KR20120140069A - 단순포진 바이러스 1형 및 2형의 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트 - Google Patents

단순포진 바이러스 1형 및 2형의 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 증폭에 사용되는 프라이머 또는 프로브, 이를 이용한 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 검사 방법, 및 이를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 키트는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 각각 그리고 동시에 분석할 수 있고 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 가지고 검사할 수 있는 장점이 있다.

Description

단순포진 바이러스 1형 및 2형의 진단을 위한 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트{PRIMEMRS AND PROBES FOR ANALYSING HSV-1 AND HSV-2, ANALYSIS METHOD USING THE SAME, AND ANALYSIS KIT COMPRISING THE SAME}
본 발명은 단순포진 바이러스 1형(HSV-1) 및 2형(HSV-2)의 감염 진단을 위한 유전자 증폭용 프라이머 및 프로브, 이를 이용한 검사 방법 및 이를 포함하는 검사 키트에 관한 것이다.
단순포진은 단순포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV)의 감염에 의해 작은 수포들이 피부에 발생하는 질환이다. 단순포진 바이러스는 주로 면역력이 떨어진 환자에 잠복해 있다가 입술 주위와 다양한 피부에 작은 수포를 발생시키며, 발병 부위에 재발하는 특징을 보인다. 또한, 단순포진 바이러스에 의한 감염은 일반적으로 성관계 의한 질환(sexual transmited diseasse, STD)의 일종으로서, 최근에는 성문화가 개방되면서 성기피부에도 발생하며 음부포진 등이 많아지는 추세이다.
단순포진 바이러스는 두 가지의 항원성을 가진 1형 및 2형이 존재하며, 각각 입 주위에 발생하는 단순포진과 음부포진을 일으키는 것으로 알려져 있다. 단순포진 바이러스는 헤르페스비리대(Herpesviridae)에 속하는 이중가닥의 DNA 바이러스이며 1형과 2형의 염기서열은 50%의 상동성을 갖는다. 단순포진 바이러스의 유전자는 표면에 존재하는 11종의 당단백질과 DNA 중합효소, 세린 프로테아제, 티미딘 키나제 등의 수종의 효소를 암호화하고 있다. 단순포진 바이러스 1형은 구강 타액의 접촉으로 전파되고 주로 아동기에 발생하며 입술, 구강 등 허리 위쪽의 피부 및 점막에 감염되어 헤르페스성 각막염, 헤르페스성 뇌염 등을 일으킨다. 단순포진 바이러스 2형은 음부포진을 일으키는 원인으로 생식기나 허리아래쪽의 피부와 점막에 감염되며 주로 사춘기 이후에 발생한다. 그러나 단순포진 바이러스 1형 및 2형 모두가 생식기 감염을 일으킬 수 있다. 단순포진 바이러스는 병소의 직접적인 접촉에 의해 감염되며 잠복기는 2?20일 정도로 알려져 있다. 단순포진 바이러스에 감염되어도 일부 환자에서는 증상이 나타나지 않으며 환자에 따라 다양한 증상을 나타낸다. 얼얼함, 가려움, 마비감 등의 전구증상이 수시간 또는 수일간 지속되며 생식기 부위에 수포가 형성된다. 수포가 터져 통증이 있는 궤양이 생기며 발열, 무력감 등의 전신증세가 나타날 수도 있다.
재발성 감염의 경우 피부나 점막을 통해 인체에 감염되면 균이 소실되지 않고 병변이 소실된 후에도 계속 척수의 후근신경절에 잠재하여 있다가 어떤 유발요인에 의해 재발되고 첫 감염보다는 증상이 심하지 않다. 외부로부터 바이러스가 재감염되어 재발하는 경우도 있지만 대부분의 경우는 외상, 추위, 자외선, 피로, 월경, 발열, 스트레스 등 면역력 약화와 관련하여 재발하게 되어 암환자, 장기이식 환자, AIDS 등 중증환자의 경우 생명의 위험이 될 수 있다.
산모의 경우 분만시 단순포진 바이러스가 감염상태이면 신생아 감염의 확률이 높으며 감염자중 60%는 사망, 20%에서는 시력장애, 뇌척수 손상과 지체장애, 나머지 20%는 정상적인 출산이 가능한 것으로 보고되어 있으며 따라서 출산시 제왕절개 분만이 요구된다. 기타 단순포진 바이러스에 의한 헤르페스성 각막염은 눈안에 이물질이 들어 듯한 느낌으로 햇볕을 보면 따갑고 눈부시며 진물이 발생하며 즉시 치료를 받지 않고 방치하면 눈에 흉터가 생겨서 시력장애를 유발할 수 있다.
단순포진 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위해서는, 이차감염을 막기 위해 감염 부위를 깨끗하고 건조하게 유지해야 하고 음부포진의 경우 궤양부위를 청결히 하고 병소가 완전히 치료될 때까지 성관계를 피해야 하고 치료를 위해 항바이러스제제인 아시클로비어(acyclovir) 등을 투여하여야 한다. 단순포진 바이러스 감염의 진단은 단순포진의 경우에는 증상이 뚜렷해서 다른 검사가 필요 없는 경우가 많으나 감염초기나 이차감염에 의한 합병증이 있는 경우 육안적 관찰로 진단이 불확실할 때는 가검물을 채취해서 바이러스 감염여부를 진단할 필요가 있다. 단순포진 바이러스의 생식기 감염에서 나타나는 수포 또는 궤양은 육안으로 확인가능하며 조직배양을 통해 전자현미경으로 바이러스입자를 확인하거나 간접형광항체법, 효소면역법 등 면역학적 기술을 사용하여 바이러스 항원을 검사하고 혈청에서 단순포진 바이러스에 대한 항체를 검사할 수 있는 진단법이 개발되어 있다. 하지만, 세포배양의 경우 바이러스 배양 시설과 인력, 기술이 있어야 하며 배양까지의 시간이 많이 걸리는 단점이 있으며 혈청학적 검사는 임상적 이용가치가 낮아 치료시기를 놓칠 수 있는 단점이 있다. 이에 따라, 최근에는 유전자 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한 유전자 증폭을 통한 바이러스의 진단 방법이 주목을 받고 있다. PCR을 이용한 진단방법은 특히 단순포진 바이러스의 중추신경계 감염에서 가장 권장되고 있는 검사법으로 척수액 검사시 예민도가 95%, 특이도가 100%에 달할 정도로 민감도와 특이도가 높으며 짧은 검사시간을 갖는 장점이 있다.
하지만, 종래 PCR을 이용한 유전자 진단의 경우 PCR 후, 유전자 증폭 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동 및 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색한 후, 이미지 분석기로 밴드의 강도를 분석하여야 하기 때문에, 많은 시간과 인력이 소요되며 결과 분석도 주관적이어서 정량적인 결과를 얻기 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 유전자 증폭 후 도트 블로팅, SSCP, 염기서열 분석을 이용하여 바이러스종을 분류할 수 있으나, 비용과 검사 시간이 많이 들고 이 역시 정량화가 불가능하다는 단점이 있다. 그리하여 기존의 방법보다 진단에 시간과 인력을 적게 필요하면서도 정량적 측정이 가능한 검사 방법의 필요성이 대두됨에 따라 최근 정량성을 확보한 실시간 유전자 중합효소 연쇄 반응(realtime Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)이 일반화되고 있다.
하지만, 사용하는 프로브나 프라이머 등에 따라 검사 효율이 달라질 수 있으므로 보다 우수한 프로브 또는 프라이머를 탐색할 필요가 있으며, 임상학적으로 가장 문제가 되는 단순포진 바이러스 1형과 2형을 동시에 분석할 수 있는 키트가 필요한 실정이다.
이에 본 출원인은 단순포진 바이러스 1형과 2형의 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브를 개발하였고, 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 RT-PCR에 의해 단순포진 바이러스 1형 또는 2형을 각각 그리고 동시에 효과적으로 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 RT-PCR에 사용될 수 있는, HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 검사하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는, HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는, 단순포진 바이러스 1형(HSV-1) 또는 2형(HSV-2) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수포 또는 궤양 부위 또는 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 검사 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 또는 프로브를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 진단할 수 있는 검사 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브, 또는 이를 포함하는 검사 키트는 HSV-1 및 HSV-2 유전자를 특이적으로 그리고 정량적으로 검사할 수 있다. 또한, HSV-1 및 HSV-2 유전자형을 각각 또는 동시에 약 1시간 이내에 확인할 수 있어, 짧은 시간 안에 검사할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 SV1 세트를 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 SV2 세트를 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 SV1 및 SV2 세트를 동시에 이용한 실시간 유전자 증폭 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HSV-1 및 HSV-2 유전자 표준물질의 염기서열 및 사용된 프라이머를 나타낸 것이다.
도 5는 HSV-1 및 HSV-2 유전자 표준물질에 대한 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 제작된 HSV 유전자 검사 키트를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 HSV-1 및 HSV-2 유전자 표준물질에 대한 바이러스 농도별 민감도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브인 SV1 세트와 SV2 세트를 이용한 유전자 표준물질에서의 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브인 SV1세트와 SV2 세트를 이용하여 유전자 표준물질에서의 실시간 유전자 증폭을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는, 단순포진 바이러스 1형(HSV-1) 또는 2형(HSV-2) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.
상기 본 발명의 프라이머 또는 프로브에서, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브는 HSV-1 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하며, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브는 HSV-2 유전자를 증폭할 수 있는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-1을 증폭시키기 위한 정방향(forward) 프라이머로서, 상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-1을 증폭시키기 위한 역방향(reverse) 프라이머로서, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-1의 증폭을 검출할 수 있는 프로브로서 사용된다. 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3의 프로브는 HSV-1을 검사하기 위한 실시간 PCR(RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트('SV1 세트'라 명명함)로 사용될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-2를 증폭시키기 위한 정방향(forward) 프라이머로서, 상기 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-2를 증폭시키기 위한 역방향(reverse) 프라이머로서, 상기 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드는 HSV-2의 증폭을 검출할 수 있는 프로브로서 사용된다. 상기 서열번호 4 및 5의 프라이머와 서열번호 6의 프로브는 HSV-2를 검사하기 위한 실시간 PCR(RT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트('SV2 세트'라 명명함)로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 서열번호 3 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프로브는 유전자 증폭 산물의 검출을 용이하게 하기 위하여 5' 말단에 리포터(reporter dye)로 작용하는 형광물질로 표지될 수 있으며, 이와는 별개로 3' 말단에는 소광물질(quencher dye)로 표지될 수 있다. 상기 5' 말단의 형광물질은 당해 기술 분야에서 사용되는 형광물질이라면 제한없이 사용될 수 있다. 형광물질의 구체적인 예로는 Sybergreen, Evagreen, Cy3, Cy5, 비오틴 결합물질, 알렉사 647(Alexa 647), 알렉사 555(Alexa 555), 5-(2-아미노에틸)아미노-1-나프탈렌 황산(EDANS), 테트라메틸로다민(TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트(TMRITC), x-로다민 및 텍사스레드 또는 록스(ROX)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 3' 말단의 소광물질은 당해 기술 분야에서 사용되는 소광물질이라면 제한없이 사용될 수 있다. 소광물질의 구체적인 예로는 DABCYL, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, Eclipse, QSY7 또는 QSY9를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 수포 또는 궤양 부위 또는 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 DNA를 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 검사 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검사 방법에서, 상기 제1단계는 수포 또는 궤양 부위 또는 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계이다. 상기 검체는 바람직하게는 수포 또는 궤양부위 삼출물 스왑(swap)일 수 있다. 상기 DNA 추출 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 세포 용해 용액으로 세포를 용해한 후 통상적인 DNA 추출 방법으로 DNA를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 검사 방법에서, 상기 제2단계는 상기 추출된 DNA를 전술한 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계이다. 상기 단계에서, HSV-1 유전자를 검사하기 위해서는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있으며, HSV-2 유전자를 검사하기 위해서는 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 사용할 수 있다. 나아가, HSV-1 및 HSV-2 유전자를 동시에 검사하고자 하는 경우에는, 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브와 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법은 비교를 위하여, 내부표준물질인 베타 글로빈을 증폭시키기 위한 프라이머 또는 프로브로서, 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브('BG세트'라 명명함)를 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브와 동시에 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 검사방법은 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 증폭을 실시간으로 정량화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 실시간 유전자 검사를 위한 공지의 방법이라면 어느 것이나 사용가능하다. 예를 들면, 실시간 중합효소 연쇄반응법을 통해 유전자 증폭시, 실시간으로 모니터링하여 얻게 되는 증폭 곡선으로부터 Ct 값(threshold cycle, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클(cycle) 수를 말함)을 산출하고 이를 이용하여 유전자 증폭 산물 내에 목표하는 유전자의 존재 유무나 증폭 산물을 정량하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, RT-PCR에서는 1사이클 반응이 추가될 때마다 DNA가 2배로 지수함수적으로 증가해 일정 이상의 사이클을 반복하면 목표하는 유전자의 양은 정체기(plateau)에 도달하게 되고, 이렇게 증폭한 유전자의 양을 실시간으로 모니터링하여 증폭 곡선을 얻을 수 있다. 초기의 DNA 주형농도가 많을수록 증폭 산물량은 빠르게 검출 가능한 양에 다다르게 되어 증폭 곡선이 가파르게 상승한다.
이러한 증폭곡선의 적당한 곳에 반응을 일으키는 최소의 역가(threshold)를 설정하면, 반응을 일으키는 최소의 역가와 증폭 곡선이 만나는 점, 즉, Ct 값이 산출된다. 이러한 Ct 값은 목표하는 유전자의 존재유무나 농도별 검량선을 작성될 경우 이를 통해 최초의 주형농도를 정량할 수 있다.
나아가, 본 발명은 전술한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 진단할 수 있는 검사 키트를 제공한다.
상기 검사 키트는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 또는 프로브 외에도 통상적인 검사 키트에 사용되는 시약, 예를 들어, DNA 추출 시약, DNA 증폭 시약 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, HSV-1과 HSV-2 유전자를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 검사 키트(도 6 참고)는 다음과 같은 시약, 기구 및 장치로 구성될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다:
1) 프라이머 및 프로브 세트 각 20 p㏖/㎕;
2) 10X PCR 완충용액;
3) Taq. DNA 폴리머라아제 250 유니트(솔젠트, 한국);
4) 2.5 mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dUTP);
5) 우라실-N-글리코실라아제(Uracil-N-Glycosylase) 1 U/㎕;
6) 증류수; 및
7) HBV 유전자 정량 판독을 위한, 실시간 유전자 증폭분석장치(LC480, Roche 또는 7500, ABI 또는 RotergeneQ, Qiagen 또는 CFX86, Biorad).
상기 시약, 기구 및 장비들로 HSV-1과 HSV-2 유전자를 각각 또는 동시에 정량적으로 검사할 수 있다. 그리고 이를 바탕으로 하기와 같은 구성으로 HSV-1과 HSV-2 유전자를 각각 또는 동시에 정량적으로 검사할 수 있는 키트를 구성할 수 있다. 하기 내용은 본 발명의 일 실시예에 불과하며, 본 발명은 하기 예에 국한되지 않는다.
HSV-1과 HSV-2 유전자를 동시 진단하기 위한 키트:
1) SV1 세트, SV2 세트와 BG 세트 각각 프라이머 세트(20 p㏖/㎕), 10X PCR 완충용액, dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dUTP, Uracil-N-glycosylase), Taq. 폴리머라제 250 유니트(솔젠트)이 들어 있는 프리믹스(premix)의 1.5 ㎖ 튜브;
2) HSV-1과 HSV-2 유전자가 각각 10-6 ng/㎕이 들어있는 양성대조용액의 1.5 ㎖ 튜브;
3) HSV-1과 HSV-2 유전자가 포함되지 않은 음성대조용액의 1.5 ㎖ 튜브; 및
4) HSV-1과 HSV-2 유전자 농도 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 및 10-7 ng/㎕를 포함하는 표준물질의 농도별 1.5 ㎖ 튜브 5개.
HSV-1과 HSV-2 유전자를 각각 검사하는 경우에도 상기의 키트를 사용할 수 있으며 그 예로 HSV-1 유전자만을 검사하는 경우 키트 1)항에서 SV2 세트를 제외하여 사용하며 HSV-2 유전자만을 검사하는 경우는 그 반대이다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브와 키트를 이용하여 RT-PCR로 유전자를 증폭한 후 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 검사하는 대략 1시간이 소요된다.
이하, 본 발명의 구성을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: HSV -1 및 HSV -2 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브의 선정
HSV-1과 HSV-2 유전자의 염기서열을 NCBI Genbank에서 검색하여 확보하였다. 진비(GeneBee) 얼라인먼트 프로그램을 이용하여 상기 공통 염기서열 중 프라이머와 프로브를 선정하였고 단순포진 바이러스 1형과 2형 유전자 이외의 다른 아형의 바이러스를 배제하였다. 구체적으로, HSV-1 및 HSV-2의 경우, 당단백-D(glycoprotein-D) 유전자 부위(Genbank: K02372.1)로부터 HSV-1 및 HSV-2를 각각 구별할 수 있는 돌연변이가 있는 부위의 유전자를 선택하여 프라이머와 프로브를 선정하였다. 그 결과, 하기 표 1의 서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 프로브를 얻을 수 있었으며, 이들은 각각 올리고 합성기(Polygen, 독일)로 제작하여 사용하였다. HSV-1을 증폭시킬 수 있는 서열번호 1 내지 3의 프라이머 및 프로브를 "SV-1 세트"라 명명하였고, HSV-2를 증폭시킬 수 있는 서열번호 4 내지 6의 프라이머 및 프로브를 "SV-2 세트"라 명명하였다.
Figure pat00001
실시예 2: HSV -1과 HSV -2 유전자 증폭을 통한 유전자형 분석
<2-1> 수포/궤양 부위의 스왑검체 또는 혈액으로부터 유전자 추출
수포/궤양 부위로부터 스왑된 검체와 7%(w/v) 킬렉스(chelex) 버퍼(12% chelex, 20 mM Tris HCl, 100 ㎍/ml proteinase K, 10 mM CaCl2, pH 8.0) 500 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 진탕 혼합하고 100℃의 항온조에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로원심기(microfuge, Sigma)에서 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 DNA를 수득하였다. 상기 수득된 DNA를 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 사용할 때까지 냉장 보관하였다.
혈액의 경우 혈액 100 ㎕와 TE 용액(10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH 8.0) 1㎖를 혼합하고 마이크로원심기(microfuge, Sigma)에서 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 침전물에 7%(w/v) 킬렉스(chelex) 버퍼(12% chelex, 20 mM Tris HCl, 100 ㎍/ml proteinase K, 10 mM CaCl2, pH 8.0) 100 ㎕를 첨가하여 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 100℃의 항온조에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로 원심분리기에서 13,000 rpm으로 4℃에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하여 DNA를 수득하였다. 상기 수득된 DNA를 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 사용할 때까지 냉장 보관하였다.
<2-2> 실시간 유전자 증폭 방법을 이용한 HSV -1 및 HSV -2 유전자 증폭
상기 실시예 <2-1>에서 획득한 DNA를 증폭시키기 위해 실시예 1에서 제작한 SV1 세트와 SV2 세트를 각각 또는 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 내부표준물질로 HSV-1 및 HSV-2를 동시에 증폭할 수 있는 베타글로빈(β-globin) 프라이머와 프로브('BG 세트'라 명명함; 서열번호 7 내지 9)를 각 실험에 동시에 사용하였다.
HSV-1과 HSV-2 유전자를 동시 분석하는 경우, 0.2 ㎖ PCR 튜브에 프리믹스 9.5 ㎕[10 × PCR 버퍼[750 mM Tris-HCl (pH 9.0), 150 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA], 2.5 mM dNTP 2.0 ㎕, 20 pmol SV1 세트, 20 pmol SV2 세트 및 20 pmol BG 세트, 우라실-N-글라이코실라아제(Uracil-N-glycosylase), Taq DNA 폴리머라아제(5 units)(Solgent Co., 한국) 0.3 ㎕, 주형 DNA 5 ㎕를 증류수로 20.0 ㎕가 되도록 혼합물을 제조하였다. 상기 실시간 유전자 증폭을 위한 혼합물을 50℃에서 3분, 95℃에서 10분 동안 전변성(pre-denaturation)하고 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 동안 35회를 반응시켰다(realtime PCR system 7500, Applied Biosystems, USA).
HSV-1과 HSV-2 유전자를 각각 분석하는 경우, SV1 세트와 SV2 세트 각각과 BG 세트를 조합하여 사용하고 검사방법은 HSV-1과 HSV-2 유전자를 동시 분석하는 경우와 동일하게 적용하였다.
SV1 세트를 이용하여 분석한 결과를 도 1에 나타내었고, SV2 세트를 이용하여 분석한 결과를 도 2에, 그리고, SV1 세트와 SV2 세트를 조합하여 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 결과, SV1 세트, SV2 세트와 BG 세트를 각각 또는 동시에 이용하여 유전자를 증폭시, 서로 간섭작용 없이 분석할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 3: HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사 키트의 제작
<3-1> HSV -1 및 HSV -2 유전자 표준물질의 제작
HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사 키트에 대조군으로 사용되기 위한 HSV-1 및 HSV-2 유전자 표준물질을 하기와 같이 제작하였다.
프로메가(Promega, Germany)사의 pGEM T 이지벡터를 이용하여, HSV-1과 HSV-2의 당단백-D(glycoprotein-D, gD)를 암호화하는 유전자 부위 전체를 증폭하여 얻은 증폭 산물을 클로닝하였다. 상기 HSV-1과 HSV-2 유전자 서열 및 사용한 프라이머를 도 4에 나타내었다.
HSV-1과 HSV-2 유전자의 표준 물질로 사용할 유전자 증폭 산물의 제작은 0.2 ㎖ PCR 튜브에 10× PCR 버퍼[750 mM Tris-HCl (pH 9.0), 150 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA], 2.5㎕, 2.5 mM dNTP 2.0 ㎕, 20 pmol HSV-1 유전자 5' 프라이머(CCCCGGCCCCCAACAAAAATC; 서열번호 10)와 3' 프라이머(AAAACGGGACGGTTCGCGAAA; 서열번호 11) 및 20 pmol HSV-2 유전자 5' 프라이머(AAGAAACTAAAAACACATCAA; 서열번호 12)와 3' 프라이머(ACGGACCAGGCCGGTGGCGCA; 서열번호 13) 각각 1.0 ㎕, Taq DNA 폴리머라아제(5 units)(솔젠트, 한국) 0.3 ㎕, 및 주형 DNA 5.0 ㎕를 넣고 증류수로 25.0 ㎕가 되도록 하여 유전자 증폭을 위한 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 10분 동안 전변성(pre-denaturation)하고 95℃에서 1분, 53℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분씩 40회를 반응시켰다(7500, Applied Biosystems, USA).
상기 HSV-1 및 HSV-2 유전자 증폭 산물을 겔 추출 키트(gel extraction kit, QIAGEN, Germany)를 사용하여 정제하고 정제한 유전자 증폭 산물 3.0 ㎕, T4 리가아제 2 X 버퍼 5.0 ㎕, PGEM T 이지벡터 1.0 ㎕ 및 T4 리가아제 1.0 ㎕를 혼합하여 실온(25℃)에서 2시간 동안 반응시켜 연결시켰다(ligation). 컴피턴트 세포(competent cell)인 JM109 50 ㎕와 연결반응(ligation)이 끝난 상기 벡터 5 ㎕를 혼합한 다음, 얼음 위에서 30분간 방치하고 42℃에서 1분 30초 동안 열처리(heat shock)한 후, 얼음 위에서 3분간 반응시키고 LB 배지(broth) 1 ml에 넣고 37℃에서 1 시간 배양하였다.
그 다음, 800 G, 4℃에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 버리고 남아있는 LB 배지와 침전물을 섞어서 X-gal과 IPTG가 포함된 LB 아가 플레이트(LB agar plate, 앰피실린 20 mg/ml)에 도포하고 37℃에서 14 시간 동안 배양하였다. 배양된 각 콜로니(colony)를 앰피실린(amphicillin)이 포함된 1 ml LB 배지에서 하루 동안 배양하고 플라스미드를 정제하였다(QIAGEN, Germany). 상기 정제한 플라스미드의 농도를 나노뷰(NanoVue, USA)에서 측정하고 염기서열 분석을 통해 HSV-1과 HSV-2 유전자가 포함되어 있음을 확인하였다(도 5).
<3-2> 검사 키트의 제작
도 6에 나타난 것과 같이, 하기와 같은 구성으로 HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사 키트를 제작하였다. 그 구성은 ① 염기서열 1 내지 6에서 선택되는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자 프라이머 또는 프로브 및 염기서열 7 내지 9에서 선택되는 베타글로빈 유전자 프라이머 또는 프로브 각각 20 pmol/㎕; ② 10X PCR 완충용액; ③ 2.5 mM dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dUTP); ④ Taq. DNA 중합효소(솔젠트, 한국) 250 유니트; ⑤ 우라실-N-글라이코실라아제(1U/㎕) 20㎕가 포함된 혼합 용액이 담겨진 1.5 ml 튜브; ⑥ HSV-1과 HSV-2 유전자가 각각 10-6 ng/ul이 들어있는 양성대조용액의 1.5㎖ 튜브; ⑦ HSV-1과 HSV-2 유전자가 포함되지 않은 음성대조용액이 담겨진 1.5㎖ 튜브; 및 ⑧ HSV-1과 HSV-2 유전자 농도 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 및 10-7 ng/㎕를 포함하는 표준물질의 농도별 1.5 ㎖ 튜브 5개였다.
상기 HSV-1 또는 HSV-2 유전자 검사 키트는 50개의 검체를 처리할 수 있도록 구성하였으며, 사용할 때까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
실시예 4: HSV -1과 HSV -2 유전자에 대한 민감도 분석
본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브의 유용성을 확인하기 위하여, 실시예 <3-1>에서 준비된 HSV-1과 HSV-2 유전자 표준물질을 대상으로 실시간 유전자 증폭을 실시하고 민감도를 분석하였다. 상기 표준물질은 각각 10 배수로 희석한 10-1 내지 10-8 ng의 농도로 각각 10배수로 희석하여 사용하였고, SV1 세트 및 SV2 세트를 이용하여 실시예 2-2에 기재된 방법에 따라 유전자 증폭을 수행하였다. SV1 세트 및 SV2 세트를 사용한 유전자 증폭 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 좌측부터 우측까지의 피크는 HSV-1과 HSV-2 유전자 표준물질의 10-1 ng, 10-2 ng, 10-3 ng, 10-4 ng, 10-5 ng, 10-6 ng, 10-7 ng 및 10-8 ng의 농도를 대상으로 유전자 증폭을 수행한 결과이다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 10-7 ng의 매우 적은 농도의 유전자도 증폭이 가능함을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브는 HSV-1과 HSV-2 유전자에 대한 민감도가 우수함을 알 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 검사 방법과 염기서열 분석 방법의 비교
본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용한 HSV-1 및 HSV-2 유전자 증폭 결과가 정확한지 확인하기 위하여, 염기서열 분석을 수행하였다.
HSV-1과 HSV-2 유전자 증폭 산물(실시예 2-2의 PCR 산물) 5 ㎕에 빅다이(Bigdye V3.0, ABI) 8 ㎕, 각 유전자의 5' 프라이머 1 ㎕(서열번호 1 및 3)를 혼합하여 총 20 ㎕가 되게 하고, 상기 혼합물은 95℃에서 2분 동안 변성하고, 95℃ 20초, 50℃ 5초, 60℃ 2분을 25회 실시하여 자동 염기서열 분석기(ABI3100, Applied Biosystems, USA)를 통해 염기서열을 분석하였다.
도 8과 9는 본 발명에 따른 실시간 유전자 검사방법과 자동 염기서열분석기를 이용한 비교 결과를 나타낸 것이다. 상기 도에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 HSV-1 및 HSV-2를 증폭한 결과와 염기서열 분석 결과가 모두 일치하는 것으로 나타났다.
실시예 6: 본 발명의 키트와 기존 HSV 분석 키트와의 비교 실험
본 발명의 키트의 효율을 살펴보기 위해, 종래 시판 중인 키트와 비교실험하였다. 본 발명의 키트는 실시예 3에서 제작된 HSV의 감염여부를 진단할 수 있는 키트를 이용하였다. 한편, 기존 시판 중인 키트 중에 A사와 B사의 HSV를 진단할 수 있는 2종의 키트를 사용하여 분석 비교하였다.
<6-1> 본 발명의 키트와 A사의 HSV 키트의 비교분석
실시간 유전자 증폭을 이용한 A사와의 키트와 본 발명의 키트를 비교하기 위하여, HSV-1 strain KOS가 감염된 Vero cell로부터 추출된 유전자(ATCC No. VR-1493D)와 HSV-2 strain MS가 감염된 Vero cell로부터 추출된 유전자(ATCC No.VR-540D)를 대상으로 본 발명의 키트의 경우 실시예 2-2의 방법에 따라 분석하였고, A사의 키트의 경우 제조사의 프로토콜에 따라 실시간 유전자 증폭을 실시하고 민감도를 분석하였다. HSV-1 및 HSV-2 각 유전자는 각각 10 배수로 희석한 10-3 내지 10-7 ng의 농도로 각각 10배수로 희석하여 사용하였고, SV1 세트 및 SV2 세트를 이용하여 실시예 2-2에 기재된 방법에 따라 유전자 증폭을 수행하였다. SV1 세트 및 SV2 세트를 사용한 유전자 증폭 결과를 도 10과 도 11에 나타내었다. 도 10과 도 11의 정량곡선에서 좌측부터 우측까지의 피크는 HSV-1와 HSV-2 유전자 표준물질의 10-3 ng, 10-4 ng, 10-5 ng, 10-6 ng, 10-7 ng의 농도를 대상으로 유전자 증폭을 수행한 결과이다. 본 발명에 따른 키트를 이용할 시 10-7 ng의 매우 적은 농도의 유전자도 증폭이 가능함을 알 수 있는 반면 A사의 경우 HSV-1의 경우 10-3 ng까지 증폭곡선을 보여 본 발명에 따른 키트의 민감도가 훨씬 높은 것으로 분석되었고 HSV-2는 본 발명의 키트에서는 HSV-1과 동일한 결과를 보였으나 A사의 키트는 분석이 불가능하였다. 따라서 HSV-1과 HSV-2를 동시에 측정하는 키트로서 본 발명의 키트는 멀티플렉스 키트의 조건을 만족하였으나 A사의 경우 그렇지 못하였기 때문에 본 발명의 키트의 우수성을 나타내고 있다.
<6-2> 본 발명의 키트와 B사의 HSV 키트의 비교분석
실시간 유전자 증폭을 이용한 B사와의 키트와 본 발명의 키트를 비교하기 위하여, HSV-1 strain KOS가 감염된 Vero cell로부터 추출된 유전자(ATCC No. VR-1493D)와 HSV-2 strain MS가 감염된 Vero cell로부터 추출된 유전자(ATCC No.VR-540D)를 대상으로 본 발명의 키트의 경우 실시예 2-2의 방법에 따라 분석하였고, B사의 키트의 경우 제조사의 프로토콜에 따라 실시간 유전자 증폭을 실시하고 민감도를 분석하였다. HSV-1 및 HSV-2 각 유전자는 각각 10 배수로 희석한 10-3 내지 10-7 ng의 농도로 각각 10배수로 희석하여 사용하였고, SV1 세트 및 SV2 세트를 이용하여 실시예 2-2에 기재된 방법에 따라 유전자 증폭을 수행하였다. SV1 세트 및 SV2 세트를 사용한 유전자 증폭 결과를 도 12와 도13에 나타내었다. 도 12와 도 13의 정량곡선에서 좌측부터 우측까지의 피크는 HSV-1와 HSV-2 유전자 표준물질의 10-3 ng, 10-4 ng, 10-5 ng, 10-6 ng, 10-7 ng의 농도를 대상으로 유전자 증폭을 수행한 결과이다. 본 발명에 따른 키트를 이용할 시 HSV-1과 HSV-2 분석 모두에서 10-7 ng의 매우 적은 농도의 유전자도 증폭이 가능함을 알 수 있는 반면 B사의 경우 HSV-1과 HSV-2 모두 분석이 불가능 하였다. 따라서 HSV-1과 HSV-2를 동시에 측정하는 키트로서 본 발명의 키트는 멀티플렉스 키트의 조건을 만족하였으나 B사의 경우 그렇지 못하였기 때문에 본 발명의 키트의 우수성을 나타내고 있다.
<110> MAXBiotech Co. JUNG, woonwon KIM, hyunsook <120> PRIMERS AND PROBES FOR ANALYSING HSV-1 AND HSV-2, ANAYSIS METHOD USING THE SAME, AND ANALYSIS KIT COMPRISING THE SAME <130> P11-214 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HSV-1 <400> 1 caccgacgaa cccctaaggg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HSV-1 <400> 2 cttaaggata actgatgatc g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HSV-1 <400> 3 agcaggggtt agggagttgt tc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HSV-2 <400> 4 agccaacccg ggcctgatca t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HSV-2 <400> 5 gagcggggaa actcctctag t 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for HSV-2 <400> 6 gtattgcgtt ttgggtacgc cgcc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta globin <400> 7 ctcctgggca acgtgctggt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for beta globin <400> 8 gccagggcat tagccacacc 20 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for beta globin <400> 9 tcaccccacc agtgcaggct gccta 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HSV-1 <400> 10 ccccggcccc caacaaaaat c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HSV-1 <400> 11 aaaacgggac ggttcgcgaa a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for HSV-2 <400> 12 aagaaactaa aaacacatca a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for HSV-2 <400> 13 acggaccagg ccggtggcgc a 21

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는, 단순포진 바이러스 1형(HSV-1) 또는 2형(HSV-2) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브가 단순포진 바이러스 1형을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프로브.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브가 단순포진 바이러스 2형을 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프로브.
  4. 수포 또는 궤양 부위 또는 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 DNA를 제1항의 프라이머 또는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR)으로 증폭하는 단계
    를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 검사 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    제1항의 프라이머 또는 프로브 외에, 내부표준물질인 베타 글로빈을 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용하는 것을 특징으로 하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자의 검사 방법.
  6. 제1항의 프라이머 또는 프로브를 포함하는 HSV-1 또는 HSV-2 유전자를 진단할 수 있는 검사 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 서열번호 7 내지 9 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 키트.
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