuzan virus) 및 이바라끼 바이러스 (Ibaraki virus) 분리주를 사용하여 다른 종의 바이러스와의 교차반응성을 검토하였다. 구체적으로 아까바네 바이러스 93FMX주, 아이노 바이러스 KSA9910주, 소 유행열 바이러스 대성 (Bovine ephemeral fever virus Daesung) 주, 츄잔 바이러스 영남 (Chuzan virus Youngnam) 주, 이바라끼 바이러스 이바라끼 (Ibaraki virus Ibaraki)주를 이용하였다. 각각의 바이러스 RNA는 Qiamp viral RNA 키트 (Qiagen, Germany)로 분리하여 실험에 사용하였다. 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-다중 RT-PCR이 상기 다른 종의 바이러스에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다.

본 발명에서 개발한 단일튜브-다중 RT-PCR법을 적용하면 점막에서 병변이 발생한 의심축의 검체로부터 RNA를 직접 검출하여 다양한 원인으로 발생할 수 있는 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스와 같은 임상적 증상만으로 진단하기 어려운 전염병을 를 동시에 신속하게 검출해 낼 수 있어 이들 전염병이 국내 유입시 신속한 진단을 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 본 발명은 국내 유입 가능한 중요한 해외 가축 전염병에 대한 분자생물학적 성 상 연구에도 이용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 도입 및 배양

리프트 계곡열 바이러스는 영국의 진단 킷트 회사인 BDSL에서 시판중인 진단 킷트내의 불활화 바이러스 Zim 688/78주 및 남아프라카 공화국 Onderstepoort Biological Products사에서 도입한 스미스번 (Smithburn) 생백신주를 사용하였다. 블루텅 바이러스는 영국 수의연구청(VLA)으로부터 도입한 표준주 24종(RSArrr/1, RSArrr/2, RSArrr/3, RSArrr/4, RSArrr/5, RSArrr/6, RSArrr/7, RSArrr/8, RSArrr/9, RSArrr/10, RSArrr/11, RSArrr/12, RSArrr/13, RSArrr/14, RSArrr/15, RSArrr/16, RSArrr/17, RSArrr/18, RSArrr/19, RSArrr/20, RSArrr/21, RSArrr/22, RSArrr/23, RSArrr/24) 및 아시아분리주 5종(IND2001/01, IND1998/01, ISA1991/01, IND2003/01, MAY1987/01)를 사용하였다. 우역 바이러스는 현재 국립수의과학검역원에서 보유하고 있는 LA주 및 LATC주를 사용하였으며, 가성우역바이러스는 프랑스 CIRAD-EMVT로부터 분양받은 Nigeria 75/1주를 사용하였다. 각각의 바이러스는 ATCC으로부터 분양받아 단층 배양한 Vero 세포 (CCL-81)에 접종하고 세포병변효과를 관찰한 후 세포배양액을 본 실험에 이용하였다.

< 실시예 2>바이러스 RNA 분리

우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 RNA는 바이러스 배양액으로부터 QIAamp viral RNA 키트 (Qiagen, Germany)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 분리하였다.

< 실시예 3> 다중 RT - PCR 프라이머 제작

우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스 4종에 대하여 특이적 증폭이 가능하고 PCR 산물을 아가로즈 젤 전기영동 수행 후 각각의 바이러스를 PCR 결과물의 크기에 따라 분류할 수 있도록 각 바이러스의 유전자를 분석하여 프라이머를 제작하고 각각의 프라이머들을 다음과 같이 명명하였다. 우역 바이러스의 F 유전자에 기초하여 NC_006296, AY948426 염기서열을 포함하는 우역바이러스 유전자 증폭을 위한 RPVF와 RPVR 프라이머, 가성우역 바이러스의 F 유전자에 기초하여 NC_006383, AF384687, AY823544, DQ267183, DQ267184, DQ267185, DQ267186, DQ267187 의 염기서열을 포함하는 가성 우역 바이러스 유전자 증폭을 위한 PPRVF1, PPRVF2, PPRVR1, PPRVR2 프라이머, 블루텅 바이러스의 VP3 유전자에 기초하여 AF529046, AY322428, AY493688, DQ186790, DQ186792, DQ186793, DQ186798, DQ186807, DQ186810, DQ186811, DQ186815, DQ186816, DQ186818, DQ186820, DQ186822, DQ186826, L19968, L19969, NC_006014, DQ380155의 염기서열을 포함하는 블루텅 바이러스 유전자 증폭을 위한 BTVF1, BTVF2, BTVF3, BTVF4, BTVF5, BTVR1, BTVR2, BTVR3, BTVR4 프라이머, 리프트 계곡열 바이러스의 NS 유전자에 기초하여 DQ380155, DQ380156, DQ380157, DQ380158, DQ380159, DQ380171, DQ380172, DQ380173, DQ380174, DQ380175, DQ380176, DQ380177, DQ380178, DQ380179, DQ380180, NC_002045 의 염기서열을 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 유전자 증폭을 위한 RVFVF1, RVFVF2, RVFVR1, RVFVR2 프라이머를 각각 제작하였다. 프라이머 세트는 하기 표 1과 같다.

우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 단일튜브-다중 RT-PCR을 위한 올리고 뉴클레오티드 프라이머 세트.

타깃바이러스(유전자부위)	프라이머 (5‘→3’) (F:포워드, R:리버스)	서열 번호
우역바이러스 (F gene)	RPVF: TGGCTGGTGCAGCTCTCGIIIIIGCAACCGCAG	1
	RPVR: TGTTTCCAGACTTGCCTRAAGACIIIIIATAGCCTGGG	2
가성우역 바이러스 (F gene)	PPRVF1: TTTGCTGGARCTGTTCTGGCCIIIIIAGCACYTGGAG	3
	PPRVF2: TTTGTYGGAGCTGTTCTGGCCIIIIIAGCACTTGGAG	4
	PPRVR1: GCATGACATTCTATGRACAGAAGGGAIIIIITCATTGTTGA	5
	PPRVR2: ACATGACATTCTATGAACAGAGGGGAIIIIITCATTGTTGA	6
블루텅 바이러스 (VP3 gene)	BTVF1: GGAACAGGATATAATGGTTGGGIIIIIATTGATGTCG	7
	BTVF2: GGAACAGGATATAATGGTTGGGIIIIIATYGATGTTG	8
	BTVF3: GGAACAGGATATAATGGATGGGCIIIIITAGAYGTTGA	9
	BTVF4: CGGGATACAACGGATGGGCIIIIITHGATGTTGA	10
	BTVF5: AACGGGGTAYAACGGTTGGGIIIIIATTGATGTTG	11
	BTVR1: TCTCATTTCTRTGCGTAGGTTCAAIIIIICTGTTGAAAG	12
	BTVR2: TCTCATTCCTATGCGTTGGTTCAAIIIIICTGTTGAAAG	13
	BTVR3: CGATGCGTTGGCTCAAAYGACCIIIIIAAGGCAAACC	14
	BTVR4: GATGCGTTGGCTCRAACGACCIIIIIAAGGCGAAC	15
리프트계곡열바이러스 (NSs gene)	RVFVF1: CCTGGCCTCTTGGAGAACIIIIICTGGCTTTCTT	16
	RVFVF2: CCTGGCCTCTTGGAGAACIIIIICTGGCCTTCTT	17
	RVFVR1: GCACAGGTCAATCCCTCTGAIIIIIGCCTCAGTC	18
	RVFVR2: GCACAGGTCAATCCCTCTGAIIIIIGCCTCGGTC	19

< 실시예 4> 단일튜브-다중 RT - PCR

점막 병변형 가축질병으로 의심되는 동물의 검체로부터 분리한 RNA를 사용하여 cDNA 합성과정이 없이 역전사 반응과 PCR 반응을 동시에 수행하기 위한 단일튜브-다중 RT-PCR 키트를 제작하였다. 먼저, 역전사 효소와 Taq 폴리머라아제를 동시에 첨가한 프리믹스 키트 (premix kit)를 제작하였다. 단일튜브-다중 RT-PCR 프리믹스는 리프트 계곡열 바이러스에 대한 RVFVF1, RVFVF2, RVFVR1, RVFVR2 프라이머, 블루텅 바이러스에 대한 BTVF1, BTVF2, BTVF3, BTVF4, BTVF5, BTVR1, BTVR2, BTVR3, BTVR4 프라이머, 우역바이러스에 대한 RPVF와 RPVR 프라이머, 가성 우역 바이러스에 대한 PPRVF1, PPRVF2, PPRVR1, PPRVR2 프라이머을 포함하였다. 제작한 프리믹스에 리프트 계곡열 바이러스, 블루텅 바이러스, 우역 바이러스, 가성우역 바이러스에 대한 RNA 샘플을 각 5㎕를 첨가하여 RT-PCR을 수행하였다. 42℃에서 1시간 1회 역전사 반응을 실시하고 94℃에서 3분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 61℃에서 90초간 어닐링 (annealing), 및 72℃에서 50초간 확장 (extension) 시키는 과정을 40회 반복 실시한 후 72℃에서 10분 동안 추가 반응을 실시하였다. PCR 반응 후 증폭된 DNA를 EtBr을 함유하는 1% 아가로즈 젤을 이용하여 전기영동을 실시하고 UV 하에서 관찰하였다. 그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 각 바이러스마다 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 제시하였다. 리프트계곡열바이러스, 블루텅바이러스, 우역바이러스, 가성우역바이러스에 대해 각기 205 bp, 440 bp, 115 bp 및 243 bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 나타냈다 (도면 1 및 도면 2 참조). 따라서 단 한 번의 PCR 반응으로 임상증상이 유사한 4종의 점막 병변형 가축 전염병을 유발하는 4가지 유형의 바이러스를 특이적으로 구분할 수 있다.

< 실시예 5>단일튜브-다중 RT - PCR 의 검출한계 확인

각각의 바이러스에 대한 단일튜브-다중 RT-PCR법을 적용하여 민감도를 확인하였다. 확인한 결과 도 3a의 1 레인에서부터 5 레인은 우역바이러스 LATC주 10^3.2TCID₅₀ 함량을 10배씩 단계별로 희석하여 10^2.2TCID_50m 10^1.2TCID_50, 10^0.2TCID_50, 10^-1.2TCID₅₀ 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

도 3b의 1 레인에서부터 5 레인은 가성우역바이러스 Nigeria 75/1주를 10^2.0TCID₅₀ 함량에서부터 10^-2.0TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다. 도 3c의 1 레인에서부터 5 레인은 리프트 계곡열 바이러스 Smithburn주를 10^4.3TCID₅₀ 함량에서부터 10^.0.3TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다. 도 3d의 1 레인에서부터 5 레인은 블루텅 바이러스 제2형 표준주를 10^4.2TCID₅₀ 함량에서부터 10^0.2TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

그 결과 리프트 계곡열 바이러스, 블루텅 바이러스, 우역바이러스, 가성우역바이러스에 대한 민감도는 10^0.2 TCID₅₀ 우역바이러스(LATC, 백신주), 10^-1 TCID₅₀ 가성우역바이러스(Nigeria 75/1), 10^1.2 TCID₅₀ 블루텅 바이러스(BTV2, BTV11, BTV13), 10^1.3 TCID₅₀ 리프트 계곡열 바이러스 역가에서 각각 확인할 수 있다 (도면 3a, 3b, 3c, 3d 참조).

< 실시예 6>교차반응 ( Cross reactivity )을 통한 다중 RT - PCR 의 특이성 확인

프라이머를 사용한 단일튜브-다중 RT-PCR의 바이러스 종에 따른 특이성을 확인하기 위해 동일한 축종에서 교차반응성을 나타낼 수 있는 아까바네 바이러스 (Akabane virus) 93FMX주, 아이노 바이러스 (Ainovirus) KSA9910주, 소 유행열 바이러스 대성 (Bovine ephemeral fever virus Daesung) 주, 츄잔 바이러스 영남 (Chuzan virus Youngnam) 주, 이바라끼 바이러스 이바라끼 (Ibaraki virus Ibaraki주) 를 사용하였다. 바이러스 RNA는 Qiamp viral RNA kit (Qiagen, Germany)으로 분리하여 실험에 사용하였다. 도 4에 의하면 1 레인에서는 우역 바이러스 LATC주의 증폭산물이며, 2 레인은 가성우역 바이러스 Nigeria 75/1주의 증폭산물이고, 3 레인은 블루텅 바이러스 2형 표준주의 증폭산물이며, 4 레인은 리프트 계곡열 바이러스 Smithburn주의 증폭산물이다. 5 레인은 아까바네 바이러스 93FMX 주의 반응성 결과이며, 6 레인은 아이노바이러스 KSA9910주에 대한 반응성 결과이고, 7 레인은 소 유행열 바이러스 Daesung주에 대한 반응성 결과이며, 8 레인은 츄쟌 바이러스 Youngnam주에 대한 반응성 결과이고, 9 레인은 이바라끼 바이러스 Ibaraki주에 대한 반응성 결과이다. 타깃으로 한 리프트 계곡열 바이러스, 블루텅 바이러스, 우역바이러스, 가성우역바이러스 이외의 바이러스에는 반응성이 전혀 없음을 확인하였다.

즉, 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-다중 RT-PCR이 가검물에서 존재할 경우 교차반응성이 나타날 수 있는 다른 종의 바이러스에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 보여준다. 이는 본 발명에 다른 단일튜브-다중 RT-PCR이 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 지지한다.

도 1은 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스에 대한 단일튜브-다중 RT-PCR 수행 결과를 나타낸 것이다. M 레인은 100 염기쌍 (base pair) 마커이며, 1 레인은 우역바이러스 LA주의 증폭산물이며, 2 레인은 우역바이러스 LATC주의 증폭산물이다. 3 레인은 가성우역바이러스 Nigeria 75/1주의 증폭산물이며, 4 레인부터 10 레인까지는 각각 블루텅 바이러스 1, 2, 3, 4, 11, 15, 16 혈청형의 증폭산물이며, 맨 마지막 11 레인은 리프트 계곡열 바이러스 스미스 번 (Smithburn)주의 증폭산물이다.

도 2는 단일튜브-다중 RT-PCR의 블루텅 바이러스 모든 24종 혈청형에 대한 반응성을 평가한 결과이다. M 레인은 100 base pair 마커이며, 1 레인부터 24 레인까지는 블루텅 바이러스 표준주 1혈청형에서 24혈청형까지의 반응결과로 생성된 증폭산물의 전기 영동상이다. 1M 레인은 블루텅 바이러스 MAY1987/01주에 대한 증폭산물이며, 1I 레인은 IND2001/01주의 증폭산물이며, 2I 레인은 IND2003/01 주의 증폭산물이며, 16I 레인은 ISA1991/01주의 증폭산물이다.

도 3a는 우역 바이러스에 대한 단일 튜브 다중 RT-PCR 의 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다. 1 레인에서부터 5 레인은 우역바이러스 LATC주 10^3.2TCID₅₀ 함량 을 10배씩 단계별로 희석하여 10^2.2TCID_50m 10^1.2TCID_50, 10^0.2TCID_50, 10^-1.2TCID₅₀ 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

도 3b는 가성 우역 바이러스에 대한 단일 튜브 다중 RT-PCR 의 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다. 1 레인에서부터 5 레인은 가성우역바이러스 Nigeria 75/1주를 10^2.0TCID₅₀ 함량에서부터 10^-2.0TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

도 3c는 리프트 계곡열 바이러스에 대한 단일 튜브 다중 RT-PCR 의 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다. 1 레인에서부터 5 레인은 리프트계곡열바이러스 Smithburn주를 10^4.3TCID₅₀ 함량에서부터 10^.0.3TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

도 3d는 블루텅 바이러스에 대한 단일 튜브 다중 RT-PCR 의 검출 한계 조사 결과를 나타낸 것이다. 1 레인에서부터 5 레인은 블루텅 바이러스 제2형 표준주를 10^4.2TCID₅₀ 함량에서부터 10^0.2TCID₅₀까지 10배씩 단계별로 희석하여 단일튜브-다중 RT-PCR법 적용한 결과로서 5레인에서만 증폭산물이 검출되지 않았다.

도 4는 본 발명의 단일튜브-다중 RT-PCR법에 의한 바이러스와 교차반응성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 1 레인에서는 우역바이러스 LATC주의 증폭산물이며, 2 레인은 가성우역바이러스 나이지리아 (Nigeria) 75/1주의 증폭산물이고, 3 레인은 블루텅바이러스 2형 표준주의 증폭산물이며, 4 레인은 리프트 계곡열 바이러스 스미스 번 주의 증폭산물이다. 5 레인은 아까바네 바이러스 93FMX 주의 반응성 결과이며, 6 레인은 아이노 바이러스 KSA9910주에 대한 반응성 결과이고, 7 레인은 소 유행열바이러스 Daesung주에 대한 반응성 결과이며, 8 레인은 츄쟌 바이러스 Youngnam주에 대한 반응성 결과이고, 9 레인은 이바라끼바이러스 Ibaraki주에 대한 반응성 결과이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Primers and its application in multiplex PCR to identify Rinderpest, Peste-des-petits-ruminants virus, Bluetongue virus and Rift Valley fever <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 1 tggctggtgc agctctcgnn nnngcaaccg cag 33 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 2 tgtttccaga cttgcctraa gacnnnnnat agcctggg 38 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 3 tttgctggar ctgttctggc cnnnnnagca cytggag 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 4 tttgtyggag ctgttctggc cnnnnnagca cttggag 37 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 5 gcatgacatt ctatgracag aagggannnn ntcattgttg a 41 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 6 acatgacatt ctatgaacag aggggannnn ntcattgttg a 41 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 7 ggaacaggat ataatggttg ggnnnnnatt gatgtcg 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 8 ggaacaggat ataatggttg ggnnnnnaty gatgttg 37 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 9 ggaacaggat ataatggatg ggcnnnnnta gaygttga 38 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 10 cgggatacaa cggatgggcn nnnnthgatg ttga 34 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 11 aacggggtay aacggttggg nnnnnattga tgttg 35 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 12 tctcatttct rtgcgtaggt tcaannnnnc tgttgaaag 39 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 13 tctcattcct atgcgttggt tcaannnnnc tgttgaaag 39 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 14 cgatgcgttg gctcaaayga ccnnnnnaag gcaaacc 37 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 15 gatgcgttgg ctcraacgac cnnnnnaagg cgaac 35 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 16 cctggcctct tggagaacnn nnnctggctt tctt 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 17 cctggcctct tggagaacnn nnnctggcct tctt 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 18 gcacaggtca atccctctga nnnnngcctc agtc 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer (the n is inosine linker.) <400> 19 gcacaggtca atccctctga nnnnngcctc ggtc 34

Claims (11)

1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 우역 바이러스 (RPV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트.
2. 서열번호 3 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 가성우역 바이러스 (PPRV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트.
3. 서열번호 7내지 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 블루텅 바이러스 (BTV)의 VP3 유전자 증폭용 프라이머 세트.
4. 서열번호 16내지 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 (VFV)의 NS 유전자 증폭용 프라이머 세트.
5. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 우역 바이러스 (RPV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트;

   서열번호 3 내지 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 가성우역 바이러스 (PPRV)의 F 유전자 증폭용 프라이머 세트;

   서열번호 7내지 15로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 블루텅 바이러스 (BTV)의 VP3 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및

   서열번호 16내지 19로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함하는 리프트 계곡열 바이러스 (VFV)의 NS 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, 우역 바이러스, 가성 우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스에 특이적인 다중 RT-PCR 프라이머 세트.
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