CN106771178A

CN106771178A - 一种猪prrsv、siv、hev抗体的液相芯片多重检测试剂盒

Info

Publication number: CN106771178A
Application number: CN201611015332.2A
Authority: CN
Inventors: 王衡; 张桂红; 纪方晓; 冀池海; 曾梦; 陈万里
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: CN106771178B

Abstract

本发明提供了一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒；以PRRSV nsp7、SIV HA、HEV ORF2的不同荧光标记微球为载体，在PRRSV、SIV、HEV抗体单一液相芯片检测方法基础上，建立同时检测3种抗体的多重液相芯片检测方法，为HEV、PRRSV、SIV抗体监测提供一种更有效、更快速的检测方法，同时为猪病鉴别诊断及其他动物疫病抗体的血清检测新方法的建立提供新的线索；针对我国养猪业快速发展、猪病情况复杂、混合感染现象严重等养殖现状，进一步加强对猪群疫病情况进行准确、快速、有效的诊断和监测。

Description

一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体地，涉及一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒。

背景技术

液相芯片技术也被称为xMAP技术（flexible multiple-analyte profiling），是一种集流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及化学为一体的新型生物分子检测技术，是最早通过美国食品与药物管理局（FDA）认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。目前已经推出第三代检测技术---Flexmap3D，与上一代检测技术相比较，Flexmap3D更加高效，可以同时对一个样本中的500种不同目的分子进行检测，并且可以一次检测384个不同样本，是一种高效检测的方法。

猪流感（Swine Influenza，SI）是猪流感病毒（Swine Influenza virus，SIV）引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床上以突发、咳嗽、高热、呼吸困难、精神沉郁、高发病率、低病死率为特征。目前，全球猪群中以经典猪流感H1N1和类人H3N2亚型为主广泛流行，尽管猪流感死亡率低，但是其可造成其他病原的继发感染，对养殖业造成巨大的经济损失。猪是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨种传播的中间宿主，是流感病毒基因重组的“混合器”，是引起流感大爆发的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒（pdm2009）在墨西哥、美国相继爆发，该流行毒株是由人流感、猪流感和禽流感病毒基因自然重组而形成的一种新型流感病毒。该毒株的PB1基因来于H3N2人流感，PA和PB2基因来自于北美禽流感，NA和M基因来自欧亚类禽猪流感，HA、NP和NS基因来自经典猪流感。该毒株能通过抗原的变异逃避机体的免疫系统，短时间内迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人们的关注。在猪场内进行定期的SIV抗体监测对于预防其它疾病的出现，以及在人群中流行具有重要的公共卫生学意义。

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的以黄疸为主要表现的急性病毒性肝炎，主要经粪-口途径传播。该病主要流行于卫生设施不完善的发展中国家（如亚洲和非洲），在发达国家（如美国和一些欧洲国家）也存在散发的情况。戊型肝炎的致死率（1～4%）比甲型肝炎（0.1～2%）的致死率要高，并且对孕妇的致死率能高达30%。

HEV具有一个血清型，四个基因型，基因1和2型只感染人，主要流行于亚洲、非洲、墨西哥。基因 3、4 型宿主范围较广，除了可感染人和家猪外，也可感染鸡、鹿、兔子、老鼠等其他动物。基因3型主要流行于美国、加拿大、阿根廷、西班牙、法国、澳大利亚、荷兰、新西兰等。基因4型分布在中国，日本，印度和越南。因此，戊型肝炎已经是一个重要的公共卫生问题而不只是食物安全和人畜共患病等潜在的风险。

猪繁殖与呼吸系统综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的高度接触性传染病，主要表现为怀孕母猪后期流产、早产、死胎及木乃伊胎，仔猪发生呼吸系统疾病，并大量死亡。1987年，美国中西部首先爆发该病，并迅速波及其他国家。我国于1996年首次报道该病，并分离到第一株PRRSV。2006年，我国爆发了以高热高死亡为特征的高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征（HP-PRRS），其传播迅速、持续时间长，给我国的养殖业带来了巨大的经济素损失，PRRS已经成为危害全球养猪业的重要传染病之一。为减少该病对来损失，对于大型集约化养殖场，针对PRRSV进行血清的抗体监测格外重要。目前主要采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA），由于其敏感度和特异性好，成为许多国家监测和诊断PRRSV的主要方法。尽管如此，ELISA方法无法用于多重诊断；而且当前亟缺一种新的方法，用于对ELISA方法的校对。

现有技术中虽然有一些分别针对猪PPRSV、HEV和SIV抗体的检测方法，但其检测较为繁琐，且检测时间长。现有技术缺乏一种能同时检测PPRSV、HEV和SIV三种抗体的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一组用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，所述羧基化荧光微球组分别由用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的羧基化荧光微球61-Nsp7、用于检测猪流感病毒的羧基化微球46-HA和用于检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2组成；所述羧基化荧光微球61-Nsp7是第61号羧基化荧光微球和PRRSV-nsp7重组蛋白偶联获得；所述羧基化微球46-HA是第46号羧基化荧光微球和SIV HA重组蛋白偶联获得；所述羧基化荧光微球12-ORF2是第12号羧基化荧光微球和HEV ORF2重组蛋白偶联获得；

其中，SIV HA重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

S11. 去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

S12. 连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可；

其中，HEV ORF2重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

S21. 以表达HEV ORF2 C段第337个到第645个氨基酸片段的核苷酸序列为目的片段，利用上游引物F和下游引物R扩增该目的片段；上游引物F和下游引物R的序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

S22. 连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-c5X-ORF2重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。

本发明所述检测方法能同时检测SIV、HEV和PPRSV抗体。

本研究应用生物学软件Signal P V2.0.b2对HA基因进行信号肽分析，去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有HIS标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白（MBP）组合标签的原核表达质粒。MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码，大小约为40KD，在大肠杆菌表达系统中可增加目的蛋白的可溶性；同时，His标签便于重组蛋白的纯化，易于进行之后的实验。

前期研究中发现，若去除HA基因的跨膜区，容易影响HA基因表达的抗原的完整性，影响其免疫原性。保留跨膜区也是为了保留HA基因的抗体完整性及其天然构象。

使用pMAL-c5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose 树脂纯化效率较低（即重组蛋白的纯化效率和纯化度低），因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在HA基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni²⁺纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率。

最终，本研究构建了带有6*His-MBP组合标签的原核表达质粒pMAL-cHA，成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，为H1亚型SIV抗体检测方法的建立奠定了基础。

优选地，S12所述诱导表达条件为：IPTG 0.3mM，温度37℃，时间2小时。

HEV基因组为单股正链RNA，大小约7.2kb，具有3个开放阅读框（open readingframe, ORF）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2为HEV主要的结构基因编码区，编码衣壳蛋白，该蛋白富含多个抗原表位，结构复杂，除N端有少数几个外，其余抗原表位主要分布在C端2/3处。

ORF2 C末端编码的452aa～617aa是HEV中和抗原表位的位置，且不同基因型能够发生交叉中和反应，提示存在共同中和抗原表位。因此，本研究选取ORF2 C段337～654aa片段进行原核表达，成功表达了具有免疫原型的ORF2蛋白，以期建立猪戊型肝炎病毒检测方法。

使用pMAL-c5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose树脂纯化效率较低（即重组蛋白的纯化效率和纯化度低），因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在ORF2基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni²⁺纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率，为HEV抗体检测方法的建立奠定了基础。

优选地，S22所述诱导表达条件为：IPTG终浓度0.8 mmol/L，温度30℃，时间5h。

本发明还提供含有所述羧基化荧光微球组的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还含有生物标记的鸡抗鼠IgG抗体或者兔抗猪IgG抗体、链霉素-藻红蛋白。

优选地，所述生物标记的鸡抗鼠IgG抗体的稀释度为1：1000，兔抗猪IgG抗体的稀释度为1：5000，链霉素-藻红蛋白的稀释度为1：1000。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以流式芯片技术（荧光微球免疫分析技术）为基础，以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）非结构蛋白7（nsp7）、H1N1亚型猪流感病毒（SIV）血凝素蛋白（HA）、戊型肝炎病毒（HEV）开放阅读抗2蛋白（ORF2）的不同荧光标记微球为载体，在PRRSV、SIV、HEV抗体单一液相芯片检测方法基础上，建立同时检测3种抗体的多重液相芯片检测方法，为HEV、PRRSV、SIV抗体监测提供一种更有效、更快速的检测方法，同时为猪病鉴别诊断及其他动物疫病抗体的血清检测新方法的建立提供新的线索；针对我国养猪业快速发展、猪病情况复杂、混合感染现象严重等养殖现状，进一步加强对猪群疫病情况进行准确、快速、有效的诊断和监测。

附图说明

图1为SIV HA重组蛋白制备实验结果图，图1A为HA 基因的PCR扩增结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：样品的PCR扩增产物；图1B为重组质粒pMAL-cHA酶切鉴定，其中，M：DL-2000标准分子量；1为重组质粒双酶切PCR扩增产物；图1C为HA重组蛋白表达结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：pMAL-c5X空载体诱导前；2：pMAL-c5X空载体诱导后；3：重组质粒pMAL-cHA诱导前；4. 重组质粒pMAL-cHA诱导后；图1D为HA重组蛋白可溶性分析结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：pMAL-c5X空载体诱导后；2：重组质粒pMAL-cHA诱导前；3：重组质粒pMAL-cHA诱导后；4：菌液超声破碎上清；5：菌液超声破碎沉淀；图1E为HA重组蛋白的Western Blot分析，其中，M：DL-2000标准分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA诱导后；2：Rosetta-pMAL-cHA诱导前；图1F为HA蛋白的纯化SDS-PAGE分析，其中，M：DL-2000标准分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA纯化前；2：Rosetta-pMAL-cHA纯化后。

图2为HEV ORF2重组蛋白制备实验结果图，图2A为ORF2基因的PCR扩增结果，其中，M：DL-2000Marker，1：PCR扩增产物；图2B为重组质粒pMAL-c5X－ORF2酶切鉴定，其中，M：1kbMarker，1：pMAL-c5X－ORF2双酶切；图2C为重组蛋白表达的SDS-PAGE结果，其中，M：蛋白分子量标准，1：pMAL-c5X空载体诱导前，2. pMAL-c5X空载体诱导后，3. 重组质粒pMAL-c5X－ORF2诱导前，4. 重组质粒pMAL-c5X－ORF2诱导后，5.菌液超声后上清，6.菌液超声后沉淀；图2D为ORF2蛋白的纯化，其中，M：蛋白分子量标准；1：诱导后全菌液；2：ORF2蛋白纯化后；图2E为ORF2蛋白 Western Blotting分析，其中M：蛋白分子量标准；1：重组质粒pMAL-c5X－ORF2未诱导；2：重组质粒pMAL-c5X－ORF2诱导后。

图3为PPRSV nsp7重组蛋白制备实验结果图，图3A为PCR鉴定pET32a-Nsp7阳性克隆菌，其中，M：DNA 2000 Marker；1.菌液PCR；2.阴性对照；图3B为重组质粒pET32a-Nsp7蛋白表达SDS-PAGE结果图；其中，1.蛋白质分子质量标准；2.重组质粒pET32a-Nsp7诱导前；3.重组质粒pET32a-Nsp7诱导后；图3C为蛋白的可溶性分析与纯化SDS-PAGE结果图，其中，1.蛋白质分子质量标准；2.重组质粒pET32a-Nsp7诱导后沉淀；3.重组质粒pET32a-Nsp7诱导后上清；4.His-Nsp7融合蛋白纯化产物；5.His-tag蛋白纯化产物；图3D为表达蛋白的Western-blot分析，其中，1.蛋白质分子质量标准；2.His-Nsp7融合蛋白印迹；3.空白对照。

图4为偶联与检测方法可行性验证结果。

图5为单抗稀释梯度的检测结果，其中，a：PRRSV Nsp7单抗稀释；b：SIV HA单抗稀释；c：HEV ORF2单抗稀释。

图6为血清稀释梯度检测结果，其中，a：PRRSV 血清稀释；b：SIV 血清稀释；c：HEV血清稀释。

图7为特异性分析，其中，a：PRRSV特异性分析；b：SIV 特异性分析；c：HEV 特异性分析。

图8为液相蛋白多重检测结果，其中，a：PRRSV多重分析；b：SIV 多重分析；c：HEV多重分析。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

一、SIV HA重组蛋白的制备

1、流感病毒总RNA的抽提与cDNA的合成

参考RNA抽提试剂盒说明书进行病毒总RNA的提取。获得总RNA后参照宝生物工程（大连）有限公司的M-MLV反转录酶的使用说明书进行反转录操作，反应体系如表1。

表1中的各试剂加入后充分混匀，于42℃水浴锅中放置1 h，获得cDNA产物置于-20℃冻存备用。

2、SIV H1N1 HA基因的扩增

应用Oligo7.0生物学软件，根据SIV H1N1 HA基因序列（GenBank： JN375120.1，去除表达信号肽部分的核苷酸序列）设计一对特异性引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，上、下游引物加入酶切位点，且下游引物加入His标签，引物序列为：

HA-F: 5’- TTGCGGCCGCGACACATTATGTATAGG -3’（Not I），

HA-R: 5’- GCGTCGAC ATGATGATGATGATGATGAATACATATTCTACACTG-3’（Sal I）；

下划线部分为引物的限制性酶切位点，限制性酶切位点名称在引物后括号内显示；下游引物中斜体部分为表达6×His基因序列；HA基因扩增片段长度为1,683bp。

SIV H1N1 HA基因的扩增反应体系如下：10×Taq Buffer 2.5 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL、HA-F 0.5 μL、HA-R 0.5 μL、模板 1μL、ddH₂O 20.25 μL；反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火温度为55℃ 30s，72℃延伸2 min，共30个循环，72℃终延伸7 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1，HA基因片段大小与预期相符，目的片段长度为1683bp。（图1A）。

3、连接、转化与鉴定

应用DNA胶回收试剂盒对首轮PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转化感受态细胞，挑取单克隆菌落培养过夜，抽提质粒并进行PCR的初步鉴定，将阳性质粒送至上海生工进行测序鉴定，阳性质粒命名为pMD-SIV HA。

将重组质粒pMD-SIV HA进行Not I和Sal I限制性内切酶的双酶切，回收目的基因片段；同时对pMAL-C5X载体进行Not I和Sal I双酶切，回收酶切载体片段。利用T4连接酶将HA与pMAL-C5X载体双酶切片段进行连接，经转化，鉴定结果如图1B，重组质粒pMAL-cHA测序结果与目的基因的序列一致，证明重组质粒构建成功，即获得pMAL-cHA重组质粒。

4、重组蛋白的表达

将含有重组质粒pMAL-cHA的Rosetta（DE3）大肠杆菌接种至Luria-Bertani（LB）液体培养液中，培养物OD值达0.6时加入终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），37℃培养2小时后，收集产物进行SDS-PAGE检测；应用Western blot方法，以抗SIV HA单抗为一抗，对表达产物进行检测。同时离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。

SIV HA目的蛋白大小与预期相符，在约100KD处有一条目的条带（图1C），且目的蛋白在上清和沉淀中均有表达，说明该蛋白具有可溶性（图1D）。

IPTG诱导表达后的菌液经SDS-PAGE电泳后转至NC膜上，SIV HA蛋白分别与各自单抗孵育，进行Western-blot分析，结果显示SIV HA蛋白与其单抗均可发生特异性反应，产生单一条带（图1E）。说明了表达的目的蛋白具有抗原性，可用于基于抗原抗体反应的检测技术的建立。

5、重组蛋白的纯化

超声破碎后的上清液经滤器（0.45 μm）过滤，用GE填料填充的Ni²⁺亲和层析柱过柱纯化。

主要操作步骤如下：放掉纯化柱中20%乙醇溶液，用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用5～10倍柱体积的20 mM咪唑缓冲液过柱，流速保持为每滴6 s，平衡柱子；将上清液过柱，保持流速每滴6 s，上清液重复过柱3遍；用10倍柱体积的20 mM、80 mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，保持流速每滴6 s；最后用500mM咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，保持流速每滴6s，每管收集1mL洗脱液。

用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度并做SDS-PAGE进行纯度分析，纯化后的HA蛋白经SDS-PAGE分析结果如图1F。

二、HEV ORF2重组蛋白的制备

1、重组表达质粒pMAL-c5X-ORF2的构建和鉴定

应用Oligo7.0生物学软件，选取ORF2蛋白C段337～654aa片段，根据ORF2基因的序列（accession No. JX855794，第1009 bp到第1926 bp的序列）设计一对特异性引物，上游引物F加入Not I 酶切位点，下游引物R加入Sal I酶切位点和6×HIS标签，以 pET32a-ORF2质粒为模板，经PCR扩增ORF2基因，PCR产物经纯化、酶切后连接至pMAL-c5X原核表达载体，并转化至Rosetta（DE3）感受态细胞，挑取单菌落进行PCR鉴定，对阳性菌进行酶切鉴定，并送英潍捷基贸易有限公司测序。

上游引物F：5'-GGGGTCGACTATTCG AGTAGTGCGCGTC-3'

下游引物R：

5'- GAGGAATTCATGATGATGATGATGATGGAAGGCACAGCCCTGGAGG -3'

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可见与目的条带一致大小为990 bp的条带（图2A），pMAL-c5X-ORF2质粒用Not I、Sal I双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后与目的条带一致（图2B），且将质粒送公司测序结果与目的序列一致，说明原核表达质粒构建成功。

2、重组表达质粒pMAL-c5X-ORF2的诱导表达和可溶性分析

将阳性菌于37 ℃培养至OD600 nm 为0.5～0.6 时，加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L于30℃进行诱导5 h，离心收集菌体冰浴条件下超声破碎，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。

菌液经IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳分析在约74 KD处有一条目的条带，与预期相符，且目的蛋白在上清和沉淀中均有表达，说明该蛋白具有可溶性（图2C）。

3、目的蛋白的纯化

采用GE填料填充的Ni²⁺亲和层析柱进行蛋白纯化，具体操作按其产品说明书进行。主要操作步骤如下：诱导后的菌液超声破碎、离心后，上清用滤器（0.45 μm）过滤；用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用6倍柱体积的结合缓冲液过柱；上清过柱，3遍；用10倍柱体积的洗脱缓冲液A和B洗脱杂蛋白；最后用5倍柱体积的洗脱缓冲液C洗脱目的蛋白，分段收集洗脱液，流速均为1 mL/min。测定目的蛋白的浓度并做SDS-PAGE进行纯度分析。

上清经Ni²⁺亲和层析柱后，收集的洗脱液经SDS-PAGE电泳分析可见一条74 KD的特异性条带即ORF2蛋白（图2D）。

4、Western Blotting验证目的蛋白的抗原性

ORF2目的蛋白经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜（NC）上，用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2h，与1：1 000 000稀释的鼠源抗体4 ℃过夜孵育，再与1：8 000稀释的羊抗鼠二抗室温孵育1 h，将NC膜放入双色激光分析系统Odyssey（LI-COR公司生产）中进行扫膜分析。

ORF2蛋白与单抗反应后在NC膜上有一条约为74KD的特异性条带，且阴性对照没有条带（图2E），说明了ORF2蛋白具有反应原型。

三、PRRSV nsp7重组蛋白的制备

1、PRRSV nsp7基因的扩增

应用Oligo7.0生物学软件，根据PRRSV nsp7基因序列（GenBank accession no.EU624117）设计一对特异性引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，上、下游游引物加入酶切位点，引物序列为：

Nsp7-F: 5’CGCGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTCG3’（BamH I），

Nsp7-R: 5’GAGAAGCTTATCCTCCCGGGTTTTAC3’（ Hind III）

下划线部分为引物的限制性酶切位点，限制性酶切位点名称在引物后括号内显示；nsp7基因扩增片段长度为777 bp。

反应体系如下：10×Taq Buffer 2.5 μL、Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板 1μL(含有PRRSV XH-GD株cDNA全长的质粒)、ddH₂O 20.25 μL；反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火温度为55℃ 30s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃终延伸7 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2、链接、转化与鉴定

应用DNA胶回收试剂盒对首轮PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转化感受态细胞，挑取单克隆菌落培养过夜，抽提质粒并进行PCR的初步鉴定，将阳性质粒送至上海生工进行测序鉴定，阳性质粒命名为pMD-nsp7。

将重组质粒pMD-nsp7进行Not I和Sal I限制性内切酶的双酶切，回收目的基因片段；同时对pET32a-Nsp7载体进行Not I和Sal I双酶切，回收酶切载体片段。利用T4连接酶将HA与pET32a载体双酶切片段进行连接，经转化、鉴定后，获得pET32a-Nsp7重组质粒。

重组质粒pET32a-Nsp7表达菌活化后，用LB（Amp⁺）固体培养基筛选；挑取单菌落接种于液体培养基，37℃过夜培养12 h；取菌液进行PCR初步鉴定，得到约777bp的目的片段，与预期大小相符（图3A）。

3、重组蛋白的表达与鉴定

将含有重组质粒pET32a-Nsp7的E.coli BL21感受态细胞种至Luria-Bertani（LB）液体培养液中，培养物OD值达0.6时加入终浓度为1 mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），37℃培养4小时后，收集产物进行SDS-PAGE检测；应用Western blot方法，以His标签蛋白单克隆抗体为一抗，对表达产物进行检测。同时离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。

阳性表达菌经IPTG诱导后用12%的SDS-PAGE电泳，结果在约49kDa处发现一条较大的表达条带，该条带与目的蛋白预期大小相符（图3B）。

4、重组蛋白的纯化

超声破碎后的上清液经滤器（0.45 μm）过滤，用GE填料填充的Ni²⁺亲和层析柱进行过柱纯化。

主要操作步骤如下：放掉纯化柱中20% 乙醇溶液，用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用5-10倍柱体积的20 mM咪唑缓冲液过柱，流速保持为每滴6 s，平衡柱子；将上清液过柱，保持流速每滴6 s，上清液重复过柱3遍；用10倍柱体积的20 mM、80 mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，保持流速每滴6 s；最后用500mM咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，保持流速每滴6s，每管收集1mL洗脱液。

用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度并做SDS-PAGE进行纯度分析。

对重组质粒pET32a-Nsp7表达产物进行可溶性分析，结果显示His-Nsp7重组蛋白主要是存在于上清液中，即重组蛋白主要以可溶形式存在；之后对重组蛋白及His-tag蛋白进行纯化，纯化样品进行SDS-PAGE鉴定；结果显示获得的样品纯度较高（图3C）。

PRRSV nsp7融合蛋白纯化产物经SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜，进行Western blotting鉴定。结果显示，PRRSV nsp7融合蛋白能够与His标签蛋白单克隆抗体发生特异性反应，表明产物为目的蛋白（图3D）。

实施例1

一、重组蛋白

本试验中采用的PRRSV nsp7、SIV HA以及HEV ORF2重组蛋白，均为本实验室自主构建的重组质粒，利用大肠杆菌表达系统，表达获得。重组质粒及重组蛋白信息见表2。

二、抗原与微球的偶联

参照Luminex公司的xMAP®技术大全，两步酰胺反应：首先磷酸化微球经磷酸氢二钠缓冲液、Sulfo-NHS和EDC溶液成为活化状态，其次PRRSV Nsp7、SIV HA、HEV ORF2重组蛋白作为抗原分别与微球形成共价酰胺键，偶联上抗原的微球用PBS-TBN 溶液重悬于4 ℃避光保存。具体操作步骤如下：

（1）漩涡仪振荡微球悬液1 min，使微球均匀散开；

（2）取微球100 μL 转移到1.5 mL离心管中，8000 g/min，2 min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清（不要吸走微球）；

（3）加入100 μL ddH₂O，涡旋1min，再8000 g/min，2 min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

（4）加入80 μL 100 mM、pH=6.2的磷酸二氢钠盐溶液（NaH₂PO₄），涡旋1 min，重悬微球；

（5）加入10 μL 50 mg/mL的 N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysulfosuccinimiesodium salt-Sulfo-NHS，N-Sulfo-NHS)，和10 μL 50mg/mL 1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy) carbodimide Hydrochloride，EDC]，涡旋1min。

（6）室温孵育20 min（每隔10 min用漩涡仪轻振），8000 g/min，2 min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

（7）加入250 μL 50 mM、pH=5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（2-(N-Moropholino)ethanesulfonic acid，MES），涡旋1min，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

（8）重复步骤（7）一次。

（9）将上述活化后的微球中加入100 μL 50 mMo、pH=5.0的MES，涡旋1min，分别在混匀的磁珠中加入10 μg的蛋白抗原，再用MES定容至500 μL，涡旋1min；

（10）在室温下放在摇床上孵育2 h，8000 g/min，2～3 min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

（11）并放于磁力架上，轻轻移走上清，涡旋1min，再在摇床上孵育30 min，8000 g/min，2～3 min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；

（12）再加入1 mL PBS-TBN，8000 g/min，2～3 min离心，沉淀微球，弃上清，再重复一次；

（13）加入1 mL PBS-TBN，重悬微球，即得偶联抗原的微球：61-Nsp7、46-HA、12-ORF2，4℃避光保存。

实施例2 利用实施例1制备得到的偶联有抗原的微球建立液相芯片检测方法

一、液相蛋白芯片单重检测技术，参照Luminex公司的xMAP®技术大全，具体步骤如下：

（1）每孔加入50 μL（2500个）偶联有抗原的微球和50 μL待检测样品（单抗或血清），室温震荡（500 r/min）避光孵育1 h，用PBST洗涤2次，200 μL/孔；

（2）加入生物素标记的鸡抗鼠（1：1000）或兔抗猪（1：5000）IgG抗体100 μL/孔，室温震荡（500 r/min）避光孵育1 h，用PBST洗涤2次，200 μL/孔；

（3）加入1：1,000稀释的链霉素-藻红蛋白（SA-PE）100μL /孔，室温震荡（500 r/min）避光孵育0.5 h，用PBST洗涤2次，200 μL/孔；

（4）每孔加入125 μL鞘液重悬，于Flex 3D液相芯片检测系统进行读取中位数荧光强度（MFI）。

二、偶联效率的评价

Nsp7蛋白与61号微球偶联、HA蛋白与46号微球偶联、ORF2蛋白与12号微球偶联，用偶联有抗原的微球对阳、阴性血清、PBS进行检测，结果表明阳性血清的MFI（mean fluorescenceintensities）大于10000，且大于5倍阴性对照的MFI，空白对照的MFI小于100（图4），说明该偶联方法和检测方法是可行的。

将Nsp7单抗从初始浓度4 mg/mL进行10倍梯度稀释，HA单抗从初始浓度14.6 ug/mL进行2倍梯度稀释，ORF2单抗从初始浓度3mg/mL开始进行10倍梯度稀释，用液相蛋白芯片检测方法检测，MFI值采用SPSS软件进行拟合三次方程。结果表明，PRRSV、SIV、HEV液相蛋白芯片检测方法的相关系数（R²）分别为1、0.997、0.994，说明了曲线相关性好（图5）。

同时，当单抗浓度低至1ng/mL时，该方法仍具有高灵敏度（图5）。

三、血清稀最佳释度的确定

PRRSV、SIV、HEV阳、阴性血清用PBS-1%BSA进行梯度稀释，即1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600。每个稀释度3个重复，进行梯度稀释检测结果显示血清的最佳稀释倍数为1:200，当血清稀释至1:800时，阳性血清的MFI大于Cutoff值，仍可检测出阳性（图6）。

四、特异性试验

利用本发明建立的液相蛋白技术芯片检测方法对猪常见疾病PRRSV、SIV、HEV、CSFV、PCV-2、PRV、FMDV阳性血清进行检测，以验证该检测方法的特异性。结果显示：应用PRRSV液相蛋白检测方法时，只有PRRSV阳性血清检测结果为阳性，其他疾病阳性血清检测结果为阴性（图7a）。应用SIV液相蛋白检测方法时，只有SIV阳性血清检测结果为阳性，其他疾病阳性血清检测结果为阴性（图7b）。应用HEV液相蛋白检测方法时，只有HEV阳性血清检测结果为阳性，其他疾病阳性血清检测结果为阴性（图7c）。说明本研究建立的3个液相蛋白芯片检测方法特异性好，与其它病毒阳性血清无交叉反应。

五、重复性试验

批内重复：取PRRSV、SIV、HEV各4份阳性血清、1份阴性血清，每份血清10个重复，通过计算其变异系数以评价该方法的批内精密度。

批间重复：取PRRSV、SIV、HEV各11份阳性血清、1份阴性血清，每份血清3个重复，不同时间做3次，通过计算变异系数以评价该方法的批间精密度。

PRRSV、SIV、HEV液相蛋白芯片检测方法的批内变异系数（CV）分别为2.6～4.1%、4.4～7.8%、3.3%～8.3%（表3），批间变异系数分别为：1.4～7.5%、2～10.6%、2.3～11.8%（表4）。其平均批内变异系数分别为：3.2%、6.2%、5.8%，平均批间变异系数分别为：4.2%、6.5%、6.6%（表5）。符合Luminex精密度的要求：批内CV为不大于10%，批间CV不大于20%，说明本研究建立的该检测方法具有良好的重复性。

六、液相蛋白芯片与ELISA的比较

采用本研究建立的液相蛋白芯片技术和ELISA同时检测临床血清，PPRSV 115份、SIV110份、HIV 102份，通过MedCalc 软件进行ROC 分析，确定最优临界值、灵敏度、特异性。同时通过配对卡方检验（关联卡方检验，优势卡方检验）评价其符合率。

PRRSV液相蛋白芯片检测方法检测115份临床血清样品，与ELISA检测方法比较，通过MedCalc 软件进行ROC 分析。结果显示，PRRSV液相蛋白芯片检测技术的灵敏度为94.9%，特异性为91.1%，临界值为8259；SIV液相蛋白芯片检测技术的灵敏度为96.6%，特异性为93.8%，临界值为6511；HEV液相蛋白芯片检测技术的灵敏度为90.5%，特异性为95.0%，临界值为4523.5（表6）。

关联性卡方检验结果：PRRSV液相蛋白芯片法与ELISA的关联极著（卡方值=81.87，P<0.01），两个方法均可反应同一指标；与ELISA相比，液相蛋白芯片法优势不显著（卡方值=0.13，P>0.05）。SIV和HEV液相蛋白芯片法同样与ELISA检测结果差异不显著，具有一致性，能反映同一指标（表7）。

七、PRRSV、SIV、HEV液相芯片多重检测技术的建立

1、液相蛋白芯片多重检测技术的建立

参照Luminex公司的xMAP®技术大全，首先每孔加入50 μL偶联有抗原的微球（PRRSV、SIV、HEV抗原偶联微球各2500个）和50 μL待检测稀释后的血清样品，其他具体参见步骤一中的（1）、（2）、（3）、（4）。

2、液相蛋白芯片多重检测技术的评价

液相蛋白芯片单重检测技术和液相芯片多重检测技术同时对猪血清进行检测，通过线性回归和相关系数（R²）验证液相蛋白芯片多重检测技术是否会有交叉反应，同时验证多重检测技术的可行性。

将Nsp7-61号微球、HA-46号微球、ORF2-12号微球同时加入同一个检测反应中，PRRSV、SIV、HEV多重检测与单一检测时MFI值的相关系数（R²）分别为：0.9901、0.9955、0.9907（图8），说明多重检测时Nsp7-61号微球、HA-46号微球、ORF2-12号微球不会相互影响，无交叉反应。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种猪PRRSV、SIV、HEV抗体的液相芯片多重检测试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> HA-F

<400> 1

ttgcggccgc gacacattat gtatagg 27

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> HA-R

<400> 2

gcgtcgacat gatgatgatg atgatgaata catattctac actg 44

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 上游引物F

<400> 3

ggggtcgact attcgagtag tgcgcgtc 28

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物R

<400> 4

gaggaattca tgatgatgat gatgatggaa ggcacagccc tggagg 46

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Nsp7-F

<400> 5

cgcggatcct cgctgactgg tgccctcg 28

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Nsp7-R

<400> 6

gagaagctta tcctcccggg ttttac 26

Claims

1.一组用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，其特征在于，所述羧基化荧光微球组分别由用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的羧基化荧光微球61-Nsp7、用于检测猪流感病毒的羧基化微球46-HA和用于检测猪戊型肝炎病毒的羧基化荧光微球12-ORF2组成；所述羧基化荧光微球61-Nsp7是第61号羧基化荧光微球和PRRSV-nsp7重组蛋白偶联获得；所述羧基化微球46-HA是第46号羧基化荧光微球和SIV HA重组蛋白偶联获得；所述羧基化荧光微球12-ORF2是第12号羧基化荧光微球和HEV ORF2重组蛋白偶联获得；

其中，SIV HA重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

其中，HEV ORF2重组蛋白的制备方法包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，其特征在于，S12所述诱导表达条件为：IPTG 0.3mM，温度37℃，时间2小时。

3. 根据权利要求1所述的用于检测猪戊型肝炎病毒、猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的羧基化荧光微球组，其特征在于，S22所述诱导表达条件为：IPTG终浓度0.8mmol/L，温度30℃，时间5h。

4.含有权利要求1至3任一项所述羧基化荧光微球组的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有生物标记的鸡抗鼠IgG抗体或者兔抗猪IgG抗体、链霉素-藻红蛋白。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述生物标记的鸡抗鼠IgG抗体的稀释度为1：1000，兔抗猪IgG抗体的稀释度为1：5000，链霉素-藻红蛋白的稀释度为1：1000。