KR101662312B1

KR101662312B1 - 한국의 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101662312B1
Application number: KR1020140162447A
Authority: KR
Inventors: 김하현; 양동군; 송재영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2016-10-10
Also published as: KR20160060830A

Abstract

본 발명은 한국의 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 특이적인 6가지의 프라이머를 포함함으로써 역전사고리매개등온증폭을 통해 한국의 야외 광견병바이러스를 광견병바이러스 백신주 또는 고정주로부터 구분하여 검출할 수 있도록 하는 프라이머 세트에 관한 것이며, 또한 이 프라이머 세트를 포함하는 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물, 키트 및 이 프라이머 세트를 사용하는 야외 광견병바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트, 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물, 역전사고리매개등온증폭 키트 및 야외 광견병바이러스 검출 방법을 사용하면, 광견병바이러스를 매우 간편하고 빠르게 검출할 수 있다. 특히 광견병 백신주나 고정주로부터 구분하여 검출할 수 있을 뿐만 아니라 민감도 또한 매우 높아, 광견병바이러스를 예방 또는 관리하는데 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

한국의 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이의 이용{Primer set for reverse transcription loop-medicated isothermal amplification(RT-LAMP) for rapid detection of Korean field rabies virus, and uses there of}

본 발명은 한국의 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 특이적인 6가지의 프라이머를 포함함으로써 역전사고리매개등온증폭을 통해 한국의 야외 광견병바이러스를 광견병바이러스 백신주 또는 고정주로부터 구분하여 검출할 수 있도록 하는 프라이머 세트에 관한 것이며, 또한 이 프라이머 세트를 포함하는 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물, 키트 및 이 프라이머 세트를 사용하는 야외 광견병바이러스 검출 방법에 관한 것이다.

광견병(Rabies)은 급성뇌염을 유발하는 신경친화성 바이러스인 광견병바이러스(Rabies virus)에 의해 발생하는 질병으로 발병 시 100% 가까운 높은 치사율을 나타내는 치명적인 인수공통전염병이다. 따라서 사람에서는 제3군 법정감염병, 수의분야에서는 제2종 법정가축전염병으로 분류되어 관리되고 있고, 국제적으로는 사람과 동물에서 광견병 발생 시 세계보건기구(WHO) 및 세계 동물보건기구(OIE)에 의무적으로 보고해야하는 질병이다.

전세계적으로 연간 55,000명의 사람이 공수병에 의해 사망하고 1,500만명이 교상 후 처치(post-exposure prophylaxis, PEP)를 받고 있다. 특히 공수병 사망의 95% 이상이 아시아와 아프리카지역에서 발생하고 있는데 대부분 광견병에 걸린 개가 교상을 일으켜 발생하고 있다. 전세계적으로 영국, 포르투갈, 아일랜드, 호주, 뉴질랜드, 괌, 하와이 등에서 광견병이 발생하지 않고 있고, 아시아에서는 일본, 홍콩, 싱가포르, 말레이시아에서 광견병이 발생하지 않고 있다. 최근까지 광견병 비발생국이었던 대만에서 2013년 야생동물인 족제비오소리에 의해 광견병이 발생하면서 청정국 지위를 상실하였다.

국내에서는 광견병이 1907년에 최초로 확인된 이후로 2013년 현재까지 16,146건이 보고되고 있다. 1940년대까지 개를 포함한 여러 동물에서 매년 400 ~ 700건의 광견병이 발생하였고, 1970년대에는 개와 가축에 불활화백신을 적용하면서 발생건수가 감소하였다. 그리고 1984년부터 1992년까지는 광견병 백신 대량 접종정책, 방견 제거 및 홍보와 같은 적극적인 광견병 방역정책으로 광견병이 발생하지 않았다. 그러나 1993년 철원에서 재발생한 이후로 너구리와 같은 야생동물의 의해 광견병이 지속적으로 발생하고 있다. 2012년에는 강원도 및 경기도 화성에서 7건의 광견병이 발생하였고 2013년에는 경기도 화성지역에서만 6건이 발생하였다.

광견병은 모든 온혈동물에 감수성이 있으나 전세계적으로 개, 너구리, 늑대, 여우, 스컹크, 담비, 족제비, 몽구스, 자칼, 코요테, 박쥐 등이 주요 매개체 역할을 하고 있다. 전파양식에 따라 광견병은 도시형(urban type)과 산림형(sylvatic type)으로 나뉘는데, 도시형은 사람과 생활영역을 공유하는 개 등의 가축이 주요 매개체가 되는 형태로 주로 개발도상국에서 발생하고, 산림형은 야생동물이 주된 매개체 역할을 하는 형태로 개 등의 가축에서 방역정책이 잘 이루어지고 있는 우리나라를 포함한 대부분의 선진국에서 발생하고 있다. 국내 광견병은 주로 야생너구리에 의해 개와 소가 교상을 입어 발생하고 있는데, 이를 방제하기 위해 개 등의 가축에 백신을 접종할 뿐만 아니라 야생동물의 광견병 억제를 위해 2000년 이후로 매년 봄과 가을에 미끼백신을 위험지역에 살포하고 있다.

광견병에 걸린 동물의 뇌에서 바이러스가 증식한 후 신경분지를 따라 말초부위로 이동하게 되는데, 특히 침샘에서 바이러스가 다량 배출되면서 교상으로 다른 동물에게 전파하게 된다. 광견병은 교상 위치, 바이러스의 종류와 양, 숙주동물의 감수성, 동물의 면역상태, 상처 정도 등에 따라서 잠복기가 다양할 수 있는데 최대 잠복기가 6개월인 것으로 알려져 있다. 광견병의 임상증상은 크게 광폭형(furious form)과 마비형(paralytic form)으로 나뉘는데, 개의 경우는 증상이 대개 3 ~ 7일간 지속되다가 대부분 10일 이내에 죽게 되고, 고양이의 경우는 개와 유사한 증상을 보이지만 광폭형으로 경과하는 경우가 많고 1 ~ 4일 이내로 폐사하게 된다. 소가 감염되면 흥분 및 공격성이 높아지고 임상증상 발현 후 3 ~ 6일 이내에 폐사하게 된다. 이렇듯 광견병에 감염된 후 임상증상이 발현되면 대부분의 동물은 사망하게 된다.

광견병의 원인체인 광견병바이러스는 Rhabdoviridae 과, Lyssavirus 속에 속하는 신경친화성 바이러스로 단일 가닥의 negative-sense RNA를 핵산으로 가지고 있다. 이 광견병바이러스 RNA는 nucleoprotein(N), phosphoprotein(P), matrix protein(M), glycoprotein(G), RNA-dependent RNA polymerase 또는 large protein(L)을 발현하는 5개의 유전자로 이루어져 있다. 이 중 N유전자는 광견병바이러스간 유전자 서열의 상동성이 높아 광견병바이러스 검출 및 계통학적 분석에 주로 사용된다.

광견병은 형광항체법(fluorescent antibody test, FAT), 바이러스 분리법(virus isolation), 마우스 접종시험(Mouse inoculation test, MIT), 신속면역진단기법(Rapid immunodiagnostic test, RIDT), 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR), 조직검사법(histological test) 등을 통해 진단된다. 확진방법인 형광항체법(FAT)과 더불어 보조적인 신속진단법으로 사용되고 있는 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR)은 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extention)의 세 가지 온도단계로 변화를 주어야 하므로 반응시간이 1 ~ 3시간으로 길고 증폭된 유전자를 전기영동을 통해 확인해야 하며 특정 유전자의 서열 2곳을 인식하는 프라이머쌍을 이용하기 때문에 위양성 및 위음성을 배제하기 위한 면밀한 검토가 필요하다.

한편 고리매개등온증폭법(loop-medicated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 중합효소연쇄반응법(PCR)과는 달리 strand displacement activity가 높은 Bst polymerase를 사용하여 3단계의 온도변화 없이 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하기 때문에 반응 시간이 1시간이내로 짧고, 온도변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없으며, 일정온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요없어 현장 활용성이 높다. 또한 증폭하고자 하는 유전자 서열의 6개 부위를 인지하는 특이적인 4개 프라이머를 이용하기 때문에 표적 유전자에 대한 특이성이 매우 높다.

최근 필리핀, 브라질, 잠비아 지역에서 광견병바이러스에 대한 역전사고리매개등온증폭법(reverse transcription loop-medicated isothermal amplification, (RT-LAMP)이 연구되어 보고된 바 있으나, 국내 야외 광견병바이러스를 특이적으로 검출하는 역전사고리매개등온증폭법에 대한 보고가 없다.

이에 본 발명자들은 한국의 야외 광견병바이러스를 신속히 검출할 수 있고 별도의 역전사효소 및 증폭확인 단계가 필요없는 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 발명하였다.

대한민국 등록특허 제10-1073984호 대한민국 등록특허 제10-1159806호

따라서 본 발명의 주된 목적은 한국의 야외 광견병바이러스를 간편한 방법으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 역전사고리매개등온증폭법을 위한 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제1프라이머'라 한다), 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제2프라이머'라 한다), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제3프라이머'라 한다), 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제4프라이머'라 한다), 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제5프라이머'라 한다) 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머(이하, '제6프라이머'라 한다)를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP) 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에서 상기 6가지의 프라이머는 광견병바이러스의 N 유전자에서 각각 6곳의 표적서열을 인식한다. 제1프라이머와 제2프라이머는 외부 프라이머(outer primer), 제3프라이머와 제4프라이머는 내부 프라이머(inner primer), 그리고 제5프라이머와 제6프라이머는 증폭반응을 가속화시켜주는 루프 프라이머(loop primer)로 작용한다.

본 발명의 프라이머 세트는 현재 국내에서 사용되고 있는 광견병 백신주(ERA)나 고정주(CVS11)와 일부 염기서열이 달라 한국의 광견병바이러스 야외주를 이들로부터 구분하여 검출할 수 있다. 백신주나 고정주는 광견병바이러스의 예방을 위해 사용되는 것이므로, 광견병바이러스를 확실하게 관리하여 예방 및 퇴치하기 위해서는 반드시 이들로부터 야외 광견병바이러스를 구분할 수 있어야 한다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 역전사고리매개등온증폭법을 수행하면 야외 광견병바이러스를 백신주나 고정주로부터 구분하여 검출할 수 있으므로, 광견병바이러스의 관리에 매우 우수한 효과를 나타내는 것이라 할 수 있다. 또한 ERA주의 G 유전자에서 병원성에 중요한 333번째 아미노산인 아르기닌을 글루탐산으로, 194번째 아미노산인 아스파라긴을 세린으로 치환하여 안전성과 면역원성을 향상시킨 ERAGS주는 현재 개발 중인 새로운 미끼백신주로써 추후에 한국의 야생동물을 대상으로 야외에 살포될 예정이다. 따라서 향후 본 발명의 프라이머 세트가 미끼백신주인 ERAGS주를 한국 광견병바이러스 야외주와 감별하는데에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지를 추가 구성할 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등이 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물을 제공한다.

이때 반응용액 조성물에는 제1프라이머 및 제2프라이머가 각각 0.1 ~ 0.5 pmole/㎕, 제3프라이머 및 제4프라이머가 각각 1.6 ~ 2.5 pmole/㎕, 제5프라이머 및 제6프라이머가 각각 0.1 ~ 1.6 pmole/㎕의 농도로 함유되는 것이 야외 광견병바이러스의 효율적인 검출을 위해 바람직하다.

본 발명의 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물에는 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 또는 반응완충액(buffer)이 더 함유될 수 있다. 광견병바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 증폭을 위해서는 역전사(reverse transcription)과정이 추가된 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)이 이용되어야 한다. 따라서 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst polymerase 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA polymerase를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지 화합물이 더 함유될 수 있다. 이때 검출용 표지 화합물은 증폭과정에서 증폭산물에 포함되거나 증폭산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물일 수 있다. 본 발명에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreenㄾ과 같은 fluorescent DNA binding dye를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물을 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 키트를 제공한다. 반응용액 조성물에 역전사고리매개등온증폭을 위한 중합효소(polymerase), dNTP 또는 반응완충용액이 함유되어 있지 않을 경우, 이들이 별도로 포함될 수 있으며, 이외에도 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 상기 RNA를 주형으로 하고, 제1프라이머, 제2프라이머, 제3프라이머, 제4프라이머, 제5프라이머 및 제6프라이머를 이용하여 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는 단계; 및 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출 방법을 제공한다.

이때 역전사고리매개등온증폭 반응액 중 제1프라이머 및 제2프라이머가 각각 0.1 ~ 0.5 pmole/㎕, 제3프라이머 및 제4프라이머가 각각 1.6 ~ 2.5 pmole/㎕, 제5프라이머 및 제6프라이머가 각각 0.1 ~ 1.6 pmole/㎕의 농도가 되도록 하는 것이 야외 광견병바이러스의 효율적인 검출을 위해 바람직하다.

또한, 검출의 편의성을 높이기 위해 프라이머에 검출용 표지를 추가하거나 별도의 검출용 표지 화합물을 사용할 수 있다. 이들 중에서도 본 발명에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreenㄾ과 같은 fluorescent DNA binding dye를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우 반응액 중 형광염색제을 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 실시간으로 증폭을 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 형광염색제를 검출할 수 있는 장비 중에는 현재 휴대가 용이하도록 가볍고 작은 크기로 이루어진 장비들이 있어 이러한 장비를 이용하여 본 발명의 검출방법을 수행하면 야외에서도 즉시 광견병바이러스 검출이 가능하다.

본 발명의 역전사고리매개등온증폭 반응용 프라이머 세트는 특이적으로 광견병바이러스만 검출할 뿐만 아니라 광견병 양성 뇌조직 샘플에서 추출한 RNA에 적용하였을 때, 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)에 비해 약 100배의 더 높은 민감도로 광견병바이러스 RNA를 검출할 수 있다. 또한 상기에서 언급한 바와 같이 한국 광견병바이러스를 광견병 백신주(ERA), 미끼백신주(ERAGS)나 고정주(CVS11)와 감별할 수 있어서 특이적으로 야외주를 검출하는데 유용하다.

따라서 본 발명의 특이적인 프라이머 세트를 이용한 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)은 야외에서 광견병바이러스를 특이적으로 신속하게 진단이 필요할 때, 신속면역진단기법(Rapid immunodiagnostic test, RIDT) 보다는 민감하고 정확하게, 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR) 보다는 민감하고 신속하게 검출할 수 있는 신속성과 편이성이 높은 광견병 보조적 신속진단법으로 매우 활용도가 높을 것으로 기대된다.

본 발명에 따른 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트, 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물, 역전사고리매개등온증폭 키트 및 야외 광견병바이러스 검출 방법을 사용하면, 광견병바이러스를 매우 간편하고 빠르게 검출할 수 있다. 특히 광견병 백신주나 고정주로부터 구분하여 검출할 수 있을 뿐만 아니라 민감도 또한 매우 높아, 광견병바이러스를 예방 또는 관리하는데 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 한국 광견병바이러스 N 유전자 염기서열 정보 및 본 발명의 각 프라이머가 인식하는 6곳의 위치를 나타낸 도면이다.
도 2는 6가지 프라이머 세트를 사용하여 광견병바이러스 RNA를 대상으로 RT-LAMP를 수행한 결과이다. 5번 세트의 증폭효과가 가장 우수하며 그 다음으로 4, 6, 2, 1, 3번 세트의 순서인 것을 보여준다.
도 3은 다양한 다른 병원체 바이러스[canine distemper virus(CDV), canine parainfluenza virus(CPiV), canine adenovirus type 2(CAdV-2), canine parvovirus(CPV), Japanese encephalitis virus(JEV), Akabane virus(AKV), Aujeszky's disease virus(ADV), negative control(DDW)]와 광견병바이러스[rabies virus(RABV)]에 본 발명의 프라이머 세트를 적용하였을 때 광견병바이러스만을 특이적으로 검출하는 것을 보여주는 결과이다.
도 4는 루프 프라이머(RVLF 및 RVLB)의 첨가농도별 증폭반응을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명 프라이머 세트의 바이러스 RNA 농도별 검출한계를 RT-PCR 검사법과 비교하여 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명 프라이머 세트가 실험실에서 사용되는 고정주(CVS11)나 백신주(ERA)는 검출하지 않고 한국 광견병바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 광견병 양성 뇌유제액 7종[개 뇌유제액 3종(KRVC1303, KRVC1304, KRVC1305), 너구리 뇌유제액 1종(KRVR1207), 고양이 뇌유제액 1종(KRVF1301), 소 뇌유제액 2종(KRVB1206, KRVB1302)]과 음성 소 뇌유제액에 본 발명의 프라이머 세트를 적용하여 야외주 광견병바이러스를 검출하는 것을 보여주는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 프라이머 세트의 작성

한국형 광견병바이러스를 역전사고리매개등온증폭법(이하 'RT-LAMP'로 약기)을 통해 검출하기 위하여 도 1과 같이 N 유전자의 표적서열 6곳을 인식하는 외부 프라이머(outer primer)(RVF3, RVB3, RVB3-1), 내부 프라이머(inner primer)[RVFIP(F1c+F2), RVFIP(F1c+F2)-1, RVFIP(F1c+F2)-2, RVFIP(F1c+F2)-3, RVFIP(F1c+F2)-4, RVBIP(B1c+B2)] 및 증폭반응을 가속화시켜주는 루프 프라이머(loop primer)(RVLF, RVLB)를 PrimerExplorer V4를 이용하여 작성하였다(표 1 참조).

서열번호	프라이머 이름	염기서열(5' - 3')
1	RVF3	AAGAATGTTTGAGCCAGGG
2	RVB3	TTTCCCGAAGAACTCCTCT
7	RVB3-1	CGAAGAACTCCTCTCCCA
3	RVFIP(F1c+F2)	ACATGACCAACTGCATTTGACGTTCACTTCCGTTCACTGG
8	RVFIP(F1c+F2)-1	ACATGACCAACTGCATTTGACGTCATTCACTTCCGTTCACTG
9	RVFIP(F1c+F2)-2	ACATGACCAACTGCATTTGACGATTCACTTCCGTTCACTGG
10	RVFIP(F1c+F2)-3	ACATGACCAACTGCATTTGACGTTCATTCACTTCCGTTCACT
11	RVFIP(F1c+F2)-4	ACATGACCAACTGCATTTGACGCATTCACTTCCGTTCACTGG
4	RVBIP(B1c+B2)	TGTCGGATGTTATATGGGGCAAACAGACATCTCATGGGGAG
5	RVLF	AAGGGGACTTCCCACTCA
6	RVLB	AACAGTCATTGCTGCATGTG

실시예 2. RT-LAMP 반응조건 확립 및 광견병바이러스 특이적 검출 확인

상기 실시예 1에서 작성한 각 프라이머를 합성한 다음, 표 2와 같은 조합으로 프라이머 세트를 설정하였다.

프라이머 세트 번호	프라이머 조합(서열번호)
1	1, 2, 8, 4
2	1, 7, 8, 4
3	1, 2, 9, 4
4	1, 2, 10, 4
5	1, 2, 3, 4
6	1, 2, 11, 4

각 프라이머 세트를 포함하는 반응용액을 표 3에 나타낸 것과 같이 isothermal master mix 15㎕, 5 pmole/㎕의 외부 프라이머 각각 1㎕, 50 pmole/㎕의 내부 프라이머 각각 1㎕, 20 pmole/㎕의 루프 프라이머 각각 0.5㎕, 바이러스 RNA 5㎕를 혼합하여 최종 25㎕가 되게 만들었다.

반응용액 구성성분	용량	반응조건
Isothermal master mix	15㎕	65℃, 1시간
RVF3(5 pmole/㎕)	1㎕
RVB3(5 pmole/㎕)	1㎕
RVFIP(F1c+F2)(50 pmole/㎕)	1㎕
RVBIP(B1c+B2)(50 pmole/㎕)	1㎕
RVLF(20 pmole/㎕)	0.5㎕
RVLB(20 pmole/㎕)	0.5㎕
RNA	5㎕
총	25㎕

Bst DNA polymerase보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA Polymerase을 포함하는 Isothermal Master Mix Iso-001(Optigene, UK)를 사용하여 별도의 역전사(reverse transcription)과정 없이 단일 온도(65℃)에서 1시간동안 증폭하였다. 또한 Master Mix에 들어있는 형광염색제(Eva Green dye)를 실시간으로 검출할 수 있는 portable real-time fluorometer인 Instrument Genie® II(OptiGene, UK) 장비(증폭장치와 디스플레이 장치가 하나로 되어 있고 가볍고 작음. 전기사용만 가능하면 손쉽게 이동 및 이용이 가능함.)를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 증폭반응을 실시간으로 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭을 확인하였다.

광견병바이러스의 RNA를 사용하여 비교한 결과 도 2와 같이 5번 프라이머 세트를 사용한 경우 가장 증폭효율이 우수한 것으로 나타났고, 그 다음으로 4, 6, 2, 1, 3번의 순서로 증폭효율이 나타났다. 이에 따라 이후 실험은 5번 프라이머 세트(본 발명의 프라이머 세트)를 선택하여 수행하였다.

상기 5번 프라이머 세트를 사용한 RT-LAMP 반응조건이 특이적으로 광견병바이러스를 검출하는지 확인하기 위하여 다양한 다른 병원체 바이러스[canine distemper virus(CDV), canine parainfluenza virus(CPiV), canine adenovirus type 2(CAdV-2), canine parvovirus(CPV), Japanese encephalitis virus(JEV), Akabane virus(AKV), Aujeszky's disease virus(ADV), negative control(DDW)]와 광견병바이러스[rabies virus(RABV)]를 적용하여 상기 실시예 1의 반응조건과 동일한 방법으로 RT-LAMP를 수행하였다. 이의 결과, 도 3과 같이 한국의 광견병바이러스 야외주 만을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

검출효율을 보다 최적화하기 위해 각 프라이머를 농도별로 사용하여 증폭반응을 확인하였다. 이중 루프 프라이머인 RVLF와 RVLB의 첨가농도별 증폭반응은 도 4와 같다. 루프 프라이머를 첨가하지 않았을 때보다 첨가하였을 때 증폭반응이 15분정도 빨라졌고, 0.4 pmole/㎕를 첨가한 경우 0.8 pmole/㎕를 첨가한 경우와 비슷한 시간에 증폭이 되면서 증폭효율이 더 좋은 것으로 나타났다.

실시예 3. 민감도 확인

광견병바이러스를 특이적으로 검출하는 RT-LAMP 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여 광견병 양성 개 뇌유제액에서 RNA를 추출한 후 증류수로 10진 계단 희석하여 1.293ng/㎕에서 1.293fg/㎕까지의 RNA 시료를 준비하였다. 그리고 실시예 2와 동일한 조건으로 RT-LAMP를 수행한 결과, 도 5에서와 같이 129.3fg/㎕ 농도의 RNA 시료까지 증폭이 가능한 것을 확인하였다. 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)과의 민감도를 비교하기 위해 서열번호 1과 2의 외부 프라이머(outer primer)를 이용하여 상기의 RT-LAMP 수행 시 동시에 RT-PCR을 수행하고 전기영동을 통해 증폭을 확인한 결과 도 5에서와 같이 12.93pg/㎕ 농도의 RNA 시료까지 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 RT-LAMP 프라이머 세트가 광견병바이러스를 특이적으로 검출할 뿐만 아니라 낮은 농도의 광견병바이러스 RNA를 RT-PCR보다 더 민감하게 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 4. 백신주나 고정주를 제외한 야외 광견병바이러스 특이적 검출 확인

본 발명의 RT-LAMP 프라이머 세트가 광견병 백신주나 고정주가 아닌 국내 야외에서 발생한 광견바이러스를 특이적으로 검출하는지 확인하기 위해 국내 광견병 양성 개 뇌조직 샘플, 백신주인 ERA주와 고정주인 CVS11주를 이용하여 실시예 2의 조건으로 RT-LAMP를 수행하였다. 그 결과 도 6에서와 같이 백신주와 고정주는 증폭되지 않은 반면 국내 야외 광견병바이러스는 특이적으로 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 더불어 최근 국내에서 발생한 야외 샘플과 음성 소 뇌조직을 이용하여 RT-LAMP를 수행한 결과 도 7에서와 같이 축종과 관계없이 음성 샘플을 제외한 야외 양성샘플에서 광견병바이러스를 특이적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer set for reverse transcription loop-medicated isothermal amplification(RT-LAMP) for rapid detection of Korean field rabies virus, and uses there of <130> PA140922-C01 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVF3 outer primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 1 aagaatgttt gagccaggg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVB3 outer primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 2 tttcccgaag aactcctct 19 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFIP(F1c+F2) inner primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 3 acatgaccaa ctgcatttga cgttcacttc cgttcactgg 40 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVBIP(B1c+B2) inner primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 4 tgtcggatgt tatatggggc aaacagacat ctcatgggga g 41 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVLF loop primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 5 aaggggactt cccactca 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVLB loop primer for RT-LAMP for detection of Korean field rabies virus <400> 6 aacagtcatt gctgcatgtg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVB3-1 outer primer <400> 7 cgaagaactc ctctccca 18 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFIP(F1c+F2)-1 inner primer <400> 8 acatgaccaa ctgcatttga cgtcattcac ttccgttcac tg 42 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFIP(F1c+F2)-2 inner primer <400> 9 acatgaccaa ctgcatttga cgattcactt ccgttcactg g 41 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFIP(F1c+F2)-3 inner primer <400> 10 acatgaccaa ctgcatttga cgttcattca cttccgttca ct 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RVFIP(F1c+F2)-4 inner primer <400> 11 acatgaccaa ctgcatttga cgcattcact tccgttcact gg 42

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP) 프라이머 세트.
제 1항의 역전사고리매개등온증폭 프라이머 세트를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물.
제 2항의 역전사고리매개등온증폭 반응용액 조성물을 포함하는 야외 광견병바이러스 검출용 역전사고리매개등온증폭 키트.
시료에서 RNA를 분리하는 단계;
상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하는 단계; 및
증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 야외 광견병바이러스 검출 방법.