CN117070616A - Timm8b突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及TIMM8B突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途,所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:c.37C>T、c.84+1G>C;本发明提供的TIMM8B突变基因、检测其的试剂等,挖掘出一种LIMD致病基因TIMM8B,并提供了TIMM8B突变基因位点,这为LIMD的早期分子筛查、家族遗传研究等提供了重要的依据。
Description
技术领域
本发明涉及疾病相关突变基因,具体涉及一种TIMM8B突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
背景技术
线粒体存在于绝大部分细胞中,是细胞能量生产的核心细胞器。线粒体功能受损可导致线粒体疾病。根据线粒体功能受损的程度、细胞类型和数量,线粒体疾病患者可出现各种各样的症状,受累器官主要包括心脏、肌肉、眼、耳和大脑等。
线粒体疾病的特别之处是,细胞核中的核基因组DNA(nDNA)的基因突变,以及细胞质中的线粒体基因组DNA(mtDNA)的基因突变均可导致线粒体疾病。mtDNA基因突变导致的线粒体疾病,通常发病较晚;nDNA基因突变导致的线粒体疾病,通常发病较早。在儿童期诊断的线粒体疾病中,由nDNA基因突变导致的占比为75%。与成人线粒体疾病的较高诊断率不同,儿童期线粒体疾病由于症状特异性不高,诊断率显著下降。其中,婴儿致死性线粒体疾病(Lethal Infantile Mitochondrial Disease,LIMD)可导致新生儿期及婴儿期的极高死亡率。重症LIMD患儿发病骤及,甚至在出生后数日或数周内夭折,因而临床和基因诊断率更低。在国外报道LIMD病例中,很多是在尸检中才发现了线粒体疾病的蛛丝马迹。因此,国内外研究指出LIMD的发病率可能被严重低估。现阶段,虽然动物模型等基础研究中已发现千余种基因在线粒体的功能、稳定性、结构维持等方面发挥作用,但已报道的与LIMD相关的致病基因和致病变异却很少。
如能够被及时临床诊断,特别是精准基因诊断,LIMD患儿可通过调控能量代谢,有效降低死亡率,改善远期预后。此外,由于LIMD的基因诊断率低,部分患儿父母无法通过辅助生殖技术或产前诊断技术,阻断继续生育LIMD患儿,导致家庭悲剧再次出现。因此,发现新的LIMD致病基因,并建立快速、准确的新型检测试剂盒,对于提高LIMD的诊疗水平具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的TIMM8B突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种突变TIMM8B基因,所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:
11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;
所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:
c.37C>T、c.84+1G>C;
所述突变TIMM8B基因对应的突变TIMM8B蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种:
p.Gln13Ter(第13位谷氨酰胺突变为终止密码子)、或p.Gln28_Val29ins*7(第28位谷氨酰胺C端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子)。
其中,所述SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2分别如下:
SEQ ID NO.1:
ATGCGCAAACACAGCTGTCGGAAGGTGGCGAGCCTGAGGCGAACAATGGCGGAGCTGGGCGAAGCCGATGAAGCGGAGTTGCAGCGCCTGGTGGCCGCCGAGCAGCAGAAGGCGCAGTTTACTGCACAGGTGCATCACTTCATGGAGTTATGTTGGGATAAATGTGTGGAGAAGCCAGGGAATCGCCTAGACTCTCGCACTGAAAATTGTCTCTCCAGCTGTGTAGACCGCTTCATTGACACCACTCTTGCCATCACCAGTCGGTTTGCCCAGATTGTACAGAAAGGAGGGCAGTAG
SEQ ID NO.2:
MRKHSCRKVASLRRTMAELGEADEAELQRLVAAEQQKAQFTAQVHHFMELCWDKCVEKPGNRLDSRTENCLSSCVDRFIDTTLAITSRFAQIVQKGGQ
Translocase Of Inner Mitochondrial Membrane 8B(线粒体内膜转位酶8B,TIMM8B)基因位于11号染色体11q23.1位置,该基因含有2个外显子,其编码的TIMM8B蛋白有98个氨基酸,分子量约为10.8KDa。TIMM8B属于进化保守的蛋白质家族,在线粒体膜间空间中以异低聚复合物组织的形式。功能研究表明,TIMM8B介导疏水膜蛋白的导入和插入线粒体内膜,在线粒体功能中发挥重要作用。但目前TIMM8B与疾病的相关性尚不明确,未见相关文献报道。
野生型TIMM8B基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000150779,该基因位于11号染色体。发明人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现TIMM8B基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本发明提供了新的致病基因的致病突变位点,为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。
上述第一种突变、第二种突变均属于无效突变(null mutation),其中第一种突变在11号染色体的物理位置为111957411,碱基G突变为A;RNA水平:TIMM8B基因的cDNA序列第37位碱基由C突变为T;蛋白水平:TIMM8B基因编码蛋白第13位谷氨酰胺突变为终止密码子。
第二种突变在11号染色体的物理位置为111957363,碱基由C突变为G,RNA水平:TIMM8B基因的cDNA序列第84+1位的内含子碱基由G突变为C;蛋白水平:TIMM8B基因编码蛋白第28位谷氨酰胺C端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子。
一种检测突变TIMM8B基因的方法,所述方法用于非诊断目的,所述方法包括检测TIMM8B基因是否存在突变位点;
所述突变位点为如下至少一种:
Chr11(GRCh37):g.111957411G>A,cDNA序列发生c.37C>T,p.Gln13Ter(第13位谷氨酰胺突变为终止密码子);
Chr11(GRCh37):g.111957363C>G,cDNA序列发生c.84+1G>C,p.Gln28_Val29ins*7;第28位谷氨酰胺C端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子。
在一些实施方案中,本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性,用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。
有些个体携带本发明的突变TIMM8B基因但不患LIMD,例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的,因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用,例如作为育前检查的重要指标,指导生育,或者用于突变携带者筛查,或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此,本发明提供的检测突变TIMM8B基因或突变TIMM8B蛋白的方法涉及检测杂合突变。
但本发明提供的检测突变TIMM8B基因的方法也包括检测纯合突变。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述检测突变TIMM8B基因的方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤:
TIMM8B_E1F:CCTCATCTTGCCCGGACTACTA(SEQ ID NO:3),
TIMM8B_E1Rseq:GGGATCGAGCACCAGTGAGC(SEQ ID NO:4);
TIMM8B_E2Fseq:TCTGTAGGGACGAGGATCTGGA(SEQ ID NO:5),
TIMM8B_E2R:GCCTGATGCTGATCTGACAATG(SEQ ID NO:6)。
在本发明应用较佳的实施方式中,上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括:96℃ 10min;96℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 30s(循环35次);72℃ 8min。
检测突变TIMM8B基因的方法包括如下步骤:
(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库,收集LIMD家系的临床信息与血液样本,提取基因组DNA;
(2)设计覆盖TIMM8B基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序;
(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。
在其中一种实施方式中,上述序列测定是Sanger序列测定。
在其他实施方式中,上述检测突变TIMM8B基因的方法还可以选自如下的技术进行:
核酸电泳、核酸杂交、ddPCR和变性高效液相色谱。
在其他实施方式中,还涉及检测TIMM8B基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法,其包括如下步骤:
(1)从受试者提取DNA样本;
(2)对上述DNA样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段;
(3)将上述测序片段与参考序列比对,得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。
一种检测突变TIMM8B基因的试剂,所述试剂为核酸检测探针或引物;
所述核酸检测探针与突变TIMM8B基因互补;所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:
11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;
所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:
c.37C>T、c.84+1G>C;
所述核酸检测探针与突变TIMM8B基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置:
物理位置为11号染色体的第111957411位、11号染色体的第111957363位;cDNA序列第37位、第84+1位;
所述引物为具有如下序列的至少一组引物:
TIMM8B_E1F:CCTCATCTTGCCCGGACTACTA(SEQ ID NO:3),
TIMM8B_E1Rseq:GGGATCGAGCACCAGTGAGC(SEQ ID NO:4);
TIMM8B_E2Fseq:TCTGTAGGGACGAGGATCTGGA(SEQ ID NO:5),
TIMM8B_E2R:GCCTGATGCTGATCTGACAATG(SEQ ID NO:6)
核酸检测探针通过与突变TIMM8B基因的互补区核酸配对从而实现突变TIMM8B基因的检测。
在其他实施方式中,检测突变TIMM8B基因的试剂还包括缓冲液,酶,无机盐。
采用检测突变TIMM8B基因的引物对模板DNA进行扩增,通过测序或凝胶电泳对扩增产物进行突变鉴定。
一种检测突变TIMM8B基因的试剂盒,它包括所述的试剂。
在其他实施方式中,上述检测突变TIMM8B基因的试剂盒还包括缓冲液、使用说明书。
一种检测突变TIMM8B基因的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用;
所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。
DNA扩增用试剂可以是引物,探针。
限制性内切酶酶切方法用试剂可以是含限制性内切酶位点的引物,无缝克隆缓冲液。
测序用试剂可以是引物,检测缓冲液。
一种检测突变TIMM8B基因的试剂在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用,该应用为非疾病的诊断目的。
一种检测突变TIMM8B基因的试剂盒在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用,该应用为非疾病的诊断目的。
较之现有技术而言,本发明的优点在于:
本发明提供了一种TIMM8B突变基因、检测其的试剂、引物、试剂盒和方法以及其用途,创造性的挖掘出一种LIMD致病基因TIMM8B,并提供了TIMM8B突变基因位点,这为婴儿致死性线粒体疾病的早期分子筛查、家族遗传研究、遗传咨询提供了重要的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为家系图;
图2为TIMM8B突变序列的高通量测序图。
图3为TIMM8B突变序列的Sanger测序图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明:
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例对多个婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrialdisease,LIMD)患者的家系进行全外显子组高通量测序检测,其包括如下依次进行的步骤:
(1)样本收集和基因组DNA的提取。
收集家系成员的临床资料以及血液样本(EDTA抗凝),样本为送检至福瑞医学检验实验室有限公司的血液样本。
根据血液DNA提取试剂盒(Magen,HiPure Blood&Tissue DNA Kit)的说明书步骤提取家系各成员的血液基因组DNA。使用Nanodrop one测量DNA的纯度,所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间,使用Nanodrop one测量DNA的浓度,所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL,总量为5-10μg。置于-20℃保存。
(2)外显子组测序和生物信息学分析。
为了找到LIMD其他的致病基因,我们应用外显子组测序筛选1个LIMD家系中潜在的遗传变异(家系图参照图1所示),而从现有已知的LIMD致病基因检测中并没有发现病理变异。
外显子组测序是在先证者身上进行。简而言之,将基因组DNA片段化,并通过使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus Library Preparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增;采用IGT公司的文库构建试剂盒(xGenExome Research Panel v2)捕获外显子区域。在Novaseq测序仪(Illumina,圣地亚哥,CA,美国)上对文库进行测序(测序深度为150X)。使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对,获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScan mpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括:dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High,Medium,Low排序。在High和Medium分组中,给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中,当一个变异符合某些标准时,则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT、REVEL软件进行SNP功能预测。
通过对图1中的1个LIMD家系TIMM8B基因的全外显子测序和生物信息学分析后,我们发现了先证者携带2个复合杂合突变,突变测序结果的BAM文件参照图2所示,所述的TIMM8B基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000150779,其中突变c.37C>T,物理位置为11号染色体的111957411位碱基由G突变为A;RNA水平:TIMM8B基因编码RNA第37位碱基由C突变为T;蛋白水平:TIMM8B基因编码蛋白第13位谷氨酰胺突变为终止密码子;另一个突变c.84+1G>C,物理位置为11号染色体的111957363位碱基由C突变为G;RNA水平:TIMM8B基因编码RNA第84+1位的内含子碱基由G突变为C;蛋白水平:TIMM8B基因编码蛋白第28位谷氨酰胺C端插入6个新氨基酸并在第7位为终止密码子。并未发现其他可疑的致病基因的突变位点。
上述TIMM8B基因的突变Chr11(GRCh37):g.111957411G>A、Chr11(GRCh37):g.111957363C>G均属于无效突变(null mutation),将导致先证者TIMM8B蛋白功能的完全丧失,严重影响TIMM8B蛋白的生理功能。根据已知生物学功能结果,与先证者LIMD的临床症状高度相符。
根据我们所设计的筛选流程,借助于高通量深度测序及生物信息学分析,我们成功发现TIMM8B基因为LIMD新致病基因,突变Chr11(GRCh37):g.111957411G>A、Chr11(GRCh37):g.111957363C>G为该疾病新的致病位点。
(3)Sanger测序验证,鉴定突变基因。
Sanger测序用于验证外显子测序检测出的TIMM8B基因的2个突变:c.37C>T、c.84+1G>C(参照图3所示)。采用Primer 3引物设计软件设计引物序列SEQ ID NO.3~SEQ IDNO.6,该引物序列扩增包含TIMM8B基因突变位点在内的基因组DNA片段。
PCR扩增体系(20μl)包括:PCR 2×buffer mix 10μl,正向引物(10μmol)1μl,与正向引物对应的反向引物(10μmol)1μl,ddH2O 6μl,DNA 2μl。PCR反应程序:96℃ 10min;96℃30s,65℃ 30s,72℃ 30s(循环35次);72℃ 8min;4℃保存。PCR扩增完成后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测,切胶回收PCR产物凝胶。将所有PCR产物分别以正、反向引物测序。测序结果参考图3所示。
综上,本发明鉴定出的突变TIMM8B基因可用于LIMD患者早期临床筛查,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种突变TIMM8B基因,其特征在于:所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:
11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;
所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:
c.37C>T、c.84+1G>C;
所述突变TIMM8B基因对应的突变TIMM8B蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种:
p.Gln13Ter、p.Gln28_Val29ins*7。
2.一种检测如权利要求1所述的突变TIMM8B基因的方法,所述方法用于非诊断目的,其特征在于:所述方法包括检测TIMM8B基因是否存在突变位点;所述突变位点为如下至少一种:
Chr11(GRCh37):g.111957411G>A,cDNA序列发生c.37C>T,p.Gln13Ter;
Chr11(GRCh37):g.111957363C>G,cDNA序列发生c.84+1G>C,p.Gln28_Val29ins*7。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤:
TIMM8B_E1F:CCTCATCTTGCCCGGACTACTA,
TIMM8B_E1Rseq:GGGATCGAGCACCAGTGAGC;
TIMM8B_E2Fseq:TCTGTAGGGACGAGGATCTGGA,
TIMM8B_E2R:GCCTGATGCTGATCTGACAATG。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述PCR扩增反应程序包括:96℃10min;96℃30s,65℃30s,72℃30s循环35次;72℃8min。
5.一种检测突变TIMM8B基因的试剂,其特征在于:所述试剂为核酸检测探针或引物;
所述核酸检测探针与突变TIMM8B基因互补;所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:
11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;
所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:
c.37C>T、c.84+1G>C;
所述核酸检测探针与突变TIMM8B基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置:
物理位置为11号染色体的第111957411位、11号染色体的第111957363位;cDNA序列第37位、第84+1位;
所述引物为具有如下序列的至少一组引物:
TIMM8B_E1F:CCTCATCTTGCCCGGACTACTA,
TIMM8B_E1Rseq:GGGATCGAGCACCAGTGAGC;
TIMM8B_E2Fseq:TCTGTAGGGACGAGGATCTGGA,
TIMM8B_E2R:GCCTGATGCTGATCTGACAATG。
6.一种检测突变TIMM8B基因的试剂盒,其特征在于:它包括如权利要求5所述的试剂。
7.一种检测突变TIMM8B基因的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用;
所述突变TIMM8B基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种:
11号染色体物理位置为111957411的碱基由G突变为A、11号染色体物理位置为111957363的碱基由C突变为G;
所述突变TIMM8B基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种:
c.37C>T、c.84+1G>C;
所述突变TIMM8B基因对应的突变TIMM8B蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种:
p.Gln13Ter、p.Gln28_Val29ins*7。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。
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