CN115992219A - Tomm6突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及TOMM6突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途，所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：c.96C>G、c.128+2T>C；本发明提供的TOMM6突变基因、检测其的试剂等，挖掘出一种LIMD致病基因TOMM6，并提供了TOMM6突变基因位点，这为LIMD的早期分子筛查、家族遗传研究等提供了重要的依据。

Description

TOMM6突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途

技术领域

本发明涉及疾病相关突变基因，具体涉及一种TOMM6突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

背景技术

线粒体存在于绝大部分细胞中，是细胞能量生产的核心细胞器。线粒体功能受损可导致线粒体疾病。根据线粒体功能受损的程度、细胞类型和数量，线粒体疾病患者可出现各种各样的症状，受累器官主要包括心脏、肌肉、眼、耳和大脑等。

线粒体疾病的特别之处是，细胞核中的核基因组DNA(nDNA)的基因突变，以及细胞质中的线粒体基因组DNA(mtDNA)的基因突变均可导致线粒体疾病。mtDNA基因突变导致的线粒体疾病，通常发病较晚；nDNA基因突变导致的线粒体疾病，通常发病较早。在儿童期诊断的线粒体疾病中，由nDNA基因突变导致的占比为75％。与成人线粒体疾病的较高诊断率不同，儿童期线粒体疾病由于症状特异性不高，诊断率显著下降。其中，婴儿致死性线粒体疾病(Lethal Infantile Mitochondrial Disease,LIMD)可导致新生儿期及婴儿期的极高死亡率。重症LIMD患儿发病骤及，甚至在出生后数日或数周内夭折，因而临床和基因诊断率更低。在国外报道LIMD病例中，很多是在尸检中才发现了线粒体疾病的蛛丝马迹。因此，国内外研究指出LIMD的发病率可能被严重低估。现阶段，虽然动物模型等基础研究中已发现千余种基因在线粒体的功能、稳定性、结构维持等方面发挥作用，但已报道的与LIMD相关的致病基因和致病变异却很少。

如能够被及时临床诊断，特别是精准基因诊断，LIMD患儿可通过调控能量代谢，有效降低死亡率，改善远期预后。此外，由于LIMD的基因诊断率低，部分患儿父母无法通过辅助生殖技术或产前诊断技术，阻断继续生育LIMD患儿，导致家庭悲剧再次出现。因此，发现新的LIMD致病基因，并建立快速、准确的新型检测试剂盒，对于提高LIMD的诊疗水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的TOMM6突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种突变TOMM6基因，所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；

所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.96C>G、c.128+2T>C；

所述突变TOMM6基因对应的突变TOMM6蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：

p.Tyr32Ter(第32位酪氨酸突变为终止密码子)、p.Asn44Ter(第44位天冬酰胺突变为终止密码子)。

其中，所述SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2分别如下：

SEQ ID NO.1：

ATGGCTTCCAGCACTGTCCCGGTGAGCGCTGCTGGCTCGGCTAATGAAACTCCCGAAATACCGGACAACGTGGGAGATTGGCTTCGGGGCGTCTACCGCTTTGCCACTGATAGGAATGACTTCCGGAGGAACTTGATACTAAATTTGGGACTCTTTGCTGCGGGAGTTTGGCTGGCCAGGAACTTGAGTGACATTGACCTCATGGCACCTCAGCCAGGGGTGTAG

SEQ ID NO.2：

MASSTVPVSAAGSANETPEIPDNVGDWLRGVYRFATDRNDFRRNLILNLGLFAAGVWLARNLSDIDLMAPQPGV

TRANSLOCASE OF OUTER MITOCHONDRIAL MEMBRANE 6(线粒体外膜转位酶6，TOMM6)基因位于6号染色体6p21.1位置，该基因含有3个外显子，其编码的TOMM6蛋白有74个氨基酸，分子量约为8KDa。TOMM6在介导细胞质中合成的前体蛋白进入线粒体中发挥重要作用。TOMM6结合前体蛋白的成熟部分，与细胞成分相互作用，并具有弱ATP酶活性。TOMM6可能是一种重要的伴侣样蛋白，有助于将新合成的前体保持在未折叠的导入相容状态。但目前TOMM6与疾病的相关性尚不明确，未见相关文献报道。

野生型TOMM6基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000214736，该基因位于6号染色体。发明人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现TOMM6基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本发明提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。

上述第一种突变、第二种突变均属于无效突变(null mutation)，其中第一种突变在6号染色体的物理位置为41755531，碱基C突变为G；RNA水平：TOMM6基因的cDNA序列第96位碱基由C突变为G；蛋白水平：TOMM6基因编码蛋白第32位酪氨酸突变为终止密码子。

第二种突变在6号染色体的物理位置为41755565，碱基由T突变为C，RNA水平：TOMM6基因的cDNA序列第128+2位的内含子碱基由T突变为C；蛋白水平：TOMM6基因编码蛋白第44位天冬酰胺突变为终止密码子。

一种检测突变TOMM6基因的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测TOMM6基因是否存在突变位点；

所述突变位点为如下至少一种：

Chr6(GRCh37):g.41755531C>G，cDNA序列发生c.96C>G，p.Tyr32Ter(第32位酪氨酸突变为终止密码子)；

Chr6(GRCh37):g.41755565T>C，cDNA序列发生c.128+2T>C，p.Asn44Ter(第44位天冬酰胺突变为终止密码子)。

在一些实施方案中，本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。

有些个体携带本发明的突变TOMM6基因但不患LIMD，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本发明提供的检测突变TOMM6基因或突变TOMM6蛋白的方法涉及检测杂合突变。

但本发明提供的检测突变TOMM6基因的方法也包括检测纯合突变。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测突变TOMM6基因的方法包括利用如下引物进行PCR扩增的步骤：

TOMM6_E1Fseq：AGGCGGCGAGGTGACAAGTT(SEQ ID NO:3)，

TOMM6_E1R：CACAGCCAGAGCTACGAAGAC(SEQ ID NO:4)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括：96℃10min；96℃30s，63℃30s，72℃30s(循环35次)；72℃8min。

检测突变TOMM6基因的方法包括如下步骤：

(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库，收集LIMD家系的临床信息与血液样本，提取基因组DNA；

(2)设计覆盖TOMM6基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；

(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。

在其中一种实施方式中，上述序列测定是Sanger序列测定。

在其他实施方式中，上述检测突变TOMM6基因的方法还可以选自如下的技术进行：

核酸电泳、核酸杂交、ddPCR和变性高效液相色谱。

在其他实施方式中，还涉及检测TOMM6基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法，其包括如下步骤：

(1)从受试者提取DNA样本；

(2)对上述DNA样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段；

(3)将上述测序片段与参考序列比对，得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。

一种检测突变TOMM6基因的试剂，所述试剂为核酸检测探针或引物；

所述核酸检测探针与突变TOMM6基因互补；所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；

所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.96C>G、c.128+2T>C；

所述核酸检测探针与突变TOMM6基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置：

物理位置为6号染色体的第41755531位、6号染色体的第41755565位；cDNA序列第96位、第128+2位；

所述引物的序列如下：

TOMM6_E1Fseq：AGGCGGCGAGGTGACAAGTT，

TOMM6_E1R：CACAGCCAGAGCTACGAAGAC。

核酸检测探针通过与突变TOMM6基因的互补区核酸配对从而实现突变TOMM6基因的检测。

在其他实施方式中，检测突变TOMM6基因的试剂还包括缓冲液，酶，无机盐。

采用检测突变TOMM6基因的引物对模板DNA进行扩增，通过测序或凝胶电泳对扩增产物进行突变鉴定。

一种检测突变TOMM6基因的试剂盒，它包括所述的试剂。

在其他实施方式中，上述检测突变TOMM6基因的试剂盒还包括缓冲液、使用说明书。

一种检测突变TOMM6基因的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用；

所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。

DNA扩增用试剂可以是引物，探针。

限制性内切酶酶切方法用试剂可以是含限制性内切酶位点的引物，无缝克隆缓冲液。

测序用试剂可以是引物，检测缓冲液。

一种检测突变TOMM6基因的试剂在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

一种检测突变TOMM6基因的试剂盒在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

本发明提供了一种TOMM6突变基因、检测其的试剂、引物、试剂盒和方法以及其用途，创造性的挖掘出一种LIMD致病基因TOMM6，并提供了TOMM6突变基因位点，这为婴儿致死性线粒体疾病的早期分子筛查、家族遗传研究、遗传咨询提供了重要的依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为家系图；

图2为TOMM6突变序列的高通量测序图。

图3为TOMM6突变序列的Sanger测序图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例对多个婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrialdisease,LIMD)患者的家系进行全外显子组高通量测序检测，其包括如下依次进行的步骤：

(1)样本收集和基因组DNA的提取。

收集家系成员的临床资料以及血液样本(EDTA抗凝)，样本为送检至福瑞医学检验实验室有限公司的血液样本。

根据血液DNA提取试剂盒(Magen,HiPure Blood&Tissue DNA Kit)的说明书步骤提取家系各成员的血液基因组DNA。使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。置于-20℃保存。

(2)外显子组测序和生物信息学分析。

为了找到LIMD其他的致病基因，我们应用外显子组测序筛选1个LIMD家系中潜在的遗传变异(家系图参照图1所示)，而从现有已知的LIMD致病基因检测中并没有发现病理变异。

外显子组测序是在先证者身上进行。简而言之，将基因组DNA片段化，并通过使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus Library Preparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增；采用IGT公司的文库构建试剂盒(xGenExome Research Panel v2)捕获外显子区域。在Novaseq测序仪(Illumina，圣地亚哥，CA，美国)上对文库进行测序(测序深度为150X)。使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScan mpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000G、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT、REVEL软件进行SNP功能预测。

通过对图1中的1个LIMD家系TOMM6基因的全外显子测序和生物信息学分析后，我们发现了先证者携带2个复合杂合突变，突变测序结果的BAM文件参照图2所示，所述的TOMM6基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000214736，其中突变c.96C>G，物理位置为6号染色体的41755531位碱基由C突变为G；RNA水平：TOMM6基因编码RNA第96位碱基由C突变为G；蛋白水平：TOMM6基因编码蛋白第32位酪氨酸突变为终止密码子；另一个突变c.128+2T>C，物理位置为6号染色体的41755565碱基由T突变为C；RNA水平：TOMM6基因编码RNA第128+2位的内含子碱基由T突变为C；蛋白水平：TOMM6基因编码蛋白第44位天冬酰胺突变为终止密码子。并未发现其他可疑的致病基因的突变位点。

上述TOMM6基因的突变Chr6(GRCh37):g.41755531C>G、Chr6(GRCh37):g.41755565T>C均属于无效突变(null mutation)，将导致先证者TOMM6蛋白功能的完全丧失，严重影响TOMM6蛋白的生理功能。根据已知生物学功能结果，与先证者LIMD的临床症状高度相符。

根据我们所设计的筛选流程，借助于高通量深度测序及生物信息学分析，我们成功发现TOMM6基因为LIMD新致病基因，突变Chr6(GRCh37):g.41755531C>G、Chr6GRCh37):g.41755565T>C为该疾病新的致病位点。

实施例2TOMM6突变基因检测引物和Sanger测序试剂盒的建立。

针对TOMM6突变基因序列(c.96C>G、c.128+2T>C)。采用Primer 3引物设计软件设计引物序列SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4，该引物序列扩增包含TOMM6基因突变位点在内的基因组DNA片段。

具体PCR扩增体系(20μl)包括：PCR 2×buffer mix 10μl，正向引物(10μmol)1μl，与正向引物对应的反向引物(10μmol)1μl，ddH₂O 6μl，DNA 2μl。PCR反应程序：96℃ 10min；96℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 30s(循环35次)；72℃ 8min；4℃保存。PCR扩增完成后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物凝胶。将所有PCR产物分别以正、反向引物测序。

测序结果参考图3所示，利用TOMM6突变基因Sanger测序试剂盒在患者TOMM6基因中检出2个杂合突变毛细管电泳峰，分别为C/G杂合峰、T/C杂合峰，峰形标准、清晰，证明TOMM6突变基因Sanger测序试剂盒可用于TOMM6基因相关LIMD的分子检测。

综上，本发明鉴定出的突变TOMM6基因可用于LIMD患者早期临床筛查，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种突变TOMM6基因，其特征在于：所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；

所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.96C>G、c.128+2T>C；

所述突变TOMM6基因对应的突变TOMM6蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：

p.Tyr32Ter、p.Asn44Ter。

2.一种检测如权利要求1所述的突变TOMM6基因的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于：所述方法包括检测TOMM6基因是否存在突变位点；所述突变位点为如下至少一种：

Chr6(GRCh37):g.41755531C>G，cDNA序列发生c.96C>G，p.Tyr32Ter；

Chr6(GRCh37):g.41755565T>C，cDNA序列发生c.128+2T>C，p.Asn44Ter。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括利用如下引物进行PCR扩增的步骤：

TOMM6_E1Fseq：AGGCGGCGAGGTGACAAGTT，

TOMM6_E1R：CACAGCCAGAGCTACGAAGAC。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序包括：96℃10min；96℃30s，63℃30s，72℃30s循环35次；72℃8min。

5.一种检测突变TOMM6基因的试剂，其特征在于：所述试剂为核酸检测探针或引物；

所述核酸检测探针与突变TOMM6基因互补；所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；

所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.96C>G、c.128+2T>C；

所述核酸检测探针与突变TOMM6基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置：

物理位置为6号染色体的第41755531位、6号染色体的第41755565位；cDNA序列第96位、第128+2位；

所述引物的序列如下：

TOMM6_E1Fseq：AGGCGGCGAGGTGACAAGTT，

TOMM6_E1R：CACAGCCAGAGCTACGAAGAC。

6.一种检测突变TOMM6基因的试剂盒，其特征在于：它包括如权利要求5所述的试剂。

7.一种检测突变TOMM6基因的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用；

所述突变TOMM6基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：

6号染色体物理位置为41755531的碱基由C突变为G、6号染色体物理位置为41755565的碱基由T突变为C；

所述突变TOMM6基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：

c.96C>G、c.128+2T>C；

所述突变TOMM6基因对应的突变TOMM6蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：

p.Tyr32Ter、p.Asn44Ter。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。

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