CN105606805A - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒 - Google Patents

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CN105606805A CN201610054589.2A CN201610054589A CN105606805A CN 105606805 A CN105606805 A CN 105606805A CN 201610054589 A CN201610054589 A CN 201610054589A CN 105606805 A CN105606805 A CN 105606805A
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刘鸿艳
李峰
任艳玲
刘磊
马永彪
沈志强
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Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明的检测试剂盒包括猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；ELISA抗原包被板中的抗原为PRRSV？DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质。PRRSV？DY株NSP7蛋白在免疫后3天即可检测到抗体，目前持续到248天仍具有较高抗体水平。本发明检测方法与IDEXX试剂盒符合率达到99%以上，但成本仅为其1/8。本试剂盒可替代进口试剂盒推广使用。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒。
背景技术
目前，国内PRRSV抗体检测试剂盒质量方面参差不齐。其中美国IDEXXPRRSELISA试剂盒被世界范围内广泛认可。但是由于其高昂的价格(包装2×96孔板的试剂盒售价为￥5500，包装5×96孔板的试剂盒售价为￥13000)极大限制了其在国内市场的广泛应用。
此外，国内自主研发、生产的PRRSELISA试剂盒多存在敏感性和特异性不好、重复性差等问题。
酶联免疫吸附试验(ELISA)因其条件要求低，操作简单，稳定性好，特异性敏感性高适用于基层兽医工作，现已被广泛应用于PRRSV抗体检测。目前，市场上商品化的PRRSVELISA检测试剂盒多为N蛋白作为包被抗原。
近年来研究表明PRRSV的nsp1α/β、nsp2、nsp4和nsp7等非结构蛋白能够诱导强烈的体液免疫反应。Brownetal.(2009)研究表明，相对于PRRSVN蛋白，nsp1α/β、nsp2、nsp4和nsp7在免疫后126天仍然保持高水平的抗体滴度，并且持续到免疫后202天能然可以检测到抗体。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种特异性好、重复性佳且价格实惠的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒。
本发明的技术方案为：
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板、样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、TMB底物液、终止液、浓缩洗涤液；
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板中的抗原为抗猪繁殖与呼吸征病毒细胞株DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；
所述样品稀释液为PBS缓冲液和10％小牛血清的混合液；
所述封闭液为5％-15％的牛血清；
所述终止液为2M的硫酸水溶液；
所述浓缩洗涤液为10×PBS缓冲液。
作为优先方案，所述样品稀释液中，PBS缓冲液和10％小牛血清的体积比为8:1-10:1，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；所述浓缩洗涤液的pH值为7.4。
作为优先方案，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒包括两个96T的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；包括两个96T的样品稀释板；阳性对照血清的体积为3mL；阴性对照血清的体积为3mL；酶标二抗的体积为25毫升；样品稀释液的体积为25毫升；TMB底物液的体积为25毫升；终止液的体积为13毫升；浓缩洗涤液为10×浓缩洗涤液且其体积为45毫升。
作为优先方案，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板是采用96孔COSTAR酶标板包被所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；具体包被方法为：用包被液将pET777所表达并纯化的蛋白质稀释至蛋白含量为100ng/100uL，在每板的反应孔中加入100uL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗5次，中间震荡；每孔中加入200uL封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时；然后洗涤液冲洗5次，拍干水分，置37℃烘干后，真空包装；所述包被液为PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，所述洗涤液为10×PBS缓冲液，所述封闭液为5％-15％的牛血清。
作为优先方案，所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质由重组表达载体pET777转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达；所述纯化的具体步骤为：
A.破菌收集上清，将收集的上清用0.45纳米的滤膜过滤；
B.过HisTrapTMFF镍柱纯化。
进一步地，过HisTrapTMFF镍柱纯化的具体步骤为：
a.用pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，PBS缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
b.用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，该缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
c.将过滤后的上清上样，流速为2mL/min，使目标蛋白充分挂柱；上样完后用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液再洗5个柱床体积，流速为5mL/min，洗去杂蛋白以及未结合的蛋白；
d.用含100mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液，进行洗脱，流速为5mL/min。并在洗脱峰处收集洗脱液；
e.将收集的洗脱液用50mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1mL，取1mL4℃备用，其余-80℃保存。
作为优先方案，抗猪繁殖与呼吸征病毒细胞株DY株NSP7-777基因片段的基因序列如下：
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病抗体中的应用。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用方法，包括步骤：
1)取出猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板，根据样品需要拆分出适当的孔数，并记录好样品的位置；
2)取100微升阳性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
3)取100微升阴性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
4)在相应孔中加入100微升已经稀释好的样品；
5)36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
6)将各孔的液体倒掉，每孔加200微升稀释好的洗涤液，进行洗板，最后一次将孔中残留的液体拍干；
7)每孔加100微升酶标二抗；
8)36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
9)重复步骤6)；
10)每孔加100微升TMB底物液；
11)36-38摄氏度下孵育10-15分钟；
12)每孔加50微升终止液；
13)立刻于450nm波长处检测各孔的吸光度值，即OD450值；
14)结果判定：
样品S/P≥0.32，则样品判定为抗体阳性；
样品S/P≤0.25，则样品判定为抗体阴性；
其中，样品S/P＝(样本OD450值-阴性对照OD450值的平均值)/(阳性对照OD450值的平均值-阴性对照OD450值的平均值)。
本发明的有益效果为：
PRRSVDY株NSP7蛋白在免疫后3天即可检测到抗体，目前持续到248天仍具有较高抗体水平。利用该蛋白建立的ELISA检测方法，实验表明，pNSP7-777ELISA与IDEXX试剂盒符合率达到99％以上。另外，本试剂盒成本仅为美国IDEXXPRRSELISA试剂盒的1/8。因此，本试剂盒可替代进口试剂盒推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为NSP7-777片段PCR扩增产物电泳检测图；其中，1代表PCR扩增产物，M代表DNA分子量标准(DL2000)；
图2为pET777表达载体酶切鉴定电泳检测图；其中，M代表DNA分子量标准(DL2000)；1,2代表BamHⅠ和SacⅠ双酶切产物；
图3为pET-777蛋白表达电泳检测图；其中，1代表pET-32a空载体；2，代表pET-777重组载体；M代表蛋白质分子量标准；
图4为pET-777所表达蛋白纯化后的电泳检测图；其中，M.蛋白质分子量标准；1,2,3,4代表不同时间段收集的目的蛋白；
图5为pET-777蛋白的动物免疫试验中，不同时段抗体水平曲线；
图6为PRRSVDY株N蛋白PCR扩增电泳图；其中，M代表Marker2000；1代表阴性对照；2、3、4、5、6、7代表PRRSVDY株N蛋白扩增；
图7为PRRSVDY株NSP7-777PCR扩增电泳图；其中，M代表Marker2000；1代表阴性对照；2、3、4、5、6、7代表PRRSVDY株NSP7-777PCR扩增。
具体实施方式
实施例1
本发明建立pET-777蛋白为包被抗原的ELISA方法通过以下步骤实现：
一、PRRSVDY株的分离与鉴定
1、病毒的分离与病毒传代
将从东营某猪场新鲜采集的患病猪组织肺脏样品无菌剪碎，加生理盐水研磨后，吸取悬浮液，反复冻融三次，12000rpm离心10分钟后，取上清保存于-20℃。
用含有青霉素、链霉素的DMEM维持培养液将处理样品稀释成1:10的悬液，0.22μm过滤除菌后，取1ml接种单层Marc-145细胞，37℃吸附1h后，补加维持液继续培养，观察细胞病变情况，在细胞出现75％病变时，收取病毒液继续传代。
通过传代培养发现，组织处理样品接种细胞后，第一代便出现典型灶状病变，病变细胞先收缩、变圆，而后聚集、脱落，形成空斑。随传代次数增加，分离株在细胞上的病变时间明显缩短，第5代时，接种1mL后3d，细胞出现弥漫性病变，4d即可达到75％病变。
2、病毒增殖浓度测定
根据中华人民共和国兽药典规定方法，测定分离株在Marc-145细胞上的增殖浓度，取传代后增殖较为稳定的第5代病毒液，梯度稀释后依次接种长满单层Marc-145细胞的96孔板，每孔接种0.1mL，每个浓度设置8个重复，接种后连续观察7d，计数病变孔数，根据病变孔计算得出TCID50浓度为10-8.0/mL。
3、病毒抗体中和试验
根据中华人民共和国兽药典规定方法，取传代后增殖较为稳定的第5代病毒液，以维持液稀释成200个TCID50后，与0，1：2，1：22，……1：26倍比稀释的标准猪抗PRRSV血清等体积混合，孵育1h后，各梯度依次接种长满单层Marc-145细胞的96孔板，每孔接种0.1ml，每个浓度设置8个重复，接种后连续观察7d，计数病变孔数，根据病变孔计算得出，其抗体中和效价为1：32。
4病毒PCR检测
按照RNA提取试剂盒(Omega)说明书提取PRRSVDY的RNA。按照ThermoScientificRevertAidFirstStorandcDNASynthesisKit(Thermo)试剂盒说明书将PRRSVDY的RNA反转录成cDNA。
以PRRSVDY株cDNA为模板，pN285s、pN285r为引物，PCR扩增片段N,PCR反应条件98℃30s,98℃10s,52℃10s,72℃30s,30个循环，72℃延伸10min。结果如图6所示。
以PRRSVDY株cDNA为模板NSP7-777s、NSP7-777r为引物，PCR扩增片段N,PCR反应条件98℃30s,98℃10s,54℃10s,72℃30s,30个循环，72℃延伸10min。结果如图7所示。
检测引物：
pN285s:5’-AACAACGGCAAGCAGCAGAAGAGAA-3’
pN285r:5’-TATCCTCCCTGAATCTGACAGGGTG-3’
NSP7-777s：5’-TCTCTGACTGGTGCCCTCGC-3’
NSP7-777r：5’-TTCCCATTGAACTCTTCCATTCTCT-3’。
二、PRRSVDY株NSP7蛋白基因表达与免疫特性研究
1、NSP7-777片段的克隆
NSP7-777片段的基因序列如下：
PCR扩增条件
上游引物：5’-GGGGGATCCTCTCTGACTGGTGCCCTCGC-3’
下游引物：5’-GGGGAGCTCTTCCCATTGAACTCTTCCATTCTCT-3’。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果表明存在一条约777bp的特异性条带，与片段理论大小一致，结果如图1所示。
2、表达载体的构建与鉴定
目的基因和pET-32a载体利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳显示2条近似777bp和5900bp的目的条带(如图2所示)，大小分别与NSP7目的片段和pET-32a载体相符合；因此，获得正确的重组表达质粒，命名为pET777。
3、pET777的表达与纯化
将重组表达载体pET777转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，发现在45KDa处有蛋白大量表达，与目的蛋白预测结果大小一致(如图3所示)。诱导表达的菌液经过离心，PBS重悬，超声波破碎后，经过SDS-PAGE检测，发现该蛋白主要存在于破碎后的上清中，为可溶性表达。
收集破碎后菌液的上清，用GE公司His标签蛋白纯化预装柱HisTrapTMFF镍柱进行蛋白纯化，纯化后得到不含其它杂蛋白的目的蛋白(如图4所示)。
蛋白表达纯化的具体步骤为：
诱导培养：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100mg/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，180rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的6瓶200mL液体LB培养基中，37℃，180rpm，3.5h(大量培养至OD600＝0.6左右)。取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L，30℃，180rpm条件下，继续振荡培养4h。
破菌收集上清：分别离心(4℃，12000g，5min)诱导后菌液，然后加入PBS(pH7.4)缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎(400W，4s，4s，30min)，然后分别离心(4℃，12000g，15min)收集上清。
过滤上清：将收集上清，用0.45纳米滤膜过滤，上样待用。
过HisTrapTMFF镍柱纯化：
a.用pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，PBS缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
b.用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，该缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
c.将过滤后的上清上样，流速为2mL/min，使目标蛋白充分挂柱；上样完后用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液再洗5个柱床体积，流速为5mL/min，洗去杂蛋白以及未结合的蛋白；
d.用含100mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液，进行洗脱，流速为5mL/min。并在洗脱峰处收集洗脱液；
e.将收集的洗脱液用50mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1mL，取1mL4℃备用，其余-80℃保存。
4、pET777蛋白的Western-blot反应
1)上样取出上样样品至1.5mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×；然后将20uL样品加入到SDS-PAGE电泳空中进行电泳；
2)转膜根据SDS-PAGE胶的大小选取合适尺寸的PVDF膜，并将胶、膜和滤纸同时浸泡在转膜缓冲液中15min，并在转膜前用甲醛激活PVDF膜(甲醛浸泡30s)；然后根据从上到下滤纸、胶、膜、滤纸的顺序在转膜仪中转移25min；
3)漂洗用PBS-T缓冲液对转膜完成后的膜进行清洗，每次3min，清洗5次；
4)封闭将清洗完的膜用10％的脱脂奶粉4℃封闭过夜；
5)漂洗用PBS-T缓冲液对封闭后的膜进行清洗，每次3min，清洗5次；
6)一抗反应封闭后的膜与500倍稀释的PRRSV阳性血清，37℃反应1h；
7)漂洗用PBS-T缓冲液对反应后的膜进行清洗，每次3min，清洗5次；
8)酶标二抗反应用3000倍稀释的酶标二抗与PVDF膜在37℃反应1h；
9)漂洗、显色用PBS-T缓冲液对反应后的膜进行清洗，每次3min，清洗5次；然后用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色。
5、pET777蛋白的动物免疫实验
将纯化后蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混合，使蛋白终浓度为100ng/mL，腹腔注射14日龄小鼠7只，进行初次免疫，免疫3天后采血检测体内抗体水平；然后用纯化后蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合进行再次免疫，共免疫3次，每隔7天采血一次，进行抗体水平检测(结果如表1和图5所示)。
表1不同时段抗体水平检测结果
三、ELISA方法的建立
1、抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定
将纯化后的pET777蛋白用包被液梯度稀释为2μg/mL、1.5μg/mL、1.0μg/mL、0.75g/mL；阴阳性对照(PRSSV猪阳性血清和阴性血清)分5个稀释度1:10、1:20、1:40、1:80、1:160。选定阳性(OD450)值1.0左右的孔，其所对应的抗体包被浓度和阴阳性对照的稀释度为最佳条件，最终确定蛋白包被浓度为1.0μg/mL，阴阳性对照稀释度为1:40(结果如表2所示)。
表2不同抗原包被浓度和血清稀释度下抗体水平
2、封闭液的选取
分别用5％BSA、10％牛血清、5％牛血清、8％羊血清、10％脱脂奶粉5种封闭液，4℃封闭过夜，分别检测其OD450值，以P/N值最大的一组为最佳封闭液，经试验确定10％牛血清为最佳封闭液(结果如表3所示)。
表3不同封闭液时抗体水平
3、酶标二抗稀释倍数的确定
按已确定条件进行ELISA，酶标二抗的稀释度分别为1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000。确定P/N最大时为酶标二抗最佳稀释度，确定酶标二抗的最佳工作稀释度为1:8000(结果如表4所示)。
表4酶标二抗稀释倍数对P/N值的影响
4、TMB底物作用时间的确定
按已确定条件进行ELISA，底物的显色时间分别为5min、10min、15min、20min，以P/N值最大组的反应时间为底物最佳反应时间，确定最佳显色时间为37℃反应15min(结果如表5所示)。
表5TMB底物作用时间对P/N值的影响
5、阴阳性临界值的确定
选取40份IDEXX试剂盒检测为阴性的血清样本(编号1-40)以及1份阳性血清样本(编号41)，测定其OD450nm值，经计算S/P值在0.25-0.32之间。判定标准为：若S/P的比值≥0.32，则样品判定为抗体阳性。若S/P的比值≤0.25，则样品判定为抗体阴性。若0.25≤S/P的比值≤0.32，则判为可疑，请重新检测，如果结果相同，判定为阳性(结果如表6所示)。
表6阴阳性临界值的确定
6、重复性试验
选取32份血清样本进行ELISA反应(编号1-32)其中2份阳性血清(编号29、30)2份阴性血清(编号31、32)。每个样品做3次重复，结果显示变异系数在0.414-9.810之间，说明具有良好的重复性(结果如表7所示)。
表7重复性试验结果
7、特异性试验
分别用猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、PRRSV抗原阳性血清、PRRSV抗原阴性血清进行特异性反应试验(结果如表8所示)。结果表明，pET777蛋白对PRRSV的特异性非常好。
表8pET777蛋白特异性试验结果
最后确定为，本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板、样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、TMB底物液、终止液、浓缩洗涤液；
其中，猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板中的抗原为抗猪繁殖与呼吸征病毒细胞株DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板是采用96孔COSTAR酶标板包被所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；具体包被方法为：用包被液将pET777所表达并纯化的蛋白质稀释至蛋白含量为100ng/100uL，在每板的反应孔中加入100uL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗5次，中间震荡；每孔中加入200uL封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时；然后洗涤液冲洗5次，拍干水分，置37℃烘干2小时后，真空包装；所述包被液为PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，所述洗涤液为10×PBS缓冲液，所述封闭液为5％-15％的牛血清。
所述样品稀释液为PBS缓冲液和10％小牛血清的混合液，PBS缓冲液和10％小牛血清的体积比为8:1-10:1，优选为9:1；所述PBS缓冲液的pH值为7.4；
所述封闭液为5％-15％的牛血清；
所述终止液为2M的硫酸水溶液；
所述浓缩洗涤液为10×PBS缓冲液；该浓缩洗涤液中，PBS缓冲液的pH值为7.4。
各组分的规格与含量如下：
猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒包括两个96T的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；包括两个96T的样品稀释板；阳性对照血清的体积为3mL；阴性对照血清的体积为3mL；酶标二抗的体积为25毫升；样品稀释液的体积为25毫升；TMB底物液的体积为25毫升；终止液的体积为13毫升；浓缩洗涤液为10×浓缩洗涤液且其体积为45毫升。
所示猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用方法，包括步骤：
1)取出猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板，根据样品需要拆分出适当的孔数，并记录好样品的位置；
2)取100微升阳性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
3)取100微升阴性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
4)在相应孔中加入100微升已经稀释好的样品；
5)36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
6)将各孔的液体倒掉，每孔加200微升稀释好的洗涤液，进行洗板，最后一次将孔中残留的液体拍干；
7)每孔加100微升酶标二抗；
8)36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
9)重复步骤6)；
10)每孔加100微升TMB底物液；
11)36-38摄氏度下孵育10-15分钟；
12)每孔加50微升终止液；
13)立刻于450nm波长处检测各孔的吸光度值，即OD450值；
试验有效性判断
如果阴性对照孔OD450值的平均值≤0.15；阳性对照孔OD450值的平均值≥0.4，则说明试验有效。
14)结果判定：
样品S/P≥0.32，则样品判定为抗体阳性；
样品S/P≤0.25，则样品判定为抗体阴性；
若样品的0.25<S/P<0.32，则判断为可疑，需要重新检测。
其中，样品S/P＝(样本OD450值-阴性对照OD450值的平均值)/(阳性对照OD450值的平均值-阴性对照OD450值的平均值)。
注意事项：
1、试剂盒中所有的样品在使用前均需恢复至室温(20-25摄氏度)，若室温太低，放置于20-25摄氏度的温箱中回温。
2、剩余的酶标二抗不要返回到酶标记瓶中。
3、底物液和终止液对皮肤有刺激性，注意防护；
4、底物液不要暴露于强光和任何氧化剂，使用洁净的玻璃和塑料容器处理底物液；
5、不同批次试剂盒的组分不要混用。

Claims (9)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板、样品稀释板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、TMB底物液、终止液、浓缩洗涤液；其特征在于：
所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板中的抗原为抗猪繁殖与呼吸征病毒细胞株DY株的NSP7-777基因片段与pET-32a利用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ双酶切得重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；
所述样品稀释液为PBS缓冲液和10%小牛血清的混合液；
所述封闭液为5%-15%的牛血清；
所述终止液为2M的硫酸水溶液；
所述浓缩洗涤液为10×PBS缓冲液。
2.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液中，PBS缓冲液和10%小牛血清的体积比为8:1-10:1，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；所述浓缩洗涤液的pH值为7.4。
3.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：包括两个96T的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板；包括两个96T的样品稀释板；阳性对照血清的体积为3mL；阴性对照血清的体积为3mL；酶标二抗的体积为25毫升；样品稀释液的体积为25毫升；TMB底物液的体积为25毫升；终止液的体积为13毫升；浓缩洗涤液为10×浓缩洗涤液且其体积为45毫升。
4.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板是采用96孔COSTAR酶标板包被所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质；具体包被方法为：用包被液将pET777所表达并纯化的蛋白质稀释至蛋白含量为100ng/100uL，在每板的反应孔中加入100uL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗5次，中间震荡；每孔中加入200uL封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时；然后洗涤液冲洗5次，拍干水分，置37℃烘干后，真空包装；所述包被液为PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，所述洗涤液为10×PBS缓冲液，所述封闭液为5%-15%的牛血清。
5.如权利要求1或4所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述重组表达质粒pET777所表达并纯化的蛋白质由重组表达载体pET777转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达；所述纯化的具体步骤为：
A．破菌收集上清，将收集的上清用0.45纳米的滤膜过滤；
B.过HisTrapTMFF镍柱纯化。
6.如权利要求5所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：过HisTrapTMFF镍柱纯化的具体步骤为：
a.用pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，PBS缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
b.用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液平衡镍柱，该缓冲液的体积为5-10个柱床体积，流速为5mL/min；
c.将过滤后的上清上样，流速为2mL/min，使目标蛋白充分挂柱；上样完后用含30mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液再洗5个柱床体积，流速为5mL/min，洗去杂蛋白以及未结合的蛋白；
d.用含100mM咪唑的pH为7.4的PBS缓冲液，进行洗脱，流速为5mL/min；
并在洗脱峰处收集洗脱液；
e.将收集的洗脱液用50mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1mL，取1mL4℃备用，其余-80℃保存。
7.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，抗猪繁殖与呼吸征病毒细胞株DY株NSP7-777基因片段的基因序列如下：
tctctgactggtgccctcgctatgagactcaatgacgaggacttggatttccttatgaaa60
tggactgattttaagtgctttgtttctgcgtccaacatgaggaatgcagcgggtcaattt120
atcgaggctgcctatgctaaagcacttagagtagaactggcccagttggtgcaggttgat180
aaagttcgaggtactttggccaaacttgaagcttttgctgataccgtggcacctcaactc240
tcgcccggtgacattgttgtcgctctcggccacacgcctgttggcagtatcttcgaccta300
aaggttggtagcaccaagcataccctccaagccattgagaccagagtccttgctgggtcc360
aaaatgaccgtggcgcgcgtcgtcgacccgacccccacgcccccacccgcacccgtgccc420
atccccctcccaccgaaagttctggagaatggccccaacgcttggggggatgaggaccgt480
ttgaataagaagaagaggcgcaggatggaagccctcggcatctatgttatgggcgggaaa540
aagtaccagaaattttgggacaagaattccggtgatgtgttttatgaggaggtccataat600
aacacagatgagtgggagtgtctcagagttggcgaccctgccgactttgaccctgagaag660
ggaactctgtgtggacatgtcaccattgaaaacaaggcttaccatgtttacacctcccca720
tctggtaagaagttcttggtccccgtcaacccagagaatggaagagttcaatgggaa777。
8.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。
9.如权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用方法，包括步骤：
1）取出猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗原包被板，根据样品需要拆分出适当的孔数，并记录好样品的位置；
2）取100微升阳性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
3）取100微升阴性对照血清，加入到抗原包被板中，每次检测至少设置2孔；
4）在相应孔中加入100微升已经稀释好的样品；
5）36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
6）将各孔的液体倒掉，每孔加200微升稀释好的洗涤液，进行洗板，最后一次将孔中残留的液体拍干；
7）每孔加100微升酶标二抗；
8）36-38摄氏度下孵育20-40分钟；
9）重复步骤6）；
10）每孔加100微升TMB底物液；
11）36-38摄氏度下孵育10-15分钟；
12）每孔加50微升终止液；
13）立刻于450nm波长处检测各孔的吸光度值，即OD450值；
14）结果判定：
样品S/P≥0.32，则样品判定为抗体阳性；
样品S/P≤0.25，则样品判定为抗体阴性；
其中，样品S/P=（样本OD450值-阴性对照OD450值的平均值）/（阳性对照OD450值的平均值-阴性对照OD450值的平均值）。
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