KR101437389B1 - 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법 - Google Patents

브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 개 브루셀라 균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 개 브루셀라 병을 일으키는 브루셀라 캐니스 균만을 특이적으로 검출하여 개 브루셀라 병을 신속하게 검색 및 진단할 수 있어, 병의 전염경로, 역학적 연구, 진단 및 치료 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법{Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same}
본 발명은 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트, 및 이를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출 방법에 관한 것이다.
브루셀라병은 잠복기가 긴 만성 전염병으로, 전 세계적으로 발생하고 있다. 특히 소 브루셀라병은 암소의 임신, 유산 등의 번식 장애를 일으키고, 수소에서는 고환염, 전립선염 등의 생식기 질환을 일으켜, 국내에서는 2종 가축전염병으로 분류되어, 검진 및 살처분의 근절 대책이 확립되어 있다. 또한, 소 브루셀라병은 소 뿐만 아니라 사람에게도 감염되어 파상열, 관절통, 오한, 쇠약 등 감기와 유사한 증상을 일으키는 인수공통전염병으로, 치료하지 않을 경우 심내막염 및 척추염 등으로 진행되어 사망에 이를 수 있다. 또한, 제3군 법정 전염병으로 분류되어 공중위생상 매우 중요한 질병으로 취급되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계적으로 근절을 위해 많은 노력을 기울이고 있다.
브루셀라속 균주는 숙주 특이성, 배양 성상, 생화학적 및 혈청학적 특성에 따라 염소 및 면양의 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 소의 브루셀라 아보투스(B. abortus), 돼지의 브루셀라 수이스(B. suis), 양의 브루셀라 오비스(B. ovis), 개의 브루셀라 캐니스(B. canis), 사막 쥐의 브루셀라 네오토매(B. neotomae)와, 최근에 해양 포유류인 바다사자, 물범, 돌고래 등에서 분리된 브루셀라 세티(B. ceti, 고래류)와 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis, 바다표범류) 등으로 분류된다. 이 중에서 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 아보투스, 브루셀라 수이스 등 3종이 사람에게 병원성이 있는 것으로 알려져 있으며, 브루셀라 캐니스도 발생 사례가 보고되고 있다.
브루셀라병의 진단은 원인균의 분리와 항체 검사로 실시되고 있다. 그러나, 균주 분리에는 생물학적 안전성이 확보된 밀폐된 실험실에서 최소 10일에서 30일의 균 배양기간이 소요되며, 균을 동정하기 위해 25가지의 생화학적 성상 검사에 5일 정도의 추가 소요 기간이 필요하다. 뿐만 아니라, 균을 취급하는 실험실과 실험자에 대한 생물학적 안전성(biosafety)이 확보되어야 하며, 실험자의 숙련도에 따라 생화학적 성상 검사에 다소 차이가 나 정확한 동정이 곤란한 문제점이 있다. 이에 따라 일반적으로 항체검사에 의한 양성 반응우의 색출 방법이 전 세계적으로 많이 이용되고 있다.
브루셀라병을 근절하기 위한 질병진단체계 수립시에 고려되어야 할 사항 중 첫 번째는 감염 집단내 감염 개체를 색출할 수 있는 진단 체계와 특이도 보다는 민감도가 우수한 진단법을 사용하는 것이다. 신속 간단하고 저렴한 진단법이 가장 이상적이고 효율적이다. 두 번째는, 균주 분리 및 동정을 위한 진단 체계가 확립되어야 한다. 특히 브루셀라병에 대한 예방 접종을 실시할 경우에는 백신주와 야외주의 감별을 위한 진단 방법이 마련되어야 하며, 이러한 점을 고려할 때 PCR기법을 이용하여 분리주의 감별 및 동정을 위한 진단체계를 수립하는 것이 바람직하다. 세 번째로 고려할 사항은, 브루셀라병 발생의 역학적 상황을 조사하기 위해 감염원의 색출 및 유입경로를 추적할 수 있는 유전학적 분석에 기인한 프로파일링(profiling) 기법에 관한 것이다.
현재 많이 사용되고 있는 혈청학적 진단 방법은 유사 항원 결정기를 가진 세균의 LPS의 교차반응에 의해 위양성 반응이 나타나지만, 이를 감별할 수 있는 정확한 검사 방법이 마련되어 있지 않은 상황이다. 브루셀라병 근절단계에 도달한 몇몇 국가에서도 위양성 반응에 따른 브루셀라병 발생으로 인한 정책의 혼선이 발생되기 때문에, 신속 정확한 원인체의 분리 및 동정을 위한 PCR 기법 등을 이용한 진단체계의 마련이 필요한 실정이다.
최근 분자 유전학의 발전과 함께 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reactiono, PCR)을 이용한 여러 가지 브루셀라병 진단 기법이 개발되어 실시되고 있으며, 감염집단을 검색하기 위해 유즙 내의 특이 유전자 부위를 검출하는 방법, 양성 집단내 감염개체를 색출하기 위한 개체 검사 방법, 분리한 균의 동정을 위한 동정방법 및 동정된 균의 분자유전학적 분석을 실시하여 감염원의 유입경로 등을 밝혀내는 역학 조사에 PCR 방법이 많이 이용되고 있다.
한편, 개 브루셀라병은 브루셀라 캐니스(B. canis)에 의해 주로 발생하며 브루셀라속 균 중 사람에게도 감염될 수 있는 인수공통병원체로 알려져 있다. 국내에서도 번식견을 중심으로 개 브루셀라병 발생이 보고되고 있으며 이에 대한 정확한 진단이 필요한 실정이다. 개 브루셀라병은 주로 혈청학적진단법인 B. canis M- strain을 이용한 rapid Rose-Bengal test 또는 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 첨가한 Rose-Bengal test로 검색하거나 최근 개발된 Dip-stick kit(immuno-chromatography kit)를 사용하고 있으나 진단의 민감도가 약 90% 내외로 알려져 있어 정확한 진단을 위하여 추가적인 다른 진단법과 함께 수행하여야한다. 보통 혈청학적 검사법과 함께 전혈에서 균 분리 동정을 수행하지만 이 방법은 시간과 비용이 많이 들고 실험자의 위험 등 여러 가지 문제점을 안고 있다.
최근 이와 같은 단점을 극복하기 위해서 유전자를 이용한 분자생물학적인 기법으로 브루셀라 균을 좀 더 쉽게 감별하려는 시도가 계속되고 있다. 하지만 브루셀라 균은 DNA 유사도가 매우 높아 아직까지도 브루셀라 캐니스 만을 특이적으로 진단할 수 있는 일반 PCR법은 보고되지 않고 있다. 비록 감별 진단법으로 Bruce-ladder PCR법이나 멀티플렉스 PCR(advanced multiplex PCR)법이 있지만 균을 감별하기 위해서 민감도가 낮아 일반적으로 사용하기에는 부적합하며 많은 프라이머가 함유되어 있어 상대적으로 비용이 매우 고가이다. 또한 SNP를 이용한 실시간 PCR법이 있지만 고가의 전문적인 장비와 비용이 소요되는 등 동물병원이나 일선 방역기관에서 일반적으로 사용하기에는 문제점이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 일반 PCR을 이용하여 브루셀라 캐니스 균을 특이적으로 동정할 수 있는 PCR 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 브루셀라 캐니스 균만을 동정함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 브루셀라 캐니스 균(개 브루셀라 균; Brucella canis) 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브루셀라 캐니스(개 브루셀라 균; Brucella canis)균 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명은 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트를 이용한 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브루셀라 캐니스 균 동정용 프라이머 세트는, 다양한 브루셀라 종(species) 중에서 개 브루셀라 병을 일으키는 브루셀라 캐니스 균만을 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어, 개 브루셀라 병을 신속하게 검색 및 진단할 수 있도록 하는 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트가 특이적으로 브루셀라 캐니스 균을 동정하는 것을 확인한 도이다(레인 M:100bp DNA 레이더; 레인 1: 브루셀라 아보투스 544(B. abortus 544); 레인 2: 브루셀라 캐니스 RM6/66(B. canis RM6/66); 레인 3: 브루셀라 수이스(B. suis 1330); 레인 4: 브루셀라 오비스(B. ovis); 레인 5: 브루셀라 네오토매(B. neotomae); 레인 6: 브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis); 레인 7: 브루셀라 세티(B. ceti); 레인 8: 브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis); 레인 9:브루셀라 마이크로티(B. microti); 레인 10: 브루셀라 이노피나타(B. inopinata); 레인 11: 에셔리키아 콜리 O157:H7(E. coli O157:H7); 레인 12: 파스텔라 멀토시다(P. multocida); 레인 13: 살모넬라 엔테리카(S. enterica); 레인 14: 예르시니아 엔테로콜리티카 O:9(Yersinia enterocolitica O:9); 레인 15: 오크로박트룸 안트로피(Ochrobactrum anthropi); 레인 16: 캄피오박터 제주니(C. jejuni); 레인 17: 스파필로코커스 아우레우스(S. aureus) 레인 18: 크로스트리디움 펄프리겐스(Clostridium perfrigens); 레인 19: 음성 대조군).
도 2는 본 발명의 프라이머 세트의 민감도를 확인한 도이다(M 레인: 100-bp DNA ladder; 레인 1: 60 ng/㎕; 레인 2: 6 ng/㎕; 레인 3: 0.6 ng/㎕; 레인 4: 60 pg/㎕; 레인 5: 6 pg/㎕; 레인 6: 0.6 pg/㎕; 레인 7: 60 fg/㎕; 레인 8: 증류수).
본 발명은 브루셀라 캐니스 균(개 브루셀라 균; Brucella canis) 특이적 동정용 프라이머 세트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트는 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용하는 용어인프라이머란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에서 사용하는 용어인 동정은 시료에서 다른 미생물뿐만 아니라 동종의 브루셀라 균중에서 브루셀라 캐니스 균을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트를 제공한다.
상기 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트는 상기의 프라이머 세트 이외에, 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 미생물 검출키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 조인자 등일 수 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
상기 브루셀라 캐니스 균 동정용 PCR 키트에는 브루셀라 캐니스 판별용 배지 또는 상기 배지를 포함하는 균주 배양용 장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 균주 배양용 장치는 상기 배지 특히, 바람직하게는 고체상의 상기 배지와 상기 배지가 적재되어 있는 용기로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 브루셀라 캐니스 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 캐니스 균의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스에만 결손된 유전자 부위를 분석하여 제작하였고, 상기의 프라이머를 이용하여 10종, 22 생태형(biovar)의 브루셀라 표준 균주, 93개 브루셀라 캐니스 분리 균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스만 특이적으로 검출할 수 있으며, 6 pg/㎕ 농도의 DNA에서도 브루셀라 캐니스의 존재 여부를 검출할 수 있는 민감도가 높은 프라이머 세트로서 개 브루셀라 병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변, 조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래등을 포함한다.
상기의 방법은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스 균을 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 브루셀라 캐니스를 특이적으로 동정하는 PCR 프라이머 세트의 제작
브루셀라 캐니스(B. canis)만을 특이적으로 증폭할 수 있는 새로운 프라이머를 제작하기 위하여 10종의 브루셀라 균의 전장 유전체 및 부분 유전체를 분석한 결과, 브루셀라 캐니스에만 결손된 12bp 크기의 유전자 부위를 확인하였다. 상기 결손된 12bp를 중심으로 브루셀라 캐니스의 염색체 Ⅱ의 BCAN_B0548-0549 유전자 부위에서 브루셀라 캐니스 균 동정용 프라이머를 제작하였으며, 제작된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 제작된 프라이머에 의해서 증폭되는 서열(서열번호 3)은 300bp의 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.
염기서열
정방향 프라이머(forward primer) 5`-CCAGATAGACCTCTCTGGA-3` 서열번호1
역방향 프라이머(reverse primer) 5`-TGGCCTTTTCTGATCTGTTC-3` 서열번호2
[ 실시예 2] 브루셀라 캐니스 특이적 동정
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머가 브루셀라 캐니스를 특이적으로 동정 하는지 확인하기 위하여 10종, 22 생태형(biovar) 브루셀라 표준균주, 93개 브루셀라 캐니스 분리균주와 함께 유전학적, 혈청학적으로 관련된 비 브루셀라균 8종에 대하여 PCR을 수행하였다.
보다 구체적으로, amfiEco PCR premix kit(GenDEPOT)에 제작된 실시예 1의 프라이머 세트(서열번호 1 및 2) 2와 각각의 균주의 DNA 2㎕를 넣고 증류수를 첨가하여 최종부피를 25㎕가 되도록 하여 PCR을 수행하였다. 사용된 PCR premix는 1U Taq DNA 중합효소, 1.75 mM MgCl2 및 0.2 mM dNTP가 포함되어 있다. PCR은 처음에 94℃에서 7분 동안 변성(denaturation) 후, 94℃에서 35초 동안 변성, 59℃에서 40초 동안 결합(anealing) 및 72℃에서 35초 동안 신장(extension)하여 35 사이클을 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 최종 신장하는 조건으로 실시하였다. 증폭된 각각의 DNA를 이용하여 1.5~2.0 % 아가로오즈 젤에서 100V로, 약 60분간 전기영동을 수행하였다. 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.
종 균주명 16S rRNA PCR 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR
브루셀라 종( Brucella species)
브루셀라 아보투스(B. abortus) bv. 1 544 + -
브루셀라 아보투스 bv. 2 86/8/59 + -
브루셀라 아보투스 bv. 3 Tulya + -
브루셀라 아보투스 bv. 4 292 + -
브루셀라 아보투스 bv. 5 B3196 + -
브루셀라 아보투스 bv. 6 870 + -
브루셀라 아보투스 bv. 9 C68 + -
브루셀라 캐니스(B. canis ) RM6/66 + +
브루셀라 수이스(B. suis) bv. 1 1330 + -
브루셀라 수이스 bv. 2 Thomsen + -
브루셀라 수이스 bv. 3 686 + -
브루셀라 수이스 bv. 4 40 + -
브루셀라 수이스 bv. 5 513 + -
브루셀라 오비스(B. ovis ) 63/290 + -
브루셀라 네오토매(B. neotomae) 5K33 + -
브루셀라 멜리텐시스(B. melitensis) bv. 1 16M + -
브루셀라 멜리텐시스 bv. 2 63/9 + -
브루셀라 멜리텐시스bv. 3 Ether + -
브루셀라 세티(B. ceti) B1/94 + -
브루셀라 핀니페디알리스(B. pinnipedialis ) B2/94 + -
브루셀라 마이크로티(B. microti) CCM4915 + -
브루셀라 이노피나타(B. inopinata ) B01 + -
브루셀라 캐니스 94 isolates + +
Non - Brucella organisms
오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi) + -
에셔리키아 콜리(Esherichia coli) O157:H7 - -
파스텔라 멀토시다( Pasteurella multocida - -
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica) - -
예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) O:9 - -
캄피오박터 제주니( Campylobacter jejuni ) - -
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) isolate + -
크로스트리디움 펄프리겐스(Clostridium perfrigens) isolate - -
도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 브루셀라 종 전체를 동정하는데 사용되는 16S rRNA PCR은 다양한 종의 브루셀라 균주뿐만 아니라 오크로박트룸 안트로피 및 스타필로코커스 아우레우스에서도 비특이적인 반응을 나타내었으나, 본 발명의 브루셀라 캐니스 균 특이적 프라이머의 경우, 다른 종의 균주와 비특이적인 반응이 일어나지 않았으며, 브루셀라 균 중에서도 브루셀라 캐니스 균만을 특이적으로 동정함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 프라이머는 유전적으로 유사한 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스 균만을 신속하고 정확하게 동정할 수 있는 프라이머임을 확인하였다.
[ 실시예 3] 브루셀라 캐니스 특이적 프라이머 세트의 민감도 확인.
브루셀라 캐니스를 특이적으로 동정하는 PCR 프라이머 세트의 민감도를 확인하기 위하여, 브루셀라 캐니스 표준 균주의 DNA를 증류수로 10진 계단 희석하여 60 fg/㎕에서 60 ng/㎕까지의 DNA 시료를 준비한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다.
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 브루셀라 캐니스 동정용 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스 표준 균주의 DNA를 6 pg/㎕ 농도까지 검출할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 브루셀라 캐니스 동정용 프라이머 세트는 브루셀라 캐니스 균주를 특이적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 낮은 농도의 브루셀라 캐니스 균주를 민감하게 검출할 수 있는 효과적인 프라이머임을 알 수 있다.
<110> Animal, plant and Fisheries quarnantine and inspection agency <120> Primer set for Brucella canis strain-specific identification and method for detecting Brucella canis strain using the same <130> P-131 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is forward primer for identifying Brucella canis <400> 1 ccagatagac ctctctgga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is reverse primer for identifying Brucella canis <400> 2 tggccttttc tgatctgttc 20 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This is DNA sequence amplified by primer for identifying Brucella canis, called BCAN_B0549-0549 <400> 3 ccagatagac ctctctggat ttgcgagcct cgcctgcctg tgccggcgca gtgaaaagcg 60 gggaggcggc aaggccgatg gccgccaccg tgaacattac ggccctgcgg aaattcatcc 120 gatcaaaaat gttggcgata ttcatgacat gcctcctgtc ttcttgtatg gaagacgttt 180 agcattcgta atttaagcaa tttgccgaag aatcgtgaaa attttcagta aattctatcg 240 atttgggcgg ttcagctgac ataaagaaga aggctggaaa gaacagatca gaaaaggcca 300 300

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하며, 브루셀라 캐니스(Brucella canis) 균의 BCAN_B0548-0549 영역을 표적으로 하는, 브루셀라 캐니스(Brucella canis) 균 특이적 동정용 프라이머 세트.
  2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 브루셀라 캐니스(Brucella canis)균 동정용 PCR 키트.
  3. 제 1항의 브루셀라 캐니스 균 특이적 동정용 프라이머 세트와 생물학적 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물의 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 동물은 사람, 개, 소, 돼지, 양, 고래 및 돌고래로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 검출은 브루셀라 균 중에서 브루셀라 캐니스를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 브루셀라 캐니스 균의 검출방법.
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