CN110735005A

CN110735005A - Siv和prrsv多重rt-pcr快速检测试剂盒及引物

Info

Publication number: CN110735005A
Application number: CN201911172299.8A
Authority: CN
Inventors: 陈樱; 余良政; 韦祖樟; 王豪; 林霜; 任同伟
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN110735005B

Abstract

本发明公开了H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT‑PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。据此，发明人还研制了相应的快速检测方法及其试剂盒，对重组质粒标准品的检出量可低至9.86×10⁰copies/μL。本发明具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点，为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定疾病防控方案，减少猪群死亡率和经济损失。

Description

SIV和PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物

技术领域

本发明属于猪呼吸道病毒核酸检测技术领域，尤其涉及H1、H3亚型SIV(猪流感病毒)和美洲型、欧洲型PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物。

背景技术

养猪业已经成为我国农业领域较为重要的支柱性产业，近年来，伴随着饲养方式朝往集约化、规模化的方向转变，猪群当中发生多种病原混合感染的情况愈演愈烈。特别是某些种类的猪病所引发的病理变化和临床症状不够典型，甚至在流行病学上也存在着相似性，这就使得我们在日常工作中很难凭借主观感受去区分这类疾病，更无法直观地确诊发病猪群同时感染了这些病原体。

猪流感(Swine Influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病，通常在猪场内呈现大规模的暴发或者地方性的流行，临床上多以突发性、群发性、咳嗽、呼吸困难为主要特征。目前，世界范围内流行的SIVs主要包括H1N1，H1N2和H3N2三种不同亚型。不同年龄、性别和品种的猪均能够感染SIV，猪群感染率高达100％，死亡率却非常低。尽管如此，猪作为异源毒株间发生基因重组的“混合容器”，其呼吸道上皮同时存在人源和禽源两种唾液酸受体，能够重配出具备感染人潜力的新型流感病毒，这对人类健康构成了巨大的威胁。

猪繁殖与呼吸综合征，又叫做“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起猪繁殖和呼吸障碍的一类传染病，临床症状多为厌食、发热、怀孕后期发生流产，产死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸系统疾病且大量死亡。该病最早于1987年在美国发生，现在已经呈现世界性分布。我国是于1996年首次分离到PRRSV美洲型的经典株，2006年分离到PRRSV美洲型高致病性变异毒株。2010年分离并鉴定出致病性的PRRSV欧洲型毒株。在我国，PPRSV流行毒株主要以美洲型的经典株和高致病性变异株为主，但是近些年，已有大量报道证实，我国部分省份的欧洲型PRRSV阳性检出率开始出现上升态势。

SIV属于正黏病毒科，是一种分节段的单股负链RNA病毒；PRRSV属于动脉炎病毒科，是一种单股正链RNA病毒。猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)同为“猪呼吸道疾病综合征”(Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)的两大类原发病原，均属于免疫抑制性疾病，可以破坏猪的免疫系统而引起免疫抑制，导致其他疫病并发或继发感染，加剧病情，给养猪业造成重大的经济损失，严重制约了我国生猪养殖产业健康的发展。

猪群中流行的流感病毒绝大多数为H1或H3亚型，流行的蓝耳病毒为美洲型(NorthAmerica，NA)或欧洲型(Europe，EU)，目前针对这些病毒的研究成果主要包括：猪H1、H3亚型流感病毒或者猪繁殖与呼吸综合征的分型方法以及同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。然而，尚未有人建立过针对这四类病毒的四重RT-PCR快速简便的诊断方法。

多重PCR方法(Multiplex PCR，M-PCR)是基于普通PCR方法开发出来的一种更加高效的病原鉴定方法，多重PCR方法只需利用一次PCR反应，就可以同时检测、鉴别出多种病原体。通常来说，与电镜观察、病毒分离、免疫组织化学、ELISA血清学检测、荧光抗体技术等常用的诊断手段相比，多重PCR检测方法降低了操作难度，减少了操作时间、劳动力和成本，提高了检测效率，不失为一种方便实用的疫病混合感染快速诊断方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供简单、高效、灵敏的H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物，以实现快速诊断这些病毒，便于尽快采取有效防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害，提升公共卫生安全。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

引物1至引物8的初始浓度摩尔比为3:3:3:3:5:5:3:3。

上述引物在制备H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。

H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

该试剂盒主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和PCR引物组成，四对PCR引物中所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

PCR标准品包括H1-SIV标准品、H3-SIV标准品、NA-PRRSV标准品、EU-PRRSV标准品；阳性对照品是含H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种病毒的阳性质粒混合物；阴性对照品是灭菌后的去离子水。

PCR标准品均为扩繁所得的阳性细胞毒。

四种病毒的阳性质粒混合物的浓度为9.86×10⁹copies/μL。

四对PCR引物的体系终浓度占比为3:3:3:3:5:5:3:3。

针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种类型病毒存在交叉感染、混合感染且难以区分的问题，发明人运用多重RT-PCR技术，针对性地设计了H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。据此，发明人还研制了相应的快速检测方法及其试剂盒，对重组质粒标准品的检出量可低至9.86×10⁰copies/μL。临床检测结果表明，应用本发明可在同一反应管内同时检测区分H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV这四种类型病毒的单个或混合感染，具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点。本发明为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定疾病防控方案，减少猪群死亡率和经济损失。

附图说明

图1是本发明四重RT-PCR检测方法建立的电泳图，图中：M:DL2000 DNA Marker；1、2、3、4泳道分别对应用H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV阳性质粒扩增的目的条带；6、7、8、9泳道分别对应用H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV临床样品cDNA扩增的目的条带，5泳道为四种病毒阳性混合质粒扩增的目的条带，10泳道为四种病毒临床样品混合cDNA扩增的目的条带。

图2是本发明四重RT-PCR温度梯度试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M:DL2000 DNA Marker；1:47.5℃；2:49.5℃；3:51.5℃；4:53.5℃；5:55.5℃；6:57.5℃。

图3是本发明四重RT-PCR重复性试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M:DL2000DNA Marker；1:48.5℃；2:50.5℃；3:52.5℃；4:53.5℃；5:54.5℃；6:55.5℃；7:56.5℃；8:58.5℃。

图4是本发明四重RT-PCR单重敏感性试验电泳图，图中：a为欧洲型蓝耳病毒检测引物的单重敏感性试验，b为H1亚型猪流感病毒检测引物的单重敏感性试验，c为H3亚型猪流感病毒检测引物的单重敏感性试验，d为美洲型蓝耳病毒检测引物的单重敏感性试验；泳道从左至右依次为M:DL2000 DNA Marker；1:9.86×10⁹；2:9.86×10⁸；3:9.86×10⁷；4:9.86×10⁶；5:9.86×10⁵；6:9.86×10⁴；7:9.86×10³；8:9.86×10²；9:9.86×10¹；10:9.86×10⁰copies/μL阳性单一质粒。

图5是本发明四重RT-PCR多重敏感性试验电泳图，图中：泳道从左至右依次为M:DL2000 DNA Marker；1:9.86×10⁹；2:9.86×10⁸；3:9.86×10⁷；4:9.86×10⁶；5:9.86×10⁵；6:9.86×10⁴；7:9.86×10³；8:9.86×10²；9:9.86×10¹；10:9.86×10⁰copies/μL阳性混合质粒。

图6是本发明四重RT-PCR多重特异性试验一电泳图，图中：泳道1、2、3、4为混合引物检测单一模板，泳道4、5、6、7为单一引物检测混合模板；泳道从左至右依次为M:DL2000DNA Marker；1:EU-PRRSV质粒单一模板；2:H3-SIV质粒单一模板；3:NA-PRRSV质粒单一模板；4:H1-SIV质粒单一模板；5:EU-PRRSV单一引物对；6:H3-SIV单一引物对；7:NA-PRRSV单一引物对；8:H1-SIV单一引物对。

图7是本发明四重RT-PCR多重特异性试验二电泳图，图中：泳道从左至右依次为M:DL2000 DNA Marker；1:NA-PRRSV；2:EU-PRRSV；3:H1-SIV；4:H3-SIV；5:ASFV；6:PRV；7:PCV；8:PRoV；9:PEVG；10:PAstV；11:CSFV；12:超纯水阴性对照。

具体实施方式

“中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行现状及遗传多样：分子流行病学研究”这篇文章全面概括了欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒基因亚型的分类，我们针对每种不同的亚型(包括：经典株、疫苗株、高致病性变异株等等)，选取3-5个代表毒株的M基因和N基因序列，相应地汇总在一起进行比对。

H1亚型的猪流感病毒鉴定引物设计选取的代表毒株涵盖了欧亚类禽H1N1猪流感病毒谱系、古典型H1N1猪流感谱系、北美三源重组H1N2谱系、2009年甲型H1N1大流感谱系等等。H3亚型猪流感病毒鉴定引物选取的代表毒株涵盖了Sydney/97-like、New York/99-like、Moscow/99-like等各种H3N2猪流感病毒小分支，同样针对每种谱系或者分支选取3-5个代表毒株的HA基因，相应地汇总在一起进行比对。

与前述文献相比，本发明严格按照引物的设计准则，获得的引物具备更为广泛的适用和检测范围，实用性较强，具体在于：

发明人在序列比对的基础上，针对美洲型猪繁殖与呼吸综合征N基因和M基因、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和M基因，H1亚型猪流感病毒HA基因，H3亚型猪流感病毒HA基因，分别设计并筛选能覆盖大部分分离株又适合多重检测并能进行鉴别的引物组合。

由于猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和M基因在欧洲型和美洲型之间差异较大，但是基因本身却很保守，是设计分型鉴定引物两个非常不错的靶位，设计难度不大。而SIV亚型鉴定引物根据不同谱系的血凝素蛋白来设计，对于鉴定当前流行亚型更具有针对性，因此猪H1亚型和H3亚型猪流感病毒的分型鉴定选择根据其HA基因进行设计，但是该基因容易发生变异，不仅存在基因型上的差异而且还存在毒株谱系之间的差异，所以要想保证引物的适用范围，设计起来难度较大。在保证四对引物TM值尽可能高的基础上，还使得这些引物的TM值尽可能接近或者相差不大，同时利用“兼并碱基”来解决部分序列碱基不保守的问题，最终获得了本发明的四对PCR引物。

实施例1、本发明试剂盒组装和使用

为方便使用，将本发明所用试剂组装成四类病毒多重RT-PCR快速检测试剂盒，主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品、引物以及盒体组成。盒体中设有相应的容器孔，用于分别放置各试剂。

如表1所示，引物包括四对PCR引物(由上海杰李生物技术有限公司合成引物，合成量为每管引物1OD)，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四类病毒。四对PCR引物中的所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。50μL总反应体系中按照引物摩尔占比3:3:3:3:5:5:3:3的比例来稀释引物，其中H1-SIV、H3-SIV、EU-PRRSV上下游引物初始浓度为15μM，NA-PRRSV上下游引物初始浓度为25μM，加入反应体系中每对上下游引物的量均为2μL。

表1本发明中所设计的多重PCR引物

PCR标准品包括H1-SIV标准品、H3-SIV标准品、NA-PRRSV标准品和EU-PRRSV标准品；阳性对照品是含H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种病毒的阳性质粒混合物(浓度约为9.86×10⁹copies/μL)；阴性对照品是灭菌后的去离子水(超纯水)。试剂盒的各试剂均保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

其中，四类病毒标准品的序列为序列表SEQ.ID.NO.9至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。

试剂盒使用方法：

每次检测根据具体情况设立阴性对照和阳性对照；标准品用无菌超纯水稀释为10⁰～10⁹copies/μL。

RNA病毒样品提取：根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒AxyPrep BodyFluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从细胞株中提取病毒核酸。

反转录反应：

1.猪流感病毒反转录合成cDNA

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL,dNTP Mixture(2.5mM,TaKaRa)1μL,Uni12 0.5μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL,Ribolock RNaseInhibitor(Vazyme)0.25μL,总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录合成cDNA

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板15μL,5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)5μL,dNTP Mixture(10mM,TaKaRa)2μL,下游引物2μL,Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.5μL,Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.5μL,总体积为25μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

核酸的检测：各取1μL已制备的cDNA模板进行多重PCR反应，其中DreamTaq HotStart Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)25μL，上游引物混合物8μL，下游引物混合物8μL，ddH₂O 5μL，总体积为50μL；反应程序为先95℃预变性5min，35个循环的反应条件为95℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸5min；PCR产物用2％的琼脂凝胶电泳进行检测，经凝胶成像仪成像后分析。

结果报告：根据H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV扩增基因片段的有无，对是否有这四类病毒进行鉴定。

实施例2、本发明检测四类病毒的特异性实验

按照多重PCR反应体系，DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(ThermoScientific)25μL，上游引物混合物8μL，下游引物混合物8μL，ddH₂O 8μL，加入1μL的样品cDNA。模板包括1:NA-PRRSV；2:EU-PRRSV；3:H1-SIV；4:H3-SIV；5:ASFV；6:PRV；7:PCV；8:PRoV；9:PEVG；10:PAstV；11:CSFV；12:超纯水阴性对照。反应在Life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先95℃预变性5min，35个循环的反应条件为95℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。取10μL PCR产物，点样于2％的琼脂凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳约20min，于凝胶成像仪紫外成像后拍照判定，结果参见图7，对应PCR产物大小与表1中H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV分别为605bp、320bp、447bp和231bp完全一致，表明本发明构建的四重RT-PCR检测试剂盒特异性好。

实施例3、本发明检测四类病毒的敏感性实验

多重PCR敏感性检测反应体系：DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)25μL，上游引物混合物8μL，下游引物混合物8μL，ddH₂O 5μL，分别加入4μL10倍系列稀释的H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV阳性质粒混合物(9.86×10⁹～9.86×10⁰copies/μL)模板。反应在Life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先95℃预变性5min，35个循环的反应条件为95℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。

常规单重PCR敏感性检测反应体系：DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，ddH₂O 20μL，分别加入4μL 10倍系列稀释的H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV阳性质粒混合物(9.86×10⁹～9.86×10⁰copies/μL)模板。反应在Life ProFlex PCR扩增仪进行，反应程序为：先95℃预变性5min，35个循环的反应条件为95℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。取10μL PCR产物，2％琼脂凝胶电泳检测。

实验结果表明，多重PCR反应对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种病毒的检出量可低至39.44copies，结果参见图5。

实施例4、本发明检测四类病毒的临床实例

将本发明所设计的四类病毒特异性引物序列(见表1)，由上海杰李生物技术有限公司合成引物，合成量为每管引物1OD进行试验。

第一步：临床样品

分别将H1亚型、H3亚型猪流感病毒阳性病料，欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性病料接种于MDCK细胞、Marc145细胞上，扩繁所得阳性细胞病毒液，经过RNA抽提之后用于临床试验检测。

第二步：总RNA小量抽提

根据产品使用说明书，用病毒RNA抽提试剂盒AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(Axygen)从新鲜或冷冻的样品中提取病毒核酸。

第三步：反转录合成cDNA

1.猪流感病毒反转录合成cDNA；

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板8μL，5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)2.5μL，dNTP Mixture(2.5mM,TaKaRa)1μL，Uni12 0.5μL，Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.25μL，Ribolock RNaseInhibitor(Vazyme)0.25μL，总体积为12.5μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

2.猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录合成cDNA；

在高压灭菌的0.2mL PCR管中依次加入上一步骤制备的总RNA模板15μL，5×Reversa Transcriptase M-MLV Buffer(TaKaRa)5μL，dNTP Mixture(10mM,TaKaRa)2μL，下游引物2μL，Reversa Transcriptase M-MLV(TaKaRa)0.5μL，Ribolock RNase Inhibitor(Vazyme)0.5μL，总体积为25μL，反应条件为42℃反应1h，待反转录反应结束后，所得反应液即为cDNA模板。

综上，本发明检测引物一次性同时可以检出多种混合感染病毒，减少反转录和PCR次数，大大节约时间和试剂耗材成本，提高工作效率。其中H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV引物呈现良好的特异性和敏感性均较好，该方法对重组质粒标准品的检出量可低至9.86×10⁰copies/μL。因此，本发明的引物具有良好的特异性和敏感性，并且在附图中可根据条带大小进行特异性区分。

研究过程中还发现，选用2×Flash Hot Star MasterMix(CWBIO)作为本实验的预混酶，可以大幅度缩短PCR的时间，有效地提高了检测的效率，且最终PCR结果不会受到任何影响。

序列表

<110> 广西大学

<120> SIV和PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggatggacag gaatgataga 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcctgtcccr gatatgttaa 20

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ckcgmggycc tgaattct 18

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rctggrygaa agcgacrc 18

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<212> DNA

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atggaagcaa gactatttgt attattctgt gtattcacta cactaaaagc tgacaccatt 60

tgtgtaggct accatgccaa caattccaca gacactgtcg acacaatatt ggagaaaaat 120

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aatttatatg aaaaagtcaa atcacaacta aggagcaatg ctaaggaaat cggaaatggc 1440

tgctttgagt tttatcacaa atgtgataat gagtgcatgg aaagcgtaaa gaatggcaca 1500

tacaattatc ccaaatattc agaagaatcc aagttgaata gggaggaaat agatggtgtg 1560

aaactagaat caatgggaat tcaccagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 1620

ctggtcttat tagtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgttctaa tgggtcattg 1680

caatgcagag tgtgcattta a 1701

<210> 10

<211> 1762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcaaaagca ggggataatt ctattaacca tgaagactat cattgctttg agctacattt 60

tatgtctggt tttcgctcaa aaacttcccg gaaatgacaa cagcacagca acgctgtgcc 120

tgggacacca tgcagtgcca aacggaaccc tagtgaaaac aatcacgaat gatcaaattg 180

aagtgactaa tgctactgag ctggttcaga gttcctcaac aggtagaata tgcgacagtc 240

ctcaccgaat ccttgatgga aaaaactgca cattgataga tgctctactg ggagaccctc 300

attgcgatgg ctttcaaaat aaggaatggg acctttttat tgaacgcagc aaagcttaca 360

gcaactgtta cccttatgat gtgccggatt attcctccct taggtcacta gttgcctcat 420

caggcaccct ggagtttacc aatgaagact tcaattggac tggggtcgct caggatgggg 480

gaagctattc ttgcaaaagg ggatctgtta aaagtttctt tagtagattg aattggttac 540

acaaattaga atacaaatat ccagcactga acgtgactat gccaaacaat gacaaatttg 600

acaaattgta catttggggg gttcaccacc cgagcacgga cagtgaacaa accagcctgt 660

atgttcaagc aatagggaga gtcacagtct ctaccaaaag tagccaacaa actgtaatcc 720

cgaacatcgg gtccagaccc tgggtgaggg gcatctccag tagaataagc atctattgga 780

caatagtaaa accgggagac atacttttga ttagcagcac agggaatcta attgctcctc 840

ggggttactt caaaatacga aatgggaaaa gctcaataat gaggtcagat gcacccattg 900

acaactgcta ttctgaatgc atcactccaa atggaagcat tcccaatgac aaaccttttc 960

aaaatgtaaa taggatcaca tatggggcct gtcccaaata tgttaagcaa aaaactctga 1020

aattggcaac agggatgcgg aatgtaccag agaaacaaac tagaggcata ttcggcgcaa 1080

tcgcaggttt catagaaaat ggttgggagg gaatggtaga cggttggtac ggtttcaggc 1140

atcaaaattc tgagggcaca ggacaagcag cagatcttaa aagcacccaa gcagcaatcg 1200

atcaagtcaa cgggaaattg aataggttaa tcgagaaaac gaacgagaaa ttccatcaaa 1260

tcgaaaaaga attttcagaa gtagaaggga gaattcagga cctcgagaaa tatgttgaag 1320

acactaaaat agatctctgg tcttacaacg cggagctcct tgttgccctg gagaatcaac 1380

atacaattga tctaactgac tcagaaatga acaaactgtt tgaaaaaaca aggaagcaac 1440

tgagggaaaa tgctgaggac atgggcaatg gttgcttcaa aatataccac aaatgtgaca 1500

atgcctgcat agggtcaatc agaaatggaa cttatgacca tgatgtatac agagacgaag 1560

cattaaacaa ccggttccag atcaaaggtg ttgagctgaa atcaggatac aaagattgga 1620

tcctatggat ttcctttgcc atatcatgct ttttgctttg tgttgttttg ctggggttca 1680

tcatgtgggc ctgccaaaaa ggcaacatta ggtgcaacat ttgcatttga gtgcattaat 1740

taaaaacacc cttgtttcta ct 1762

<210> 11

<211> 886

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggggtcgt ccttagatga cttctgtcat gatagcacgg ctccacaaaa ggtgcttttg 60

gcgttttcta ttacctacac gccagtgatg atatatgccc taaaggtgag tcgcggccga 120

ctgctagggc ttctgcacct tttgatcttc ctgaattgtg ctttcacctt cgggtacatg 180

actttcgcgc actttcagag tacaaataag gtcgcgctca ctatgggagc agtagttgca 240

ctcctttggg gggtgtactc agccatagaa acctggaaat tcatcacctc cagatgccgt 300

ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgttga aagtgccgca 360

ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg tcccggctcc 420

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gctgttaaac agggagtggt aaaccttgtc aaatatgcca aataacaacg gcaagcagca 540

gaagagaaag aagggggatg gccagccagt caatcagctg tgccagatgc tgggtaagat 600

catcgctcag caaaaccagt ccagaggcaa gggaccggga aagaaaaata agaagaaaaa 660

cccggagaag ccccattttc ctctagcgac tgaagatgat gtcagacatc actttacccc 720

tagtgagcgg caattgtgtc tgtcgtcaat ccagaccgcc tttaatcaag gcgctgggac 780

ttgcaccctg tcagattcag ggaggataag ttacactgtg gagtttagtt tgcctacgca 840

tcatactgtg cgcctgatcc gcgtcacagc atcaccctca gcatga 886

<210> 12

<211> 898

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggaagcc tagacgattt ttgcaacgat cctaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc 60

tttagcatca catatacacc tataatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgcctc 120

ctggggctat tgcacatctt gatattcctg aactgttcct ttacattcgg atacatgaca 180

tatgtgcatt ttcaatccac caaccgtgtc gcatttactc tgggggccgt tgtcgccctt 240

ctgtggggtg tttacagctt cacagagtca tggaagttca ttacttccag atgcagattg 300

tgttgcctag gccggcgata cattctggcc cctgcccatc acgtagaaag tgctgcaggt 360

ctccattcaa tcccagcgtc tggtaaccga gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca 420

tcagtgaacg gcactctagt accaggactt cggagcctcg tgctgggcgg caaacgagct 480

gttaaacgag gagtggttaa cctcgtcaag tatggccggt aaaaatcaga gccagaagaa 540

aaagaagaat acagctccga tggggaatgg ccagccagtc aatcaactgt gccagttgct 600

gggtgcaatg ataaagtccc agcgccagca acctagggga ggacaggcaa aaaaaagaaa 660

gcctgagaag ccacattttc ccctagctgc tgaagatgac attcggcacc acctcaccca 720

gaccgaacgt tccctctgct tgcaatcgat ccagacggct tttaatcaag gcgcaggaac 780

tgcgtcgctt tcatccagcg ggaaggtcag ttttcaggtt gagttcatgc tgccggttgc 840

tcatacagtg cgcctgattc gcgtgacttc tacatccgcc agtcagggtg caaattaa 898

Claims

1.H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，其特征在于包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；所述四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR快速检测引物，其特征在于所述引物1至引物8的初始浓度摩尔比为3:3:3:3:5:5:3:3。

3.权利要求1所述引物在制备H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。

4.H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；所述四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。

5.根据权利要求4所述的多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和PCR引物组成，四对PCR引物中所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。

6.根据权利要求5所述的多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR标准品包括H1-SIV标准品、H3-SIV标准品、NA-PRRSV标准品、EU-PRRSV标准品；所述阳性对照品是含H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种病毒的阳性质粒混合物；所述阴性对照品是灭菌后的去离子水。

7.根据权利要求6所述的多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR标准品均为扩繁所得的阳性细胞毒。

8.根据权利要求7所述的多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述四种病毒的阳性质粒混合物的浓度为9.86×10⁹copies/μL。

9.根据权利要求8所述的多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述四对PCR引物的体系终浓度占比为3:3:3:3:5:5:3:3。