CN112708685A

CN112708685A - 用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN112708685A
Application number: CN202011582120.9A
Authority: CN
Inventors: 王素华; 吕继洲; 吴绍强; 袁淑辉; 蔡军; 帅江冰
Original assignee: Wenzhou Customs Comprehensive Technical Service Center
Current assignee: Wenzhou Customs Comprehensive Technical Service Center
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2021-04-27

Abstract

本发明属于埃立克体(Ehrlichia)检测技术领域，涉及用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒和检测方法。本发明基于反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)16S RNA提供了Eva Green荧光定量PCR引物，其如SEQ ID NOs 1‑6所示。本发明还提供了包含所述引物的Eva Green荧光定量PCR试剂盒。本发明提供的检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品中的DNA；(2)Eva Green荧光定量PCR：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用前述引物，进行Eva Green荧光定量PCR；(3)分析Eva Green荧光定量PCR扩增产物。本发明的检测方法特异性好，与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫等无交叉反应；对16S RNA质粒标准品的最低检测限为1.32拷贝·μL^‑1，与套式PCR检测方法相比，敏感性更高。

Description

用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于埃立克体(Ehrlichia)检测技术领域，具体而言涉及通过 Eva Green荧光定量PCR检测埃立克体的试剂盒和检测方法。

背景技术

埃立克体属(Ehrlichia)细菌属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria)立克次体目(Rickettsiales)的无形体科(Anaplasmataceae)。埃立克体在自然界中借助节肢动物媒介和脊椎动物宿主而存在，能引起人或动物埃立克体病。

例如，反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性细菌。由反刍动物埃立克体引起的疾病统称心水病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，这种疾病几乎分布在撒哈拉沙漠以南非洲的所有地区和加勒比海的一些岛屿上，并传播至其他国家，其传播者主要是钝眼蜱属的希伯来钝眼蜱和美洲钝眼蜱。该病是牛、绵羊、山羊及其他反刍动物最重要的传染病之一，临床症状包括发热、食欲不振、呼吸困难和猝死，死亡率高达80％。心水病的流行与传播媒介蜱的消长和活动规律相一致，具有明显的地方性和季节性。心水病不仅威胁农牧业健康发展和食品安全，对流行国家造成了巨大的经济损失，而且被认为是一种潜在的新出现的人畜共患病。

早期诊断可以有效控制埃立克体病。例如反刍动物心水病的传统诊断方法是基于临床症状的血液涂片镜检和血清学检测，这些检测方法耗时较长，难以适应快速诊断和控制疫情的需要，也不适合蜱样本内的反刍动物检测。随着分子检测技术的快速发展，常规PCR、套式PCR(nested PCR)、LAMP和荧光定量PCR(qPCR)等检测技术已应用于反刍动物血液和蜱体内反刍动物埃立克体的检测。这些检测方法各有优缺点，常规PCR 方法特异性和敏感性较低，扩增时容易产生假阳性；LAMP技术污染的可能性较大，条件控制要求比PCR更严格；套式PCR方法耗时、污染风险高。

埃立克体的分子检测主要集中在pCS20、16S RNA和map1等基因序列或基因家族。如何针对上述基因序列，比如16S RNA序列建立一种检测方法，以便快速、准确的检测埃立克体，埃立克体病的防控及分子流行病学研究提供技术支持和试验依据，是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是针对埃立克体，尤其是反刍动物埃立克体16S RNA高度保守和特异的基因片段设计特异性引物，将Eva Green荧光定量PCR技术应用于反刍动物埃立克体的检测和定量分析中，建立Eva Green荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法，以便快速、准确地检测埃立克体，尤其是反刍动物埃立克体。

本发明的目的及其技术问题的解决是通过以下技术方案实现的。

一方面，本发明提供了一种用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量 PCR引物，该引物选自下述引物对中的一对：

正向引物F1：5’-ACT CTAGTG GYCCAC GTC CA-3'(SEQ ID NO.1)，

反向引物R1：5’-TAG TCT CTG GTACAGCAT TG-3'(SEQ ID NO.2)；

正向引物F2：5’-CAG GAT ATG GAG GGA ACC GTC-3'(SEQ ID NO.3)，

反向引物R2：5’-CTC CTG GTT TGA CAGTTG TA-3'(SEQ ID NO.4)；以及

正向引物F3：5’-CAG GATATG GAG GGAACC GTC-3'(SEQ ID NO. 5)，

反向引物R3：5’-GTT GTATAA GGTATTTCA GG-3'(SEQ ID NO.6)。

另一方面，本发明提供了用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量 PCR试剂盒，包含上述引物对之一。

在第三方面，本发明提供了用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

(1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；

(2)Eva Green荧光定量PCR：以步骤(1)提取的DNA为模板，并采用权利要求1所述引物对之一，进行Eva Green荧光定量PCR；

(3)分析Eva Green荧光定量PCR扩增产物；

该方法不以疾病的诊断和/或治疗为目的。

在本发明第三方面的实施方案中，Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25μL计包含：

DNA模板：2.0μL，

SsoFast Eva

Supermix(2x)：12.5μL，

正向引物：0.25-2.0μL，

反向引物：0.25-2.0μL，

灭菌去离子水补至25μL。

在另一实施方案中，Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25 μL计包含：

DNA模板：2.0μL，

SsoFast Eva

Supermix(2x)：12.5μL，

正向引物：0.75μL，

反向引物：0.75μL，

灭菌去离子水补至25μL。

在本发明第三方面的实施方案中，引物优选为：正向引物F3：5’-CAG GATATG GAGGGAACC GTC-3'(SEQ ID NO.5)，反向引物R3：5’-GTT GTATAAGGTATTTCAGG-3'(SEQ IDNO.6)。

在本发明第三方面的实施方案中，在Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系中，正向引物和反向引物的终浓度优选均为0.6pmol/μL。

在本发明第三方面的另一实施方案中，Eva Green荧光定量PCR的反应条件为：50℃2min，95℃10min预变性；然后95℃变性15s，51-60℃延伸1min并收集荧光，共40个循环，优选52℃下延伸1min。

在本发明第三方面的具体实施方案中，步骤(3)中以出现典型扩增和溶解曲线为阳性，表明检测的样品中存在埃立克体，反之，若不出现典型扩增和溶解曲线，则表明检测的样品中不存在埃立克体。

在本发明的实施方案中，埃立克体是指埃立克体属中的细菌，例如犬埃立克体、查菲埃立克体、伊文氏埃立克体、反刍动物埃立克体，但不限于此。

与现有技术相比，本发明具有明显的有益效果。具体而言，本发明基于埃立克体16S RNA基因设计合成了用于Eva Green荧光定量PCR的引物对，通过对引物浓度、反应温度等进行优化，建立了能够特异性、高灵敏性检测埃立克体，尤其是反刍动物埃立克体的EvaGreen荧光定量 PCR方法和试剂盒。本发明的引物和检测方法特异性好，与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、弓形虫、伊氏锥虫和牛无浆体等无交叉反应，对埃立克体16SRNA基因的最低检测限位1.32拷贝·μL^-1，标准曲线相关系数大于0.99，组内和组间CV均小于1.5％；与套式PCR检测方法相比，敏感性更高。

附图说明

图1显示了质粒标准品DNA的Eva Green荧光定量PCR标准曲线图。

图2显示了Eva Green荧光定量PCR的特异性实验结果，其中，1 为pUC57-16S RNA质粒；2为反刍动物埃立克体(Ehrlichia ruminantium)； 3-9分别为牛巴贝斯虫(B.bovis)、牛双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、牛环形泰勒虫(Theileria annulata)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、伊氏锥虫 (Trypanosoma evansi)和牛无浆体(Anaplasmosis)和阴性对照。

图3显示了Eva Green荧光定量PCR的敏感性试验结果，其中1-6 为1.32×10⁵-1.32×10⁰拷贝·μL^-1pUC57-16S RNA质粒；7为阴性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1

1材料与方法

1.1病原核酸及临床样品

反刍动物埃立克体(E.ruminantium)、牛巴贝斯虫(B.bovis)、牛双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、牛环形泰勒虫(Theileria annulata)、弓形虫 (Toxoplasma gondii)、伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)和牛无浆体(Anaplasmosis)基因组DNA由温州海关综合技术服务中心动植物检疫实验室提取、合成和保存。钝眼蜱采自温州口岸进境盐渍牛皮，-80℃保存于温州海关综合技术服务中心动植物检疫实验室。

1.2主要试剂和仪器

Quick-DNA^TM提取和纯化试剂盒购自ZYMO RESEARCH公司； 2xSsoFast EvaGreenSupermix预混液购置美国Bio-Rad公司；Taq DNA聚合酶(5U/μL)、dNTPs(10.0mmol/L)、Mgcl₂(25mmol/L)、DL5000 DAN Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。qTOWER3Gtouch荧光定量 PCR仪购自德国椰拿公司；KingfisherDuo Prime全自动核酸提取纯化仪、NanoDrop2000核酸蛋白分析仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3引物探针设计

16S RNA是反刍动物埃立克体特异性鉴定基因，根据GenBank中登录的反刍动物埃立克体16S RNA基因，用软件Primer 5.0设计Eva Green 荧光定量PCR引物；在16S RNA基因相对保守区域设计三对引物，选择最佳引物序列用于Eva Green荧光定量PCR扩增。EvaGreen荧光定量 PCR引物序列见表1。引物由上海华大基因科技有限公司合成。

表1. 16S RNA Eva Green荧光定量PCR引物

1.4质粒标准品制备

根据NCBI中反刍动物埃立克体Kwanyanga株16S RNA基因序列合成基因片段共1382bp，全基因由上海华大基因科技有限公司合成。选择 EcoRV和NdeI两个酶切位点，将目的基因克隆于pUC57载体中构建重组质粒pUC57-16S RNA，重组质粒经鉴定正确后，质粒浓度稀释为20 ng·μL^-1，按照公式(6.02×10²³拷贝·mol^-1)×质粒浓度(ng·μL^-1)×10^-9/(DNA长度×660)＝1.32×10⁹拷贝·μL^-1，作为pUC57-16S RNA质粒标准品备用。

1.5 Eva Green荧光定量PCR反应条件的优化

1.5.1 Eva Green荧光定量PCR退火温度的优化

试验使用qTOWER3G touch荧光定量PCR仪进行扩增和分析，以 SsoFast Eva

Supermix(1725200，BIO-RAD,USA)作为反应缓冲液。在缓冲液试剂盒推荐的反应体系下进行退火温度优化，Eva Green荧光定量PCR设置51～60℃10个整数值梯度退火温度，反应条件为50℃2min，95℃预变性10min，然后95℃15s变性，51-60℃退火延伸1min并收集荧光，共40个循环。

1.5.2 Eva Green荧光定量PCR反应体系的优化

在确定退火温度后对引物反应浓度进行优化。引物初始浓度为20 pmol/μL，以0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0μL引物进行反应，选取最佳引物浓度。Eva Green荧光定量PCR25μL反应体系为：SsoFast Eva

Supermix(2x)12.5μL，正、反向引物(16S RNAF1-F3和16S RNA R1-R3)各0.25-2.0μL(6个浓度梯度)，pUC57-16S RNA的质粒标准品 DNA2.0μL，加灭菌去离子水补至25μL。

1.6特异性试验

利用建立的Eva Green荧光定量PCR方法对反刍动物埃立克体、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、弓形虫、伊氏锥虫和牛无浆体的基因组DNA进行检测，并以pUC57-16S RNA质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，按照1.5确定的方法进行实时荧光定量PCR，评价此方法的特异性。

1.7敏感性试验

将pUC57-16S RNA质粒进行10倍梯度稀释，用已建立的反应条件进行Eva Green荧光定量PCR扩增，评价此方法的敏感性。

1.8重复性试验

将1.4制备的质粒标准品10倍倍比稀释，使用4个浓度梯度进行重复试验，将同一批不同稀释度的标准品按建立的方法重复3次进行组内重复试验，对3次不同时间段稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，对试验结果进行统计，分析此方法的重复性。同时设置去灭菌离子水为阴性对照。

1.9临床样品检测

从美国、乌拉圭、苏丹和南非等不同国家盐渍牛皮上采集的硬蜱中选取420只钝眼蜱，其中美国20只、乌拉圭100只、苏丹和南非各150 只，用Quick-DNA^TM提取和纯化试剂盒提取钝眼蜱DNA,用建立的Eva Green荧光定量PCR方法和OIE推荐的套式PCR方法对420只钝眼蜱样本进行检测。反应时用pUC57-16S RNA质粒作阳性对照，用灭菌去离子水作阴性对照。Eva Green荧光定量PCR以出现典型扩增曲线和溶解曲线为阳性；套式PCR以电泳检测时出现目的片段，且基因测序及比对正确为阳性。

2结果

2.1 Eva Green荧光定量PCR最优反应条件

经退火温度和引物优化，最终确定了Eva Green荧光定量PCR方法的最佳退火温度分别为52℃，Eva Green荧光定量PCR的最佳引物序列为16S RNAF3和16S RNAR3，稀释的引物的最佳使用量为0.75μL。

Eva Green荧光定量PCR反应体系为：SsoFast Eva

Supermix (2x)12.5μL，正、反向引物(16S RNAF3和16S RNAR3)各0.75μL，DNA 模板2.0μL，加灭菌去离子水至25μL。该反应的循环参数最终确定为： 50℃2min，95℃10min预变性；然后95℃变性15s，52℃延伸1min 并收集荧光，共40个循环。

2.2 Eva Green荧光定量PCR标准曲线的建立

将质粒标准品pUC57-16S RNA 10倍梯度稀释后，以7个稀释度进行荧光定量PCR扩增，通过系统自动分析软件分析，可以得到以Ct值为纵坐标，质粒标准品浓度对数为横坐标绘制的荧光定量PCR标准曲线(图 1)。由图1可知，在10²～10⁸拷贝·μL-1的范围内，EvaGreen荧光定量PCR 方法的标准曲线呈现良好的线性关系。Eva Green荧光定量PCR方法的线性关系表达式为：Y＝-1.587ln(x)+36.932，相关系数R²在0.99以上，扩增效率均高于90％。标准曲线比较理想。

2.3特异性分析

利用建立的Eva Green荧光定量PCR方法对反刍动物埃立克体、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、弓形虫、伊氏锥虫和牛无浆体的基因组DNA进行检测，并以pUC57-16S RNA质粒标准品作为阳性对照，以灭菌去离子水作为阴性对照，仅反刍动物埃立克体基因组DNA 和pUC57-16S RNA质粒标准品出现特异性扩增曲线(图2)，表明该检测方法的特异性较好。

2.4敏感性分析

将浓度为1.32×10⁵拷贝·μL^-1的pUC57-16S RNA质粒标准品进行10 倍梯度稀释，按照所建立的条件，进行Eva Green荧光定量PCR扩增。结果表明，Eva Green荧光定量PCR最低可以检出1.32拷贝·μL^-1的 pUC57-16S RNA质粒(图3)。

2.5重复性分析

为验证所建立检测方法的重复性，对同一批稀释的标准品按照建立的方法重复3次进行组内重复试验，并对3次不同时间稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，结果显示，Eva Green荧光定量PCR组内检测的变异系数为0.00-1.46，组间检测的变异系数为0.49-1.29，表明该方法具有较高的可重复性。

表2.Eva Green荧光定量PCR的组内、组间重复性实验结果

2.6临床样品检测

分别采用Eva Green荧光定量PCR和套式PCR和对420只钝眼蜱进行检测，结果如表3所示，上述2种检测方法对钝眼蜱体内埃立克体的检出率分别为30.71％(129/420)和24.76％(104/420)。套式PCR检测的阳性样品，Eva Green荧光定量PCR检测都为阳性。对2种检测方法的敏感性进行分析，Eva Green荧光定量PCR能检出单个拷贝数的质粒标准品，套式PCR能检出10¹拷贝·μL^-1的质粒标准品，表明Eva Green荧光定量PCR的敏感性更高，能够检出痕量的埃立克体DNA。

表3.Eva Green荧光定量PCR和套式PCR对420个钝眼蜱样品的检测结果

注：“+”表示出现扩增曲线或扩增条带的样品数；“-”表示未扩增曲线或扩增条带的样品数

3讨论

心水病是一种致命的细菌性疾病，20世纪在美国首次发现，由反刍动物埃立克次体引起，经钝眼蜱传播，在世界范围内严重威胁人和动物健康，曾给人类带来严重灾难。反刍动物埃立克体相对于其他微生物而言，繁殖、传播快，能够形成气溶胶，对我国牛羊等反刍动物主要养殖区的威胁随着进口贸易的发展日益突出，一旦侵入将会给我国牛羊养殖业带来严重经济损失。因此，迫切需要研发和建立快速简便、精准有效的检测方法作为技术储备。

本发明选取16S RNA基因上高度保守的区域，建立了反刍动物埃立克体Eva Green荧光定量PCR，对来自非洲和美洲不同国家的420只蜱进行检测，以验证该检测方法的敏感性，并评估心水病疫区媒介蜱感染反刍动物埃立克体的情况。Eva Green是一种新型染料，具有更强的荧光信号，Eva Green荧光定量PCR在扩增反应中不易受PCR抑制剂的影响，大大增加了扩增和延伸效率。临床试验结果表明，本发明建立的Eva Green 荧光定量PCR方法敏感性高于OIE推荐的套式PCR方法。Eva Green荧光定量PCR对反刍动物埃立克体16S RNA基因的最低检测限分别为1.32 拷贝·μL^-1，与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、弓形虫、伊氏锥虫和牛无浆体等无交叉反应，特异性好。

序列表

<110> 温州海关综合技术服务中心

<120> 用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及检测方法

<130> PI202010022

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actctagtgg yccacgtcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagtctctgg tacagcattg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggatatgg agggaaccgt c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcctggttt gacagttgta 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggatatgg agggaaccgt c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgtataag gtatttcagg 20

Claims

1.一种用于检测埃立克体(Ehrlichia)的Eva Green荧光定量PCR引物，其特征在于，该引物选自下述引物对中的一对：

正向引物F1：5’-ACT CTA GTG GYCCAC GTC CA-3'(SEQ ID NO.1)，

反向引物R1：5’-TAG TCT CTG GTA CAGCATTG-3'(SEQ ID NO.2)；

正向引物F2：5’-CAG GAT ATG GAG GGA ACC GTC-3'(SEQ ID NO.3)，

反向引物R2：5’-CTC CTG GTT TGA CAGTTG TA-3'(SEQ ID NO.4)；和

正向引物F3：5’-CAG GAT ATG GAG GGAACC GTC-3'(SEQ ID NO.5)，

反向引物R3：5’-GTT GTA TAA GGT ATTTCA GG-3'(SEQ ID NO.6)。

2.用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。

3.权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在检测埃立克体中的应用，所述应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。

4.用于检测埃立克体的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)DNA模板提取：提取待测样品中的DNA；

(3)分析Eva Green荧光定量PCR扩增产物；

所述方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。

5.根据权利要求4所述的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于，所述Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25μL计包含：

DNA模板：2.0μL，

SsoFast Eva

Supermix(2x)：12.5μL，

正向引物：0.25-2.0μL，

反向引物：0.25-2.0μL，

灭菌去离子水补至25μL。

6.根据权利要求5所述的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于，所述Eva Green荧光定量PCR方法的反应体系以25μL计包含：

DNA模板：2.0μL，

SsoFast Eva

Supermix(2x)：12.5μL，

正向引物：0.75μL，

反向引物：0.75μL，

灭菌去离子水补至25μL。

7.根据权利要求5或6所述的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的终浓度均为0.6pmol/μL。

8.根据权利要求7所述的Eva Green荧光定量PCR方法，其特征在于，所述引物为：

正向引物F3：5’-CAG GAT ATG GAG GGAACC GTC-3'(SEQ ID NO.5)，

反向引物R3：5’-GTT GTA TAA GGT ATTTCA GG-3'(SEQ ID NO.6)。

9.根据权利要求7所述的Eva Green荧光定量PCR方法，其反应条件为：50℃2min，95℃10min预变性；然后95℃变性15s，51-60℃延伸1min并收集荧光，共40个循环，优选52℃延伸1min。