KR101742470B1 - 리프트계곡열 바이러스와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브 - Google Patents

리프트계곡열 바이러스와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리프트계곡열 바이러스(Rift Valley Fever Virus)와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)와 그 백신(Clone 13)이 공통적으로 가지고 있는 N 부위와, 백신에는 결여되어 있는 NSs 부위를 각각 검출할 수 있는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, 역전사중합효소연쇄반응)용, 바람직하게는 실시간 RT-PCR용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 구별 또는 감별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하면, 소량의 시료를 가지고 높은 민감도로 S 세그먼트 유전자의 N 과 NSs 부위를 검출함으로써 리프트계곡열 바이러스 감염여부를 신속하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 외부로부터 감염된 바이러스인지 접종된 백신인지 여부를 감별할 수 있고, 원스텝 실시간 유전자 진단으로 신속하고 정확하게 진단하여 시간과 노동력, 경비 절감 효과가 있어, 결과적으로 국내 축산업 보호, 가축방역 및 검역에 기여할 수 있다.

Description

리프트계곡열 바이러스와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브{Method for Differentiating between Rift Valley Fever Virus and its Vaccine(Clone 13), and Primer Set and Probe Used for the Differentiation}
본 발명은 리프트계곡열 바이러스(Rift Valley Fever Virus)와 그 백신(Clone 13)의 감별방법, 및 이를 위한 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)와 그 백신(Clone 13)이 공통적으로 가지고 있는 N 부위와, 백신에는 결여되어 있는 NSs 부위를 각각 검출할 수 있는 RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, 역전사중합효소연쇄반응)용, 바람직하게는 실시간 RT-PCR용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 구별 또는 감별하는 방법에 관한 것이다.
리프트계곡열은 1931년 케냐에서 처음 발생된 이후 아프리카 지역에서 계속 발생하다가 2000년에 처음으로 아프리카 이외 지역인 사우디아라비아와 예멘에서 발생하였다. 이후 이 질병의 전 세계적인 전파가능성이 제기되었고 한국의 경우 2012년 아프리카 직항이 생기면서 이 질병에 유입 가능성이 더욱 높아지고 있는 상황이다. 한국의 경우 리프트계곡열의 발생보고는 아직까지 없으며 제1종 법정가축전염병으로 지정되어 있다.
리프트계곡열은 주로 모기에 의해 전파되는 질병으로, 소, 양, 염소 등에 감염되는 경우 유사산 및 신생자의 폐사를 특징으로 하며, 사람에게도 감염되어 감기와 같은 가벼운 증상을 나타내거나 심한 경우 출혈열 및 뇌염을 일으켜 사망에 이르게 하는 인수공통전염병이다. 사람에게의 감염은 주로 모기 또는 감염된 동물의 체액 및 유사산 태자의 접촉과 같은 직접접촉에 의한다.
리프트계곡열 백신은 동물에서 불활화백신 및 순화생백신(Smithburn)이 사용되고 있으며, 임신 개체에서 사용시 유산 등의 부작용이 있다. 최근 임신 개체에서 안전하게 사용할 수 있는 Clone 13이라는 새로운 생백신이 개발되어 사용되고 있다.
OIE(국제수역사무국) 진단법은 리프트계곡열의 M 유전자를 검출하는 방법으로, 상용화된 백신에 대해 감별이 되지 않는다는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명자들은 리프트계곡열에 대한 감염여부를 신속하게 확인하는 동시에 Clone 13 백신 접종 개체에 대해서도 감별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 특정 유전자 서열에 결합하는 프라이머 및 프로브를 실시간 RT-PCR에 이용하면 리프트계곡열 감염 개체와 Clone 13 백신 접종 개체를 높은 민감도로 감별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)와 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13)이 공통적으로 가지고 있는 S 세그먼트(segment) 유전자의 N 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브와, 리프트계곡열 바이러스 백신에 결여되어 있는 S 세그먼트 유전자의 NSs 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 프라이머 및 프로브를 RT-PCR, 바람직하게는 실시간 RT-PCR에 이용하여 리프트계곡열 바이러스와 리프트계곡열 바이러스 백신을 높은 민감도로 감별하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및 (b) 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트; 를 포함하는, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 감별하기 위한 RT-PCR용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및 (b) 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트; 를 포함하는 조성물을 RT-PCR에 이용하여, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하면, 소량의 시료를 가지고 높은 민감도로 S 세그먼트 유전자의 N 과 NSs 부위를 검출함으로써 리프트계곡열 바이러스 감염여부를 신속하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 외부로부터 감염된 바이러스인지 접종된 백신(Clone 13)인지 여부를 감별할 수 있고, 원스텝(one-step) 실시간 유전자 진단으로 신속하고 정확하게 진단하여 시간과 노동력, 경비 절감 효과가 있어, 결과적으로 국내 축산업 보호, 가축방역 및 검역에 기여할 수 있다.
도 1은 리프트계곡열 바이러스(Smithburn) 샘플에 대하여 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13) 샘플에 대하여 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 "리프트계곡열 바이러스"는 야생형(wild-type) 바이러스를 의미하고, "리프트계곡열 바이러스 백신"은 리프트계곡열 바이러스 감염을 예방하기 위한 목적으로 접종되는 리프트계곡열 바이러스 유래 모든 생백신, 사백신, 불활화백신, 항원 등을 의미한다.
본 발명에서는, 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)와 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13)이 공통적으로 가지고 있는 S 세그먼트(segment) 유전자의 N 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브와, 리프트계곡열 바이러스 백신에 결여되어 있는 S 세그먼트 유전자의 NSs 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 이용하여, 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain) 샘플과 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13) 샘플 각각에 대한 원스텝 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 리프트계곡열 바이러스 샘플에서는 N 부위 및 NSs 부위가 모두 검출되고, 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13) 샘플에서는 N 부위만 검출되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 프라이머 및 프로브를 사용하였을 경우 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 효과적으로 감별할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및 (b) 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트; 를 포함하는, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 감별하기 위한 RT-PCR용, 바람직하게는 실시간 RT-PCR용 조성물 및 이를 이용한 감별방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하고, 상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트의 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머는 실시간 RT-PCR 과정에서 리프트계곡열 바이러스 S 세그먼트 유전자의 N 부위에 특이적으로 결합하여 이를 증폭시키고, 상기 제2 프라이머 세트의 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머는 실시간 RT-PCR 과정에서 리프트계곡열 바이러스 S 세그먼트 유전자의 NSs 부위에 특이적으로 결합하여 이를 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 제1 프라이머 세트와 제2 프라이머 세트는 실시간 RT-PCR 뿐만 아니라, 다른 일반적인 PCR에도 사용되어 N 부위 또는 NSs 부위를 증폭시킬 수 있다.
또한, 상기 제1 프라이머 세트와 함께 S 세그먼트 유전자의 N 부위에 특이적으로 결합하는 서열번호 5의 프로브를 사용하고, 상기 제2 프라이머 세트와 함께 S 세그먼트 유전자의 NSs 부위에 특이적으로 결합하는 서열번호 6의 염기서열의 프로브를 사용함으로써, 증폭된 N 부위 및 NSs 부위를 정량적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 실시간으로 검출할 수 있는 실시간 RT-PCR이 가능하다.
상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 프로브를 사용할 경우, 프로브의 말단에 형광 물질 등의 리포터를 표지(labeling)할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, N 부위와 결합하는 서열번호 5의 프로브 말단에는 Cy5를 표지하고, NSs 부위와 결합하는 서열번호 6의 프로브 말단에는 FAM(6-carboxytetramethyl-rhodamine)을 표지하였으나, 상기 형광 물질이 반드시 이에 한정되지 않으며, 형광 물질로 Cy5, FAM 외에도 사용 장비에 따라 Texas red, HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluprescein), TAMRA, ROX 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 실시간 RT-PCR은 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR인 것을 특징으로 할 수 있다. "원스텝"은 첫번째 가닥 cDNA 합성 반응과 qPCR 반응이 하나의 튜브에서 일어나는 것으로, 간편할 뿐만 아니라 샘플의 오염을 방지할 수 있다는 장점이 있다. "실시간 RT-PCR"은 qRT-PCR(quantitative RT-PCR)이라고도 하며, 표지 물질이 표지된 프로브를 이용함으로써 증폭되는 유전자를 실시간으로 정량할 수 있다는 장점이 있다. 본 발명에서는 리프트계곡열 바이러스 및 백신 유전자의 증폭을 위해 프라이머를 사용함과 동시에 특정 서열의 프로브를 사용함으로써, 소량의 시료를 가지고 높은 민감도로 N 부위 및 NSs 부위를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스는 바람직하게는 Smithburn strain(Bunyaviridae 과, Phlebovirus 속)이고, 리프트계곡열 바이러스 백신은 바람직하게는 생백신인 Clone 13 인 것을 특징으로 할 수 있다. 리프트계곡열 바이러스의 S 세그먼트는 염기서열이 매우 유사하므로(highly conserved), 상기 리프트계곡열 바이러스는 반드시 Smithburn strain에 한정되는 것은 아니고, 서열번호 1 내지 6의 프라이머 또는 프로브가 결합할 수 있는 S 세그먼트 유전자의 N 부위 및 NSs 부위를 갖는 모든 strain을 포함할 수 있다. 또한, 상기 리프트계곡열 바이러스 백신은 반드시 Clone 13에 한정되는 것은 아니고, S 세그먼트 유전자의 NSs 부위의 일부(서열번호 3, 4, 6의 프라이머 또는 프로브와 결합하는 부분 포함) 또는 전체가 결여되도록 제작된 모든 백신을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스 감염 개체 또는 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체는 소, 염소, 산양, 모기 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 리프트계곡열 바이러스 감염이 의심되거나, 감염개체인지 백신 접종개체인지 감별이 필요한 가축으로부터 채취된 혈청 샘플, 또는 리프트계곡열 바이러스를 보유하는 것으로 의심되는 모기 샘플을 본 발명의 실시간 RT-PCR에 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[실시예 1] 리프트계곡열 바이러스의 제조
리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)의 유전자정보(NCBI Gen Bank No: DQ380157)를 이용하여, L(2771-3543), M(658-1314) 세그먼트 유전자 일부와 S 세그먼트 유전자(1-1690) 전체 부위를 (주)바이오니아에서 인공적으로 각각 합성한 것을 제공받았으며, 합성유전자를 모두 포함하는 RT-PCR을 실시하였다.
PCR 산물은 Gel exctraction kit(QIAGENE)를 이용하여 정제된 DNA 상태로 추출하고, 이를 MEGAscript kit(Life Technologies)를 이용하여 RNA로 전사한 뒤, Nanodrop(Thermo Scientific, USA)을 이용하여 정량 후 L, M, S 유전자를 혼합하여 RNA control로 사용하였다.
[실시예 2] 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13)의 제조
리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13)의 유전자정보(NCBI Gen Bank No: DQ380182)를 이용하여, NSs 부위의 일부가 결여되어 있는 S 세그먼트 유전자(1-1141) 전체 부위를 (주)바이오니아에서 인공적으로 합성한 것을 제공받았으며, 합성유전자를 모두 포함하는 RT-PCR을 실시하였다.
PCR 산물은 Gel exctraction kit(QIAGENE)를 이용하여 정제된 DNA 상태로 추출하고, 이를 MEGAscript kit(Life Technologies)를 이용하여 RNA로 전사한 뒤, Nanodrop (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 정량 후 실시예 1에서 만들어진 L과 M 유전자를 혼합하여 RNA control로 사용하였다.
[실시예 3] 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR을 이용한 리프트계곡열 바이러스 및 그 백신(Clone 13)의 감별
3-1. 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR용 프라이머의 제작
리프트계곡열 바이러스 유전자의 S 세그먼트의 N 부위와 특이적으로 결합하는 (i) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프로브로 구성된 제1 프라이머 세트를 하기 표 1과 같이 제작하였다.
제1 프라이머 세트의 구성(증폭 위치는 S 세그먼트 상의 위치를 나타냄)
서열번호 종류 염기서열 증폭위치
1 정방향 프라이머
(RVFV-N-F)		 ACTCACTCAAGACGACCAAAG 511-534
2 역방향 프라이머
(RVFV-N-R)		 GGAGGCTCTCATCAACAAGTATAA 592-614
5 프로브
(RVFV-N-P)		 Cy5-CGGCAGCAACTCGTGATAGAGTCAA 551-575
리프트계곡열 바이러스 유전자의 S 세그먼트의 NSs 부위와 특이적으로 결합하는 (i) 서열번호 3의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머와, (ii) 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프로브로 구성된 제2 프라이머 세트를 하기 표 2와 같이 제작하였다.
제2 프라이머 세트의 구성(증폭 위치는 S 세그먼트 상의 위치를 나타냄)
서열번호 종류 염기서열 증폭위치
3 정방향 프라이머
(RVFV-NS-F)		 TGTTGGCTTACACAGGATGATAG 1280-1301
4 역방향 프라이머
(RVFV-NS-R)		 CTGTACGTGAGCAACCTCATAC 1381-1405
6 프로브
(RVFV-NS-P)		 FAM-AGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTG 1325-1350
3-2. 바이러스와 백신의 감별을 위한 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR
상기 제1 프라이머 세트의 프라이머 및 프로브, 제2 프라이머 세트의 프라이머 및 프로브를 이용하여 원스텝 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이 때, 프라이머 농도는 20 pmole, 프로브의 농도는 20 pmole로 하였으며, 반응조건은 (i) 45℃에서 30분, (ii) 95℃에서 5분, (iii) (95℃에서 5초, 60℃에서 1분) X 45 싸이클로 수행하였다.
상기와 같이 증폭된 유전자를 확인한 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 리프트계곡열 바이러스(Smithburn) 합성유전자가 포함된 샘플에서는 제1 프라이머 세트가 N 부위를 증폭시키고, 제2 프라이머 세트가 NSs 부위를 증폭시켜 N 부위와 NSs 부위가 모두 검출되었으나(도 1), 실시예 2에서 제조한 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13) 합성유전자가 포함된 샘플에서는 제1 프라이머 세트만 N 부위를 증폭시키고, 제2 프라이머 세트와 특이적으로 결합하는 NSs 부위가 존재하지 않아 NSs 부위는 증폭되지 않은 것을 확인할 수 있었다(도 2).
리프트계곡열 바이러스
(Smithburn)		 리프트계곡열 바이러스 백신(Clone 13) 결합하는 유전자 부위
제1 프라이머 세트 O O N
제2 프라이머 세트 O X NSs
3-3. 민감도 평가
실시예 1에서 제조된 리프트계곡열 바이러스(Smithburn strain)의 RNA control을 이용하여, 본 발명의 프라이머 및 프로브의 민감도를 측정한 결과, N 부위의 경우 101 copy/㎕, NSs 부위의 경우 100 copy/㎕로, 본 발명의 민감도의 수준은 OIE(국제수역사무국)에서 권장하는 M 유전자를 검출하는 진단법의 민감도와 동일하였으며, 최근 보고된 L 유전자 검출법 (Bird et al, 2007) 및 L, M, S 유전자 검출법 (Wilson et al, 2013) 등과도 동일함을 확인할 수 있었다.
[비교예] 본 발명의 프라이머 세트의 리프트계곡열 바이러스에의 특이성 확인
본 발명의 감별법의 특이도 평가를 위해 국내 발생중인 모기매개질병인 아까바네바이러스, 아이노바이러스, 츄잔 바이러스 및 최근 문제시되고 있는 슈말렌베르크 바이러스, 중증열성혈소판감소증후군 바이러스를 이용하여 상기 실시예 1 내지 3의 방법과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 이들 바이러스에 대한 특이반응은 확인되지 않았다.
또한, 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 개발된 진단법을 이용하여 리프트계곡열 바이러스가 존재할 수 있는 야외가검물인 소 및 염소의 혈청, 그리고 바이러스를 전파하는 것으로 알려진 Aedes 및 Culex 모기 pooling 샘플 100개에 대하여 검사한 결과, 모두 바이러스가 검출되지 않았다.
Virus Family and genus Real time RT-PCR
Akabane virus Bunyaviridae Orthobunyavirus NDa
Aino virus Bunyaviridae Orthobunyavirus ND
Chuzan virus Bunyaviridae Orthobunyavirus ND
Schmallenberg virus (SBV) Bunyaviridae Orthobunyavirus ND
Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome virus (SFTSV) Bunyaviridae Phlebovirus ND
aND: not detected
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency, Republic of Korea <120> Method for Differentiating between Rift Valley Fever Virus and its Vaccine(Clone 13), and Primer Set and Probe Used for the Differentiation <130> YPD201503-0009 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV N forward primer <400> 1 actcactcaa gacgaccaaa g 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV N reverse primer <400> 2 ggaggctctc atcaacaagt ataa 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV NS forward primer <400> 3 tgttggctta cacaggatga tag 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV NS reverse primer <400> 4 ctgtacgtga gcaacctcat ac 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV N probe <400> 5 cggcagcaac tcgtgataga gtcaa 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFV NS probe <400> 6 agagggattg acctgtgcct gttg 24

Claims (13)

  1. (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및
    (b) 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트;를 유효성분으로 포함하는, 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 감별하기 위한 RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하고, 상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, RT-PCR용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 5의 염기서열을 가지는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열을 가지는 프로브는 Cy5, FAM, Texas red, HEX, TAMRA 및 ROX로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 리포터(reporter)로 표지되는 것을 특징으로 하는, RT-PCR용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 RT-PCR은 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR인 것을 특징으로 하는, RT-PCR용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스는 Smithburn strain이고, 리프트계곡열 바이러스 백신은 생백신인 Clone 13인 것을 특징으로 하는, RT-PCR용 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스 감염 개체 또는 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체는 소, 염소, 산양 및 모기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, RT-PCR용 조성물.
  7. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통한 리프트계곡열 바이러스 감염 개체와 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체의 감별방법에 있어서,
    리프트계곡열 바이러스의 S 세그먼트(S segment) 중 N 단백질(Nucleocapsid protein)을 코딩하는 염기서열에 대한 제1 프라이머 세트의 특이적 결합성과, 리프트계곡열 바이러스의 S 세그먼트 중 NS 단백질(Nonstructural protein)을 코딩하는 염기서열에 대한 제2 프라이머 세트의 특이적 결합성을 이용하여 리프트계곡열 바이러스 감염 개체 및 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체를 감별하는 단계를 포함하고,
    상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되며,
    상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하고, 상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 프로브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 서열번호 5의 염기서열을 가지는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열을 가지는 프로브는 Cy5, FAM, Texas red, HEX, TAMRA 및 ROX로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 리포터(reporter)로 표지되는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 RT-PCR은 원스텝(one-step) 실시간 RT-PCR인 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스는 Smithburn strain이고, 리프트계곡열바이러스 백신은 생백신인 Clone 13인 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리프트계곡열 바이러스 감염 개체 또는 리프트계곡열 바이러스 백신 접종 개체는 소, 염소, 산양 및 모기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 감별방법.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RT-PCR은 45℃에서 30분간 가열하는 단계, 95℃에서 5분간 가열하는 단계, 및 45 사이클로 95℃에서 5초간 가열하고 60℃에서 1분간 가열하는 것을 반복하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 감별방법.
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