CN106645712B - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒 - Google Patents

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒。本发明建立的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒主要针对PRRSV类型有经典美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和高致病性PRRSV进行血清学鉴别诊断。第1个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型和美洲型共同抗原表位串联优化表达后的蛋白；第2个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型独特型抗原表位优化表达后的蛋白；第3个ELISA板的包被抗原是PRRSV美洲型独特型抗原表位优化表达后的蛋白；第4个ELISA板的包被抗原是高致病性PRRSV的Nsp2基因缺失区核苷酸序列表达的蛋白。经上述检测后，即可明确猪血清中PRRSV感染类型及抗体水平。本方法简便快捷，可有效用于不同类型PRRSV的临床血清学诊断。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒
技术领域
本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清学鉴别诊断试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus， PRRSV）属于网巢病毒目（Nidovirales）动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus），该类病毒为单股正链RNA病毒。PRRSV基因组长约15kb，分别为（5’端至3’端）：非结构蛋白ORF1（ORF1a和ORF1b）、结构蛋白ORF2a（GP2a）、ORF2b（GP2b）、ORF3（GP3）、ORF4（GP4）、ORF5（GP5）、ORF6（M）和ORF7（N）。PRRSV基因组结构和其他动脉炎病毒组基因组结构相似，在病毒的5’端有帽子结构，3’端多聚腺苷酸化。其非结构蛋白ORF1占基因组全长的75%左右，包含有PRRSV复制所需的酶类，参与病毒的增殖过程，可进一步细分为Nsp1、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、Nsp7、Nsp9、Nsp1和Nsp11共10种非结构蛋白。结构蛋白中ORF2-ORF6编码病毒的囊膜蛋白，其中ORF2-ORF5编码的蛋白均为糖基化蛋白（GP2、GP3、GP4和GP5）而ORF6编码的M蛋白为非糖基化蛋白；ORF7编码病毒的核衣壳蛋白（N），有较强的免疫原性。
猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV引起的，可导致妊娠母猪发热、厌食及繁殖障碍（如流产、早产、死胎、木乃伊胎），新生及断奶仔猪高死亡率的仔猪呼吸道疾病，俗称猪“蓝耳病”。根据PRRSV的血清学和基因组特征分析，PPRSV可细分为洲型（代表株为VR2332株）和欧洲型（代表株为LV株）。2006年，我国南方地区大部分猪场出现以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，即猪“高热病”，给我国养猪业造成极大损失。经国内各位猪病专家联合攻关，明确为该病病原为 “高致病性蓝耳病”（即HP-PRRSV）。对HP-PRRSV基因组分析比较发现，HP-PRRSV在非结构蛋白2（Nsp2）存在连续核苷酸（约87个核苷酸，29个氨基酸）缺失。2008年，欧洲型PRRSV在我国福建和浙江猪群中首次发现报道，随后在我国多省市均检测到欧洲型PRRSV感染阳性。
目前，我国猪群中PPRSV感染的类型较为复杂，为了更好的预防和控制PRRSV的流行，需要对猪群PRRSV血清学抗体进行科学有效区分。从病原学来看，根据欧洲型和美洲型PRRSV的基因组差异已见有RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法；此外，根据HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因组差异（主要是Nsp2）已见有RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法，但是上述实验方法（RT-PCR方法和实时荧光定量PCR方法）对实验操作者操作技能和实验仪器设备要求较高，不适宜临床现场使用。从血清学来看，已见有欧洲型和美洲型PRRSV鉴别诊断ELISA方法报道；此外，也见有HP-PRRSV和美洲型PRRSV的基因组差异鉴别诊断ELISA报道。但是，当前未见可同时区分欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV和HP-PRRSV的血清学鉴别诊断试剂盒报道。
抗原表位是指抗原分子表面具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能被其识别的免疫活性区。根据表位与受体细胞结合部位的差异，表位可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。本发明根据相关文献报道的不同类型PRRSV抗原表位特征和基因独特保守区为研究对象，建立检测不同类型PRRSV血清学鉴别诊断ELISA试剂盒：①美洲型和欧洲型PRRSV血清学抗体均可检测ELISA试剂盒；②仅检测欧洲型PRRSV血清学抗体的ELISA试剂盒；③仅检测美洲型PRRSV血清学抗体的ELISA试剂盒；④针对HP-PRRSV基因缺失区表达蛋白，该蛋白为包被抗原建立的ELISA方法，对前期检测为美洲型PRRSV感染阳性血清进行检测，检测结果为阴性值代表该血清为HP-PRRSV感染阳性。上述4种ELISA方法，经过组装形成的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒，可以供现场检测的试剂情况选择使用，有效用于对猪群中不同类型PRRSV感染情况进行鉴别诊断。本发明可填补P-RRSV血清学抗体鉴别诊断研究空白，为我国科学防控PRRSV提供新的检测手段和方法学参考。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒中包含4块ELISA板，且每块板的包被抗原核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
SEQ ID NO.1：GGATCCCCGGAGAAGCCGCATTTCCCGCTGGCGACTGAAGATGACGTCCGTCATCACTTTACCCCGAGTACCCGTGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO.2：GGATCC TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAA TGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO.3：GGATCC GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTT GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTTGAGCGGCCGC；
SEQ ID NO. 4：TCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTTTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCG；
本发明的优点在于：本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，具体基于不同类型PRRSV抗原表位建立的血清学鉴别诊断试剂盒。目前流行的PRRSV类型有经典美洲型PRRSV、高致病性PRRSV和欧洲型PRRSV，本发明建立的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒主要针对上述3种类型进行血清学鉴别诊断。第1个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型和美洲型共同抗原表位串联优化表达后的蛋白；第2个ELISA板的包被抗原是PRRSV欧洲型独特型抗原表位串联优化优化表达后的蛋白；第3个ELISA板的包被抗原是PRRSV美洲型独特型抗原表位串联优化优化表达后的蛋白；第4个ELISA板的包被抗原是高致病性PRRSV的Nsp2基因缺失区核苷酸序列表达的蛋白。经过上述4个ELISA平板检测后，即可明确猪血清中PRRSV感染类型及抗体水平。本方法简便快捷，可有效用于不同类型PRRSV的临床血清学诊断。与现有技术相比，本试剂盒可同时对PRRSV的不同血清学感染类型进行同时现场检测，方便、准确、快捷，可有效弥补病原学检测时所需的精密仪器和操作者操作能力的局限性，可以直接现地使用。
附图说明
图1 表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的蛋白。
图2 Western Blot分析，M：蛋白质分子量标准；1：美洲型PRRSV；2：欧洲型PRRSV。
图2-1 欧洲型PRRSV的ORF4抗原表位分析。
图2-2 表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的蛋白。
图2-3 Western Blot分析，M：蛋白质分子量标准；1：欧洲型PRRSV；2：美洲型PRRSV。
图3-1 美洲型PRRSV的GP5抗原表位分析。
图3-2 表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的蛋白。
图3-3 Western Blot分析，M：蛋白质分子量标准；1：美洲型PRRSV；2：欧洲型PRRSV。
图4-1经典型PRRSV和HP-PRRSV的非结构蛋白Nsp2差异区。
图4-2 表达蛋白的SDS-PAGE分析，M：蛋白质分子量标准；1：空载体对照；2：目的蛋白。
图4-3 Western Blot分析，M：蛋白质分子量标准；1：美洲型PRRSV；2：HP PRRSV。
具体实施方式
实施例1
一、美洲型和欧洲型PRRSV血清学抗体均可检测ELISA试剂盒
1、抗原表位的选取、串联表达及鉴定
选取针对美洲型和欧洲型PRRSV的N蛋白的保守抗原表位（50PEKPHFPLATEDDVRHHFTPS70）和针对GP5的保守抗原表位（195TRVSAEQWGRL200），将选取的抗原表位（50PEKPHFPLATEDDVRHHFTPS70和195TRVSAEQWGRL200）核苷酸序列进行串联，并根据原核表达条件的需要对其进行优化，优化后的序列为GGATCCCCGGAGAAGCCGCATTTCCCGCTGGCGACTGAAGATGACGTCCGTCATCACTTTACCCCGAGTACCCGTGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTGAGCGGCCGC；其中在优化后的序列末端（5’端和3’端）分别引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位点（方框内序列），并在3端酶切位点前引入终止密码子TGA。优化后的序列进行基因合成后，克隆到原核表达载体pET32a上。按照常规原核表达方法对构建的阳性重组质粒pET32a-N-GP5-e。将pET32a-N-GP5-e质粒转化原核表达感受态细胞BL21(DE3)感受态后鉴定获得阳性单菌落（阳性菌培养液）。取100 μL阳性菌培养液加入5mL LB液体培养基 (Amp+、 100μg/ml)，培养至OD600 nm值约为0.6。加入不同终浓度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5mM）的IPTG进行诱导，37℃诱导（诱导时间分别为2h、3h、4h、5h和6h）。经SDS-PAGE分析发现，优化后的条件为IPTG终浓度为0.5 mM，37℃诱导4h即可获得高效表达，经分析串联的抗原表位蛋白基本为可溶性表达，目的大小约为24.7 ku（见图1-1）。将目的蛋白转膜后进行Western Blot鉴定，可见串联表位表达的蛋白可与PRRSV高免血清发生特异性反应（见图1-2）。
2、ELISA方法的建立
2.1 间接方法的操作程序
（1）包被：将表达的目的蛋白用包被液稀释成一定浓度，包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（2）封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h（或4℃封闭过夜），再弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（3）加血清：血清用抗体稀释液按一定倍数稀释，加入酶标板中，100μL/孔，同时设阴性对照孔，阳性对照孔和空白对照孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（4）加酶标二抗：将酶标二抗用二抗稀释液（也可用PBST）按一定倍数稀释（商品化试剂可直接按照推荐的浓度稀释），加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（5） TMB反应液显色：将TMB反应液加入酶标板上，100μL/孔，室温避光反应5-10min。
（6）加入终止液：TMB显色后加入终止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶标仪测定：用酶标仪测定OD450值。
为便于后续实验室的统一，本发明中将包被时间明确为4℃包被过夜；封闭时间明确为4℃封闭过夜；一抗孵育时间明确为37℃孵育2h；二抗孵育时间明确为37℃孵育90min；显色7 min后测定OD450值。
2.2 临界值的判断标准
选取30份临床收集的PRRSV阴性血清，对30份阴性血清进行ELISA检测。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X），标准方差（SD）。本发明统一规定，临界值（C）=平均数（X）+3标准方差（SD）。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧临界值（C）判为阳性，其他均判为阴性。
2.3 试剂
ELISA平板购自Costar；HRP标记的山羊抗猪酶标二抗购自Abcam；ELISA显色液TMB购自武汉博士德生物工程有限公司。碳酸盐包被液、抗体稀释液和封闭液均购自碧云天生物技术研究所。
2.4 血清
欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）高免血清和猪阴性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所制备并保存。
2.5 ELISA检测条件
经矩阵滴定后获得最适条件为包被抗原（纯化后的目的蛋白）5μg/mL、血清稀释度为1：80、酶标二抗浓度1：5000。37℃孵育90min，避光显色7min，即可获得最大化P/N值。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X）=0.2336、标准方差（SD）=0.0372，得到本研究的临界值（C）位0.3452。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧0.3452判为阳性，其他均判为阴性。
2.6 特异性实验
利用优化后的条件，对猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）阳性血清进行检测OD450nm值均在0.250以内；猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型PRRSV和欧洲型）阳性血清OD450nm值为1.173和0.968；阴性血清OD450nm值为0.186；表明本研究建立的方法特异性强，与常规病原阳性血清均无交叉反应。
2.7 重复性实验
利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得组间变异系数在1.38%～4.83%之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。
2.8 临床样品检测
利用建立的ELISA方法对本团队收集的45份猪血清进行检测，其中阳性38份，阳性率为84.44%（38/45）；使用商品化IDEXX试剂盒测得阳性36份，阳性率为80%（36/45）。
二、欧洲型PRRSV血清学抗体检测ELISA试剂盒
1、抗原表位的选取、串联表达及鉴定
通过对欧洲型PRRSV 的ORF4编码区蛋白的抗原表位进行分析研究发现，其存在一个53 LRPHGVSAAQEEIPFGLSSQ 72，该表位在欧洲型PRRSV较为保守，和美洲型PRRSV差异极大（图2-1）。
将该表位的核苷酸序列“TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAA”，优化后的序列为GGATCC TTCCGACCTCACGGGGTCTCAGCAGCGCAAGAGAAAATTTCCTTCGGAAAGTCGTCCCAA TGAGCGGCCGC。其中在优化后的序列末端（5’端和3’端）分别引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位点（方框内序列），并在3端酶切位点前引入终止密码子TGA。优化后的序列进行基因合成后，克隆到原核表达载体pET32a上。按照常规原核表达方法对构建的阳性重组质粒pET32a-ORF4-e。将pET32a-ORF4-e质粒转化原核表达感受态细胞BL21(DE3)感受态后鉴定获得阳性单菌落（阳性菌培养液）。取100 μL阳性菌培养液加入5mLLB液体培养基 (Amp+、 100μg/ml)，培养至OD600 nm值约为0.6。加入不同终浓度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG进行诱导，37℃诱导（诱导时间分别为2h、3h、4h、5h和6h）。经SDS-PAGE分析发现，优化后的条件为IPTG终浓度为0.75 mM，37℃诱导3h即可获得高效表达，经分析表达蛋白基本为可溶性表达，目的大小约为23.6 ku（见图2-2）。将目的蛋白转膜后进行Western Blot鉴定，可见串联表位表达的蛋白可与PRRSV高免血清发生特异性反应（见图2-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 间接方法的操作程序
（1）包被：将表达的目的蛋白用包被液稀释成一定浓度，包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（2）封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h（或4℃封闭过夜），再弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（3）加血清：血清用抗体稀释液按一定倍数稀释，加入酶标板中，100μL/孔，同时设阴性对照孔，阳性对照孔和空白对照孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（4）加酶标二抗：将酶标二抗用二抗稀释液（也可用PBST）按一定倍数稀释（商品化试剂可直接按照推荐的浓度稀释），加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（5） TMB反应液显色：将TMB反应液加入酶标板上，100μL/孔，室温避光反应5-10min。
（6）加入终止液：TMB显色后加入终止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶标仪测定：用酶标仪测定OD450值。
为便于后续实验室的统一，本发明中将包被时间明确为4℃包被过夜；封闭时间明确为4℃封闭过夜；一抗孵育时间明确为37℃孵育2h；二抗孵育时间明确为37℃孵育90min；显色7 min后测定OD450值。
2.2 临界值的判断标准
选取30份临床收集的PRRSV阴性血清，对30份阴性血清进行ELISA检测。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X），标准方差（SD）。本发明统一规定，临界值（C）=平均数（X）+3标准方差（SD）。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧临界值（C）判为阳性，其他均判为阴性。
2.3 试剂
ELISA平板购自Costar；HRP标记的山羊抗猪酶标二抗购自Abcam；ELISA显色液TMB购自武汉博士德生物工程有限公司。碳酸盐包被液、抗体稀释液和封闭液均购自碧云天生物技术研究所。
2.4 血清
欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）高免血清和猪阴性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所制备并保存。
2.5 ELISA检测条件
经矩阵滴定后获得最适条件为包被抗原（纯化后的目的蛋白）7.5μg/mL、血清稀释度为1：40、酶标二抗浓度1：5000。37℃孵育90min，避光显色7min，即可获得最大化P/N值。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X）=0.2409、标准方差（SD）=0.0385，得到本研究的临界值（C）为0.3564。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧0.3564判为阳性，其他均判为阴性。
2.6 特异性实验
利用优化后的条件，对猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）阳性血清进行检测OD450nm值均在0.350以内；猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型PRRSV和欧洲型）阳性血清OD450nm值为0.302和0.874；阴性血清OD450nm值为0.215；表明本研究建立的方法特异性强，与常规病原阳性血清均无交叉反应。
2.7 重复性实验
利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得组间变异系数在1.48%～4.96%之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。
2.8 临床样品检测
利用建立的ELISA方法对本团队收集的45份猪血清进行检测，其中阳性2份，阳性率为4.44%（2/45）。
三、美洲型PRRSV血清学抗体检测ELISA试剂盒
1、抗原表位的选取、串联表达及鉴定
通过对美洲型PRRSV 的GP5编码区蛋白的抗原表位进行分析研究发现，其存在一个169EGHLIDLKRV178，该表位在美洲型PRRSV较为保守，和欧洲型PRRSV差异极大（图3-1）。
将该表位的核苷酸序列“GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTT”，串联2次后优化后的序列为GGATCC GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTT GAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTTGAGCGGCCGC。其中在优化后的序列末端（5’端和3’端）分别引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位点（方框内序列），并在3端酶切位点前引入终止密码子TGA。优化后的序列进行基因合成后，克隆到原核表达载体pET32a上。按照常规原核表达方法对构建的阳性重组质粒pET32a-GP5-e2。将pET32a-GP5-e2质粒转化原核表达感受态细胞BL21(DE3)感受态后鉴定获得阳性单菌落（阳性菌培养液）。取100 μL阳性菌培养液加入5mL LB液体培养基(Amp+、 100μg/ml)，培养至OD600 nm值约为0.6。加入不同终浓度（0.25 mM、0.5 mM、0.75mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG进行诱导，37℃诱导（诱导时间分别为2h、3h、4h、5h和6h）。经SDS-PAGE分析发现，优化后的条件为IPTG终浓度为0.50 mM，37℃诱导4h即可获得高效表达，经分析表达蛋白基本为可溶性表达，目的大小约为23.5 ku（见图3-2）。将目的蛋白转膜后进行Western Blot鉴定，可见串联表位表达的蛋白可与PRRSV高免血清发生特异性反应（见图3-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 间接方法的操作程序
（1）包被：将表达的目的蛋白用包被液稀释成一定浓度，包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（2）封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h（或4℃封闭过夜），再弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（3）加血清：血清用抗体稀释液按一定倍数稀释，加入酶标板中，100μL/孔，同时设阴性对照孔，阳性对照孔和空白对照孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（4）加酶标二抗：将酶标二抗用二抗稀释液（也可用PBST）按一定倍数稀释（商品化试剂可直接按照推荐的浓度稀释），加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（5） TMB反应液显色：将TMB反应液加入酶标板上，100μL/孔，室温避光反应5-10min。
（6）加入终止液：TMB显色后加入终止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶标仪测定：用酶标仪测定OD450值。
为便于后续实验室的统一，本发明中将包被时间明确为4℃包被过夜；封闭时间明确为4℃封闭过夜；一抗孵育时间明确为37℃孵育2h；二抗孵育时间明确为37℃孵育90min；显色7 min后测定OD450值。
2.2 临界值的判断标准
选取30份临床收集的PRRSV阴性血清，对30份阴性血清进行ELISA检测。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X），标准方差（SD）。本发明统一规定，临界值（C）=平均数（X）+3标准方差（SD）。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧临界值（C）判为阳性，其他均判为阴性。
2.3 试剂
ELISA平板购自Costar；HRP标记的山羊抗猪酶标二抗购自Abcam；ELISA显色液TMB购自武汉博士德生物工程有限公司。碳酸盐包被液、抗体稀释液和封闭液均购自碧云天生物技术研究所。
2.4 血清
欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）高免血清和猪阴性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所制备并保存。
2.5 ELISA检测条件
经矩阵滴定后获得最适条件为包被抗原（纯化后的目的蛋白）0.25 μg/mL、血清稀释度为1：40、酶标二抗浓度1：5000。37℃孵育90min，避光显色7min，即可获得最大化P/N值。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X）=0.2256、标准方差（SD）=0.0294，得到本研究的临界值（C）为0.3138。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧0.3138判为阳性，其他均判为阴性。
2.6 特异性实验
利用优化后的条件，对猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）阳性血清进行检测OD450nm值均在0.300以内；猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型PRRSV和欧洲型）阳性血清OD450nm值为0.934和0.259；阴性血清OD450nm值为0.194；表明本研究建立的方法特异性强，与常规病原阳性血清均无交叉反应。
2.7 重复性实验
利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得组间变异系数在1.05%～4.28%之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。
2.8 临床样品检测
利用建立的ELISA方法对本团队收集的45份猪血清进行检测，其中阳性35份，阳性率为77.78%（35/45）。
四、HP PRRSV血清学抗体检测ELISA试剂盒
1、抗原表位的选取、串联表达及鉴定
通过对经典型PRRSV和HP-PRRSV的差异区的非结构蛋白Nsp2（Nsp2）的进行氨基酸序列比对发现，经典型PRRSV和HP-PRRSV存在非结构蛋白Nsp2 的差异“RPMTPLSEPIFLSAPRHKFQQVEEANPAT”（见图4-1）
将该表位的核苷酸序列“TCCCGACCGATGACGCCCTTGAGTGAGCCAATTTTTTTGTCTGCACCGCGACACAAATTTCAGCAGGTGGAAGAAGCGAATCCGGCG”，在序列末端（5’端和3’端）分别引入BamHⅠ（GGATCC）和NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位点（方框内序列），并在3端酶切位点前引入终止密码子TGA。优化后的序列进行基因合成后，克隆到原核表达载体pET32a上。按照常规原核表达方法对构建的阳性重组质粒pET32a-Nsp2。将pET32a-Nsp2质粒转化原核表达感受态细胞BL21(DE3)感受态后鉴定获得阳性单菌落（阳性菌培养液）。取100 μL阳性菌培养液加入5mL LB液体培养基 (Amp+、 100μg/ml)，培养至OD600 nm值约为0.6。加入不同终浓度（0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM、1.0 mM、1.5 mM）的IPTG进行诱导，37℃诱导（诱导时间分别为2h、3h、4h、5h和6h）。经SDS-PAGE分析发现，优化后的条件为IPTG终浓度为0.50 mM，37℃诱导4h即可获得高效表达，经分析表达蛋白基本为可溶性表达，目的大小约为24.7 ku（见图4-2）。将目的蛋白转膜后进行Western Blot鉴定，可见串联表位表达的蛋白可与PRRSV高免血清发生特异性反应（见图4-3）。
2、ELISA方法的建立
2.1 间接方法的操作程序
（1）包被：将表达的目的蛋白用包被液稀释成一定浓度，包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜，次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（2）封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h（或4℃封闭过夜），再弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（3）加血清：血清用抗体稀释液按一定倍数稀释，加入酶标板中，100μL/孔，同时设阴性对照孔，阳性对照孔和空白对照孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（4）加酶标二抗：将酶标二抗用二抗稀释液（也可用PBST）按一定倍数稀释（商品化试剂可直接按照推荐的浓度稀释），加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去液体，用PBST洗涤3次，每次5min，250μL/孔，最后一次拍干。
（5） TMB反应液显色：将TMB反应液加入酶标板上，100μL/孔，室温避光反应5-10min。
（6）加入终止液：TMB显色后加入终止液，2M硫酸，100μL/孔。
（7）酶标仪测定：用酶标仪测定OD450值。
为便于后续实验室的统一，本发明中将包被时间明确为4℃包被过夜；封闭时间明确为4℃封闭过夜；一抗孵育时间明确为37℃孵育2h；二抗孵育时间明确为37℃孵育90min；显色7 min后测定OD450值。
2.2 临界值的判断标准
选取30份临床收集的PRRSV阴性血清，对30份阴性血清进行ELISA检测。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X），标准方差（SD）。本发明统一规定，临界值（C）=平均数（X）+3标准方差（SD）。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧临界值（C）判为阳性，其他均判为阴性。
2.3 试剂
ELISA平板购自Costar；HRP标记的山羊抗猪酶标二抗购自Abcam；ELISA显色液TMB购自武汉博士德生物工程有限公司。碳酸盐包被液、抗体稀释液和封闭液均购自碧云天生物技术研究所。
2.4 血清
欧洲型PRRSV、美洲型PRRSV、HP-PRRSV、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）高免血清和猪阴性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所制备并保存。
2.5 ELISA检测条件
经矩阵滴定后获得最适条件为包被抗原（纯化后的目的蛋白）0.75 μg/mL、血清稀释度为1：80、酶标二抗浓度1：5000。37℃孵育90min，避光显色7min，即可获得最大化P/N值。对30份进行检测后计算得到OD450nm值的平均数（X）=0.2607、标准方差（SD）=0.0413，得到本研究的临界值（C）为0.3843。即本实验建立的ELISA对临床样品进行检测OD450nm值≧0.3843判为阳性，其他均判为阴性。
2.6 特异性实验
利用优化后的条件，对猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性乙型脑炎病毒（JEV）阳性血清进行检测OD450nm值均在0.380以内；猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型PRRSV和HP PRRSV）阳性血清OD450nm值为1.207和0.284；阴性血清OD450nm值为0.238；表明本研究建立的方法特异性强，与常规病原阳性血清均无交叉反应。
2.7 重复性实验
利用优化后的条件建立的ELISA条件进行检测，获得组间变异系数在1.31%～5.16%之间，表明建立的ELISA具有良好的重复性。
2.8 临床样品检测
利用建立的ELISA方法对本团队收集的45份猪血清进行检测，其中阳性6份，阳性率为13.33%（6/45）。
五、不同类型PRRSV的试剂盒组装
利用建立的4个间接ELISA方法，对45份血清进行PRRSV血清学检测，其中欧洲型PRRSV有2份；美洲型PRRSV（含经典型PRRSV和HP PRRSV）有35份；HP PRRSV有29份（35-6=29）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农科院畜牧兽医研究所
<120> 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒
<130> 9
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccccgg agaagccgca tttcccgctg gcgactgaag atgacgtccg tcatcacttt 60
accccgagta cccgtgtttc agcggaacaa tggggtcgtc tctgagcggc cgc 113
<210> 2
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggatccttcc gacctcacgg ggtctcagca gcgcaagaga aaatttcctt cggaaagtcg 60
tcccaatgag cggccgc 77
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatccgaag gtcacctgat cgacctcaag agagttgaag gtcacctgat cgacctcaag 60
agagtttgag cggccgc 77
<210> 4
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcccgaccga tgacgccctt gagtgagcca atttttttgt ctgcaccgcg acacaaattt 60
cagcaggtgg aagaagcgaa tccggcg 87
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg His
1 5 10 15
His Phe Thr Pro Ser
20
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Leu Arg Pro His Gly Val Ser Ala Ala Gln Glu Glu Ile Pro Phe Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ser Gln
20
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val
1 5 10
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Arg Pro Met Thr Pro Leu Ser Glu Pro Ile Phe Leu Ser Ala Pro Arg
1 5 10 15
His Lys Phe Gln Gln Val Glu Glu Ala Asn Pro Ala Thr
20 25

Claims (1)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含4块ELISA板，且每块板各自包被了一种抗原，抗原核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。
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