CN111876502A

CN111876502A - 双重实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌s2疫苗株的方法及其使用的成套试剂

Info

Publication number: CN111876502A
Application number: CN202010738876.1A
Authority: CN
Inventors: 董浩; 原霖; 王传彬; 顾小雪; 魏巍; 韩焘; 赵柏林; 毕一鸣; 徐琦
Original assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural And Rural Department Slaughter Technology Center)
Current assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural And Rural Department Slaughter Technology Center)
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: CN111876502B

Abstract

本发明公开了双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法及其使用的成套试剂。成套试剂由引物Bru‑F1、引物Bru‑R1、探针Bru‑Probe1、引物S2‑F2、引物S2‑R2和探针S2‑Probe2组成，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1—SEQ ID NO:6所示。与其他布鲁氏菌核酸检测方法相比，本发明建立的方法是直接通过荧光信息对布鲁氏菌S2疫苗株进行定性、定量，且同时进行分析鉴定，具有便捷、准确、灵敏、特异等优点，大大缩短了检测时间，对于布鲁氏菌病的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防布病疫情的大规模爆发，保障畜牧业的发展和公共卫生安全。

Description

双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法及其使用的成套试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法及其使用的成套试剂。

背景技术

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella spp.)引起的一种重要的人畜共患传染病。布病在畜群和人间布病感染率逐年上升，并在维持在较高水平，持续对公共卫生安全和畜牧业的发展构成危害。

疫苗免疫是流行率较高的地区控制布鲁氏菌病的最有效的方法之一。根据原农业部和卫计委印发的《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020年)》的相关规定，对一类地区的牛羊场群采取全面免疫，奶畜原则上不免疫的措施。我国目前使用的布病疫苗主要有布鲁氏菌A19疫苗、布鲁氏菌S2疫苗和布鲁氏菌M5疫苗。其中布鲁氏菌S2疫苗是使用最多的布病疫苗，同时也是唯一一种可以对怀孕动物进行免疫的疫苗。

动物布病的检测主要以血清学检测方法为主，但是现有血清学检测方法与大肠杆菌、耶尔森菌的部分血清型存在交叉反应，同时我国所使用的布病疫苗产生的免疫抗体和野毒株自然感染抗体无法进行区分。截止目前，还没有一种能快速鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的鉴定方法。

荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种对基因组进行检测的相对定量技术。与普通PCR技术相比，qPCR增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用寡核苷酸探针实现相似性较高基因的检测。目前，qPCR已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的检测等领域。因此，基于布鲁氏菌S2疫苗株和其它布鲁氏菌基因组水平的差异，建立一种准确、特异、快速地鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的荧光定量PCR方法对于布病的防控具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是鉴定布鲁氏菌S2疫苗株。

本发明首先保护鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的成套试剂，可为成套试剂2和/或成套试剂1。

所述成套试剂2可包括引物Bru-F1、引物Bru-R1、探针Bru-Probe1、引物S2-F2、引物S2-R2和探针S2-Probe2。

所述成套试剂1可包括所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、引物S2-F1、引物S2-R1和探针S2-Probe1。

所述引物Bru-F1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示。

所述引物Bru-R1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:2所示。

所述探针Bru-Probe1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示。

所述引物S2-F2的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示。

所述引物S2-R2的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。

所述探针S2-Probe2的核苷酸序列可如SEQ ID NO:6所示。

所述引物S2-F1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:7所示。

所述引物S2-R1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:8所示。

所述探针S2-Probe1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:9所示。

所述探针Bru-Probe1的5′末端可具有荧光报告基团甲，3′末端可具有荧光淬灭基团甲。

所述探针S2-Probe2的5′末端可具有荧光报告基团乙，3′末端可具有荧光淬灭基团乙。

所述探针S2-Probe1的5′末端可具有荧光报告基团丙，3′末端可具有荧光淬灭基团丙。

荧光报告基团乙和荧光报告基团丙可以相同，也可以不同。

荧光淬灭基团乙和荧光淬灭基团丙可以相同，也可以不同。

荧光报告基团甲与荧光报告基团乙不同，与荧光报告基团丙也不同。

荧光淬灭基团甲与荧光淬灭基团乙不同，与荧光淬灭基团丙也不同。

所述荧光报告基团甲具体可为VIC荧光报告基团。所述荧光淬灭基团甲可为BHQ1荧光淬灭基团。

所述荧光报告基团乙和所述荧光报告基团丙具体可为FAM荧光报告集团。所述荧光淬灭基团乙和所述荧光淬灭基团丙具体可为MGB荧光淬灭基团。

所述成套试剂2具体可由所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、所述引物S2-F2、所述引物S2-R2和所述探针S2-Probe2组成。

所述成套试剂1具体可由所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、所述引物S2-F1、所述引物S2-R1和所述探针S2-Probe1组成。

本发明还保护上述任一所述的成套试剂的应用，可为e1)-e3)中的至少一种：

e1)制备用于鉴定或辅助鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒；

e2)鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有或疑似含有布鲁氏菌S2疫苗株；

e3)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株。

本发明还保护含有上述任一所述的成套试剂的试剂盒。

本发明还保护所述试剂盒的应用，可为e2)或e3)：

本发明还保护上述任一所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护鉴定待测样品是否含有或疑似含布鲁氏菌S2疫苗株的方法。

本发明所保护的鉴定待测样品是否含有或疑似含布鲁氏菌S2疫苗株的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：以待测样品的核酸为模板，以上述任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌(可能同时也含有布鲁氏菌S2疫苗株)；如果检出一种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果未检出荧光信号，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

本发明所保护的鉴定待测样品是否含有或疑似含布鲁氏菌S2疫苗株的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：以待测样品的核酸为模板，以上述任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌(可能同时也含有布鲁氏菌S2疫苗株)；如果获得1条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果不能获得S形扩增曲线，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

上述任一所述方法中，所述待测样品具体可为羊的阴道拭子、牛的阴道拭子、牛奶、羊奶、病畜的流产物、组织脏器(如羊的组织脏器、牛的组织脏器)或环境样品(如饲养羊的环境样品、饲养牛的环境样品)。

本发明还保护鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株的方法。

本发明所保护的鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株的方法，具体可为方法甲，包括如下步骤：以待测菌的核酸为模板，以上述任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果检出一种荧光信号，则待测菌为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株；如果未检出荧光信号，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌。

本发明所保护的鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株的方法，具体可为方法乙，包括如下步骤：以待测菌的核酸为模板，以上述任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果获得1条S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株；如果不能获得S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌。

上述任一所述方法中，当成套试剂为成套试剂2时，双重实时荧光定量PCR的反应体系具体可为反应体系1，总体积为20μL，由10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、引物Bru-F1水溶液、引物Bru-R1水溶液、探针Bru-Probe1水溶液、引物S2-F2水溶液、引物S2-R2水溶液、探针S2-Probe2水溶液、模板和水组成。反应体系中1，引物Bru-F1、引物Bru-R1、探针Bru-Probe1、引物S2-F2、引物S2-R2和探针S2-Probe2的浓度均可为0.3μM。

上述任一所述方法中，当成套试剂为成套试剂1时，双重实时荧光定量PCR的反应体系具体可为反应体系2，总体积为20μL，由10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、引物Bru-F1水溶液、引物Bru-R1水溶液、探针Bru-Probe1水溶液、引物S2-F1水溶液、引物S2-R1水溶液、探针S2-Probe1水溶液、模板和水组成。反应体系中2，引物Bru-F1、引物Bru-R1、探针Bru-Probe1、引物S2-F1、引物S2-R1和探针S2-Probe1的浓度均可为0.3μM。

上述任一所述方法中，反应程序具体可为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

上述任一所述两种荧光信号，一种为荧光报告基团甲发出的荧光信号，另一种为荧光报告基团乙或荧光报告基团丙发出的荧光信号。

上述任一所述一种荧光信号具体可为荧光报告基团甲发出的荧光信号。

上述任一所述2×

Probe qPCR Master Mix具体可为Promega公司的产品。

本发明针对布鲁氏菌的IS711序列和布鲁氏菌S2疫苗株的缺失序列，设计4条特异性引物和2个探针，组成成套试剂；之后通过对反应体系和反应条件的优化，建立了双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法，实现在同一管中对布鲁氏菌进行鉴别诊断。与其他现行的动物布鲁氏菌病检测的国家标准和行业标准中推荐的布鲁氏菌核酸检测方法相比，本发明建立的方法是直接通过荧光信息对布鲁氏菌S2疫苗株进行定性、定量，且同时进行分析鉴定，具有便捷、准确、灵敏(最低检测限达到1×10¹拷贝/μL)、特异等优点，大大缩短了检测时间，对于布鲁氏菌病的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防布病疫情的大规模爆发，保障畜牧业的发展和公共卫生安全。

附图说明

图1为布鲁氏菌S2疫苗株和其它种布鲁氏菌基因序列的比对结果。

图2为比较三个成套试剂扩增效果。

图3为荧光定量PCR标准曲线。

图4为特异性检测结果。

图5为灵敏度检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，实时荧光定量PCR均采用Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪进行。

Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪、超微量分光光度计(NANODROP2000)和2×

Probe qPCR Master Mix均为Promega公司的产品。

布鲁氏菌S2疫苗株、布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、牛种布鲁氏菌2308株、猪种布鲁氏菌1330株、犬种布鲁氏菌6/66株、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9的核酸均由中国动物疫病预防控制中心提供。

实施例1、用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒的制备

一、用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的成套试剂的筛选

1、本发明的发明人通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，最终以布鲁氏菌基因组中的IS711基因为靶基因，筛选并合成用于检测布鲁氏菌的引物探针组合Bru-F1/Bru-R1/Bru-Probe1；针对S2疫苗株特有的缺失序列(如图1所示)，设计并合成用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的引物探针组合S2-F1/S2-R1/S2-Probe1、S2-F2/S2-R2/S2-Probe2和S2-F3/S2-R3/S2-Probe3。将Bru-F1/Bru-R1/Bru-Probe1分别与S2-F1/S2-R1/S2-Probe1、S2-F2/S2-R2/S2-Probe2和S2-F3/S2-R3/S2-Probe3进行组合，依次获得成套试剂1、成套试剂2和成套试剂3。每个成套试剂均由4个引物和2个探针组成。各个成套试剂的引物和探针的序列详见表1。

表1

2、提取灭活的布鲁氏菌S2疫苗株的总核酸，得到布鲁氏菌S2的总核酸。

3、以布鲁氏菌S2的总核酸为模板，采用成套试剂1、成套试剂2或成套试剂3进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20μL，包括10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、Bru-F1水溶液、Bru-R1水溶液、Bru-Probe1水溶液、上游引物水溶液、下游引物水溶液、探针水溶液、模板和水。名称中含有“S2-F”的为上游引物，名称中含有“S2-R”的为下游引物，名称中含有“S2-Probe”的为探针。反应体系中，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、上游引物、下游引物和探针的浓度均为0.3μM。

反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

检测结果见图2。3个成套试剂的实时荧光定量PCR扩增结果表明，针对布鲁氏菌IS711序列的扩增曲线没有差异，针对S2菌株缺失序列的扩增曲线却显著不同：成套试剂2的扩增曲线的Ct值最小、扩增效率最高且荧光信号强度最强，成套试剂1次之，成套试剂3则基本没有得到S型的扩增曲线。因此，成套试剂2和成套试剂1均可以作为用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的最优成套试剂。

二、用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒的制备

用于鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒由成套试剂2和/或成套试剂1组成。

实施例2、双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法的建立

一、标准曲线的绘制

1、参照NCBI数据库中布鲁氏菌S2疫苗株、布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、牛种布鲁氏菌2308株的全基因组序列，由英潍捷基贸易有限公司人工合成质粒IS711和质粒S2。

质粒IS711中含有布鲁氏菌IS711基因的核苷酸序列。布鲁氏菌IS711基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

质粒S2中含有特异DNA序列。特异DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

布鲁氏菌S2疫苗株不含有该特异DNA序列，其它布鲁氏菌含有该特异DNA序列。

2、用超微量分光光度计(NANO DROP2000)检测质粒IS711和质粒S2的浓度，计算其拷贝数；然后将质粒IS711和质粒S2进行10倍梯度稀释。

3、分别以不同拷贝数的质粒IS711为模板，采用成套试剂2进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20μL，包括10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、Bru-F1水溶液、Bru-R1水溶液、Bru-Probe1水溶液、S2-F2水溶液、S2-R2水溶液、S2-Probe2水溶液、模板和水。反应体系中，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、S2-F2、S2-R2和S2-Probe2的浓度均为0.3μM。

反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

检测结果见图3中A(从左至右质粒IS711的浓度依次为1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL)。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

按照上述步骤，将成套试剂2替换为成套试剂1，其它步骤均不变。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

4、分别以不同拷贝数的质粒S2为模板，采用成套试剂2进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20μL，包括10μL 2×

反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

检测结果见图3中B(从左至右质粒S2的浓度依次为1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL)。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

二、双重实时荧光定量PCR扩增的条件优化

采用单一变量的优化方法，对退火温度、引物浓度、探针浓度等进行优化。

以浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒IS711水溶液和浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒S2水溶液等体积混合并作为模板，采用成套试剂2进行双重实时荧光定量PCR扩增；延伸时进行荧光信号采集，如果可以同时检出VIC荧光信号和FAM荧光信号，则说明可以检测出质粒IS711和质粒S2。

反应体系为20μL，包括10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、Bru-F1水溶液、Bru-R1水溶液、Bru-Probe1水溶液、S2-F2水溶液、S2-R2水溶液、S2-Probe2水溶液、质粒IS711、质粒S2和水。反应体系中，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、S2-F2、S2-R2和S2-Probe2的浓度为0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM或0.8μM。

反应程序为：95℃2min；95℃15s，54-64℃1min，40个循环。

结果表明，退火温度为54-64℃时均能同时检出VIC荧光信号和FAM荧光信号；退火温度为60℃时，双重实时荧光定量PCR的扩增效率最佳，因此最佳退火温度为60℃；通过比较ΔRn最大值和Ct最小值发现，进行双重实时荧光定量PCR的反应体系中，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、S2-F2、S2-R2和S2-Probe2的最佳浓度均为0.3μM。

按照上述步骤，将成套试剂2替换为成套试剂1，其它步骤均不变。结果表明，成套试剂2和成套试剂1的双重实时荧光定量PCR扩增的最佳退火温度，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、S2-F2、S2-R2和S2-Probe2的最佳浓度基本一致。

三、双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法一的建立

1、以待测样品的核酸为模板，采用成套试剂2进行双重实时荧光定量PCR扩增。

反应体系为20μL，包括10μL 2×

Probe qPCR Master Mix、Bru-F1水溶液、Bru-R1水溶液、Bru-Probe1水溶液、S2-F2水溶液、S2-R2水溶液、S2-Probe2水溶液、模板和水。反应体系中，Bru-F1、Bru-R1、Bru-Probe1、S2-F2、S2-R2和S2-Probe2的浓度为0.3μM。

反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

按照上述步骤，将无菌水作为模板，其它步骤均不变，作为阴性对照。

2、完成步骤1后，根据采集的荧光信号(延伸时进行荧光信号采集)进行如下判断：如果同时检出VIC荧光信号和FAM荧光信号，则待测样品中含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌(可能同时也含有布鲁氏菌S2疫苗株)；如果检出VIC荧光信号且未检出FAM荧光信号，则待测样品中含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果未检出VIC荧光信号，也未检出FAM荧光信号，则待测样品中不含有布鲁氏菌。阴性对照未检出VIC荧光信号，也未检出FAM荧光信号。

3、完成步骤1后，根据扩增曲线进行如下判断：如果获得2条“S”形扩增曲线，则待测样品中含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌(可能同时也含有布鲁氏菌S2疫苗株)；如果获得1条“S”形扩增曲线，则待测样品中含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果不能获得“S”形扩增曲线，则待测样品中不含有布鲁氏菌。阴性对照不能获得“S”形扩增曲线。

四、双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法二的建立

按照步骤三，将成套试剂2替换为成套试剂1，其它步骤均不变，建立双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法二；即方法一采用成套试剂2进行双重实时荧光定量PCR扩增，方法二采用成套试剂1进行双重实时荧光定量PCR扩增。

实施例3、特异性检测

1、按照实施例2中步骤三的方法，进行特异性检测。待测样品为布鲁氏菌S2疫苗株、布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、牛种布鲁氏菌2308株、猪种布鲁氏菌1330株、犬种布鲁氏菌6/66株、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157和耶尔森菌O:9。

部分结果见图4(A为布鲁氏菌A19疫苗株，B为布鲁氏菌S2疫苗株)。结果表明，布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、牛种布鲁氏菌2308株、猪种布鲁氏菌1330株和犬种布鲁氏菌6/66株(均为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌)均有2条“S”形扩增曲线，布鲁氏菌S2疫苗株有1条“S”形扩增曲线，金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9和阴性对照均没有“S”形扩增曲线。与预期结果完全一致。

2、按照实施例2中步骤四的方法，进行特异性检测。待测样品同步骤1。

结果表明，布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、牛种布鲁氏菌2308株、猪种布鲁氏菌1330株和犬种布鲁氏菌6/66株(均为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌)均有2条“S”形扩增曲线，布鲁氏菌S2疫苗株有1条“S”形扩增曲线，金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9和阴性对照均没有“S”形扩增曲线。与步骤1的结果完全一致。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒可以鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的特异性高。

实施例4、灵敏度检测

1、按照实施例2中步骤三的方法，进行灵敏度检测。模板为浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒IS711溶液1、1×10⁵拷贝/μL的质粒IS711溶液2、1×10⁴拷贝/μL的质粒IS711溶液3、浓度为1×10³拷贝/μL的质粒IS711溶液4、浓度为1×10²拷贝/μL的质粒IS711溶液5、浓度为1×10¹拷贝/μL的质粒IS711溶液6和浓度为1×100拷贝/μL的质粒IS711溶液7。

检测结果见图5中A(从左至右依次为质粒IS711溶液1—质粒IS711溶液7)。结果表明，检测质粒IS711的灵敏度达到1×10¹拷贝/μL。

2、按照实施例2中步骤三的方法，进行灵敏度检测。模板为浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒S2溶液1、1×10⁵拷贝/μL的质粒S2溶液2、1×10⁴拷贝/μL的质粒S2溶液3、浓度为1×10³拷贝/μL的质粒S2溶液4、浓度为1×10²拷贝/μL的质粒S2溶液5、浓度为1×10¹拷贝/μL的质粒S2溶液6和浓度为1×10⁰拷贝/μL的质粒S2溶液7。

检测结果见图5中B(从左至右依次为质粒S2溶液1—质粒S2溶液7)。结果表明，检测质粒S2的灵敏度达到1×10¹拷贝/μL。

因此，成套试剂2对质粒IS711和质粒S2的最低检测限都达到1×10¹拷贝/μL，10个拷贝也是荧光定量检测方法的检测极限。

3、按照实施例2中步骤四的方法，进行灵敏度检测。模板同步骤1。

结果表明，检测质粒IS711的灵敏度达到1×10¹拷贝/μL。与步骤1的结果完全一致。

4、按照实施例2中步骤四的方法，进行灵敏度检测。模板同步骤2。

结果表明，检测质粒S2的灵敏度达到1×10¹拷贝/μL。

因此，成套试剂1对质粒IS711和质粒S2的最低检测限都达到1×10¹拷贝/μL，10个拷贝也是荧光定量检测方法的检测极限。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒鉴定布鲁氏菌S2疫苗株具有较高的灵敏度。

实施例5、重复性试验

重复性也是判断鉴定方法好坏的重要指标之一，良好的重复性是鉴定结果正确的重要保障。

1、实验重复三次，每次重复的步骤如下：按照实施例2中步骤三的方法进行检测，模板为10²拷贝/μL的质粒IS711溶液a、10⁴拷贝/μL的质粒IS711溶液b、10⁶拷贝/μL的质粒IS711溶液c、10²拷贝/μL的质粒S2溶液A、10⁴拷贝/μL的质粒S2溶液B或10⁶拷贝/μL的质粒S2溶液C。

2、统计三次重复产生的Ct值并计算变异系数。

检测结果见表2。3次重复的Ct值重复性均良好，其变异系数均小于3％。

表2

按照上述方法，将按照实施例2中步骤三的方法进行检测替换为按照实施例2中步骤四的方法进行检测，其它步骤均不变。结果表明，3次重复的Ct值重复性也均良好，其变异系数也均小于3％。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒及鉴定布鲁氏菌S2疫苗株具有较好的重复性。

实施例6、实施例1制备的试剂盒在鉴定布鲁氏菌S2疫苗株中的应用

96个待测样品为辽宁省葫芦岛市建昌县96只免疫羊的阴道拭子。

1、取待测样品，按照实施例2中步骤三的方法，进行双重实时荧光定量PCR检测。

检测结果见表3中第2行。结果表明，96个样品中，非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌3个，检出率为3.13％；布鲁氏菌S2疫苗株14个，检出率为14.58％；其余为布鲁氏菌阴性(即样品中不含有布鲁氏菌)。

2、取待测样品，采用《奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术》(NY/T 1467-2007)中的套式PCR的方法检测。

检测结果见表3中第3行。结果表明，96个样品中，布鲁氏菌阳性样品为11个，检出率为11.46％；且不能区分布鲁氏菌S2疫苗株和非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌。

3、取待测样品，采用《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T 18646-2018)中的多重PCR方法检测。

检测结果见表3中第4行。结果表明，96个样品中，布鲁氏菌阳性样品为7个，检出率为7.29％；且不能区分布鲁氏菌S2疫苗株和非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌。

由此可见，本发明提供的方法不仅检测敏感性高于现行国家标准和行业标准，还能够对布鲁氏菌S2疫苗株和其它种布鲁氏菌进行区分，提高了检测效率。

表3

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国动物疫病预防控制中心（农业农村部屠宰技术中心）

<120> 双重实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的方法及其使用的成套试剂

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

cgctcgcgcg gtggat 16

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

cttgaagctt gcggacagtc acc 23

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

acgaccaagc tgcatgctgt tgtcgatg 28

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

catccacact cgccag 16

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

cgatttgcgg gtggtt 16

<210>6

<211>14

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>6

ataaatggct ttct 14

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

gccatccaca ctcgccag 18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

gcgatttgcg ggtggtta 18

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>9

cataaatggc tttctt 16

<210>10

<211>481

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>10

cgaccttcgg caaatggaca gcggttcatg cccgctttcg gcgctggtcg cacgccggtg 60

tatgggaaag gcttttccat gccctggctg atacgccgga ctttgaatat gtcctcattg 120

acagcaccat atcgaaagtc cacgcagatg cggcgggcgc aaaagggggg ctgaagctgc 180

ctgcatcggt cgctcgcgcg gtggattgac gaccaagctg catgctgttg tcgatgctat 240

cggcctaccg ctgcgaataa agccaacacc cggccattat ggtgactgtc cgcaagcttc 300

aagccttcta tccggcttga agggtgtggg gcatgtcatt gctgatgcag cctatgatgc 360

cgatcactta agggccttca ttgccagcga tctcaaggca acggctcaga tcaaggtcaa 420

tccaacacgt tccagtgccc caacaatcga ctggaggctg tacaaggaac gccatcagat 480

t 481

<210>11

<211>298

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>11

gaacagcttc agcgtcagtg aataacggtc gccatcgagt ttggtgacat agccgcgctt 60

caccagccgg tccagcatcc ggtaaaattc gttggggctg cggtcgagat gcttggcgat 120

ctcggcctgc gtcagcccgc catccacact cgccagcgat tccaatatgt ccagcccctt 180

gtccagcgcg ggcgcgcgat agcgatcgtc agtttccaag gtcggctccc tcataaatgg 240

ctttcttcat atacgaacag cgtaaagggt gaaaggaata accacccgca aatcgcct 298

Claims

1.鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的成套试剂，为成套试剂2和/或成套试剂1；

所述成套试剂2包括引物Bru-F1、引物Bru-R1、探针Bru-Probe1、引物S2-F2、引物S2-R2和探针S2-Probe2；

所述成套试剂1包括所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、引物S2-F1、引物S2-R1和探针S2-Probe1；

所述引物Bru-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述引物Bru-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述探针Bru-Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述引物S2-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述引物S2-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述探针S2-Probe2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述引物S2-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述引物S2-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述探针S2-Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.如权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：

所述探针Bru-Probe1的5′末端具有荧光报告基团甲，3′末端具有荧光淬灭基团甲；

所述探针S2-Probe2的5′末端具有荧光报告基团乙，3′末端具有荧光淬灭基团乙；

所述探针S2-Probe1的5′末端具有荧光报告基团丙，3′末端具有荧光淬灭基团丙。

3.如权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：

所述成套试剂2由所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、所述引物S2-F2、所述引物S2-R2和所述探针S2-Probe2组成；

所述成套试剂1由所述引物Bru-F1、所述引物Bru-R1、所述探针Bru-Probe1、所述引物S2-F1、所述引物S2-R1和所述探针S2-Probe1组成。

4.权利要求1至3任一所述的成套试剂的应用，为e1)-e3)中的至少一种：

e1)制备用于鉴定或辅助鉴定布鲁氏菌S2疫苗株的试剂盒；

5.含有权利要求1至3任一所述的成套试剂的试剂盒。

6.权利要求5所述试剂盒的应用，为e2)或e3)：

7.一种鉴定待测样品是否含有或疑似含布鲁氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步骤：以待测样品的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果检出一种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果未检出荧光信号，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

8.一种鉴定待测样品是否含有或疑似含布鲁氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步骤：以待测样品的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果获得1条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有布鲁氏菌S2疫苗株；如果不能获得S形扩增曲线，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

9.一种鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步骤：以待测菌的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果检出一种荧光信号，则待测菌为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株；如果未检出荧光信号，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌。

10.一种鉴定待测菌是否为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步骤：以待测菌的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的成套试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌S2疫苗株的布鲁氏菌；如果获得1条S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为布鲁氏菌S2疫苗株；如果不能获得S形扩增曲线，则待测菌为或疑似为非布鲁氏菌。