KR101758609B1 - 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물 - Google Patents

일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 조성물, 이를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 키트 및, 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 특정 시료로부터 일본뇌염바이러스를 검출할 수 있을 뿐 아니라, 동시에 유전자형 1형 및 3형을 구분할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 민감도 및 특이도가 높아, 신속하고 정확하게 일본뇌염바이러스를 진단할 수 있어 이를 개체의 일본뇌염 감염 여부를 판별하거나 일본뇌염 백신주의 유전자형을 판별하는 등 다양한 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물{Compositions for detecting Japanese encephalitis virus and identifying genotype}
본 발명은 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 조성물, 이를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 키트 및, 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법에 관한 것이다.
일본뇌염은 모기에 의해서 매개되는 대표적인 감염증으로, 플라비바이러스속 (Flavivirus)의 일본뇌염 바이러스가 원인체이다. 상기 일본뇌염은 사람에서 고열 및 혼수 등을 동반한 뇌염을 일으켜 결국 사망에 이르게 하는 치명적인 인수공통전염병이다. 한국 및 일본 지역에서 일본뇌염을 주로 매개하는 모기종은 작은 빨간 집모기(Culex tritaeniorhynchus)에 의해 전파되는 것으로 알려져 있으나, 중국, 인도를 비롯한 동남아시아 지역에서는 쿨렉스 비시누이(Culex vishnui), 쿨렉스 피피엔스(Culex Pipiens), 쿨렉스 애눌리로스트리스(Culex annulirostris) 및 학질모기(Anopheles spp .)도 일본뇌염 바이러스를 매개하는 것으로 알려져 있다.
불현성 감염을 나타내는 성인과는 달리 14세 이하의 어린이나 노약자가 일본뇌염에 감염되면 고열, 두통, 지각이상, 의식 장애, 혼수 및 사망을 일으키며, 회복기에는 언어 장애, 판단 능력 저하 등의 후유증이 나타난다. 돼지, 말, 소, 양 및 염소를 포함한 가축뿐만 아니라 비둘기 및 왜가리 등과 같은 야생조류, 박쥐, 파충류가 일본뇌염에 감수성이 있다. 특히 야생 멧돼지를 포함한 돼지는 일본뇌염바이러스의 증폭 숙주로 알려져 있어, 공중 보건학적으로 중요한 면역 대상 동물이다. 모기에 의해 일본뇌염바이러스가 성돈과 비육돈에 감염되면 바이러스 혈증을 일으켜도 불현성 임상증상을 나타내지만, 임신 모돈이 일본뇌염에 감염되면 조산, 미이라 태아 등 유사산 증상과 신경 증상을 동반하는 허약 자돈을 분만하는 번식 장애 질병을 유발한다. 웅돈에서는 생식기에 침입하여 정자 형성을 저해하며, 정자수의 감소, 기형 정자의 증가로 수태율을 떨어뜨린다.
우리나라에서 일본뇌염은 1950년도 이후부터 지속적으로 발생하고 있으며, 중국, 일본 및 한국을 포함한 동남아시아에서 주로 발생하고 있다. 그러나 아시아가 아닌 지역인 호주, 아프리카, 러시아 등지에서도 보고되고 있어 다시 부상하는 신종 전염병으로 인식되고 있다. 사람의 경우 아시아 지역에서만 매년 67,900여 건이 보고되었고, 그 중 약 5,000명이 사망하고 있다. 특히, 최근 지구온난화와 기후의 변화, 농업 관계수로의 정비, 농업의 전업화 및 규모화와 더불어 질병 매개체인 모기의 생태환경을 변화시켜 일본뇌염의 전파에 큰 영향을 줄 수 있어 더욱 문제가 되고 있다. 1980년도 이후 대량의 백신접종 프로그램과 모기구제를 통해 돼지에서 일본뇌염 발생 건수는 년간 10 내지 20건으로 감소하게 되었다. 돼지에서 2002년부터 2007년까지 매년 1 내지 4 건의 일본뇌염이 발생하였으나, 2008년 이후에는 발생하고 있지 않다. 그러나 최근 사람에서 2014년에 26건이 발생하였으며, 해외에서 감염되어 국내에서 검색되는 등 기후 온난화와 사람의 지속적인 이동으로 일본뇌염의 발생이 증가하고 있어 일본 뇌염에 대한 관심이 높아지고 있다. 또한, 돼지가 일본뇌염바이러스에 감염되면 2 ~ 3일간의 바이러스 혈증을 나타내고, 이 시기에 모기들이 흡혈을 하면 대량의 바이러스가 모기에 옮겨지게 된다. 돼지로부터 옮겨진 일본뇌염바이러스는 모기의 체내에서 약 10일이 경과되면, 모기의 타액선을 통하여 다른 동물 혹은 사람에 감염될 수 있다. 따라서 증폭숙주인 돼지에 대한 일본뇌염의 방역과 면역의 형성은 사람의 일본뇌염 관리에 매우 중요하다.
일본뇌염의 진단법은 포유 마우스에 접종법, 바이러스 분리법, 유전자 검사법 (RT-PCR) 및 혈청학적 검사법이 있다. 포유 마우스를 이용한 진단법은 70일령 이전에 유산된 태아의 흉수, 뇌, 척수 혹은 척수액의 일부를 시료로 하여 3 - 4일령의 포유 마우스의 뇌에 접종하고 14일 동안 관찰하여 마우스가 7일 이내에 신경증상을 나타내면서 폐사하는 경우 일본뇌염으로 의심한다. 상기 마우스의 뇌 조직을 다시 수집하여 뇌 조직에서 바이러스를 추출하고, 거위혈구와 반응시켜 응집이 일어나면 일본뇌염으로 진단한다. 바이러스 분리법은 병아리 태아 세포(CEF), Vero, BHK-21, 모기유래세포(C6/36)를 준비하고, 이 세포에 뇌 조직, 흉수 혹은 혈장의 시료를 여과시킨 후 접종한다. 세포에 접종하고 4 ~ 7일이 지나서 세포를 고정한 후 일본뇌염바이러스에 대한 특이적인 항체와 반응시키고 다시 형광항체로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였을 때 세포질 내 특이한 형광이 나타나면 일본뇌염으로 진단한다. 동물에서 결정적인 진단은 원인체를 분리 및 동정하는 것이지만 바이러스의 분리가 쉽지 않기 때문에 임상학적, 혈청학적, 병리소견 등이 진단에 유용하다. 최근 널리 사용하고 있는 일본뇌염의 유전자진단법은 바이러스의 유전자 중에서 보존이 잘 되어 있는 외피유전자 (Envelope (E) gene)를 증폭 및 확인하는 방법(RT-PCR법)이다. 이 방법은 뇌 조직, 태아의 흉수, 모기, 혈장의 시료에 적용이 가능하며, 특이적인 유전자가 검출되면 일본뇌염 양성으로 진단한다.
현재까지 일본뇌염을 진단하기 위해서는 주로 일본뇌염바이러스 유전자형 3의 유전자 염기서열에 기초하여 진단키트를 사용하고 있으나 1990년 이후에 우리나라에 유행하는 유전자형은 주로 유전자형 1형이다. 일본뇌염 1형과 3형의 유전자의 상동성이 87%에 불과하여 현재 유행 중인 유전자 1형을 진단하는데 한계가 있다. 따라서 유전자 1형 및 3형을 동시에 그리고 각각 감별이 가능한 유전자 진단키트의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자는 신속하고 정확하게 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 및 3형을 구분하여 검출하는 것으로 일본뇌염을 진단할 수 있는 방법을 연구한 결과, 유전자형 1형 및 3형을 동시에 증폭하는 프라이머 쌍, 유전자형 1형만을 증폭하는 프라이머 쌍 및 유전자형 3형만을 증폭하는 프라이머 쌍을 제작하고, 상기 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용 시, 정확하게 어느 유전자형의 일본뇌염바이러스에 감염되었는지 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용한 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및, 서열번호 5 및 6;으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 이용한 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 시료의 RNA 또는 DNA를 추출하는 단계; 및 (2) 상기 (1)의 RNA 또는 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및, 서열번호 5 및 6;으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 이를 분석하는 단계;를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 특정 시료로부터 일본뇌염바이러스를 검출할 수 있을 뿐 아니라, 동시에 유전자형 1형 및 3형을 구분할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 민감도 및 특이도가 높아, 신속하고 정확하게 일본뇌염바이러스를 진단할 수 있어 이를 개체의 일본뇌염 감염 여부를 판별하거나 일본뇌염 백신주의 유전자형을 판별하는 등 다양한 분야에서 하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 및 3형의 E 유전자의 염기서열 및 프라이머 선정 위치를 나타낸 도이다.
도 2는 일본뇌염바이러스의 전체 유전자를 도식화하여 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 및 3형 감별을 위한 증폭 부위와 밴드 크기를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출), 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출) 및 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출)을 이용하여 RT-PCR을 수행하기 위한 어닐링 온도를 확인한 결과를 나타낸 도이다(M은 마커, 1은 50℃, 2는 57℃, 3은 62℃를 나타냄).
도 4는 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출), 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출) 및 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출)을 이용하여 일본뇌염바이러스의 1형 및 3형의 검출 여부를 확인한 도이다(1은 KV1899주 및 안양300주에 1 프라이머 쌍 1번을, 2는 KV1899주에 프라이머 쌍 2번를, 3은 안양300주에 프라이머 쌍 3번을, 4 내지 7은 KV1899주, 안양300주, K87주 및 K95주 각각에 프라이머 쌍 1번을 이용하고, 8은 음성대조군을 이용한 결과임).
도 5는 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출) 또는 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출)을 이용하여 KV1899주(A, 일본뇌염바이러스 유전자형 1형) 또는 안양300주(B, 일본뇌염바이러스 유전자형 3형)에 대한 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 또한, 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출) 또는 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출)을 이용하여 KV1899주(C, 일본뇌염바이러스 유전자형 1형) 또는 안양300주(D, 일본뇌염바이러스 유전자형 3형)에 대한 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출), 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출) 및 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출) 의 일본뇌염바이러스에 대한 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 7은 각 돼지열병바이러스, 파보바이러스, 뇌심근염바이러스, 오제스키병바이러스, 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 게타바이러스를, 8은 1형 및 3형의 일본뇌염바이러스, 9는 1형 일본뇌염바이러스, 10은 3형 일본뇌염바이러스 및 11은 음성시료를 나타냄).
본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및, 서열번호 5 및 6;으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 일본뇌염바이러스 유전자 1형 및 제3형을 동시에 검출할 수 있고, 상기 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 일본뇌염바이러스 유전자 1형을 단독으로 검출할 수 있고, 상기 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 일본뇌염바이러스 유전자 3형을 단독으로 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "검출"은 화학 분석에서, 시료(試料) 속에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것으로, 본 발명에서는 일본뇌염바이러스를 검출하는 것을 의미한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 이용한 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다
또한 본 발명은 (1) 시료의 RNA 또는 DNA를 추출하는 단계; 및 (2) 상기 (1)의 RNA 또는 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및, 서열번호 5 및 6;으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 이를 분석하는 단계;를 포함하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법을 제공한다.
상기 (1) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이나, 일본뇌염바이러스가 검출될 수 있는 시료이면 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 (2) 단계의 증폭 반응은 50 내지 65℃에서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 52 내지 60℃에서 수행하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (2) 단계의 증폭은 RT-PCR, 인 시추 하이브리디제이션(in situ hybridization), 노던 블랏(Northern blot), S1 뉴클레아제 분석(S1 nuclease assay) 및 RNaseA 프로텍션 분석(RNaseA protection assay)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수행할 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR을 통해 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (2) 단계의 분석은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하나, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광을 형광 측정기를 이용하여 측정하는 방법이다. 상기 방사성 측정 방법은 증폭 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 1번(일본뇌염바이러스 유전자형 1형 및 3형 공통 검출); 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 2번(단독으로 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 검출); 및 서열번호 5 및 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 3번(단독으로 일본뇌염바이러스 유전자형 3형 검출)을 제작한 후, 상기 프라이머 쌍 1 내지 3번을 이용 시, 정확하게 어느 유전자형의 일본뇌염바이러스에 감염되었는지 알 수 있고, 신속하고 간단하게 일본뇌염의 감염 여부를 진단할 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 일본뇌염바이러스 준비 및 증식
1-1. 일본뇌염바이러스 준비
일본뇌염바이러스를 증식시키기 위하여, 다음과 같이 일본뇌염바이러스를 준비하였다.
구체적으로, 일본뇌염바이러스 유전자형 1형에는 KV1899주(strain)를, 3형에는 안양300주를 사용하였다. 상기 KV1899주는 1999년 경기도 돼지농장의 돼지혈액에서 분리하고, Vero 세포에서 증식한 바이러스 주이다. 또한, 안양300주는 1963년도에 경기도 돼지농장의 자돈에서 채취한 돼지 시료에서 일본뇌염바이러스를 분리하여 계태아에서 300대 계대한 바이러스 주이다. K87주는 1987년에 분리하였고 유전자형은 3형에 속한다. K95는 1995년 모기에서 분리한 일본뇌염바이러스로, 유전자형은 1형에 속한다. 상기 일본뇌염바이러스 주는 질병관리본부에서 분양받았다. 특이도 시험을 위하여 대조군으로서, 돼지에서 분리한 돼지열병바이러스, 파보바이러스, 뇌심근염바이러스, 오제스키병바이러스, 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 게타바이러스를 사용하였다.
1-2. Vero 세포에서 일본뇌염바이러스의 증식
일본뇌염바이러스는 Vero(African green monkey kidney cell), BHK-21(baby hamster kidney cell) 및 RK-13 세포에서 증식이 가능하다. 따라서 세포를 취급하는데 어렵지 않는 Vero 세포를 선정하고, 상기 Vero 세포에 일본뇌염바이러스 안양300주, KV1899주, K87주 및 K95주를 각각 접종하였다. 접종 후 96시간 이후부터 특이적인 세포변성효과가 나타남을 확인하였고, 이 후 동결융해과정을 3회 실시하여 바이러스 함량을 확인하였다. 그 결과, 106.0TCID50/mL임을 확인하였고 하기의 실험에 이용하였다.
실시예 2. 일본뇌염바이러스의 염기서열 분석 및 프라이머 디자인
일본뇌염바이러스 E 유전자의 뉴클레오타이드 염기서열을 분석하고 프라이머 쌍 1번(일본뇌염바이러스 1형 및 3형 공통 검출), 프라이머 쌍 2번(단독으로 일본뇌염바이러스 1형 검출) 및 프라이머 쌍 3번(단독으로 일본뇌염바이러스 3형 검출)을 각각 제작하였다.
2-1. 일본뇌염바이러스 E 유전자 분석을 통한 프라이머 선정
구체적으로, 일본뇌염바이러스 유전자 1형과 3형의 E 유전자의 염기서열의 상동성을 비교 및 분석하였다. 일본뇌염바이러스 E 유전자의 뉴클레오타이드 염기서열 1,500 bp 중 1,311개가 일치하여 상동성은 87.4%로 나타났으며, 아미노산 염기서열은 500개 중 485개가 일치하여 상동성은 97%를 나타내었다.
이에 따라, 일본뇌염바이러스의 유전자형에 따른 상동성이 큰 차이를 나타냄에 따라 공통으로 증폭할 유전자를 확인하고, 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 및 3형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 쌍 1번은 다음과 같이 제작하였다. 일본뇌염바이러스 E 유전자 중 115-135번째의 뉴클레오타이드의 3개 부위가 차이가 있음을 확인하여 C/T의 부위는 Y로 G/A는 R로 치환하여 forward 프라이머를 작성하였고, 402-420번째의 뉴클레오타이드도 3부위에 차이를 나타냄에 따라서 T/C부위를 Y로 치환하여 reverse 프라이머를 선정하였다.
일본뇌염바이러스 유전자 1형을 검출할 수 있는 프라이머 쌍 2번은 다음과 같이 제작하였다. 일본뇌염바이러스 E 유전자 중 481-504번째의 뉴클레오타이드 중 4개가 3형과 차이를 나타내어 1형에 대한 forward 프라이머로 선정하였고, 1023-1045번째의 뉴클레오타이드 중 7개가 차이를 나타내었으며, 특히 1023번째의 뉴클레오타이드가 3형과 차이를 나타내어 RT-PCR 과정에서 1형만 증폭하고, 3형은 증폭되지 않도록 reverse 프라이머를 선정하였다.
일본뇌염바이러스 유전자 3형을 검출할 수 있는 프라이머 쌍 3번은 다음과 같이 제작하였다. 일본뇌염바이러스 E 유전자 중 1012-1034번째의 뉴클레오타이드 중 5개가 1형과 차이를 나타내어 3형에 대한 forward 프라이머로 선정하였고, 1443-1462번째의 뉴클레오타이드 중 7개가 차이를 나타내며, 1443, 1444번째의 뉴클레오타이드가 1형과 차이를 나타내어 RT-PCR 과정에서 3형만 증폭하고, 1형은 증폭되지 않도록 reverse 프라이머를 선정하였다.
상기 과정을 통하여 확인한 일본뇌염바이러스의 상동성 비교 및 선정된 프라이머 쌍 1 내지 3번의 위치를 도 1에 나타내었다.
2-2. 일본뇌염바이러스 E 유전자 감별 진단을 위한 프라이머 작성
상기 실시예 2-1에서 제조한 프라이머 쌍 1 내지 3번의 정보를 하기 표 1에 나타내었다. 이에 대한 구체적인 증폭 부위는 도 2에 나타내었다. 디자인된 각 프라이머 쌍은 상업적으로 제작의뢰를 통해 올리고뉴클레오티드로 제작하였다(바이오니아, 대한민국).
번호 프라이머명 염기서열 방향 유전자 목적 일본뇌염 유전자형
프라이머 쌍 1번 JEcomF
(115-135)		 CCAACAYTRGAYGTCCGCATG
(서열번호 1)		 Forward E
306 bp		 1형 및 3형
(공통)
JEcomR
(402-420)		 GCCAACRTCGYARTTGATG
(서열번호 2)		 Reverse
프라이머 쌍 2번 JEgene1F
(481-504)		 GCGTCTCAAGCAGCAAAGTTTACT
(서열번호 3)		 Forward E
565 bp		 1형
JEgene1R
(1023-1045)		 TCATGTCGTTTAAACTCGCGACT
(서열번호 4)		 Reverse
프라이머 쌍 3번 JEgene3F
(1012-1034)		 CCGATCGTCTCCGTTGCGAGCC
(서열번호 5)		 Forward E
451 b		 3형
JEgene3R
(1443-1462)		 CTGTGGCTAAGTTGGCCAAA
(서열번호 6)		 Reverse
실시예 3. 일본뇌염바이러스 진단을 위한 RT- PCR 조건 확립 및 일본뇌염 바이러스 유전자형 감별 여부 확인
3-1. 일본뇌염바이러스 진단을 위한 RT- PCR 조건
상기 실시예 2-1에서 제조한 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출), 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출) 또는 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출)의 어닐링 온도가 다르면 유전자의 증폭 농도가 달라질 수 있으므로, 어닐링 온도 조건을 확립하였다.
이를 위해, 프라이머 쌍 1 내지 3번을 함께 넣고 일본뇌염바이러스 1형 및 3형의 RNA를 추가하여 어닐링 온도 조건을 50℃, 57℃, 62℃로 하여 증폭한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 50℃(도 3의 1) 및 62℃(도 3의 3)에서 증폭한 결과보다 57℃(도 3의 2)에서 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번을 이용하여 RT-PCR을 수행하였을 때, 일본뇌염바이러스의 1형 또는 3형이 단독으로 검출될 뿐만 아니라, 1형 및 3형이 공통으로 검출됨을 확인하였다. 이를 바탕으로 민감도와 특이도에 대한 어닐링 온도를 57℃로 설정하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
3-2. 일본뇌염바이러스 유전자형 감별 여부 확인
상기 실시예 3-1의 어닐링 온도 조건으로, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번을 이용하여 RT-PCR을 수행하였을 때 일본뇌염바이러스의 유전자형을 올바르게 감별하는지 확인하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번 및 다양한 일본뇌염바이러스를 대상으로 상기 실시예 3-1의 어닐링 온도 조건에서 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하였다.
도 4의 1은 KV1899주 및 안양300주에 프라이머 쌍 1 내지 3을, 2는 KV1899주에 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출)를, 3은 안양300주에 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출), 4 내지 7은 KV1899주, 안양300주, K87주, K95주에 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출)을 사용하여 증폭한 유전자를, 8은 음성대조군을 나타낸 것이다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번을 이용 시, 일본뇌염바이러스 1형 또는 3형이 각각 존재할 때나 동시에 존재할 때 모두 검출이 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명의 프라이머 쌍의 일본뇌염바이러스에 대한 민감도 및 특이도 검정
4-1. 일본뇌염바이러스에 대한 민감도 검정
일본뇌염바이러스를 10진 희석하여 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3에 대한 민감도를 검정하였다.
구체적으로, 실험에 사용된 일본뇌염바이러스(KV1899, 안양300)의 함량은 106.0 TCID50/mL이었고, 200 uL의 일본뇌염바이러스를 RNA 추출키트(바이오니아)를 사용하여 RNA를 50 uL로 추출하였다. 그 후, 민감도시험을 위해 추출한 RNA을 10진 희석하였고, RT-PCR은 one-step RT-PCR kit(QIAGEN, 미국)를 이용하여 수행하였다. 보다 구체적으로, One-step RT-PCR kit의 튜브에 1 ul의 각 프라이머 쌍 1 내지 3번(50 pM), 5 ul의 RNA, 10 ul의 5x butter(12.5 mM MgCl2), 2 ul의 dNTP mix, 1 ul의 enzyme mix, 30 ul의 DEPC-water를 넣어 총 50 ul의 혼합액을 만들었다. 상기 혼합액을 PCR 장비 (Biometra T3000 thermocycler)에 넣고 42℃에서 30분, 35사이클로 PCR (95℃에서 45초, 57℃에서 45초, 72℃에서 45초), 72℃에서 10분의 조건으로 반응시킨 후, PCR 생성물을 1.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 일본뇌염바이러스의 각 유전자형의 증폭여부를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A 또는 B는 각 KV1899주(일본뇌염바이러스 유전자형 1형) 또는 안양300주(일본뇌염바이러스 유전자형 3형)에 대하여, 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출) 또는 프라이머 쌍 2번(단독 1형 검출)의 민감도를 확인한 것이다. 또한, 도 5의 C 또는 D는 각 KV1899주(일본뇌염바이러스 유전자형 1형) 또는 안양300주(일본뇌염바이러스 유전자형 3형)에 대하여, 본 발명의 프라이머 쌍 1번(1형 및 3형 공통 검출) 또는 프라이머 쌍 3번(단독 3형 검출)의 민감도를 확인한 것이다.
또한, 각 일본뇌염바이러스주의 RNA를 추출하기 위해 200 uL를 사용하였고, 50 uL로 용출하였다. 따라서, 1/20의 용량을 사용한 것으로, 최초 바이러스 함량은 106.0 TCID50/mL이므로, 10-1의 함량은 2*104.0 TCID50/mL에 해당한다.
도 5에 나타낸 바와 같이, KV1899주(A, 유전자형 1형)에 대한 본 발명의 프라이머 쌍 1번 또는 2번의 민감도는 각 2*100.0 TCID50/mL 또는 2*101.0 TCID50/mL임을 확인하였다. 또한, 안양300주(B, 유전자형 3형)에 대한 본 발명의 프라이머 쌍 1번 또는 2번의 민감도는 각 2*101.0 TCID50/mL 또는 0 TCID50/mL임을 확인하였다.
또한, KV1899주(C, 유전자형 1형)에 대한 본 발명의 프라이머 쌍 1번 또는 3번의 민감도는 각 2*100.0 TCID50/mL 또는 0 TCID50/mL임을 확인하였다. 또한, 안양300주(D, 유전자형 3형)에 대한 본 발명의 프라이머 쌍 1번 또는 3번의 민감도는 각 2*100.0 TCID50/mL 또는 2*101.0 TCID50/mL임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3은 시료 내 매우 낮은 농도의 일본뇌염바이러스도 효과적으로 검출할 수 있을 뿐 아니라, 동시에 유전자형 1형 및 3형을 구분하여 검출할 수 있음을 확인하였다.
4-2. 일본뇌염바이러스에 대한 특이도 검정
일본뇌염바이러스 이외에 돼지에서 분리한 다른 바이러스 7종을 대상으로 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3에 대한 특이도를 검정하였다.
구체적으로, 양성으로서 일본뇌염바이러스 유전자형 1형 (KV1899) 및 3형 (안양300주)을 사용하였고, 대조군으로서, 돼지열병바이러스, 파보바이러스, 뇌심근염바이러스, 오제스키병바이러스, 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 게타바이러스를 이용하였다. 상기 각 바이러스의 RNA 혹은 DNA는 바이오니아사의 추출키트를 사용하였고, 특이도 시험을 위해 추출한 RNA 혹은 DNA를 희석하지 않고 그대로 사용하였다. One-step RT-PCR kit의 튜브에 각 바이러스의 5 ul의 RNA, 각 1 ul (총 3 ul)의 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번(50 pM), 10 ul의 5x butter(12.5 mM MgCl2), 2 ul의 dNTP mix, 1 ul의 enzyme mix, 29 ul의 DEPC-water를 넣어 총 50 ul의 혼합액을 만들었다. 상기 혼합액을 PCR 장비(Biometra T3000 thermocycler)에 넣고 42℃에서 30분, 35 사이클로 PCR (95℃에서 45초, 57℃에서 45초, 72℃에서 45초), 72℃에서 10분의 조건으로 반응시킨 후 PCR 생성물을 1.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 유전자의 증폭여부를 확인하였다.
도 6의 1 내지 7은 각 돼지열병바이러스, 파보바이러스, 뇌심근염바이러스, 오제스키병바이러스, 전염성위장염바이러스, 유행성설사병바이러스, 게타바이러스를, 8은 1형 및 3형의 일본뇌염바이러스, 9는 1형 일본뇌염바이러스, 10은 3형 일본뇌염바이러스 및 11은 음성시료를 나타낸 것이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번은 돼지 유래 7종류의 바이러스에 대하여 모두 음성을 나타내었고, 일본뇌염 1형 및 3형에는 3개의 밴드(306 bp, 565 bp, 451 bp)가, 1형에는 2개의 밴드 (306 bp, 565 bp)가, 3형에는 2개의 밴드(306 bp, 451 bp)가 특이적으로 증폭한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 프라이머 쌍 1 내지 3번은 돼지 유래 7종류의 바이러스에 비특이 반응을 나타내고, 일본뇌염바이러스의 유전자형에 따라서 특이적으로 반응함을 확인하였다.
<110> Animal and plant quaratine agency <120> Compositions for detecting Japanese encephalitis virus and identifying genotype <130> 1-66 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEcomF primer <400> 1 ccaacaytrg aygtccgcat g 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEcomR primer <400> 2 gccaacrtcg yarttgatg 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEgene1F primer <400> 3 gcgtctcaag cagcaaagtt tact 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEgene1R primer <400> 4 tcatgtcgtt taaactcgcg act 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEgene3F primer <400> 5 ccgatcgtct ccgttgcgag cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JEgene3R primer <400> 6 ctgtggctaa gttggccaaa 20

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (1) 시료의 RNA 또는 DNA를 추출하는 단계; 및
    (2) 상기 (1)의 RNA 또는 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및, 서열번호 5 및 6;으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하고, 어닐링(annealing) 온도를 57℃로 하여 표적 서열을 증폭하는 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 (2) 단계의 증폭 산물을 분석하는 단계;를 포함하며, 상기 프라이머 세트는 E 유전자를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는, 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 분석은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수행하는 것을 특징으로 하는 일본뇌염바이러스의 검출 및 유전자형 판별 방법.
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