KR100796007B1

KR100796007B1 - 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머, 이를 이용한검출방법 및 검출키트

Info

Publication number: KR100796007B1
Application number: KR1020050076247A
Authority: KR
Inventors: 강춘; 박미선; 이주연; 권동혁; 이남주
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2005-08-19
Publication date: 2008-01-21
Also published as: KR20070021690A

Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭하여 바이러스를 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 4종의 인플루엔자 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 방법 및 검출 키트를 제공한다. 이와 같이, 본 발명에 따른 PCR 프라이머 세트 및 검출 키트는 새로운 조류 인플루엔자 바이러스의 출현을 조기 진단하는데 사용될 수 있어, 국가 방역 대책 자료로서 널리 활용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스, 프라이머, PCR

Description

인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머, 이를 이용한 검출방법 및 검출키트 {PRIMER SEQUENCES FOR DETECTING INFLUENZA VIRUS, AND DETECTING METHOD AND KIT USING THEREOF}

도 1a는 인플루엔자 A형 (A/H1형) 바이러스의 HA (hemagglutinin) 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 1b는 인플루엔자 A형 (A/H3형) 바이러스의 HA 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 1c는 인플루엔자 A형 (A/H5형) 바이러스의 HA 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 2는 인플루엔자 A형 바이러스의 M (Matrix) 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 3은 인플루엔자 B형 바이러스의 NP (nucleoprotein) 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 4는 본 발명을 원-스텝, 싱글-튜브, 멀티플렉스 (one-step, single-tube, multiplex) RT-PCR 방법으로 동시에 적용하여 인플루엔자 바이러스 (A/H1, A/H3, A/H5, B형)에 대한 형 (type) 및 아형 (subtype)을 진단한 결과 사진이다.

도 5a 내지 도 5d는 본 발명을 원-스텝, 싱글-튜브, 멀티플렉스 (one-step, single-tube, multiplex) RT-PCR 방법으로 동시에 사용했을때의 프라이머의 검출 한계(detection limit)를 분석한 결과 사진이다.

도 5a는 A/H1형 바이러스에 대한 검출 한계 분석 결과 사진이다.

도 5b는 A/H3형 바이러스에 대한 검출 한계 분석 결과 사진이다.

도 5c는 A/H5형 바이러스에 대한 검출 한계 분석 결과 사진이다.

도 5d는 B형 바이러스에 대한 검출 한계 분석 결과 사진이다.

도 6은 본 발명을 인플루엔자 바이러스 이외의 다른 주요 호흡기 바이러스에 적용하여 특이도 (specificity)를 평가한 RT-PCR 결과 사진이다.

도 7은 본 발명을 인플루엔자 바이러스 국내 분리주에 적용하여 검출 효능을 평가한 RT-PCR 결과 사진이다.

기술분야

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭하여 이를 검출하기 위한 프라이머 (올리고 뉴클레오티드) 세트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스를 하나의 시험관내에서 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 할 수 있는 PCR 검출방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

종래기술

인플루엔자 바이러스는 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체로서 NP (nuleocapsid) 와 M (matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 HA (hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형까지, NA 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류 된다 (참고문헌: Wiely DC and Skehel TT, Ann Rev Biochem, 56:365-394, 1987). 사람에서는 인플루엔자 A 및 B형 바이러스가 하기도 감염증을 포함한 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는데 특히, A형 감염에 의해서 유행기간 동안 매년 약 10,000 여명의 사망자가 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다 (참고문헌: Fleming DM et al., Br. Med. J. 311:290-291, 1995).

인플루엔자 바이러스를 진단하기 위해, 바이러스의 분리, 단백 항원이나 유전자를 검출하는 방법 및 혈청학적 검사법 등이 이용되고 있다. 이 중 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리로서, 이후에 간접면역형광법이나 혈구응집억제시험법 등을 이용하여 동정을 하지만 최근에는 인플루엔자 바이러스 특이 유전자를 검출하는 역전사중합효소연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)법 등을 이용한 분자생물학적인 진단법이 많이 사용된다. 유전자 검출법을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 형 및 아형을 구분하기 위해서 NP, M, HA 유전자에 특이적인 프라이머를 제작하여 이용하는 다양한 RT-PCR 방법이 수행 될 수 있다 (참고문헌: Fouchier RAM., J. Clin. Microbiol., 38(11): 4096-4101). 최근 여러 가지 아형의 유전자를 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 제작된 프라이머를 이용하는 싱글-스텝 싱글-튜브 멀티플렉스 (single-step single-tube multiplex) RT-PCR 진단법이 일부 연구진에 의해 보고 되었다 (참고문헌: Stockton J et al., J. Clin. Microbiol., 36(10): 2990-2995; Poddar SK, J. Virol. Methods, 99:63-70, 2002; Wright KE et al., J Clin. Microbiol., 33(5): 180-1184, 1995; Zambon et al., Options for the Control of Influenza III. Elsevier, Amsterdam pp 607-614, 1996).

한편 인플루엔자 바이러스에 대한 연구 결과에 따르면, 각각 사람과 조류에 대해 감염성인 바이러스가 중간 숙주 예를 들어, 돼지에서 재조합 및 증폭됨에 의해 사람에 대해 감염성을 갖는 새로운 바이러스가 출현될 수 있음이 이미 알려졌다 (참고문헌: Claas ECJ et al., Lancet, 351:472-477, 1998). 특히, 1997년과 1999년 홍콩에서의 A/H5N1형 발생과 같이 최근에는 조류에만 감염될 수 있는 바이러스가 중간 숙주 없이 사람에게 직접 감염이 될 수 있다는 사실이 확인된 바 있다. 또한 1999년 이탈리아에서의 A/H7N1형, 2003년 네덜란드에서의 A/H7N7형 및 2003년 겨울 아시아 일부 국가에서의 A/H5N1형 조류 독감 바이러스에 의한 인체 감염 발생이 보고 되었으며 국내에서도 2003년 12월부터 2004년 3월까지 철새에 의해 유입된 것으로 추정되는 A/H5N1형이 발생한 바 있으나 인체 감염 사례는 보고 되지 않았다 (참고문헌: 보건복지부, 2004 조류 인플루엔자 백서, pp 3-21, 2004).

이와 같이, 점점 다양해지는 인체 감염 인플루엔자 바이러스 중 기존의 A/H1, A/H3, B형 외에 A/H5형 바이러스를 신속 정확하게 진단할 수 있는 방법이 요구된다. 특히, 조류 독감 바이러스 확인이 지연되는 경우 신속한 진단에 이은 방역 조치에 어려움이 있다. 따라서 현재 국내외적으로 인체 감염 가능성이 큰 A/H5형 및 사람 인플루엔자 바이러스를 포함한 신속 간편한 진단법이 필요하다. 이에, 본 발명자들은 조류독감인 A/H5형과 사람 인플루엔자 바이러스인 A/H1, A/H3 및 B형을 신속하고 간편하게 동시에 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 인플루엔자 유사 환자의 검체를 동물세포에 접종하여 얻어진 배양액으로부터 A/H1, A/H3, A/H5 및 B형을 동시에 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 인체 감염 가능성이 큰 인플루엔자 바이러스의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응으로 인플루엔자 바이러스를 신속하고 정확하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용한 중합효소연쇄반응으로 인플루엔자 바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 인플루 엔자 A형 바이러스의 HA (hemagglutinin) 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A 형 바이러스의 M (matrix) 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 B형 바이러스의 NP (nucleoprotein) 유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 AH1-PD-F6/R2 (서열번호 1 및 2), AH3-PD-F1-2/R1 (서열번호 3 및 4), AH5-PD-F3/R4 (서열번호 5 및 6), M-F2/M-R2 (서열번호 7 및 8) 및 BNP-PD-F2/R2 (서열번호 9 및 10)와 같이 명명된다.

또한, 본 발명은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출방법에 있어서, 상기 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR을 수행함에 의해 인플루엔자 바이러스를 확인함을 특징으로 검출방법을 제공한다. 바람직하게는 다른 인플루엔자 바이러스의 특정 유전자 증폭용 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 다중 중합효소연쇄반응으로 4종의 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물은 상기 프라이머 세트 (올리고 뉴클레오티드) 및 일반적으로 허용되는 담체를 포함 한다. 여기서, 상기 조성물은 역전사효소, DNA 중합효소, DNA 염색시약 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 임상 검체 및 세포 배양액 등에 적용 가능하다.

또한, 본 발명은 RT-PCR을 이용하여 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 RT-PCR 프라이머 세트, 반응 완충액, DNA 중합효소, 역전사효소를 포함하는 검출키트에 있어서, RT-PCR 프라이머 세트가 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 HA (hemagglutinin) 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 A 형 바이러스의 M (matrix) 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 인플루엔자 B형 바이러스의 NP (nucleoprotein) 유전자의 증폭을 위한 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트임을 특징으로 하는, 인플루엔자 바이러스 검출키트에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 인플루엔자 바이러스의 당단백질에 해당되는 유전자 중 변이가 심한 지역을 아형 (subtype)별로 구분하여 멀티플렉스 (multiplex) RT-PCR을 실시할 경우, 동일한 검체로부터 하나의 시험관내에서 여러 바이러스를 동시에 진단 및 구분할 수 있다는 점에 착안하여 데이터베이스 (database)에 등록되어 있는 국내 및 국외 A/H1, A/H3, A/H5 및 B형의 분리주에 대한 HA, NP 및 M 유전자의 염기서열을 종합적으로 분석하여, 이의 염기서열로부터 상응되는 프라이머 (올리고 뉴클레오티드)를 제작하였다. 이때, 제작된 프라이머를 각각 AH1-PD-F6/R2, AH3-PD-F1-2/R1, AH5-PD-F3/R4, M-F2/M-R2 및 BNP-PD-F2/R2라고 명명하였다: AH1-PD-F6/R2에서 F6은 인플루엔자 A/H1형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 156번째에서 20개까지의 센스 폴리뉴클레오티드로 구성되고, R2는 동일 유전자의 5' 말단 으로부터 971번째에서 22개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성된다. AH3-PD-F1-2/R1에서 F1-2는 인플루엔자 A/H3형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 290번째에서 21개까지의 센스 폴리뉴클레오티드로 구성되고, R1은 동일 유전자의 5' 말단으로부터 929번째에서 20개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있다. AH5-PD-F3/R4에서 F3는 인플루엔자 A/H5형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 671번째에서 20개까지의 센스 폴리뉴클레오티드로 구성되고, R4는 동일 유전자의 5' 말단으로부터 1,221번째에서 18개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있다. M-F2/M-R2 에서 F2는 인플루엔자 A형 바이러스 M 유전자의 5' 말단으로부터 234번째에서 22개까지의 센스 폴리뉴클레오티드로 구성되고, R2는 동일 유전자의 5' 말단으로부터 570번째에서 22개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 상기 프라이머 세트를 인플루엔자 증세를 보이는 환자의 검체를 동물세포 [MDCK (Madin Darby Canine Kidney), ATCC CCL34]에 접종하여 얻은 세포 배양액에 적용하여 RT-PCR을 실시하였다. 이후 A/H1, A/H3, A/H5형 인플루엔자 바이러스에 대한 HA 유전자에 특이적인 RT-PCR, A 및 B형의 인플루엔자 바이러스에 보편적인 RT-PCR을 실시하여 확인하였다.

A형 인플루엔자 바이러스에 대한 아형 특이도를 확인하기 위한 RT-PCR 결과, 상기 프라이머는 A형 바이러스 중 A/H1, A/H3 및 A/H5형을 특이적으로 구분할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 A 및 B형 바이러스의 구분을 위한 RT-PCR 결과에서도, 상기 프라이머는 A 및 B형을 각각 구분할 수 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 프라이머 (올리고 뉴클레오티드)의 서열이 인플루엔자 바이 러스 특히 A/H1, A/H3, A/H5 및 B형 바이러스에 대한 진단을 한번의 시행으로 하나의 시험관내에서 동시에 구분할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 프라이머 (올리고 뉴클레오티드)의 서열은 형 (type) 및 아형 (subtype) 특이적으로 작용하도록 고안된 것이기 때문에, 본 프라이머 제작시 토대로 한 A/H1, A/H3 및 A/H5 아형간의 교차반응은 없으며 이외의 다른 A형 바이러스는 M 유전자에 대한 특이 밴드 (band)만 나타날 것으로 판단되기 때문에 본 발명을 사용할 경우 간과되는 새로운 조류 인플루엔자 바이러스 출현은 없을 것으로 판단된다.

본 발명의 4종의 인플루엔자 바이러스를 하나의 시험관내에서 동시에 진단할 수 있는 프라이머 (올리고 뉴클레오티드)의 서열은 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 DNA를 합성하는 과정인 역전사반응과 상보적인 DNA를 증폭하는 과정인 중합효소반응에 관여하는 효소, dNTP 등의 물질이 포함되어 있으며, 또한 PCR 증폭 후에 산물 (products)을 관찰하기 위해 사용되는 염색시약인 브로모페놀 블루 (Bromophenol blue) / 자일렌 (Xylene) FF (Sigma, St. Louis, MO)을 함유한다.

이하 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 기술한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실시예

실시예 1: 인플루엔자 A형 (A/H1, A/H3, A/H5) 바이러스의 HA 지역에 대한 프라이머의 제작

인플루엔자 A/H1형의 HA 지역에 대응하는 프라이머 A/H1-PD-F6/R2는 각각의 GC 함량이 34.6%, 37.9% 이고 다른 A형 (A/H3 및 A/H5)의 유전자와 상동성이 없도록 고안하였다. 이것은 A/H1형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 156번째에서 20개까지의 센스 폴리뉴클레오티드 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 971번째에서 22개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되도록 합성하였다. 인플루엔자 A/H3형의 HA 지역에 대응하는 프라이머 A/H3-PD-F1-2/R1은 각각의 GC 함량이 40.7%, 34.6% 이고 다른 A형 (A/H1 및 A/H5)의 유전자와 상동성이 없도록 고안하였다. 이것은 A/H3형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 290번째에서 21개까지의 센스 폴리뉴클레오티드 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 929번째에서 20개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되도록 합성하였다. 인플루엔자 A/H5형의 HA 지역에 대응하는 프라이머 A/H5-PD-F3/R4는 각각의 GC 함량이 38.5%, 39.1% 이고 다른 A형 (A/H1 및 A/H3)의 유전자와 상동성이 없도록 고안하였다. 이것은 A/H5형 바이러스 HA 유전자의 5' 말단으로부터 671번째에서 20개까지의 센스 폴리뉴클레오티드 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 1,221번째에서 18개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되도록 합성하였다 (표 1 참조). 표 1은 각각의 프라이머를 구성하는 폴리뉴클레오티드 핵산서열 (센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드) 및 A/H1, A/H3, A/H5 및 B형 인플루엔자 바이러스의 전체 HA 유전자 5' 말단으로부터의 위치 번호를 나타낸다.

[표 1] 인플루엔자 A형 바이러스 (A/H1, A/H3, A/H5) HA 지역에 대한 프라이머

프라이머 명칭	서열번호	방 향	염기서열 (5' -> 3')	각 아형 HA 유전자의 5' 말단으로부터의 위치 번호
AH1-PD-F6	1	센스	ACAGTGACACACTCTGTCAA	156-175
AH1-PD-R2	2	안티센스	ACACTCTCCTATTGTGACTGGG	971-992
AH3-PD-F1-2	3	센스	TGGGAGACCCTCATTGTGATG	290-310
AH3-PD-R1	4	안티센스	TTGGGAATGCTTCCATTTGG	929-948
AH5-PD-F3	5	센스	CCCAACCACCTATATTTCCG	671-690
AH5-PD-R4	6	안티센스	GACCTTATTGGTGACTCC	1221-1238

실시예 2: 인플루엔자 A형 바이러스 M 지역 및 B형 바이러스 NP 지역에 대한 프라이머의 제작

인플루엔자 A형 바이러스의 M 지역에 대응하는 프라이머 M-F2/R2는 각각의 GC 함량이 44.8%, 48.3% 이고 모든 A형 바이러스를 선택할 수 있으며 B형 바이러스와는 상동성이 없도록 고안하였다. 이것은 A형 바이러스 M 유전자의 5' 말단으로부터 234번째에서 22개까지의 센스 폴리뉴클레오티드 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 570번째에서 22개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되도록 합성하였다. 인플루엔자 B형 바이러스의 NP 지역에 대응하는 프라이머 BNP-PD-F2/R2는 각각의 GC 함량이 39.1%, 33.3% 이고 모든 B형 바이러스를 선택할 수 있으며 A형 바이러스와는 상동성이 없도록 고안하였다. 이것은 B형 바이러스의 NP 유전자의 5' 말단으로부터 498번째에서 18개까지의 센스 폴리뉴클레오티드 및 동일 유전자의 5' 말단으로부터 1,494번째에서 21개까지의 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되도록 합성하였다 (표 2 참조). 표 2는 각각의 프라이머를 구성하는 폴리뉴클레오티드 핵산서열 (센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드) 및 A형 인플루엔자 바이러스 전체 M 유전자의 5' 말단 및 B형 바이러스 전체 NP 유전자의 5' 말단으로부터 선택된 위 치 번호를 나타낸다.

[표 2] 인플루엔자 A형 바이러스 M 지역 및 B형 바이러스 NP 지역에 대한 프라이머

프라이머 명칭	서열번호	방 향	염기서열 (5' -> 3')	각 아형 5' 말단으로부터의 위치 번호
M-F2	7	센스	AGTGAGCGAGGACTGCAGCGTA	234-255
M-R2	8	안티센스	TAGCYTTAGCYGTRGTGCTGGC	570-591
BNP-PD-F2	9	센스	CACAACAAAACAGGAGGC	498-515
BNP-PD-R2	10	안티센스	CAGCATTCTTCTTACAGCTTG	1494-1514

상기 표 1 및 표 2의 각각의 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드는 동일 분량으로 나누어 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.

실시예 3: 인플루엔자 A형 (A/H1, A/H3, A/H5) 바이러스 HA 지역에 대한 프라이머를 이용한 RT-PCR

상기 실시예 1에서 제작된 각 프라이머 중 A/H1형 바이러스에 대해서는 서열번호 1과 2의 센스 및 안티센스 프라이머를, A/H3형 바이러스에 대해서는 서열번호 3과 4의 센스 및 안티센스 프라이머를, A/H5형 바이러스에 대해서는 서열번호 5와 6의 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하여 RT-PCR 반응을 각각 실시하였다. 인플루엔자 바이러스는 세계보건기구 인플루엔자 협력센타인 미국 질병관리예방센타로부터 분양 받은 인플루엔자 바이러스 백신주 (A/H1형: A/Beijing/262/95-유사주, A/Bayern/7/95-유사주, A/New Caledonia/20/99-유사주, A/H3형: A/Sydney/5/97-유사주, A/Panama/2007/99-유사주, A/Wyoming/3/2003-유사주, B형: B/Beijing/243/97-유사주, B/Sichuan/379/99-유사주, B/Hong Kong/330/2001-유사주, B/Brisbane/32/2002-유사주) 및 대한민국 질병관리본부 국립보건원 호흡기바이 러스과에 보관중인 인플루엔자 바이러스 분리주 (A/H1, A/H3, B)를 사용하였다. A/H5형의 경우 미국 질병관리예방센타 및 국립수의과학검역원으로부터 분양받은 분리주 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)를 이용하였다. A/H1형, A/H3형 및 B형 인플루엔자 바이러스는 MDCK 동물세포에 감염시키고 감염 후 세포병변효과가 나타난 것을 이용하였으며 A/H5형 바이러스는 유정란에 배양하여 얻어진 상층액을 이용하였다. 이후 바이러스 배양액으로부터 Viral RNA (Qiagen, CA, USA) 키트를 이용하여 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 RNA 5~10 ㎕ 를 상기 프라이머가 포함된 RT-PCR 키트를 이용하여 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 조정한 후 RT-PCR을 수행하였다. 역전사 반응은 42℃에서 1시간동안 수행되었고, 95℃에서 3분간 가열한 후, 94℃에서 1분, 61℃에서 1분, 72℃에서 1분간의 증폭반응을 35회 반복한 후 72℃에서 5분간 반응시켰다. 모든 반응에는 음성대조군으로 증류수를 사용하였다 (도 1a 내지 도 1c 참조). 도 1a 내지 도 1c는 인플루엔자 A형 (A/H1, A/H3, A/H5) 바이러스의 HA (hemagglutinin) 지역에 대한 각각의 프라이머만을 이용한 RT-PCR 반응 결과 사진이다. 도 1a 내지 도 1c에서 확인되는 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 3 세트의 프라이머는 A/H1, A/H3, A/H5형 바이러스의 HA 유전자에 특이적인 산물 (837 bp, 658 bp, 568 bp)들을 각각 증폭시켰으며 각 아형간의 비특이 반응은 나타나지 않았다.

도 1a는 인플루엔자 A/H1형 바이러스의 HA 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 (size marker) 이며, 1번에서 5번까지 레인 (lane)들은 상기 기술된 3개의 A/H1형 바이러스 백신주 및 2개의 국내 분리주 에 대한 반응이며, 6번 레인은 A/H3형 바이러스(A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 7번 레인은 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 8번 레인은 B형 바이러스 (B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 9번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

도 1b는 인플루엔자 A/H3형 바이러스 HA 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번에서 5번까지 레인들은 상기 기술된 3개의 A/H3형 바이러스 백신주 및 2개의 국내 분리주에 대한 반응이며, 6번 레인은 A/H1형 바이러스 (A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 7번 레인은 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 8번 레인은 B형 바이러스 (B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 9번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

도 1c는 인플루엔자 A/H5형 바이러스의 HA 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커이며, 1번에서 4번까지 레인들은 상기 기술된 2개의 A/H5형 바이러스에 대한 반응이며, 5번 레인은 A/H1형 바이러스 (A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 6번 레인은 A/H3형 바이러스(A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 7번 레인은 B형 바이러스 (B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 8번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

실시예 4: 인플루엔자 A형 바이러스 M (Matrix) 지역 및 B형 바이러스 NP (nucleoprotein) 지역에 대한 RT-PCR

상기 실시예 2에서 제작된 각 프라이머 중 A형 바이러스에 대해서는 서열번호 7과 8의 센스 및 안티센스 프라이머를, B형 바이러스에 대해서는 서열번호 9와 10의 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하여 RT-PCR 반응을 실시하였다. 인플루엔자 바이러스는 상기 실시예 3에서 사용한 A/H1, A/H3, A/H5, B형 바이러스들을 사용하였다. RNA 추출 및 RT-PCR 방법은 상기 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 실시하였다 (도 2 및 도 3 참조). 도 2는 인플루엔자 A형 바이러스 M 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다. 상기 반응 결과, 도 2에서 나타낸 바와 같이 상기 실시예 2에서 제작한 M 유전자에 대한 프라이머 (M-F2, M-R2)는 A형 바이러스의 M 유전자에 특이적인 산물 (358 bp)을 모두 증폭시켰으며 B형과의 비특이 반응은 관찰되지 않았다. 도 2에서 M은 1kb DNA 사이즈 마커이며, 1번에서 3번까지 레인들은 A/H1형 바이러스 (A/Beijing/262/95-유사주, A/Bayern/7/95-유사주, A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 4번에서 6번까지 레인들은 A/H3형 바이러스 (A/Sydney/5/97-유사주, A/Panama/2007/99-유사주, A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 7번에서 9번까지 레인들은 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 10번에서 11번까지 레인들은 B형 바이러스 (B/Sichuan/379/99-유사주, B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 12번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

도 3은 인플루엔자 B형 바이러스의 NP 지역에 대한 프라이머만을 이용한 RT-PCR 결과 사진이다. 상기 반응 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 실시예 2에서 제작한 M 유전자에 대한 프라이머 (BNP-PD-F2, BNP-PD-R2)는 B형 바이러스의 NP 유 전자에 특이적인 산물 (1,017 bp)을 모두 증폭시켰으며 A형과의 비특이 반응은 관찰되지 않았다. 도 3에서 M은 1kb DNA 사이즈 마커이며, 1번에서 5번까지 레인들은 상기 실시예 3에서 기술된 4개의 B형 인플루엔자 백신주 (B/Beijing/243/97-유사주, B/Sichuan/379/99-유사주, B/Hong Kong/330/2001-유사주, B/Brisbane/32/2002-유사주)와 1개의 B형 인플루엔자 바이러스 국내 분리주에 대한 반응이며, 6번 레인은 A/H1형 바이러스 (A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 7번 레인은 A/H3형 바이러스(A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 8번 레인은 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 9번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

실시예 5 : 원-스텝, 싱글-튜브, 멀티플렉스 (One-step, single-tube, multiplex) RT-PCR 프라이머를 이용한 인플루엔자 바이러스에 대한 형 및 아형 진단

상기 실시예 3 및 실시예 4의 결과에서 각 프라이머 세트가 각 아형에 특이적으로 작용함이 확인됨에 따라 상기 10개의 프라이머를 동시에 하나의 시험관내에 혼합한 경우에도 이들 프라이머가 특이적으로 작용하는지 조사하기 위하여 상기 실시예 3과 동일한 조건으로 반응시켰다 (도 4 참조). 도 4는 인플루엔자 바이러스 형 및 아형(A/H1, A/H3, A/H5, B형)을 진단하기 위해 10종의 프라이머를 동시에 원-스텝, 싱글-튜브, 멀티플렉스 (one-step, single-tube, multiplex) RT-PCR 방법으로 반응시킨 결과 사진이다. 상기 반응 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 10개의 프라이머를 동시에 반응시켰을때도 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 및 M 유전자, 그리고 B형 바이러스의 NP 유전자에 대해 특이적인 산물을 모두 증폭시켰으며 각각의 아형 및 형 간의 비특이 반응은 나타나지 않았다. 도 4에서 M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 A/H1형 바이러스(A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 2번 레인은 A/H3형 바이러스(A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 3번 레인은 A/H5형 바이러스(A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 4번 레인은 B형 바이러스(B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 5번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

실시예 6 : 원-스텝, 싱글-튜브, 멀티플렉스 (One-step, single-tube, multiplex) RT-PCR용 프라이머를 이용한 인플루엔자 바이러스에 대한 형 및 아형 진단 시험의 검출 농도 한계

상기 실시예 5의 결과에서 상기 총 10개의 프라이머가 멀티플렉스 (multiplex) RT-PCR을 위한 반응에 적합함이 확인됨에 따라 멀티플렉스 (multiplex) RT-PCR 용 프라이머를 이용했을 때의 각 바이러스 형에 따른 검출 농도 한계 (detection limit)를 조사하였다 (도 5a 내지 도 5d 참조). 도 5a 내지 도 5d에서 확인되는 바와 같이, 각 아형의 주형으로 작용하는 RNA의 농도를 희석하여 상기 실시예 5에서와 동일한 방법으로 반응시킨 결과, 바이러스 형(type)에 따라 검출 농도 한계가 다양한 것으로 나타났다. 이 검출 한계는 동일한 바이러스 형이라도 바이러스 주 (strain)에 따라 다양하게 나타날 것으로 본다. 도 5a는 인플루엔자 A/H1형 바이러스 (A/New Caledonia/20/99-유사주) 유전자를 희석하여 각 농도별로 RT-PCR을 실시한 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 A/H1형 바이러스 유전자 (RNA)의 총 농도가 22.06 ng 일때의 반응이며, 2번부터 14번까지의 레인들은 이 농도로부터 2배 희석된 농도의 RNA에 대한 반응이며, 15번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다. 이 반응에서는 RNA의 총 농도가 약 0.02 ng인 12번 레인까지 전기영동 상에서 A/H1형에 특이적인 PCR 산물이 검출 되었다.

도 5b는 인플루엔자 A/H3형 바이러스 (A/Wyoming/3/2003-유사주) 유전자를 희석하여 각 농도별로 RT-PCR을 실시한 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 A/H3형 바이러스 총 유전자 (RNA)의 농도가 7.6 ng 일때의 반응이며, 2번부터 8번까지의 레인들은 이 농도로부터 2배 희석된 농도의 RNA에 대한 반응이며, 9번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다. 이 반응에서는 RNA의 총 농도가 약 0.24 ng인 6번 레인까지 전기영동 상에서 A/H3형에 특이적인 PCR 산물이 검출 되었다.

도 5c는 인플루엔자 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03) 유전자를 희석하여 각 농도별로 RT-PCR을 실시한 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 A/H5형 바이러스 총 유전자 (RNA)의 농도가 202.6 ng 일때의 반응이며, 2번부터 13번까지의 레인들은 이 농도로부터 2배 희석된 농도의 RNA에 대한 반응이며, 14번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다. 이 반응에서는 RNA농도가 약 3.2 ng인 7번 레인까지 전기영동 상에서 A/H5형에 특이적인 PCR 산물이 검출 되었다.

도 5d는 인플루엔자 B형 바이러스 (B/Hong Kong/330/2001-유사주) 유전자를 희석하여 각 농도별로 RT-PCR을 실시한 사진이다. M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 B형 바이러스 유전자 (RNA)의 총 농도가 1.4 ㎍ 일때의 반응이며, 2번부터 15번까지의 레인들은 이 농도로부터 2배 희석된 농도의 RNA에 대한 반응이며, 16번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다. 이 반응에서는 RNA의 총 농도가 약 2.7 ng인 10번 레인까지 전기영동 상에서 B형에 특이적인 PCR 산물이 검출 되었다.

실시예 7: 특이도 (specificity) 분석

상기 총 10개의 프라이머에 대한 특이도를 분석하기 위해 인플루엔자 바이러스 외에 호흡기 질환을 유발하는 주요 바이러스를 주형으로 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 사용된 바이러스는 아데노 바이러스 (ATCC VR-5), 파라인플루엔자 바이러스 1형 (ATCC VR-94), 파라인플루엔자 바이러스 2형 (ATCC VR-92), 파라인플루엔자 바이러스 3형 (ATCC VR-93), RSV (Respiratory syncytial virus) (ATCC VR-26) 홍역 바이러스 (ATCC VR-24), 유행성 이하선염 바이러스(ATCC VR-1379), 풍진 바이러스(ATCC VR-1359) 이며 이들 바이러스는 모두 미국의 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. 도 6은 상기 프라이머들을 인플루엔자 이외의 기타 호흡기 바이러스에 적용 했을때의 특이도를 나타내는 사진이다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머는 인플루엔자 바이러스에만 특이적으로 작용하고 이외의 호흡기 질환 유발 바이러스에 대한 교차 반응은 나타나지 않았다. 따라서 본 발명을 인플루엔자 바이러스에 대한 형 및 아형 진단에 적용할 수 있다. 도 6에서, M은 1kb DNA 사이즈 마커 이며, 1번 레인은 A/H1형 바이러스 (A/New Caledonia/20/99-유사주)에 대한 반응이며, 2번 레인은 A/H3형 바이러스(A/Wyoming/3/2003-유사주)에 대한 반응이며, 3번 레인은 A/H5형 바이러스 (A/H5N1 : A/Ch/Korea/ES03)에 대한 반응이며, 4번 레인은 B형 바이러스(B/Hong Kong/330/2001-유사주)에 대한 반응이며, 5번에서 7번 까지의 레인들은 각각 파라인플루엔자 바이러스 1형, 2형 및 3형 바이러스에 대한 반응이며, 8번 레인은 RSV (Respiratory syncytial virus)에 대한 반응이며, 9번 레인은 아데노 바이러스에 대한 반응이며, 10번 레인은 홍역 바이러스에 대한 반응이며, 11번 레인은 유행성 이하선염 바이러스에 대한 반응이며, 12번 레인은 풍진 바이러스에 대한 반응이며, 13번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

실시예 8: 인플루엔자 바이러스 분리주에 대한 적용 (evaluation)

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 국내에서 인플루엔자 증세를 보이는 환자로부터 세포배양을 통해 분리된 인플루엔자 바이러스에 적용시켜 그 효능을 평가 하였다. 상기 실시예 5와 동일한 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. 단, 이때 사용된 RNA는 국내 분리주 중 A/H1, A/H3, A/H5, B형을 사용하였다 (도 7 참조). 도 7은 본 발명의 프라이머 세트를 국내 분리주에 적용시킨 RT-PCR 사진 결과이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 10개의 프라이머를 원-튜브, 싱글-스텝 (one-tube, single-step)으로 멀티플렉스 (multiplex) RT-PCR을 수행 했을 경우에도 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 및 M 유전자, 그리고 B형 바이러스의 NP 유전자에 대해 특이적인 산물을 모두 증폭시켰으며 각각의 아형 및 형 간의 비특이 반응은 나타나지 않았다. 도 7에서, M은 1kb DNA 사이즈 마커이며, 1번에서 3번 레인들은 A/H1형으 로 확인된 3개의 인플루엔자 바이러스 분리주에 대한 반응이며, 4번에서 6번 레인들은 A/H3형으로 확인된 3개의 인플루엔자 바이러스 분리주에 대한 반응이며, 7번 레인은 A/H5형 바이러스에 대한 반응이며, 8번에서 10번 레인들은 B형으로 확인된 3개의 인플루엔자 바이러스 분리주에 대한 반응이며, 11번 레인은 음성 대조군에 대한 반응 결과를 나타낸다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 인플루엔자 A형 바이러스의 HA 유전자와 M 유전자 및 인플루엔자 B형 바이러스의 NP 유전자에 대해서 선택된 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 총 10개 프라이머 (올리고 뉴클레오티드) 서열 및 이를 이용하여 4종의 인플루엔자 바이러스를 동시에 진단할 수 있다. 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 HA 유전자 특성에 의해 아형 구분이 가능하며 동시에 M 유전자의 특성에 의해 모든 A형 인플루엔자 바이러스를 진단할 수 있으므로 새로운 조류 인플루엔자 바이러스의 출현에 따른 조기 진단 및 국가 방역 대책 자료에 널리 활용될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4으로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머 세트.
역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 이용한 인플루엔자 바이러스 검출방법에 있어서, 제 1항의 프라이머 세트들을 이용한 역전사 중합효소연쇄반응으로 인플루엔자 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출방법.
제 2항에 있어서, 제 1항의 프라이머 세트들을 이용한 역전사 중합효소연쇄반응으로 A/H1, A/H3, A/H5 및 B형의 인플루엔자 바이러스를 동시에 검출함을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출방법.
역전사 중합효소연쇄반응에 이용되는 프라이머 세트, 역전사 효소, DNA 중합효소, DNA 염색 시약 및 적합한 담체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물에 있어서, 프라이머 세트가 제 1항의 프라이머 세트임을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.
역전사 중합효소연쇄반응에 이용되는 프라이머 세트, 역전사 효소, DNA 중합효소, DNA 염색 시약 및 적합한 담체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출키트에 있어서, 프라이머 세트가 제 1항의 프라이머 세트임을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 검출키트.