KR20230138279A - 전장유전체 증폭을 위한 리프트밸리열 바이러스 범용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리프트밸리열 바이러스(rift valley fever virus, RVFV) 감염 여부를 판별하기 위한 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 키트, 조성물은 리프트밸리열 바이러스의 유전체 서열을 증폭할 수 있는 범용 프라이머 세트를 포함하고, 이에 따라 시료 내 목적 리프트밸리열 바이러스의 존재 유무 및 관련 질환을 간편하고 빠르게 확인할 수 있다. 또한 전장 유전체 분석을 통해 리프트밸리열 바이러스의 변이여부를 판별하여 리프트밸리열 바이러스 동정에도 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 리프트밸리열 바이러스(Rift valley fever virus, RVFV)의 전장유전체를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 활용하여 미량의 시료에서 바이러스 유전체를 증폭하고 염기서열을 분석하여 전장 유전체 정보를 얻어내는 기술에 관한 것이다.
리프트 밸리열(Rift Valley Fever; RVF)은 버냐바이러스(Bunyaviridae)와 필보바이러스(Phlebovirus)속에 속하며, 세 개의 분절로 이루어진 단일가닥의 선형(-)RNA 바이러스이다. 1900년대 초반 케냐의 가축에서 처음 발견된 이후 감염된 가축을 통하여 많은 사람과 동물에서 발생이 보고되고 있다. 잠복기는 대개 2-6일이며, 일반적으로 발열, 현기증, 극심한 체중감소 등의 경미한 증상을 나타내지만 심한 경우에는 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통, 혼수상태 등의 증상을 보이며 사망에 이를 수 있다. 전체 감염자의 1%가 사망하고 출혈열 증상 환자의 경우 치사율이 50%에 달하나 현재까지 특이적 항바이러스제나 예방 백신이 개발되지 않았으며, 발병시 대증 치료만 가능하다. 감염 경로는 감염된 혈액을 가진 모기나 흡혈곤충에게 물리거나 감염된 동물의 혈액이나 체액, 장기에 접촉하는 경우, 감염된 동물의 우유를 가공하지 않고 마실 경우에 감염이 일어날 수 있다. 대부분의 아프리카 지역과 아라비아 반도에서 주로 발생하며, 특히 매개모기 서식지인 서아프리카 지역에서 많이 발생하나, 현재까지 국내에서 발병된 보고는 없다.
이러한 국내에 유입되지 않은 고위험 바이러스가 생물테러로 사용될 경우 진단과 치료에 있어 치명적이며, 확산을 방지하기 어려워 국민보건에 심각한 영향을 끼칠 우려가 있으므로 이에 대한 대응책 마련이 시급하다. 그러나 생물테러 사건현장에서 주로 이용되는 면역크로마토그래피 시험법으로는 검출 가능한 생물작용제가 한정되어 있어 검출 가능한 생물작용제의 확대가 요구되고 있다.
RVFV 출현의 위험에서 백신 및 치료 개발, 역학 및 진화 유전체학의 측면에서 전체 게놈 시퀀싱(WGS)의 중요성이 증가하고 있다. Whole Genome Sequencing은 완전한 염기서열 분석을 위한 염기서열분석이다. 그것은 샷건 접근 방식으로 전체 게놈 무작위 시퀀싱의 적용에서 발생한다. 무작위 크기의 게놈 시퀀싱을 통해 각 게놈 단편('읽기'라고 함)은 시퀀스에 반복적인 영역을 가진다. 읽기(read)는 이러한 반복 영역을 식별하고 서로를 조합하여 하나의 연속 시퀀스를 만든다. 결과적으로 전체 게놈이 시퀀싱된다. WGS는 이제 NGS 플랫폼에서 수행할 수 있다.
이전에 대규모 병렬 시퀀싱으로 알려진 NGS(next generation sequencing)는 Sanger 시퀀싱 이후에 등장한 대용량 시퀀싱 기술의 총칭이다. NGS는 실행 시간, 비용 및 출력 데이터를 개선하기 위해 Sanger 시퀀싱의 다양한 접근 방식을 기반으로 개발되었다. short-read 또는 long-read를 분석하기 위한 여러 플랫폼이 있다. Illumina는 short-read NGS28을 나타내는 플랫폼 중 하나이다. Illumina 플랫폼은 2개의 가역 어댑터의 브리지 증폭으로 페어 엔드 시퀀싱을 수행한다. 서로 다른 어댑터 서열이 단일 가닥 DNA 단편의 각 끝과 연결되어 플로우 셀 표면에 부착된다. 다른 하나는 하나의 어댑터를 부착한 후 표면의 상보적인 올리고에 결합한다. 그런 다음 두 개의 어댑터에 의해 유도된 브리지 모양에 따라 새로운 가닥이 합성된다. 각 형광 연결 염기는 합성 주기 동안 다른 신호를 방출한다. 방출된 신호는 DNA 서열을 결정한다. ONT(Oxford Nanopore Technology)는 PacBio 플랫폼을 탑재한 Long-Read NGS의 대표적인 플랫폼이다. ONT는 최대 수십만 kb의 읽기 길이를 처리할 수 있다. 단일 단백질 나노포어를 이용하여 나노포어 시퀀싱을 수행한다. 나노포어는 플로우 셀의 지질 이중층에 위치하며 단일 가닥 DNA 단편이 통과할 때 염기의 전기 신호를 읽는다. 각 염기는 다른 잔류 이온 전류를 제공하며 그 순서는 시퀀스를 나타낸다. 이러한 NGS 플랫폼의 등장은 WGS뿐만 아니라 RNA 시퀀싱, 메타게노믹스, 질병 전파 모니터링(추적) 및 생물 정보학에서도 우수한 연구를 가능하게 했다.
한국등록특허 제1149422호는 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1742470호는 리프트계곡열 바이러스와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브에 관해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제2149373호는 리프트밸리열바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도이 개시되어 있다.
하지만, 본 발명의 리프트밸리열 바이러스의 전장 유전체 검출을 위한 범용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 리프트밸리열 바이러스에서 증폭이 가능한 범용 프라이머를 활용하여 미량의 유전체로부터 PCR 등을 통하여 증폭된 유전체를 염기서열분석법으로 빠르고 간편하게 바이러스의 전장 유전체 염기서열을 확보할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 리프트밸리열 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
상기 서열 확인 방법은 (a) 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
(b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
(c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
(e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것이다.
본 발명은 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것인 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것이다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 리프트밸리열 바이러스는 ZH548, Kenya 56 및 BIME01로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예에서, 상기 리프트밸리열 바이러스 유발 질환은 발열, 현기증, 극심한 체중감소, 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통 및 혼수상태로 이루어진 군에서에서 선택된 하나 이상인 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
본 발명은 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체의 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 리프트밸리열 바이러스의 전장유전체를 증폭시킬 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 이용하고, 유전체 증폭을 통하기 때문에 미량의 바이러스 시료 및 미배양 임상시료 등에서 리프트밸리열 바이러스의 존재 유무 및 변종유무를 간편하고 빠르게 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 리프트밸리열 바이러스의 전장유전체 서열을 정확하고 신속하게 얻을 수 있게 해주며, 이를 통해 리프트밸리열 바이러스로 유발된 질환의 진단에 효과적으로 적용될 수 있다.
도 1은 리프트밸리열 바이러스 L segment 계통도로 확인한 분석대상 세 바이러스주의 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 리프트밸리열 바이러스 S segment 계통도로 확인한 분석대상 세 바이러스주의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 리프트밸리열 바이러스 M segment 계통도로 확인한 분석대상 세 바이러스주의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 변경된 프라이머 후보군의 유전체 상의 위치를 표시한 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 선정된 프라이머 후보군을 사용한 mixed RNA singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Multiplex 프라이머를 사용한 mixed RNA multiplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 리프트밸리열 바이러스 유전체 증폭 산물의 primer walking sequence 조립 결과를 나타낸 것이다. (A) ZH548, (B) Kenya56, (C) BIME01.
도 8은 MiSeq 분석을 위해 사용된 input DNA 품질 및 양을 나타낸 것이다.
도 9는 Oxford Nanopore Technology (ONT) MinION MK1C 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 시퀀스 분석개요를 나타낸 것이다.
도 11은 Singleplex PCR 기반 ONT Reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 12는 Multiplex PCR 기반 ONT Reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 13은 리프트밸리열 바이러스에 대한 프라이머의 검출 한계 결정을 위한 증폭 산물을 나타낸 것이다.
도 14는 검출 한계점 평가를 위한 reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 15는 리프트밸리열 바이러스 진단을 위한 qPCR 참조 프라이머와 개발 전장유전체 프라이머 유전체 genome region 상의 coverage 비교를 나타낸 것이다.
도 2는 리프트밸리열 바이러스 S segment 계통도로 확인한 분석대상 세 바이러스주의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 리프트밸리열 바이러스 M segment 계통도로 확인한 분석대상 세 바이러스주의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 변경된 프라이머 후보군의 유전체 상의 위치를 표시한 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 선정된 프라이머 후보군을 사용한 mixed RNA singleplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Multiplex 프라이머를 사용한 mixed RNA multiplex PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 리프트밸리열 바이러스 유전체 증폭 산물의 primer walking sequence 조립 결과를 나타낸 것이다. (A) ZH548, (B) Kenya56, (C) BIME01.
도 8은 MiSeq 분석을 위해 사용된 input DNA 품질 및 양을 나타낸 것이다.
도 9는 Oxford Nanopore Technology (ONT) MinION MK1C 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 시퀀스 분석개요를 나타낸 것이다.
도 11은 Singleplex PCR 기반 ONT Reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 12는 Multiplex PCR 기반 ONT Reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 13은 리프트밸리열 바이러스에 대한 프라이머의 검출 한계 결정을 위한 증폭 산물을 나타낸 것이다.
도 14는 검출 한계점 평가를 위한 reference mapping 결과의 depth coverage를 나타낸 것이다.
도 15는 리프트밸리열 바이러스 진단을 위한 qPCR 참조 프라이머와 개발 전장유전체 프라이머 유전체 genome region 상의 coverage 비교를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 리프트밸리열 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법을 제공한다.
상기 서열 확인 방법은 (a) 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
(b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
(c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
(e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것이다.
상기 프라이머의 농도는 각각 0.1 내지 1.0 pM, 0.1 내지 0.8 pM, 0.1 내지 0.6 pM, 0.2 내지 1.0 pM, 0.2 내지 0.8 pM, 0.2 내지 0.6 pM, 0.3 내지 1.0 pM, 0.3 내지 0.8 pM, 0.3 내지 0.6 pM, 0.4 내지 1.0 pM 또는 0.4 내지 0.8 pM, 예를 들어, 0.4 내지 0.6 pM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것이다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 리프트밸리열 바이러스는 ZH548, Kenya 56 및 BIME01로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것이다.
상기 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계는 이 분야에 알려진 시퀀싱 방법이면 종류에 관계없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 Sanger법 또는 차세대염기서열분석법(NGS; next generation sequencing)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
염색체의 일부가 결핍 또는 중복되어 나타나는 DNA복제수 변이(CNVs)를 포함한 염색체 이상을 확인하기 위해 핵형분석, 형광동소보합법, 염색체 마이크로어레이, NGS기반의 스크리닝 검사와 같이 다양한 검사가 이루어지고 있다 (Capalbo A, et al. 2017, Hum Reprod. Vol. 32(3), pp. 492-498). 핵형분석은 다른 검사들에 비해 5Mb 정도의 낮은 해상도를 보이며 그보다 작은 크기의 염색체 결실/중복은 검출이 불가능하다. 5Mb 미만의 작은 크기의 염색체 결실 및 중복을 미세결실/중복이라고 하며, 단일유전자에 의한 질환 중 미세결실/중복에 의한 비율이 전체 변이의 15%에 해당한다(Vissers LE, et al. 2005, Hum Mol Genet. Vol. 15;14 Spec No. 2:R215-23.).
이러한 미세결실/중복을 검출해내기 위해서 특정 염기서열에 상보적인 탐침자를 활용한 형광동소보합법(FISH)과 염색체 마이크로어레이 검사가 이루어지고 있다. 형광동소보합법은 확인하려는 염기서열에 상보적인 탐침자에 형광라벨을 붙여 염색체 내에 특정 염기서열의 여부를 확인하는 검사법이다. 100kb-1Mb의 해상도를 보이기 때문에 미세결실/중복의 검출이 가능하지만 탐침자 서열에 상보적인 부분만 확인이 가능하기 때문에 기존에 알려진 변이에 대해서만 검출이 가능하다는 단점이 있다.
현재 염색체 미세결실/중복을 확인하는 가장 일반적인 검사법으로 마이크로어레이를 기반으로 하는 비교유전체 혼성화법(aCGH)이 활용되고 있다(Russo CD, et al. 2014, Cancer Discov. Vol. 4(1), pp. 19-21). 마이크로어레이를 통해 검출 가능한 CNV의 크기는 탐침자의 밀도에 의해 결정되며 대략 50kb 크기의 CNV까지 검출이 가능하다. (Watson CT, et al. 2014) 하지만 전좌 또는 역위와 같이 염색체 재배열에 의한 염색체 이상은 검출이 불가능하다.
생명체를 구성하는 유전자의 염기서열 순서를 확정하는 기술은 1세대 생어(Sanger) 방식과 차세대 염기서열 분석법인 NGS(Next Generation Sequencing)로 나뉜다. 1977년경에 개발된 생어 서열분석(Sanger sequencing)이라 불리는 1세대 방법은 유전자 증폭 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 과정 중 ddNTPs(di-deoxynucleotidetriphosphates)가 DNA 가닥(strand)의 합성을 중단시키는 연쇄-정지(chain-termination) 원리를 응용하여 증폭된 DNA 절편(fragment)을 모아 염기서열을 확인하는 방법이다. 이 방법은 정확도는 높지만, 염기서열 확정에 시간이 오래 걸리며, 높은 비용이 발생한다는 문제점을 가지고 있다.
이와 같은 문제점을 극복하기 위하여 차세대 염기 서열 분석법이 개발되었다. 수많은 유전체의 유전정보를 분절화한 후, 증폭하여 빅데이타를 얻은 다음 생물정보학을 이용하여 원하는 생물체의 전장 유전체 염기서열(Whole genome sequences; WGS)을 확보하는 것이다. 차세대염기서열분석법(NGS)은 염색체를 작은 조각으로 나누고 각 조각의 유전정보를 병렬적으로 분석하는 염기서열분석법이다. NGS는 유전자분석 기술이 발전하면서 상대적으로 검사의 소요시간과 비용이 적고 단일염기 다형성(SNP), 삽입-결실(INDELs)까지 검출 가능한 높은 해상도 때문에 신생아의 유전성 질환 선별검사로 활용되고 있다. 그러나 염색체를 작게 나누어 분석하는 NGS의 원리적 특성상 큰 규모의 염색체의 구조적 변이나 CNVs을 검출하는데 기술적 한계가 있다(Yohe S, Thyagarajan B. 2017, Arch Pathol Lab Med. Vol. 141(11), pp. 1544-1557).
하지만 NGS는 탐침자를 기반으로 하는 마이크로어레이에서 검출할 수 없는 염색체 재배열에 의한 염색체 이상과 기존에 알려지지 않은 새로운 CNV의 검출이 가능하다(Talkowski ME, et al. 2011, Am J Hum Genet. Vol. 88(4), pp. 469-81). 또한 염색체를 작게 조각 내어 염기서열을 분석하는 특성으로 마이크로어레이 보다 더 높은 coverage와 해상도를 보이고 염색체 이상이 시작되는 구획점(breakpoint) 검출이 가능하다는 장점이 있다(Zhao M, et al. 2013, BMC Bioinformatics. Vol. 14, Suppl 11:S1).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것인 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 본 발명의 또 다른 예에서, 상기 리프트밸리열 바이러스 유발 질환은 발열, 현기증, 극심한 체중감소, 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통 및 혼수상태로 이루어진 군에서에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
실시예 1. 리프트밸리열 바이러스(RVFV) 유전체 계통분석
병원체 바이러스 공개 데이터베이스인 Virus Pathogen Resources(ViPR)를 통해 약 6.4 kb 크기인 L 분절 유전체 142개, 약 3.8 kb 크기인 M 분절 유전체 151개, 약 1.7 kb 크기인 S 분절 유전체 237개의 염기서열 확보하였다.
확보된 유전체는 ViPR내의 분석 도구를 활용하여 각 분절 유전체별로 정렬되었으며 각각의 정렬된 분절 유전체들은 MEGA를 이용하여 계통 분석이 진행되었다. RVFV와 같은 genus에 속하는 sandfly fever Naples phlebovirus 유전체는 계통수 분석에서 outgroup으로 활용되었다.
L 분절 유전체는 Bean24262 strain을 제외하고 상호간 대부분 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 outgroup과는 65% 이하의 유사도를 나타내었다(도 1 참조). S 분절 유전체는 상호간 대부분 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 outgroup과는 65% 이하의 유사도를 나타내었다(도 2 참조). M 분절 유전체는 Bean24262 strain을 제외하고 상호간 대부분 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 outgroup과는 55% 이하의 유사도를 나타내었다(도 3 참조). 각 유전체 거리 및 계통적인 관계를 고려하여 RVFV의 주요 모델 바이러스주인 ZH548과 계통적 거리가 있는 Kenya 56 및 BIME01을 연구 대상 바이러스주로 선택하였다.
실시예 2. 리프트밸리열 바이러스 범용 프라이머 세트 선정
정렬한 서열을 이용하여 전체 균주의 90% 이상에서 보존되어 있는 부위(conserved site)를 선택하고, 그중 Tm값, GC%, 길이, degeneracy, hair-pin구조를 고려하여 L segment 35개, M segment 18개, S segment 12개로 총 65개의 전장유전체 프라이머를 설계하였다. 이 중 7쌍의 프라이머 (표 1, 도 4)를 선택하여 증폭 산물을 합성하였다. 프라이머 선별 기준은 1) 증폭산물의 길이가 약 1.5-2kb정도이며, 2) Tm값이 50도에서 58도 사이인 프라이머를 선택하였고, 3) 염기서열 분석 시 서열 누락을 방지하기 위해서 각 증폭 산물이 약 300bp 이상 중복될 수 있도록 고려하였다. S segment의 길이가 가장 작으며 약 1.7kb길이이므로 이를 기준으로 모든 프라이머 세트를 제작하였다. 따라서 L segment는 L1, L2, L3, L4로 나누었으며 M segment는 M1, M2로 나누어 제작하였다.
| Forward | Reverse | Size (bp) | |
| RVFV_L1 | 1F (서열번호 1) ACACAAAGGCGCCCAATCA |
1737R (서열번호 2) AAACCCTGGAAGTGGAGAG |
1736 |
| RVFV_L2 | 1472F (서열번호 3) CATCAGCCATCCTTRTCAG |
3428R (서열번호 4) GCTGGGAAGCTGATTAGCA |
1956 |
| RVFV_L3 | 2962F (서열번호 5) CCTGTGTGGACTTGTGC |
5027R (서열번호 6) GATTCCTTTATCTCAACGTTTG |
2065 |
| RVFV_L4 | 4471F (서열번호 7) TCACTGGATTCTATAGTTTAC |
6384R (서열번호 8) ACACAAAGACCGCCCAATATT |
1913 |
| RVFV_M1 | 2F (서열번호 9) ACACAAAGACGGTGCATTAAAT |
2037R (서열번호 10) AGGTATGTGCTATAACGTGG |
2035 |
| RVFV_M2 | 1650F (서열번호 11) GATGATCAGTCAGTTAGCTC |
3845R (서열번호 12) TCAAAGAGTTAGTTTAATTCCY |
2195 |
| RVFV_S | 1F (서열번호 13) ACACAAAGACCCCCTAGTG |
1671R (서열번호 14) ACACAAAGCTCCCTAGAGAT |
1670 |
실시예 3. 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 유전체 고속 진단법 확립
주관기관으로부터 2021년 6월경 RVFV 시험관 내 전사(In Vitro Transcription; IVT)합성물을 L, M, S 분절로 각각 인계받았다.
Mixed RNA-singleplex PCR: 임상 및 세포 단계에서 RVFV 핵산 추출물은 모든 분절이 섞여 있는 상태이다. 이와 동일 조건을 위해 RVFV의 모든 분절이 포함된 혼합물을 제조하여 프라이머 적용성 평가를 진행하였다. First-strand cDNA합성 시 L, M, S segment genomic RNA를 1:1:1 비율로 혼합하여 분절 혼합 주형으로 사용하였다. 이를 random hexamer 방법을 사용하여 first-strand cDNA 역전사 합성(Reverse-Transcription; RT)을 진행하였다. Lunascript RT supermix (NEB E3010s) kit를 이용하여 RT를 진행하였으며, 방법은 kit의 매뉴얼을 따랐다. 증폭 산물 합성조건은 1μl first strand cDNA, 1μl forward primer, 1μl reverse primer, 10μl Q5® High-Fidelity 2X Master mix, 7μl DW 혼합물을, ① 98℃ 30초 후, ②denaturation 98℃ 5초, annealing 55℃ 30초, extension 72℃ 2분 싸이클을 30회 반복하고 ③ final extension 72℃ 3분을 처리하였다.
그 결과, 도 5와 같이 모든 증폭 산물이 1.7 - 2.2kb로 나타나 설계 당시 기대한 크기의 band가 형성되는 것을 확인하였다. ZH548의 M2 증폭 산물의 경우 다른 증폭 산물들과 비슷한 단일 밴드가 형성되었으나 기대한 위치에 형성되지 않았다. 그러나 QIAquick Gel Extraction Kit을 이용하여 gel extraction 정제 후 Sanger 시퀀싱 결과 목표한 서열임을 확인되었다. 유전자 구조상 전기영동 결과 특이적인 경향을 보이는 것으로 생각되었다.
Mixed RNA-multiplex PCR: 모든 분절이 혼합된 RVFV 혼합물에 multiplex PCR을 적용하였다. Odd, Even multiplex PCR primer는 표 2와 같이 제작하였다. PCR 조건은 2μl first-strand cDNA, Odd/Even forward primer 1μl, Odd/Even reverse primer 1μl, 10μl Q5® High-Fidelity 2X Master mix, 6μl DW 혼합물을, ① 98℃ 30초 후, ② denaturation 98℃ 5초, annealing 55℃ 30초, extension 72℃ 2분의 싸이클을 30회 진행하고, ③ final extension 72℃ 3분의 조건으로 진행하였다.
그 결과 도 6과 같이 원하는 위치에 멀티 밴드가 형성되는 것을 확인하였다. ZH548 strain의 multiplex PCR 증폭 산물에서는 target band 이외에 다양한 크기의 원치 않는 band들도 보였는데, 이는 여러 프라이머가 함께 섞여 있기 때문에 생길 수 있는 문제라고 생각된다.
| Multiplex PCR 프라이머 세트 | ||||
| Sample ID | Primer | Length (bp) |
||
| Forward | Reverse | |||
| Odd Primer |
L1 | 1F (서열번호 1) ACACAAAGGCGCCCAATCA |
1737R (서열번호 2) AAACCCTGGAAGTGGAGAG |
1736 |
| L3 | 2962F (서열번호 5) CCTGTGTGGACTTGTGC |
5027R (서열번호 6) GATTCCTTTATCTCAACGTTTG |
2065 | |
| M1 | 2F (서열번호 9) ACACAAAGACGGTGCATTAAAT |
2037R (서열번호 10) AGG TAT GTG CTA TAA CGT GG |
2035 | |
| S | 1F (서열번호 13) ACACAAAGACCCCCTAGTG |
1671R (서열번호 14) ACACAAAGCTCCCTAGAGAT |
1670 | |
| Even Primer |
L2 | 1472F (서열번호 3) CATCAGCCATCCTTRTCAG |
3428R (서열번호 4) GCTGGGAAGCTGATTAGCA |
1956 |
| L4 | 4471F (서열번호 7) TCACTGGATTCTATAGTTTAC |
6384R (서열번호 8) ACACAAAGACCGCCCAATATT |
1913 | |
| M2 | 1650F (서열번호 11) GATGATCAGTCAGTTAGCTC |
3845R (서열번호 12) TCAAAGAGTTAGTTTAATTCCY |
2195 | |
실시예 4. 리프트밸리열 바이러스의 범용 프라이머 세트 검증
세가지 종의 RVFV 유전체 증폭산물을 Sanger 시퀀싱 primer walking법으로 전장유전체 분석을 수행하였다. 각 종마다 14개 primer가 walking에 사용되었으며, 산출된 모든 염기서열은 Q20 이상인 base를 chromatogram을 참고하여 quality를 확인하고, CodonCode Aligner 프로그램을 사용하여 trim 하였다. Trimming이 끝난 Sanger 시퀀스를 조합한 결과 리프트밸리열 바이러스의 전장유전체 전 구역이 cover되었으며 대부분의 염기서열이 이미 알려진 reference 서열과 일치하였다(도 7).
실시예 5. 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 분석
1) 전장유전체 증폭물에 대한 NGS 시퀀싱 라이브러리 구축
- Illumina MiSeq
Illumina사의 Truseq 방식을 진행하기 위해 필요한 조건은 농도>10ng/ul, 절대량>0.2ng, A260/280>1.8 이다. 본 발명에서는 정제한 증폭산물 혼합물의 DNA 양이 총 0.2μg 이상 되도록 준비하여 paired-end 방식으로 prep하였다(도 8). 도 8은 MiSeq을 위한 input DNA의 품질 및 양을 분석한 결과이다.
- OxfordNanopore Technology (ONT)
Oxford Nanopore사의 MinION FLO-MIN106 flowcell과 1d 증폭산물/cDNA by Ligation kit를 이용하기 위해 필요한 조건은 절대량>1-1.5μg, A260/280>1.8 이다. 본 발명에서는 정제한 증폭산물 혼합물의 DNA 양이 총 1μg이상으로 준비하여 표준 프로토콜에 따라 라이브러리를 제작하였다.
2) 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 증폭물에 대한 NGS 시퀀싱
- Illumina MiSeq paired-end 방식으로 Singleplex PCR 증폭 산물을 sequencing한 raw data는 약 500Mb씩 양쪽 두 개의 파일이 생산되어 총 1Gb의 fastq 포맷의 raw data가 생산되었다. Raw data의 품질 확인을 위해 fastqc 프로그램을 사용하여 분석한 결과 대부분의 Q-score가 30이상이었다.
- OxfordNanopore MinIon MK1C device, Ligation kit(SQK-LSK109)과 barcode kit(EXP-NBD104, EXP-NBD114)을 이용하여 singleplex 및 multiplex PCR 증폭 산물을 약 46시간의 시퀀싱 결과 212Gb의 fast5포맷의 raw data를 생산하였다(도 9). 시퀀싱 프로그램으로는 MinKNOW ver. 21.05.12를 이용하였다. 이것을 GPU Guppy basecaller ver. 5.0.12을 사용하여 fastq 포맷으로 변환 후 quality check control을 진행하였다. 그 결과 30.6Gb의 data가 생성되었다.
3) 시퀀싱 결과
- Short read sequencing (Illumina Miseq): 1Gb의 MiSeq raw data를 CLC Genomic Workbench를 이용하여 QC와 Trimming를 진행한 후 merge하였다. Merge된 시퀀스를 reference genome에 mapping하는 법과 de novo assembly 하는 법 2가지 종류의 assemble 방법으로 각기 분석하였다.
- Long read sequencing (Oxford Nanopore Technology): MinION 시퀀싱 결과는 다음과 같이 CLI (command line interphase) 기반의 assembly 및 error-correction 과정을 설계하여 수행하였다. Sequencing raw reads를 BWA (Burrow-Wheeler Aligner) 프로그램을 이용하여 reference mapping을 진행하였다. 생산된 SAM (Sequence Alignment/Map format) 파일은 samtools을 이용하여 BAM (Binary Alignment Map format)으로 변환하였다. 이를 Pilon(ver. 1.24) 프로그램을 이용하여 error-correction을 수행하고 최종적으로 consensus sequence를 도출하였다. 마지막으로 Codoncode Aligner(ver. 8.0.2)로 homopolymer base를 manual curation으로 교정하였다(도 10).
- 이미 보고된 RVFV 전장유전체를 참조유전체로 사용하여 reference mapping을 수행하였다. MiSeq, MinIon 모두 reference mapping방식으로 1개의 최종 contig로 조립되었다. Reference mapping의 depth coverage가 Singleplex/Multiplex PCR 및 시퀀싱 방법별로 차이가 있었다(도 11-12, 표 3-4). 실시간 현장 시퀀서로 관심을 받고 있는 MinIon은 1단계의 시퀀스 처리 기법에서 훨씬 발전하여 정확도 면에서 99.6%로 다른 NGS 기술들과 동일한 수준을 보여주었다.
- Illumina Miseq assemble 결과: NGS중 정확도가 높은편인 MiSeq결과를 이용하여 de novo assembly방법을 적용하였다. 그 결과 Kenya56, BIME01 세가지 분절이 모두 single contig로 조립되었다(표 3). 그러나 ZH548은 de novo assembly로 L, S 분절만 조립되었다.
실시예 6. 리프트밸리열 바이러스 임상 시료 적용성 평가
개발한 리프트밸리열 바이러스 진단 프로토콜 임상시료 적용성 평가를 위해 검출 한계점(limit of detection)을 시험하였다.
- First strand cDNA 합성에 필요한 주형 RNA 최소량 결정: 프라이머 증폭 결과 약 1.0 x 106(copy/μL) 농도까지 전기영동 결과 확인이 가능하였다(도 12). 이에 대한 MinION 염기서열 증폭 결과 약 1.0 x 102(copy/uL) 농도까지 전장유전체 염기서열을 확보할 수 있었다(도 13).
- 전장유전체 증폭을 위한 PCR조건 최적화: 선별된 프라이머를 사용하여 singleplex PCR 및 Multiplex PCR법의 검출 한계점을 점검하였다. 이를 위해 NEB사의 Q5 High-Fidelity 2x master mix를 사용한 증폭 산물 생성 후 MinION 시퀀싱을 진행하였다. 그 결과, 모두 리프트밸리열 바이러스 유전체를 100% 커버하였지만, 정확도에서는 Singleplex PCR이 더 높은 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 5). 또한, 증폭 산물 합성 조건은 2μl First strand cDNA, 1μl Forward primer, 1μl Reverse primer, 10μl Q5 High-Fidelity 2x master mix, 6μl DW 혼합물을, ① 98℃ 30초 후, ② denaturation 98℃ 5초, annealing 55℃ 30초, extension 72℃ 2분 싸이클을 30회 진행하고 ③ final extension 72℃ 3분 처리하였다.
실시예 7. 리프트밸리열 바이러스 범용 전장유전체 분석용 프라이머 우수성
현재 알려진 리프트밸리열 바이러스 진단의 고속 실험법에 따르면 아래 도 15와 같이 몇 개의 짧은 유전자를 이용하여 짧은 시간 내에 저농도의 RNA를 민감하게 검출할 수 있다. 이 진단 유전자들은 약 100-150 nt의 아주 짧은 서열로 전체 리프트밸리열 바이러스 유전체 서열의 약 2.5%만을 사용하여 검출하는 것이므로, 감염 여부를 판단하기 위한 진단용에 한정하여 사용하며, 바이러스의 변이 여부 판별에는 사용할 수 없다는 한계가 있다.
시퀀스를 모르는 신종 균주의 경우 SISPA(sequence independent single primer amplification)를 사용하는데, 이 경우 RT 및 PCR 단계에서 완전한 random 프라이머 세트에 의존하므로 임상시료에서 바이러스 시퀀스 회수율이 0.1% 이하이다. 개발 리프트밸리열 바이러스 범용 전장유전체 프라이머 세트는 관련 유전자만을 선택적으로 증폭하므로 임상시료에서도 높은 민감도를 보일 것으로 예상된다.
현재 기술 수준으로 가장 선진적인 방법은 메르스, 사스-코로나바이러스-2를 12시간 내에 유전체의 100%를 시퀀싱 하는 기술이다. 본 발명의 결과인 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 프라이머는 현재 개발 기술 상태에서 12시간 내 유전체의 100%를 시퀀싱 할 수 있는 수준이다. 본 발명의 결과인 리프트밸리열 바이러스 전장유전체 프라이머는 인간 및 가축의 리프트밸리열 바이러스까지 아우를 수 있는 범용프라이머로 향후 리프트밸리열 바이러스 변이주 출현 시 빠른 유전체 시퀀싱을 가능케 할 것으로 기대된다.
<110> KRISS
<120> Rift valley fever virus universal primer sets for whole genome
amplification method and diagnosis kit
<130> M22-9023
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L1 Forward(1F)
<400> 1
acacaaaggc gcccaatca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L1 Reverse(1737R)
<400> 2
aaaccctgga agtggagag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L2 Forward(1472F)
<400> 3
catcagccat ccttrtcag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L2 Reverse(3428R)
<400> 4
gctgggaagc tgattagca 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L3 Forward(2962F)
<400> 5
cctgtgtgga cttgtgc 17
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L3 Reverse(5027R)
<400> 6
gattccttta tctcaacgtt tg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L4 Forward(4471F)
<400> 7
tcactggatt ctatagttta c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_L4 Reverse(6384R)
<400> 8
acacaaagac cgcccaatat t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_M1 Forward(2F)
<400> 9
acacaaagac ggtgcattaa at 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_M1 Reverse(2037R)
<400> 10
aggtatgtgc tataacgtgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_M2 Forward(1650F)
<400> 11
gatgatcagt cagttagctc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_M2 Reverse(3845R)
<400> 12
tcaaagagtt agtttaattc cy 22
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_S Forward(1F)
<400> 13
acacaaagac cccctagtg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RVFV_S Reverse(1671R)
<400> 14
acacaaagct ccctagagat 20
Claims (10)
- 하기의 단계를 포함하는 분리된 시료 내 리프트밸리열 바이러스의 전장 유전체 서열 확인 방법
(a) 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 제조하는 단계;
(b) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
(c) 분리된 RNA를 사용하여 역전사 반응을 수행하는 단계;
(d) 역전사 반응이 수행된 시료에 프라이머 세트를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계; 및
(e) 증폭된 산물의 서열을 분석하는 단계
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것임. - 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 방법
- 제1항에 있어서, 상기 리프트밸리열 바이러스는 ZH548, Kenya 56 및 BIME01로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법
- 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 진단 키트. - 제4항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 키트
- 제4항에 있어서, 상기 리프트밸리열 바이러스는 ZH548, Kenya 56 및 BIME01로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 키트
- 리프트밸리열 바이러스 전장 유전체에 상보적인 하나 이상의 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 포함하는 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 및 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트를 포함하는 것인 리프트밸리열 바이러스 유발 질환 진단용 조성물 - 제7항에 있어서, 상기 리프트밸리열 바이러스 유발 질환은 발열, 현기증, 극심한 체중감소, 쇼크, 출혈, 안질환, 뇌염으로 인한 두통 및 혼수상태로 이루어진 군에서에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물
- 제7항에 있어서, 진단 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것인, 조성물
- 제7항에 있어서, 상기 리프트밸리열 바이러스는 ZH548, Kenya 56 및 BIME01로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물
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-
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