KR20090100950A

KR20090100950A - 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법

Info

Publication number: KR20090100950A
Application number: KR1020080026488A
Authority: KR
Inventors: 조민희; 김영환; 김성국; 장성준; 도재철; 남용석; 김수복; 백묘아; 최선미; 홍성원; 김진혁
Original assignee: 경상북도(가축위생시험소); 주식회사 코젠바이오텍
Priority date: 2008-03-21
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2009-09-24

Abstract

본 발명은 실시간 PCR을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 브루셀라 속 균주의 글리세르알데하이드 3-포스페이트(gap) 디하이드로게나제 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 브루셀라 속 균주의 신속 정확한 검출 방법에 관한 것이다.

Description

실시간 ＰＣＲ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법{METHOD FOR DETECTION BRUCELLOSIS USING REAL TIME PCR}

브루셀라병은 잠복기가 긴 만성 전염병으로, 전 세계적으로 발생하고 있다. 특히 소 브루셀라병은 암소의 불임, 유산 등의 번식 장애를 일으키고, 수소에서는 고환염, 전립선염 등의 생식기 질환을 일으켜, 국내에서는 제 2종 가축전염병으로 분류되어, 검진 및 살처분의 근절 대책이 확립되어 있다. 또한, 소 브루셀라병은 소 뿐만 아니라 사람에게도 감염되어 파상열, 관절통, 오한, 쇠약 등 감기와 유사한 증상을 일으키는 인수공통전염병으로, 치료하지 않을 경우 심내막염 및 척추염 등으로 진행되어 사망에 이를 수 있다. 또한, 제3군 법정 전염병으로 분류되어 공중위생상 매우 중요한 질병으로 취급되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계적으로 근절을 위해 많은 노력을 기울이고 있다(Alton GG. 1975. Laboratory techniques in brucellosis, 2nd Ed. WHO, Geneva. 11-63; Beran GW. 1994. Handbook of zoonoses, 2nd Ed. CRC Press, Boca Raton, 9-39; Timoney JF, Gillespie JH, Scott FW, Barlough JE. 1988. 8th Ed. Cornell University Press, New York. 135-152; Brenner DT, Kreig NR, Staley JT. 2005. 2nd Ed, Vol 2. Springer Press, New York. 370-389; Nielsen K, Duncan JR. 1990. Animal brucellosis, CRC Press, Boston. 1-453; Hirsh DC, Zee YC. 1999. Veterinary microbiology. Blackwell Science Press. 196-203; OIE. 2004. Mannual of diagnostic test and vaccinees for terrestrial animals, Part 2, Section 2.3, Chapter 2.3.1. OIE Press, France, Paris.).

브루셀라속 균주는 숙주 특이성, 배양 성상, 생화학적 및 혈청학적 특성에 따라 염소 및 면양의 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 소의 브루셀라 아보르투스(B abortus), 돼지의 브루셀라 수이스(B suis), 양의 브루셀라 오비스(B ovis), 개의 브루셀라 캐니스(B canis), 사막 쥐의 브루셀라 네오토마(B neotomae)와, 최근에 해양 포유류인 바다사자, 물범, 돌고래 등에서 분리된 브루셀라균에 대해서는 브루셀라 세타세아(B cetaceae, 고래류)와 브루셀라 핀니페디아(B pinnipediae, 바다표범류) 등으로 분류되며, 이 중에서 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 수이스 등 3종이 사람에게 병원성이 있는 것으로 알려져 있으며, 브루셀라 캐니스도 극히 드물게 발생 사례가 보고되고 있다(Timoney JF, Gillespie JH, Scott FW, Barlough JE. 1988. Hagan and Bruner's Microbiology and infectious disease of domestic animals, 8th Ed. Cornell University Press, New York. 135-152).

브루셀라병의 진단은 원인균의 분리와 항체 검사로 실시되고 있다. 그러나, 균주 분리에는 생물학적 안전성이 확보된 밀폐된 실험실에서 최소 10일에서 30일의 균 배양 기간이 소요되며, 동정하기 위해 25가지의 생화학적 성상 검사에 5일 정도의 추가 소요 기간이 필요할 뿐만 아니라, 균을 취급하는 실험실과 실험자에 대한 생물학적 안전성(biosafety)이 확보되어야 하며, 실험자의 숙련도에 따라 생화학적 성상 검사에 다소 차이가 나 정확한 동정이 곤란할 수 있다. 일반적으로 항체검사에 의한 양성 반응우의 색출 방법이 전세계적으로 많이 이용되고 있다(Lopez-Goni I, Moriyon I. 2005. Brucella : Molecular and cellular biology. Horizon Bioscience, Norfolk. 1-432; Young EJ, Corbel MJ. 1989. Brucellosis : Clinical and laboratory aspects. CRC Press, Boca Raton. 1-192).

브루셀라병을 근절하기 위한 질병진단체계 수립시에 고려되어야 할 사항 중 첫 번째는 감염 집단내 감염 개체를 색출할 수 있는 진단 체계와 특이도 보다는 민감도가 우수한 진단법을 사용하는 것이다. 신속 간단하고 저렴한 진단법이 가장 이상적이고 효율적이다. 두 번째는, 균주 분리 및 동정을 위한 진단 체계가 확립되어야 한다. 특히 브루셀라병에 대한 예방 접종을 실시할 경우에는 백신주와 야외주의 감별을 위한 진단 방법이 마련되어야 하며, 이러한 점을 고려할 때 PCR기법을 이용하여 분리주의 감별 및 동정을 위한 진단체계를 수립하는 것이 바람직하다. 세 번째로 고려할 사항은, 브루셀라병 발생의 역학적 상황을 조사하기 위해 감염원의 색출 및 유입 경로를 추적할 수 있는 유전학적 분석에 기인한 프로파일 링(profiling) 기법이 필요하다.

현재 많이 사용되고 있는 혈청학적 진단 방법은 유사 항원 결정기를 가진 세균의 LPS의 교차반응에 의해 위양성 반응이 나타나지만, 이를 감별할 수 있는 정확한 검사 방법이 마련되어 있지 않은 상황이다. 브루셀라병 근절 단계에 도달한 몇몇 국가에서도 위양성 반응에 따른 브루셀라병 발생으로 인한 정책의 혼선이 발생되기도 하여, 신속 정확한 원인체의 분리 및 동정을 위한 PCR 기법 등을 이용한 진단체계의 마련이 필요한 실정이다.

최근 분자 유전학의 발전과 함께 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactiono, PCR)을 이용한 여러가지 브루셀라병 진단 기법이 개발되어 실시되고 있으며, 감염집단을 검색하기 위해 유즙내의 특이 유전자 부위를 검출하는 방법, 양성 집단내 감염개체를 색출하기 위한 개체 검사 방법, 분리한 균의 동정을 위한 동정방법 및 동정된 균의 분자유전학적 분석을 실시하여 감염원의 유입경로 등을 밝혀내는 역학 조사에 PCR 방법이 많이 이용되고 있다.

실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭산물과 반응하는 형광물질의 검출과 정량으로 해석하는 기술이다. 이 방법은 기존의 PCR법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기영동 후 PCR 증폭산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 필요없고 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하고, 결과를 수치화할 수 있으며, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있는 진단방법으로, 검출하고자 하는 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다(Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res . 30(6):1292-1305).

본 발명은 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 실시간 PCR용 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 단시간내에 신속 정확하게 브루셀라병의 감염 여부를 판단할 수 있는 브루셀라 속 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 사용이 용이한 브루셀라 속 균주를 검출하는 검출 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프로브를 포함하는, 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출하기 위한 실시간 PCR 검출 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 실시간 PCR 검출 세트를 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계 및 상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 브루셀라 속 균주의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는, 브루셀라 속 균주를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 브루셀라 속 균주 검출용 실시간 PCR 검출 세트를 포함하는 브루셀라 속 균주를 검출하기 위한 검출 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신속 정확하게 브루셀라 속 균주의 존재 유무를 검출할 수 있는 실시간 PCR 방법을 확립하고자 연구하던 중, 브루셀라 속 균주의 gap 유전자를 토대로 특이적인 브루셀라 속 균주 검출이 가능한 프라이머 세트 및 프로브를 설계 및 제작하였고, 이를 토대로 브루셀라 속 균주의 검출 방법을 확립하였다.

본 발명은 브루셀라 속 균주에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여, 시료내 브루셀라 속 균주의 존재 유무를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 시료로부터 브루셀라 속 균주에 특이적인 염기서열을 PCR로 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR로 브루셀라 속 균주를 검출한다.

본 발명의 브루셀라 속 균주는 브루셀라 속에 속하는 모든 균주일 수 있으며, 그 예로는 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 수이스(B suis), 브루셀라 오비스(B ovis), 루셀라 캐니스(B canis), 브루셀라 네오토마(B neotomae)가 있다. 본 발명에서 검출가능한 바람직한 브루셀라 속 균주로는 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 수이스(B suis), 브루셀라 오비스(B ovis), 브루셀라 캐 니스(B canis)가 있다.

본 발명의 브루셀라 속 균주 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머 세트이며, 프로브는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프로브이다.

본 발명의 프로브는 검출가능한 수단으로 표지될 수 있다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광표지 인자가 가장 바람직하다. 형광표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED , HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기 형광표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.

일 예로, 형광표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출하기 위한 검출 세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5’말단을 형광표지 인자(FAM 등)로 3’말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5’→ 3’엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광표지 인자(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광표지 인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광표지 인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.

이러한 방법을 본 발명의 브루셀라 속 균주를 검출하기 위한 실시간 PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광표지 인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이 다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 브루셀라 속 균주의 검출 방법에 있어, 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있으며, 일 예로, UDG 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 15초), 결합 및 연장(annealing, extension, 60℃에서 1분)을 총 40회 실시하는 조건을 취할 수 있다.

또한, 본 발명의 브루셀라 속 균주의 검출 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.

본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광표지 인자를 감지하여 도 11 내지 도 13과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동 과정없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.

본 발명의 브루셀라 속 균주 검출 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 속 균주 검출 방법에 의해, 기존의 브루셀라병 진단 방법에 비해 시간을 현저하게 단축시킬 수 있어, 전염병의 확산을 신속 정확하게 방제할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

또한, 본 발명은 브루셀라 속 균주 검출용 실시간 PCR 검출 세트를 포함하는 브루셀라 속 균주 검출 키트를 제공하며, 상기 키트는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프라이머 세트 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프로브를 포함하는 브루셀라 속 균주 검출용 실시간 PCR 검출 세트를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl₂를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 실시간 PCR을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법은 기존 방법에 비해 특이도와 민감도가 높으며, 실험자에 대한 생물학적 안전성이 우수하다. 또한, 본 발명의 방법은 브루셀라 속 균주의 검출 시간을 단축시킬 수 있어, 브루셀라병 발생 여부를 신속하게 정확하게 판단하여, 병의 확산을 조기에 방제할 수 있다.

주형 DNA 의 추출

주형 DNA를 추출하기 위해 본 실험에 사용한 균주 및 대조군 균주는 표 1 및 표 2와 같다. 국립수의과학검역원에서 분양받은 브루셀라 표준 균주 5주와 경상북도에서 브루셀라병에 감염된 소 및 개에서 분리한 브루셀라 아보르투스(B abortus) 4주 및 브루셀라 캐니스(B canis) 2주를 시험에 이용하였다. 대조군은 실험실에서 분리한 그람음성 및 양성균 9종 50주를 이용하였다.

표 1.

균주	기원
브루셀라 아보르투스 2308	NVRQS
브루셀라 멜리텐시스	NVRQS
브루셀라 수이스	NVRQS
브루셀라 오비스	NVRQS
브루셀라 캐니스 RM6/66	NVRQS
브루셀라 아보르투스 GB1	Field(Korean native cattle)
브루셀라 아보르투스 GB2	Field(Korean native cattle)
브루셀라 아보르투스 GB3	Field(Korean native cattle)
브루셀라 아보르투스 GB4	Field(Korean native cattle)
브루셀라 캐니스 GB1	Field(dog)
브루셀라 캐니스 GB2	Field(dog)

표 2. 대조군 균주

균주명	갯수
시젤라 소네이(Shigella sonnei )	4
에셰리키아 콜리(Escherichea coli)	15
살모넬라 종(Salmonella spp)	15
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)	4
바실러스 안트락스(Bacillus anthrax)	1
예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)	4
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)	4
비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)	1
리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)	2

주형 DNA는 다음과 같이 추출하였다. 먼저, 브루셀라 표준균주 및 야외분리주를 TSA에서 계대하여 CO₂, 37℃에서 72시간 배양한 후, 집락을 채취하여 RNA-결핍된 물(QIAgen^��, USA) 300㎕가 첨가된 1.5㎖ 미세원심분리 튜브에 부유시켰다. 이를 10분간 끓는 물에 중탕하여 12,000Xg에서 10분간 원심분리하고, 상층액을 새로운 미세원심분리 튜브로 이동시켜, PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였다. 대조군은 TSA에서 계대하여 37℃에서 24시간 배양하였고, 집락을 채취하여 표준균주와 동일한 방법으로 주형 DNA를 추출하였다.

PCR 에 의한 브루셀라균의 동정

정 등(정석찬 등, 대한수의학회지. 38(2):345-352), Romero 등(Romero C, Gamazo C, Pardo M, Lopez-goni I. 1995. J Clin Microbol. 33(3):615-617), Baily 등(Baily GG, Krahn JB, Drasar BS, Stoker NG. 1992. J Trop Med Hyg. 95(4):271-5) 및 Bricker 등(Bricker BJ, Halling SM. 1994. J Clin Microbiol . 32(11):2660-2666)의 방법에 따라, 브루셀라균의 특이적인 유전자 부위인 BCSP-31KDa, 16S rRNA, BCSP, IS711 요소(AMOS)에 기초하여 프라이머를 설계한 다음 전문 제조회사(Bioneer^��, Korea)에 의뢰하여 제작하였다(표 3).

표 3.

프라이머	서열(5' -> 3')	증폭 산물의 크기(bp)
BCSP-31KDa	F(B4) : TGC-CTC-GGT-TGC-CAA-TAT-CAA R(B5) : CGC-GCT-TGC-CTT-TCA-GGT-CTG	223
16S rRNA	F(F4) : TCG-AGC-GCC-CGC-AAG-GGG R(R2) : AAC-CAT-AGT-GTC-TCC-ACT-AA	905
BCSP	F : GTA-TCG-TTC-TTG-AAG-CCT-AC R : GTG-CAT-TTC-AAT-AGG-CTA-GAG	711
AMOS	abortus : GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC melitensis : AAA-TCG-CGT-CCT-TGC-TGG-TCT-GA ovis : CGG-GTT-CTG-GCA-CCA-TCG-TCG suis : GCG-CGG-TTT-TCT-GAA-GGT-TCA-GG IS711 : TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT	498 731 976 285 -

PCR은 Accu-Power^�� HL PCR 프리믹스(1U Taq DNA 중합효소, 각 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 250uM, 10mM Tris-HCl(pH9.0), 40mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 안정화제 및 트래킹 염료, Bioneer^��, Korea)에, 주형 DNA 5㎕ 및 설계 제작한 프라이머 1㎕를 첨가하여, T-gradient thermoblock(Germany, Biometra Co.)에서 실시하였다. PCR 반응조건은 표 4와 같다.

표 4.

단계	BCSP-31KDa	16S rRNA	BCSP	AMOS
최종 변성 단계	93℃ 5분	95℃ 5분	94℃ 5분	95℃ 5분
변성 단계	90℃ 60초	95℃ 30초	94℃ 60초	95℃ 72초
어닐링 단계	60℃ 30초	54℃ 90초	55℃ 60초	55℃ 2분
연장 단계	72℃ 60초	72℃ 90초	72℃ 60초	72℃ 2분
사이클	40	30	30	35
최종 연장 단계	72℃ 7분	72℃ 6분	72℃ 5분	72℃ 5분

PCR 종료 후, 증폭된 유전자 부위를 확인하기 위하여 EtBr이 함유된 1.5% 아가로스 겔(Sigma^��, USA)에 각 반응이 끝난 시료를 8㎕씩 취하여 점적하여, 110V에서 30분간 전기영동을 실시하고, 자외선 조사(ultraviolet luminater)하에서 특정 위치의 DNA 밴드를 확인하고 사진촬영을 실시하였다. 분자 크기 마커로 1kb 100bp DNA 래더(Bioneer^��, Korea)를 사용하였다.

도 1 내지 도 4에 31 KDa - BCSP 유전자 프라이머, BCSP 유전자 프라이머, 16S-rRNA 유전자 프라이머 및 AMOS-PCR 유전자 프라이머를 이용한, 여러가지 브루셀라 종에 대한 PCR 결과를 나타낸다. 각 도에서 레인1 및 레인12는 100bp DNA 래더이고, 레인2는 브루셀라 아보르투스 bv 1이고, 레인3은 브루셀라 멜리텐시스이고, 레인4는 브루셀라 오비스이고, 레인5는 브루셀라 수이스이고, 레인6은 브루셀라 캐니스 RM6/66이고, 레인 7-10은 야외에서 분리한 브루셀라 아보르투스이고, 레인11은 증류수이다. 각 프라이머 세트로 증폭한 결과, 1 KDa - BCSP 유전자 프라이머 세트에서는 223bp가, BCSP 유전자 프라이머 세트로는 711bp가, 16S-rRNA 유전자 프라이머 세트로는 905bp가, 그리고 AMOS-PCR 유전자 프라이머 세트로는 각각 498, 731, 976, 285bp가 증폭되었다. 도 1 내지 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기한 4종의 유전자에 대한 프라이머 세트는 브루셀라 속 균주의 종류에 관계없이 동일한 크기로 증폭되었다.

실시간 PCR 용 프라이머 및 프로브 설계

미생물 검출에 사용된다고 알려진 여러 유전자들(SSU, LSU, gyrA, gyrB, recA, tuf, groEL, atpD, ompA, gap, pgi 등)의 염기서열을 각 브루셀라 종별로 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 획득하여 비교 및 분석하였다. 웹을 이용 한 소프트웨어인 Multalign(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html)으로 획득한 브루셀라균 각각의 유전자들의 유사도를 비교하였다. 그 결과, gap 유전자가 전체 종에서 약 98%의 유사도를 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 6).

이러한 유사도 분석 결과를 바탕으로 프라이머 익스프레스 3.0(Applied Biosystems, USA) 프로그램으로, 표 5의 실시간 PCR용 프라이머와 프로브를 설계 및 제작하였다. 제작한 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브 염기서열을 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 분석한 결과 각각의 염기서열은 모두 브루셀라 균에 특이도가 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 7 내지 도 9).

표 5.

	올리고뉴클레오티드의 서열(5' -> 3')
프라이머	정방향 : cgc tgg aca cca tgc aca a 역방향 : ggg tcg gga cgc gaa tg
프로브	5'-FAM-tct cta ccg cgc ccg-MGBNFQ-3‘

실시간 PCR 반응

실시간 PCR 반응용 조성물은 주형 DNA 2㎕, 프라이머 세트(5pmol) 2㎕, 프로브(1pmol, FAM) 1㎕, 2XPCR 마스터 믹스 8㎕를 혼합하고, 잔량의 멸균 증류수를 총 용량 20㎕가 되도록 첨가하여 제조하였다. 실시간 PCR 기종은 ABI 7500 실시간 PCR(Applied Biosystems^��, USA)을 사용하였고, Taqman 프로브 개시부의 5'-리포터 염료는 FAM(6-carboxyl-fluorescein), 말단부에는 3'-퀀처 염료(Quencher dye)로 MGBNFQ(minor grove binding non fluorescence quencher)를 프로브 양끝에 부착하였다. 실시간 PCR 반응조건은 표 6과 같다. PCR 증폭 유무는 서열 검출 소프트웨 어(ABI Version 1.3.1, USA)를 이용하여 실시간으로 관찰하였다.

표 6.

단계	온도	시간	반복	온도 상승율(Ramp rate)
1	50℃	2분	1	100
2	95℃	10분	1	100
3	95℃	15초	40	100
3	60℃	1분	40	100

그 결과는 도 10에 나타낸다. 도 10은 브루셀라 종의 증폭 곡선을 나타낸 것으로, 주형 DNA로는 브루셀라 아보르투스, 브루셀라멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 브루셀라 오비스 및 브루셀라 캐니스 표준 균주와 야생 균주이며, 음성 대조군으로는 멸균 증류수를 사용한 것이다. 브루셀라 특이적인 실시간 PCR의 임계 사이클(threshold cycle; Ct) 범위는 14-22이였으며, 이러한 차이는 주형 DNA 양의 차이로 생각된다. 대조군으로 사용한 멸균증류수에서는 형광검출이 감지되지 않았다.

아울러, 제작한 브루셀라 특이적인 gap 유전자를 이용한 TaqMan 프로브의 특이도를 검사하기 위해 실험실에서 분리한 시겔라 소네이, 에셰리키아 콜리, 살모넬라 종, 스트필로코커스 아우레우스, 바실러스 안트락스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 바실러스 세루우스, 비브리오 콜레라, 리스테리아 모노사이토게네스로부터 주형 DNA를 추출하여 실시간으로 확인하였지만, 증폭산물은 검출되지 않았다(도 11).

실시간 PCR 의 검출한계

실시간 PCR의 검출한계(Limited of detection, LOD)를 측정하기 위해 공시 균주의 DNA를 10배씩 연속 희석하는 방법을 이용하였다. 브루셀라균에서 추출한 DNA를 pGEM T-이지 벡터(Promega^��, USA)에 연결한 후 DH5α 컴피턴트 세프(competent cell)에 형질전환시키고, 클로닝된 플라스미드를 1 X 10⁶pg에서 1 X 10¹pg까지 연속희석하여 주형 DNA로 사용하여 PCR 반응 후 주형 DNA의 농도별 반응곡선의 유무를 확인하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 1 x 10⁶ pg을 제외한 나머지 경우 주형 농도 차이와 Ct 값 간의 차이가 부합되는 것을 확인할 수 있었다. 주형 농도가 1 x 10¹ pg인 경우도 정상적으로 산물이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

혈액에서 세균배양 및 실시간 PCR 의 검출비교

Alton 등의 방법에 따라 소 브루셀라병 정기검진에서 Rose Bengal 1차 혈청검사에서 양성반응을 나타낸 혈액 5ml을, 브루셀라균 선택 증균 배지인 항생제 첨가된 15ml 혈청 덱스트로스 브로스에 첨가하였다. 이를 37℃에서 30일간 진탕 배양하면서, 접종 7일부터 배양액을 7일 간격으로 취하고, 5% 면양 혈액 첨가 배지에 도말 접종하여 10% CO₂, 37℃에서 5일간 브루셀라균 검출을 관찰하였다. 분리된 균주는 생화학시험 및 전술한 브루셀라 진단 PCR법으로 동정하였다. 각 혈액에서 세균을 분리하기 위해, 배양액을 채취하면서 일부를 500㎕씩 미세튜브에 별도로 채취한 후 브루셀라균이 검출된 시료에 대하여 실시간 PCR을 실시하고 일반 PCR에서의 특이 밴드의 검출 유무를 확인하였다.

그 결과는 표 7과 같다.

표 7.

종류		샘플 수	양성 수	%
혈액 배양물		52	9	17.3%
RT-PCR		52	9	17.3%
PCR	BCSP-31KDa	52	9	17.3%
	16S-rRNA	52	9	17.3%
	BCSP	52	9	17.3%
	AMOS	52	9	17.3%

양성 혈액 52두 중 9두에서 브루셀라균이 분리되었다. 균분리된 배양액을 대상으로 gap 유전자를 이용한 실시간 PCR을 실시한 결과, 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었으며(도 13), 본 실험에 이용한 브루셀라 특이적인 PCR 4종으로 확인한 결과 동일한 결과가 확인되었다(도 14: BCSP-31 KDa 유전자 특이적인 PCR 검출(223bp); 도 15: 16S-rRNA 유전자 특이적인 PCR 검출(905bp); 도 16: BCSP 유전자 특이적인 PCR 검출(711bp); 도 17: AMOS 특이적인 PCR 검출(498bp)).

도 1 내지 도 4는 31 KDa - BCSP 유전자 프라이머, BCSP 유전자 프라이머, 16S-rRNA 유전자 프라이머 및 AMOS-PCR 유전자 프라이머를 이용한, 여러가지 브루셀라 균주에 대한 PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 브루셀라 속 균주의 gap 유전자의 다중 정렬 결과이다.

도 6은 실시간 PCR을 위한 gap 프라이머 및 Tapman 프로브를 설계하는 과정을 나타낸 것이다.

도 7은 gap 유전자에 대한 정방향 프라이머 서열의 BLAST 분석 결과이다.

도 8은 gap 유전자에 대한 역방향 프라이머 서열의 BLAST 분석 결과이다.

도 9는 gap 유전자에 대한 Taqman 프로브 서열의 BLAST 분석 결과이다.

도 10은 브루셀라 균주에 대한의 실시간 PCR 증폭 곡선을 나타낸 것이다.

도 11은 시겔라 소네이, 에셰리키아 콜리, 살모넬라 종, 스트필로코커스 아우레우스, 바실러스 안트락스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 바실러스 세루우스, 비브리오 콜레라, 리스테리아 모노사이토게네스의 DNA를 대상으로 gap 유전자를 이용한 TaqMan 프로브의 특이도를 검사한 결과이다.

도 12는 브루셀라균 DNA를 클로닝한 플라스미드를 1 X 10⁶pg에서 1 X 10¹pg까지 연속 희석하고 이를 주형 DNA로 사용하여 농도별로 실시간 PCR한 결과이다.

도 13은 혈액에서 분리한 균의 배양액을 대상으로 브루셀라 검출하기 위한 실시간 PCR 결과이다.

도 14는 혈액에서 분리한 균의 배양액에서 브루셀라 균주를 동정하기 위한 BCSP-31 KDa 유전자 특이적인 PCR 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 15는 혈액에서 분리한 균의 배양액에서 브루셀라 균주를 동정하기 위한 16S-rRNA 유전자 특이적인 PCR 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 16은 혈액에서 분리한 균의 배양액에서 브루셀라 균주를 동정하기 위한 BCSP 유전자 특이적인 PCR 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 17은 혈액에서 분리한 균의 배양액에서 브루셀라 균주를 동정하기 위한 AMOS 특이적인 PCR 검출 결과를 나타낸 것이다.

<110> KOGENE BIOTECH CO.LTD GYEONGSANGBUK-DO VETERINARY SERVICE LABORATORY <120> METHOD FOR DETECTION BRUCELLOSIS USING REAL TIME PCR <130> DP080029 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 cgctggacac catgcacaa 19 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gggtcgggac gcgaatg 17 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 tctctaccgc gcccg 15

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는, 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트.
서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프라이머 세트; 및

서열번호 3의 염기서열을 갖는 브루셀라 속 균주에 특이적인 프로브;

를 포함하는, 브루셀라 속 균주를 특이적으로 검출하기 위한 실시간 PCR 검출 세트.
제 2항에 있어서, 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단이 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, Cy5, MGB 및 BHQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 표지인자로 표지되는 것을 특징으로 하는 검출 세트.
시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제 2항 또는 제3항의 실시간 PCR 검출 세트를 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및

상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 브루셀라 속 균주의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는, 브루셀라 속 균주를 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 브루셀라 속 균주는 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 아보르투스(B abortus), 브루셀라 캐니스(B canis) 및 돼지의 브루셀라 수이스(B suis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항 또는 제3항의 브루셀라 속 균주 검출용 실시간 PCR 검출 세트를 포함하는 브루셀라 속 균주를 검출하기 위한 검출 키트.