CN104459160A - 试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒，其包括：酶标板、底物显色液、酶标二抗、终止液、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清；其中，所述酶标板包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白包括猪繁殖与呼吸综合征GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白、GP5蛋白中的至少两种蛋白的混合物。本发明还涉及该试剂盒的制备方法，以及该试剂盒的使用方法。

Description

试剂盒及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。本发明还涉及该试剂盒的制备方法，以及该试剂盒的使用方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus,PRRSV)引起的猪的一种急性、高度传染病毒性疾病，是目前引起猪场繁殖障碍的主要疫病之一。主要临床特征有怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍以及仔猪与育肥猪的呼吸道疾病。1987年，首先在美国发现，随后迅速传播到世界各地。我国于1996年在北京首次发现该病，并分离出国内第一株PRRSV毒株。2006年夏季我国南方多个省份爆发猪无名高热病，最后证明引发此次疫病爆发的最主要病原就是高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRSV)。根据病毒基因组核苷酸序列的差异，将其分为两个基因型：北美洲型和欧洲型。猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒属(Arterivirus)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，套式(又称“巢状”)病毒目(Nidovirales)。基因组为不分节段的单股正链RNA，包含5’非编码区、3’非编码区和至少8个不分首尾重叠开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的蛋白编码区，即ORF1a、ORF1b、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7。其中，ORF1a和ORF1b分别编码具有病毒复制酶和RNA聚合酶功能的两个多聚蛋白pp1a和pp1b，ORF2a、ORF2b、ORF3和ORF4分别编码GP2a、GP2b、GP3、GP4等小囊膜蛋白，ORF5、ORF6和ORF7分别编码病毒主要囊膜蛋白GP5、膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N。目前，猪繁殖与呼吸综合征的诊断方法主要包括病毒的分离鉴定、血清学方法及分子生物学检测方法。其中，病毒的分离鉴定和分子生物学方法主要用于病原诊断，而血清学方法主要用于针对病原抗体诊断。血清学方法中的ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)方法又因其敏感性和特异性强、操作简单、检测快速等特点，被广泛用于动物疫病检测、流行病学调查、免疫抗体水平监测和疫苗免疫效力评价。市场上应用较为广泛的检测PRRSV抗体的ELISA试剂盒为IDEXX公司，但IDEXX公司的试剂盒主要应用于猪群早期感染PRRSV抗体诊断。因此，本领域亟需一种对于猪繁殖与呼吸综合征病毒效果更好的试剂盒。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒，其包括：酶标板、底物显色液、酶标二抗、终止液、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清；其中，所述酶标板包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白包括猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白、GP5蛋白中的至少两种蛋白的混合物。

术语“猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白”是指具有免疫原性的猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白片段，包括但不限于猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白。术语“猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白”是猪繁殖与呼吸综合征病毒中的GP2蛋白的免疫原性片段，优选由168个氨基酸组成；术语“猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白”是猪繁殖与呼吸综合征GP3蛋白的免疫原性片段，优选由155个氨基酸组成；术语“猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白”是猪繁殖与呼吸综合征病毒中GP4蛋白的免疫原性片段，优选由134个氨基酸组成；术语“猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白”是猪繁殖与呼吸综合征病毒中GP5蛋白的免疫原性片段，优选由169个氨基酸组成(本发明的优选的情况可参加Dea S,Gagnon CA,Mardassi H,et al.Current knowledge on the structuralproteins of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus:comparisonof the North American and European isolates.Arch Virol.2000,145:659-688)。

与现有技术中只具有单一一种蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白的试剂盒相比，本发明的具有至少两种蛋白的混合物作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白的试剂盒的检测效果更好。这是由于：第一，目前对猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究还不充分，许多猪繁殖与呼吸综合征病毒的一些蛋白的功能还不完全确定，使用至少两种蛋白的混合物作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白能够避免由于研究不充分带来的检测结果不稳定或不灵敏的风险；第二，单一一种蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白的面比较窄，而使用至少两种蛋白的混合物作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白的面更宽；第三，由于猪繁殖与呼吸综合征病毒容易变异，使用至少两种蛋白的混合物作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白比使用单一一种蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白能够使得由于病毒变异带来的试剂盒失效的风险呈指数级别地减小。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括洗涤液和/或样品稀释液；所述洗涤液优选含有磷酸盐缓冲液和/或Tween-20，更优选为含有pH4-10的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液，尤其优选为含有pH6-8的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液，最优选为含有pH7.4的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液；所述样品稀释液优选为含有牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶和犊牛血清中的任意一种或多种的磷酸盐缓冲液，更优选为含有1％(M/V)牛血清白蛋白、1％(M/V)脱脂奶和3％(V/V)犊牛血清中的任意一种或多种的磷酸盐缓冲液。

术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约pH4至约pH10的范围，优选约pH5至pH9的范围，更有选约pH6至约pH8的范围，最优选约pH7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白中的至少一种为分泌蛋白。在本发明的一个更加优选的实施方式中，所述GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白中的至少一种为分泌蛋白。在本发明的一个尤其更加优选的实施方式中，所述GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白均为分泌蛋白。与现有技术中未使用分泌蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白的试剂盒相比，本发明的试剂盒中至少含有一种分泌蛋白作为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，使得猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白更易溶于水，蛋白的结构更加稳定，检测结果更好。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述GP2蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述GP3蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示的蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述GP4蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示的蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述GP5蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示的蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白为含有GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白和GP5蛋白中的两种或多种，并且其中每种蛋白的含量均为100-500ng。

在本发明的一个优选实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白中GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白和GP5蛋白中至少两种蛋白可以串联表达。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述底物显色液包括底物显色液A和底物显色液B，所述底物显色液A含有3,3",5,5"-四甲基联苯胺、无水乙醇和ddH₂O，所述底物显色液B含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素以及ddH₂O，优选地，所述底物显色液A含有3,3",5,5"-四甲基联苯胺20mg、无水乙醇10ml以及定容至100ml的ddH₂O，所述底物显色液B含有柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml以及定容至100ml的ddH₂O；

并且所述终止液为H₂SO₄溶液，优选为2M的H₂SO₄溶液；

并且所述酶标二抗优选为兔抗猪酶标二抗。

本发明进一步提供了上述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)克隆表达所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，定量，配制包被原，并包被酶标板，并对酶标板用封闭液进行封闭；

2)制备或配制底物显色液、酶标二抗、终止液、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清和猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清，优选地还制备或配制洗涤液和/或样品稀释液；以及

3)将步骤1)与步骤2)所制备的成分组装成试剂盒。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白为GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白和GP5蛋白中的两种或多种，其优选包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的GP2蛋白、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的GP3蛋白、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的GP4蛋白以及氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示的GP5蛋白中的两种或多种。

在本发明的一个还更加优选的实施方式中，所述克隆表达采用杆状病毒表达系统来表达所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述步骤1)中封闭液为1％(M/V)BSA溶液、5％(M/V)脱脂奶粉溶液、1.5％(M/V)明胶溶液和5％(V/V)犊牛血清(FCS)中的任意一种或多种；优选为1％(M/V)BSA溶液。

本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：

1)用样品稀释液将被检血清进行稀释后，优选以1:50(V/V)的比例进行稀释后，每一血清样品添加酶标板的两孔，每孔加入100μl，同时设立猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清对照和阳性血清对照，各添加两孔；室温下作用15-60min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μl的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续1-5min，优选4-5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；

2)用样品稀释液将酶标二抗按1:200-1:1600(V/V)进行稀释，并将稀释后的酶标二抗加入酶标板，100μl/孔，室温下作用45min，洗涤3-5次；

3)每孔加入100μl底物显色液，室温下作用10-30min；

4)向每孔中加入20-100μl终止液终止反应，优选加入50μl终止液终止反应；

5)在450nm波长下测定各孔吸光度OD值，根据判定标准对结果进行判定。

本发明的有益效果在于：

1.能够灵敏、有效、稳定、可靠地检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，检测效果好，尤其是在猪繁殖与呼吸综合征病毒存在一定变异的情况下；

2.本发明的试剂盒中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白更易溶于水，结构更加稳定，更易于保存，检测结果更灵敏、稳定；

3.成本较为低廉。

具体实施方式

以下结合具体的非限制性实施例来对本发明进行进一步的说明，本发明的优点和特点将会随着进一步的描述更加清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明的某些实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，其1L体积配方为：Na₂CO₃1.59g、NaHCO₃2.93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

在本发明的某些实施方式(如在下列实施例)中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

本实例中所用的猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA试剂盒检测方法的判定标准为：

(其中，OD值表示在450nm时酶标仪测定的吸光度值)

当OD_阳性血清－OD_阴性血清>0.15，OD_阴性血清<0.20时结果成立；

当血清样品的S/P值≥0.40时为阳性，当S/P值<0.40时为阴性。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白的制备、纯化及定量

1.1GP2蛋白引物设计

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332疫苗株(登录号为AF066183)中GP2蛋白的基因序列(见序列表SEQ IDNo.1)设计一对特异性引物，引物序列如下：

GP2-F:5’TCACCATCGCCGGTTGG3’

GP2-R:5’TTGCTGAAAATCATGAAGCTTTG3’

1.2GP2蛋白基因克隆载体构建

1.2.1PCR扩增：按核酸提取试剂盒操作步骤提取VR-2332疫苗株基因组做模板，扩增cDNA，再以cDNA为模板，扩增GP2基因片段。反应体系50μl：5×PrimeSTAR PCR buffer:(Mg²⁺Plus)10μl，dNTP(each2.5mM)4μl，上游引物(20μmol/L):1μl，下游引物(20μmol/L):1μl，模板:1μl，ddH₂O:32μl，PrimeSTAR HSDNA聚合酶(2.5U/μl):1μl。反应条件为：94℃5min；94℃40S，55℃50S,72℃30S，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物，条带大小为501bp。

1.2.2胶回收：按天根胶回收试剂盒的使用说明，胶回收纯化上述酶切片段。

1.2.3连接反应：将PCR产物GP2胶回收后，连接体系如下：

PCR胶回收产物4μl，Salt Solution 1μl，pFastBac^TM vector 1μl轻柔混合后，22℃金属浴连接30min。

1.2.4转化OneMachTM T1R感受态细胞：按照Bac To Bac TOPOCloning Kit说明书进行，具体操作如下：将要转化的连接产物6μl加入到100μLOneMach1^TM T1R感受态细胞的离心管中，轻柔混匀，冰浴30min；将离心管放入42℃水浴中，热激90s，忌晃动；快速将管转移到冰浴中，冷却2-3min；在离心管中加入250μl SOC培养基(恢复室温)，然后将管转移到37℃摇床上225rpm水平震荡培养1h；无菌条件下，将25-100μl的已转化的感受态细胞涂布到含有100ug/mL Amp的LB平板上(可以涂两种不同体积以保证至少有一个有足够的空间长的好)；将平板倒置放入37℃温箱过夜培养(12-16h)。

1.2.5阳性克隆鉴定：从上述平板上挑选至少10个菌落，在含100μg/mL Amp的LB液体培养基中过夜培养，先用菌液PCR方法鉴定，然后再按照质粒小提试剂盒(天根)说明书对阳性菌液提取质粒，用PCR方法对插入目的片段进行方向鉴定。反应体系为50μl：10×LA Taq Buffer 5.0μl，质粒1.0μl，Polyhedrin forwardprimer(为Bac to bac HBM TOPO Cloning Kit中自带)1.0μl,GP2基因下游引物1.0μl,LA Taq Polymerase 0.5μl,dNTP Mixture 4.0μl,ddH₂O 37.5μl。反应条件同1.2.1。所得PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。目的片段为700bp，鉴定为阳性的pFastBac/HBM-GP2质粒送测序公司测序再次鉴定无核苷酸或氨基酸突变。

1.3重组Bacmid质粒构建

1.3.1转化DH10BacTM感受态细胞：将重组pFastBac/HBM-GP2质粒5μl加入100μl DH10BacTM感受态细胞中，轻柔混合，冰上孵育30min；42℃水浴热激90s；迅速将离心管放置冰上2-3min；每管加入900μl的SOC培养基(恢复室温)；含pFastBac/HBM-GP2质粒的离心管在37℃,225rpm的摇床中培养4h；用SOC培养基将培养的感受态细胞进行10倍稀释(10^-1)，然后分别取原液和10倍稀释后的菌液各100μl，在含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素以及100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB平板上涂布；将所有平板在37℃温箱中正置30min使表面液体完全吸收，然后倒置培养48h。

1.3.2阳性克隆的筛选：挑取2个白色菌落，重新划线接种于含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素以及100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的新的LB平板上，在37℃温箱中过夜培养；挑取单个的、白色的克隆在含50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的液体LB培养基中，37℃摇床，250rpm培养12-16h。

1.3.3重组Bacmid质粒鉴定：先用菌液PCR对重组Bacmid质粒进行鉴定，然后根据PureLink^TM HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit试剂盒说明书从鉴定为阳性的菌液中提取重组转座子DNA，以质粒DNA为模板再次进行PCR鉴定。反应体系如下：10×LA Taq Buffer 5.0μl，菌液/质粒1.0μl，pUC/M13上游引物1.0μl，pUC/M13下游引物1.0μl，LA Taq Polymerase 0.5μl，dNTP Mixture 4.0μl，ddH₂O37.5μl。反应条件94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃3min，30个循环后；72℃7min。所得DNA产物在0.8-1.0％琼脂糖凝胶电泳中鉴定。目的条带大小约为3200bp。阳性重组质粒即为Bacmid-GP2质粒。

1.4拯救并扩大培养重组杆状病毒

1.4.1拯救重组杆状病毒：取处于对数期的sf9细胞(1.5×10⁶–2.5×10⁶cells/mL，细胞活性在95％以上)，铺一个6孔板，每孔加入2mL SF-900培养基(不含抗生素和血清)，每孔含8×10⁵cell，室温吸附至少1h。将A：8μl II(用之前4℃保存)和100μL SF-900，混匀，室温放置30min；B:10μl(1ug)Bacmid-GP2+100μL SF-900，轻柔混匀；再轻柔混匀A和B，总体积约210μl，室温孵育15-30min；将混合物滴加到六孔板中，在27℃培养箱中孵育3-5h；移去培养液与转染混合物，再加2mL新的SF-900培养基；27℃培养箱培养72h或看到病毒感染信号后，将上清收获至EP管中，为P1病毒株，4℃避光保存。

1.4.2重组杆状病毒扩大培养：按0.1MOI进行P2和P3代毒株的培养。收获的病毒液上清4℃避光保存。其中P3代毒株用来进行蛋白表达。

1.4.3将Sf9细胞放大至250mL摇瓶悬浮培养，以5MOI的感染剂量接种细胞，96h收获培养液，5000g离心10min，收集细胞上清，用于纯化。另在离心前取出少量上清用于GP2蛋白的Western blot鉴定。分别以His单抗和PRRSV高免血清为一抗，再分别以辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠和抗猪二抗孵育，结果在约25kDa处出现目的条带。

1.5GP2蛋白的纯化、定量

按GE公司His纯化试剂盒说明书进行。将蛋白纯化后，纯化样品在pH7.4的1×PBS磷酸盐缓冲液中透析过夜。透析后样品按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量。结果表明：GP2蛋白的浓度为150μg/ml。

实施例2 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP4、GP5蛋白的制备、纯化及定量

2.1GP3蛋白

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒株VR2332疫苗株(登录号为AF066183)中GP3蛋白的基因序列(见序列表SEQID No.3)设计一对特异性引物，引物序列如下：

GP3-F:5’TCCAATACTACGTACTGTTTTTGG3’

GP3-R:5’TTCTAGGTGAAACCAATTGCC3’

按核酸提取试剂盒操作步骤提取猪呼吸与繁殖综合征病毒VR-2332疫苗株基因组做模板，按照实施例1.2-1.5部分依次制备、纯化、定量GP3蛋白结果表明：GP3蛋白的浓度为256μg/ml。

2.2GP4蛋白

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒株VR2332疫苗株(登录号为AF066183)中GP4蛋白的基因序列(见序列表SEQID No.5)设计一对特异性引物，引物序列如下：

GP4-F:5’GCCTGCAAACCATGTTTCAGTT3’

GP4-R:5’ATGGAGCAACCGCACATGG3’

按核酸提取试剂盒操作步骤提取猪呼吸与繁殖综合征病毒VR-2332疫苗株基因组做模板，按照实施例1.2-1.5部分依次制备、纯化、定量GP4蛋白，结果表明：GP4蛋白的浓度为250μg/ml。

2.3GP5蛋白

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒VR2332疫苗株(登录号为AF066183)中GP5蛋白的基因序列(见序列表SEQ IDNo.7)设计一对特异性引物，引物序列如下：

GP5-F:5’CGCGGATCCGCGAGCAACGACAGCAGCTCCC3’

GP5-R:5’CCGCTCGAGCGGAGGACGACCCCATTGTTCC3’

PCR扩增GP5基因后，胶回收目的片段后，用BamH I和Xho I分别双酶切胶回收产物和pFastBacTM HT A载体，37℃反应3h，胶回收酶切片段，将回收GP5连接到pFastBacTMHT A载体上。酶切体系：10×Buffer 2μL，ddH₂O12μL，DNA 5μL，BamH I 0.5μL，Xho I 0.5μL，37℃反应30min。连接产物转化入DH5α感受态细胞。挑取单克隆进行扩大培养后进行PCR鉴定和测序鉴定，鉴定为阳性的质粒为pFastBac HT-GP5。

重组Bacmid-GP5质粒构建、重组杆状病毒rAcV-GP5的拯救及扩增和GP5蛋白的表达、纯化、定量操作方法依次参照实施例1.3-1.5进行操作。在纯化GP5蛋白用的是细胞裂解上清；蛋白纯化后，纯化样品在1×PBS(pH7.4)中透析过夜；透析后样品按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量，结果表明：GP5蛋白的浓度为320μg/ml。

实施例3 用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的制备

3.1包被原的制备、酶标板的包被与封闭

用pH9.6碳酸盐缓冲液将实施例1-2所制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2、GP3、GP4、GP5蛋白按表1所示各包被原编号所对应的成分进行配制。

表1 试剂盒及对比盒编号和其对应包被原编号及其成分

将表1所示的包被原1-10及对比原1-4分别用pH9.6的碳酸盐溶液稀释后包被于96孔Costar高吸附型酶标板上，100μl/孔，于4℃保存过夜。之后用1％BSA溶液进行封闭，于4℃保存1h。

3.2其它组分的制备

样品稀释液：pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有0.05％(V/V)Tween-20和10％(M/V)脱脂奶，混合均匀。

洗涤液：pH7.4的磷酸盐缓冲液中含有0.05％(V/V)Tween-20，混合均匀。

底物显色液A液：含有3，3"，5，5"-四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，然后用ddH₂O定容至100ml。

底物显色液B：含有柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml，然后用ddH₂O定容至100ml。

终止液：配制2M H₂SO₄。

酶标二抗：购自中国军事医学科学院的兔抗猪酶标二抗。

猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清包括PRRSV经典美洲株阳性血清、PRRSV经典欧洲株阳性血清、PRRSV变异株阳性血清，其中，PRRSV经典美洲株阳性血清为选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的健康易感猪，肌肉注射PRRSVVR2332疫苗株而制备得到的阳性血清；PRRSV经典欧洲株阳性血清为选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的健康易感猪，肌肉注射PRRSV LV疫苗株而制备得到的阳性血清；PRRSV变异株阳性血清为选择PRRSV抗原、抗体均为阴性的健康易感猪，肌肉注射PRRSV JXA1-R株而制备得到的阳性血清。

猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清：采集PRRSV抗原、抗体均为阴性的健康易感猪的血清。

3.3试剂盒的组装

将实施例3.1-3.2部分制备的试剂及材料组装成猪繁殖与呼吸综合征抗体试剂盒及对比盒，按包被原的不同组装成不同的试剂盒，编号依次为试剂盒1-10及对比盒1-4(见表1)。

实施例4 用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的使用方法

用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)加入血清样品：用样品稀释液将待检血清、阳性血清和阴性血清作1:50倍(V/V)稀释，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μl，每个样品重复一次，于室温下作用45min后弃去反应空中液体，每孔用200μl的洗涤液清洗3-5次，每次3min；

(2)加入兔抗猪酶标二抗：每孔加入100μl用样品稀释液按1:800倍(V/V)稀释的兔抗猪酶标二抗，室温作用40min，洗涤3-5次；

(3)每孔中加入100μl底物显色液，室温下避光作用15min；

(4)每孔中加入50μl 2M H₂SO₄终止液终止反应；

(5)用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔的OD值，根据判定标准对结果进行判定。

实施例5 用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的特性的研究

5.1三种不同阳性血清的检测

将实施例3制备的三种阳性血清即PRRSV经典美洲株阳性血清、PRRSV经典欧洲株阳性血清、PRRSV变异株阳性血清分别用稀释液进行1:50(V/V)稀释，按照实施例4所建立的方法进行检测，检测结果见表2。

表2 不同阳性血清的检测结果

OD_阴性血清＝0.125

由表2结果可知：用试剂盒1-10检测三种不同的阳性血清时，检测结果均为阳性。

以下以PRRSV变异株阳性血清作为本发明的试剂盒中的猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清来对酶联免疫吸附测定试剂盒的特性进行研究。

5.2敏感性试验

将猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清做1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1660、1:3200、1:6400(V/V)8个稀释度，同时设猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清对照。按照实施例4所述的方法用实施例3制备的猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA试剂盒1-10与对比盒1-4分别进行检测，测定结果见表3。

表3用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的灵敏度试验结果

OD_阴性血清＝0.127

由表4可知：依据判定标准，当猪繁殖与呼吸综合征病毒株阳性血清稀释到1:3200(V/V)时，试剂盒1-10的检出结果仍为阳性，且远远高于对比盒1-4，表明试剂盒1-10的灵敏度较高，以及包被的抗原性蛋白至少含2种免疫原性蛋白的检测效果优于包被单一免疫原性的蛋白，且具备一定的协同作用。

5.3特异性试验

在同一条件下，用实施例3制备的用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒1-10，分别对猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清、猪瘟阳性血清、猪传染性乙型脑炎阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清进行ELISA检测，每份血清重复检测2孔。通过OD值判定阴阳性结果。在两次重复实验中，试剂盒1-10检测结果(见表4)均显示为阴性，表明试剂盒1-10特异性较好。

表4 用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒的特异性试验结果

注：OD_阳性血清＝1.530，OD_阴性血清＝0.159

5.4重复性试验

5.4.1批内重复试验

用试剂盒1对5份阳性和5份阴性抗体水平不同的PRRS血清，在同一批试验中按照实施例4所述的方法对每份样品重复3次检测。结果表明：10份血清的OD₄₅₀值变异系数在2.1％-9.6％之间，均具有较好的重复性。

同样，分别用试剂盒2-10对以上10个样品做测定，测定结果表明：该检测方法重复性好。

5.4.2批间重复试验

用3个批次的试剂盒1对5份阳性和5份阴性抗体水平不同PRRS血清，检测结果经统计学进行分析后发现：3个批次的试验结果差异不显著，变异系数均在5.6％-8.1％之间，说明该检测方法重复性好。

同样，分别用3个批次的试剂盒2-10对以上10个样品做测定，测定结果表明：该检测方法重复性好。

5.5包被抗原保存期的确定

将分别用包被原1-10包被好的酶标板一式四份用封闭液封闭后洗涤吸干水分，再用包装袋封好置于4℃分别保存6、9、12、15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同保存条件下的酶标板用5份被检样品进行检测。经统计学分析，结果显示：各酶标板对每一样品进行检测时，6、9、12个月的结果均无显著差异，而与15个月的结果由显著差异，说明所有试剂盒在4℃可保存12个月。

实施例6 猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA试剂盒的临床应用

将经中和抗体鉴定为阳性的200份临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪血清样品，分别用i)试剂盒1-10(实施例5)以及实施例6所述的方法、ii)GP2-ELISA检测方法(其中GP2按照刘明莉的文献制备而成，参考文献具体为：刘明莉,李伟娟,王中明等.猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达.江西农业学报,2009,21(3):4-7；ELISA方法参照实施例6)，以及iii)PRRS试剂盒(购自IDEXX公司，该试剂盒所用包被原为N蛋白)对样品进行检测对比。检测结果为：试剂盒1-10阳性检出率依次为90.0％、93.2％、93.8％、92.5％、93.5％、94.3％、96.8％、95.4％、94.9％、98.2％；而GP2-ELISA试剂盒的阳性检出率为71.2％，IDEXX试剂盒的阳性检出率为84.7％。

因而，本实施例所制备的试剂盒1-10检测时阳性检测率与中和抗体检测结果的吻合率均更高，具有较好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的酶联免疫吸附测定试剂盒，其包括：酶标板、底物显色液、酶标二抗、终止液、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清；

其中，所述酶标板包被有猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白包括猪繁殖与呼吸综合征病毒GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白、GP5蛋白中的至少两种蛋白的混合物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括洗涤液和/或样品稀释液；所述洗涤液优选含有磷酸盐缓冲液和/或Tween-20，更优选为含有pH4-10的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液，尤其优选为含有pH6-8的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液，最优选为含有pH7.4的磷酸盐缓冲液和Tween-20的混合液；所述样品稀释液优选为含有牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶和犊牛血清中的任意一种或多种的磷酸盐缓冲液，更优选为含有1％(M/V)牛血清白蛋白、1％(M/V)脱脂奶和3％(V/V)犊牛血清中的任意一种或多种的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白中的至少一种为分泌蛋白，优选地，所述GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白中的至少一种为分泌蛋白，更优选地，所述GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白均为分泌蛋白。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述GP2蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白，和/或

所述GP3蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的蛋白，和/或

所述GP4蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白，和/或

所述GP5蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白中含有GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白和GP5蛋白中的两种或多种，并且其中每种蛋白的含量均为100-500ng。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液包括底物显色液A和底物显色液B，所述底物显色液A含有3,3",5,5"-四甲基联苯胺、无水乙醇和ddH₂O，所述底物显色液B含有柠檬酸、无水Na₂HPO₄、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素以及ddH₂O，优选地，所述底物显色液A含有3,3",5,5"-四甲基联苯胺20mg、无水乙醇10ml以及定容至100ml的ddH₂O，所述底物显色液B含有柠檬酸2.1g、无水Na₂HPO₄2.82g、0.75％(V/V)的过氧化氢尿素0.64ml以及定容至100ml的ddH₂O；

并且所述终止液为H₂SO₄溶液，优选为2M的H₂SO₄溶液；

并且所述酶标二抗优选为兔抗猪酶标二抗。

7.一种根据权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)克隆表达所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白，定量，配制包被原，并包被酶标板，并对酶标板用封闭液进行封闭；

2)制备或配制底物显色液、酶标二抗、终止液、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清和猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清，优选地还制备或配制洗涤液和/或样品稀释液；以及

3)将步骤1)与步骤2)所制备的成分组装成试剂盒。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白为GP2蛋白、GP3蛋白、GP4蛋白和GP5蛋白中的两种或多种，其优选包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的GP2蛋白、氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示的GP3蛋白、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的GP4蛋白以及氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的GP5蛋白中的两种或多种；

更优选地，所述克隆表达采用杆状病毒表达系统来表达所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中封闭液为1％(M/V)BSA溶液、5％(M/V)脱脂奶粉溶液、1.5％(M/V)明胶溶液和5％(V/V)犊牛血清中的任意一种或多种；优选为1％(M/V)BSA溶液。

10.一种根据权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒或者根据权利要求7-9中任意一项所述的制备方法制得的试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：

1)用样品稀释液将被检血清进行稀释后，优选以1:50(V/V)的比例进行稀释后，每一血清样品添加酶标板的两孔，每孔加入100μl，同时设立猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性血清对照和阳性血清对照，各添加两孔；室温下作用15-60min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μl的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续1-5min，优选4-5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；

2)用样品稀释液将酶标二抗按1:200-1:1600(V/V)进行稀释，并将稀释后的酶标二抗加入酶标板，100μl/孔，室温下作用45min，洗涤3-5次；

3)每孔加入100μl底物显色液，室温下作用10-30min；

4)向每孔中加入20-100μl终止液终止反应，优选加入50μl终止液终止反应；

5)在450nm波长下测定各孔吸光度OD值，根据判定标准对结果进行判定。