CN115948588A - 布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量pcr分种检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量PCR分种检测试剂，其包括针对布鲁氏菌属四个种：牛种、羊种、猪种和犬种的特异性引物和探针，所述的引物探针根据四个种的布鲁氏菌特异性基因片段设计，该试剂用于布鲁氏菌四个种的检测，具有特异性高、敏感性强、检测时间短，安全等优势，并且价格适中；本方法不仅可实现布鲁氏菌检出，而且可以对布鲁氏菌属进行四个种的分类，提高检出率，对临床诊断布鲁氏菌具有重要意义。

Description

布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量PCR分种检测试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量PCR分种检测试剂。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是一种由布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的人畜共患疾病。截止目前，已明确的布鲁氏菌属有10个种，20多个生物型。其中牛种、羊种，猪种和犬种可通过皮肤接触、食入性和呼吸道气溶胶等方式感染人类。

不同种类的布鲁氏杆菌大多具有不同宿主间交叉感染的能力，并具有极为明显的宿主危害倾向性。各生物种之间及各生物型之间致病力有所差异，并且在部分症状上具有差异性。羊种布鲁氏菌致病性最强，侵袭性也相对较强，多数患者出现布病的典型临床症状。牛种布鲁氏菌生物型较多，毒力较羊种弱，但侵袭性更强。人布鲁氏菌病临床表现多样，因感染的病原体，病程阶段以及累及器官系统的不同而异。其中羊种、猪种症状最重，牛种次之，犬种症状最轻。人类感染羊种布鲁氏菌在急性期常表现为：发热、多汗、头痛、肌痛、肝脾淋巴结肿大等症状，且可累及全身任意器官或系统，造成关节炎、脊柱炎、脑膜炎、睾丸炎、心肌炎等疾病。牛种多导致流产，最具特征性的胎儿病变是支气管炎和支气管肺炎。猪种在慢性病例中，睾丸可能变小且萎缩，附睾头脓肿也有报道，睾丸炎的组织学病变严重程度各不相同，但通常以多灶性至融合性变性和生精小管坏死为特征，也伴有跛行和偶尔后麻痹的关节。犬种于1966年首次被发现，男性感染犬种布鲁氏菌病主要通过性和口腔传播，其主要症状包括附睾炎、前列腺炎和睾丸炎；在女性中，病变包括子宫内膜炎、胎盘炎和晚期流产；感染犬种布鲁氏菌可导致男性或女性不育；并且还可能导致眼部和骨骼病变(椎间盘炎)，与其他三个种相比犬种感染后一般不发热。在中国地区流行主要以羊种为主，目前发现中国地区羊种、牛种、猪种均有流行，犬种还未在中国地区发现，可能是由于诊断不足等原因造成。

布鲁氏菌病的特征是临床表现多变，从无明显症状到多器官病变。抗生素通常用于治疗布鲁氏菌病，并可能抑制病原体的复制。目前已报道不同种的鲁氏菌对抗生素敏感性不同，犬种对头孢噻吩、氨苄西林和庆大霉素容易产生耐药，羊种对克拉霉素和阿奇霉素耐药，牛种对链霉素、红霉素和利福平敏感性低，而在羊种和猪种中出现了利福平和氟喹诺酮类耐药的现象。WHO推荐采用多西环素联合利福平或链霉素进行治疗，羊种、猪种感染者使用四环素与链霉素方案效果较好。因此布鲁氏菌分种在临床诊疗过程中具有重要意义，可以更加精确的指导临床用药。

布鲁氏菌病分种诊断的金标准是分离布鲁氏菌后进行生理生化鉴定。传统的方法不仅耗时长，而且对人员及操作的生物安全等级较高。而抗原抗体等血清学检测方法灵敏度差，且无法进行种型间的区分。荧光PCR技术具有简单快速，是当前的主流技术，根据种型特异性基因设计引物探针，可实现精准检测及分种，更好地为临床诊断和治疗提供有力依据。

发明内容

针对现有布鲁氏菌分种检测的不足，本发明提供了一种多重荧光定量PCR检测布鲁氏菌属四个种(牛种、羊种、猪种、犬种)的试剂，本发明针对牛种alkB基因、羊种IS711基因、猪种BS1330_II0657基因、犬种omp25基因设计特异性引物和探针，此外根据GAPDH基因设计引物探针，作为内标基因。本发明的检测试剂不仅具有检测灵敏度高、特异性强、操作安全简单、时效性、所需时间短等优点，而且还能准确地对布鲁氏菌属进行分种，对临床诊断和精准用药提供有利指导，具有较大的应用价值。

其中针对布鲁氏菌牛种的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、针对布鲁氏菌羊种的特异性引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、针对布鲁氏菌猪种的特异性引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、针对布鲁氏菌犬种的特异性引物为SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11；

针对布鲁氏菌牛种的探针为SEQ ID NO:3、针对布鲁氏菌羊种的探针为SEQ IDNO:6、针对布鲁氏菌猪种的探针为SEQ ID NO:9、针对布鲁氏菌犬种的探针为SEQ ID NO:12；

本发明试剂还包括GAPDH基因的引物和探针，针对GAPDH的探针为SEQ ID NO:15，引物序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。

本试剂中还包括用于多重荧光定量PCR的其他常规试剂。

使用上述多重荧光定量PCR检测试剂的方法如下：

1、收集临床患者全血样本1mL于抗凝管中，采样时核对患者信息，并记录，登记入册，运输过程低温保藏，后置于-80℃保存；

2、用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取血液中布鲁氏菌基因组的DNA；

3、以步骤2中提取的DNA为模板，采用针对布鲁氏菌四个种的特异性引物和探针，进行多重荧光定量PCR检测，以GAPDH基因为内参，根据Ct值进行结果判定；其中反应程序为95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，40个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。

检测结果判读包括如下内容：(1)扩增曲线呈标准“S”型且无异常波动。内参(GAPDH基因)Ct值≤36，阴性对照组、无模板对照组无Ct值，实验视为有效，如不符合须再次进行多重荧光定量PCR检测，或重新提取核酸进行多重荧光定量PCR检测；(2)病原体Ct值≤38.0，则为阳性，若38＜Ct≤40，复检一次仍是38＜Ct≤40，则为阴性；(3)CT值显示UNDFT，样本低于检测限，结果为阴性。

本发明相比现有技术具有如下优势：

本发明建立了布鲁氏菌属四个种(牛种、羊种、猪种、犬种)的多重荧光定量PCR检测方法，对该方法进行特异性评价发现病原体之间均无交叉反应，且特异性良好，能准确地对四个种的布鲁氏菌进行区分，灵敏度评价发现猪种布鲁氏菌的灵敏度均达到100copies/μL，其余三个种的灵敏度均达到1000copies/μL；对该方法进行重复性评价发现各组病原体在批间和批内的变异系数(CV)均小于5，重复性良好；通过检测10例布鲁氏菌临床样本进行多重qPCR准确性评价，结果发现多重qPCR方法准确性良好，可以用于临床用药指导。

附图说明

图1为多重荧光定量PCR体系(第①体系)反应结果；

图2为多重荧光定量PCR体系(第②体系)反应结果；

图3为多重荧光定量PCR体系(第③体系)反应结果；

图4羊种布鲁氏菌单重qPCR特异性实验结果；

图5牛种布鲁氏菌单重qPCR特异性实验结果；

图6猪种布鲁氏菌单重qPCR特异性实验结果；

图7犬种布鲁氏菌单重qPCR特异性实验结果；

图8布鲁氏菌四种生物型(牛种、羊种、猪种、犬种)多重qPCR特异性实验结果；

图9羊种布鲁氏菌多重qPCR灵敏度实验结果；

图10牛种布鲁氏菌多重qPCR灵敏度实验结果；

图11猪种布鲁氏菌多重qPCR灵敏度实验结果；

图12犬种布鲁氏菌多重qPCR灵敏度实验结果；

图13内参GADPH基因的多重qPCR灵敏性试验结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1：特异性引物和探针的设计

1、在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中下载病原体基因参考序列如下：牛种布鲁氏菌alkB基因、羊种布鲁氏菌IS711基因、猪种布鲁氏菌BS1330_II0657基因、犬种布鲁氏菌omp25基因各20条；

2、使用Mega 7软件对核苷酸序列进行对齐，使用Primer Select软件设计引物与探针；

3、引物与探针BLAST评估：初步设计完成的引物探针核苷酸序列，再次使用NCBI网站中的BLAST检索功能，进行比对，选择特异性高的引物、探针序列；

靶向布鲁氏菌属四个种(牛种、羊种、猪种、犬种)及内参GAPDH基因的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:15所示，见下表：

实施例2：多重荧光定量PCR方法的建立

1、质粒的构建

将牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌的特异性基因序列与pUC57载体连接，合成布鲁氏菌阳性参考品，质粒构建由中美泰和生物技术北京有限公司完成；通过紫外分光光度计进行浓度测定，根据各个质粒长度和浓度计算出质粒的拷贝数，计算公式如下：

拷贝数结果如下表所示：

将阳性质粒按10倍稀释法梯度稀释，设置六个浓度10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10¹⁰copies/μL，用以检测该方法最低检测浓度。

2、多重荧光定量反应体系优化

根据预实验结果，选取引物浓度为150nmol/L-400nmol/L，探针终浓度为125nmol/L，进行多重荧光定量PCR最佳引物探针优化。反应体系为2×Pro TaqHS Probe Premix II20μL、模板5μL，加入无菌水补充至40μL，调整引物探针加入量，并进行组合；各引物探针浓度加入量如下表所示：

以拷贝数为10⁴copies/μL的阳性参考品作为模板，使用艾科瑞生物公司的ProTaq HS预混型探针法试剂盒，进行多重荧光定量PCR检测。使用的实时荧光定量PCR仪为博日FQD-96a，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，40个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号，检测结果如图1-3所示，通过比较Ct值的平均值和Ct值标准偏差大小，以及试验组的扩增曲线等综合指数，最终确定组合②为最优的引物探针浓度组合，即羊种：1.5μL，犬种:1.4μL，牛种0.6μL、猪种：0.6μL。

实施例3：多重荧光定量PCR特异性、灵敏度、重复性评价

1、多重荧光定量PCR特异性评价

选取10⁴copies/μL的布鲁氏菌阳性参考品，以及与布鲁氏菌感染具有相似临床症状的6种病原体：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌，进行多重荧光定量PCR特异性检测，反应体系如下：

扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性3s，58℃退火并延伸30s，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号。使用艾科瑞生物公司Pro Taq HS预混型探针法qPCR试剂盒进行多重荧光定量PCR检测，结果如图8所示，从以上结果可以看出仅阳性参考品出现扩增曲线，为阳性，其余六种菌株均为阴性，说明多重荧光定量PCR检测特异性良好；

再分别使用牛种、羊种、猪种和犬种的特异性引物和探针检测4种类型病原体的混合质粒模板，反应条件、体系如上，结果如图4-7；从以上结果可以看出各组病原体之间均无交叉反应，说明多重荧光定量PCR特异性良好；

根据图4-8，说明本方法能够特异性识别四种布鲁氏菌，且相互之间无交叉反应，特异性良好。

2、多重荧光定量PCR灵敏度评价

多重荧光定量PCR方法对四个种的布鲁氏菌进行灵敏度评价，以确定多重荧光定量PCR检测方法的最低检测下限；采用梯度稀释法，设置10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰(copies/μL)8个浓度，使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，40个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号；反应体系同实施例3步骤1；

结果如图9-12所示，图中扩增曲线从左至右分别是10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰(copies/uL)，分析检测结果可知猪种布鲁氏菌的灵敏度均达到100copies/μL，其他三种的灵敏度均达到1000copies/μL；图13结果显示内参GADPH基因的检测限达到100copies/μL量级。

3、多重荧光定量PCR重复性评价

为了验证多重qPCR检测方法的重复性，用10⁴copies/μL的质粒作为模板进行实验，使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，40个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号；其反应体系同实施例3步骤1；

分别进行组内和组间重复性实验；以布鲁氏菌属四个种的特异性引物和探针对质粒模板进行检测，批内重复：同一时间重复进行三次，观察记录其Ct值；批间重复：每周三进行重复性检测，连续进行三周，观察记录其Ct值。根据如下公式计算CV值：

在10⁴copies/uL的质粒浓度下分别进行批内和批间重复性检测，每个病原体在模板浓度相同的情况下变异系数(Coefficient of Variation，CV)均小于5，说明mqPCR方法的重复性良好，重复性结果如下表；

实施例4：多重荧光定量PCR临床样本的检测

1、样本来源

收集10例临床布鲁氏菌羊种患者1mL全血至无菌EP管中，仔细核对患者信息，做好标记，并登录在册，在运输全程储存在4℃，保存在-80℃直至提取核酸；

2、核酸提取

采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作步骤如下：

a、实验前准备，使用天根血液基因组DNA提取试剂盒前，先在漂洗液PWB中加入200mL无水乙醇；

b、样品分装：分装200μL菌液至新的EP管中，利用移液器加200μL Buffer AP1至EP管中；

c、向EP管中加入200μL缓冲液GB和20μL Proteninase K，并充分颠倒混匀后防御水浴锅中56℃水浴加热100min，期间每两分钟上下颠倒混匀(溶液加热后，颜色便深且清凉无浑浊)；

d、室温放置3分种后，加入350μL缓冲液BD，并充分颠倒混匀，出现絮状沉淀；

e、将步骤d中得到的溶液和絮状沉淀加入吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入收集管中；

f、向收集管中加入600μL漂洗液PWB(确认使用前已加入无水乙醇)12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱放入吸附管中；

g、12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱室温放置5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

h、将吸附柱放入新的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加75μL缓冲液TB(已56℃水域加热)，将溶液收集到离心管中。

3、多重qPCR检测

以步骤2提取的核酸作为模板，使用博日FQD-96a实时荧光定量PCR仪进行检测，扩增反应程序为：反应程序95℃预变性30s；95℃变性5s，58℃退火并延伸30s，40个循环；在每个循环的退火延伸阶段收集荧光信号；反应体系同实施例3步骤1；

同时采用常规细菌培养法检测作为对照，结果见下表：

样品编号	荧光定量结果	MqPCR Ct值	细菌培养结果
				GGJ	羊种	23.14	羊种
FHJ	羊种	23.57	羊种
				LZH	羊种	23.81	羊种
LYC	羊种	23.47	羊种
				LCH	羊种	23.52	羊种
DQX	羊种	22.59	羊种
				SGX	羊种	23.86	羊种
YJL	羊种	23.63	羊种
				WBF	羊种	23.12	羊种
WBH	羊种	23.69	羊种

由上表可知，本发明开发的布鲁氏菌属四个种(牛种、羊种、猪种、犬种)的多重荧光定量PCR分种检测试剂，具有高效、灵敏、安全等优势，即可以对细菌培养或一代测序的结果起到很好的补充作用，还可以对布鲁氏菌属的四个种进行准确分种，对临床诊断及精准治疗提供有力支持。

Claims (1)

1.一种布鲁氏菌属四个种的多重荧光定量PCR分种检测试剂，其特征在于：包括针对布鲁氏菌属四个种：牛种、羊种、猪种和犬种的特异性引物和探针；

其中针对布鲁氏菌牛种的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、针对布鲁氏菌羊种的特异性引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5、针对布鲁氏菌猪种的特异性引物为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、针对布鲁氏菌犬种的特异性引物为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11、针对GAPDH的特异性引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；

针对布鲁氏菌牛种的探针为SEQ ID NO:3、针对布鲁氏菌羊种的探针为SEQ ID NO:6、针对布鲁氏菌猪种的探针为SEQ ID NO:9、针对布鲁氏菌犬种的探针为SEQ ID NO:12、GAPDH的特异性探针为SEQ ID NO:15。

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