CN104678104A - 一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的elisa免疫试剂盒 - Google Patents

一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的elisa免疫试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，包括已包被抗原的酶联板，所述包被抗原为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白；所述试剂盒还包括兔抗猪的酶标二抗，所述酶为辣根过氧化物酶。本发明提供的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接ELISA检测试剂盒可以准确的测定美洲型猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒的抗体，其操作简单，所需1.5h，仅为法国LISSEU公司的检测美洲型PRRSA的ELISA检测试剂盒检测方法的一半，且与其具有良好的一致性，可以用于大量样品检测和流行病学调查。

Description

一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在全球范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。该病于20世纪八十年代首次几乎同时出现在德国和美国，此后，PRRS在全球范围内爆发和流行。2006年春，在中国中部暴发猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic PRRS，PHFD)以高达20％～100％的死亡率引起了社会广泛的关注。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是导致该病主要病原。其属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。各种年龄的猪均易感，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒包括欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局(1996)已将本病例为B类传染病。
目前检测PRRSV的方法主要有病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。以上技术要么工作量太大，要么要操作活病毒，要么特异性和敏感性不足，要么诊断时间过长，影响了疫病控制，要么不能够方便的进行临床检测。因此，开发一种具有特异性、敏感性良好，适用于临床检测，劳动强度不高，检测时间较短，检测费用较低的抗体检测试剂盒具有良好的应用价值和市场价值。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，通过纯化的该病毒的核蛋白为检测抗原，以标准血清作为对照，能够简单快速准确的检测待检猪血清中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体值。
本发明提供一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，包括已包被抗原的酶联板，所述包被抗原为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白；所述试剂盒还包括兔抗猪的酶标二抗，所述酶为辣根过氧化物酶。
优选地，包被抗原时使用的封闭液为5％脱脂奶粉和5％的马血清。
优选地，所述包被抗原的包被浓度为234ng/ml。
优选地，所述酶标二抗的工作浓度为1:20000。
优选地，所述试剂盒还包括标准血清、显色液、终止液。
本发明的第二个目的是提供上述试剂盒在检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。
本发明的第三个目的是提供应用上述试剂盒检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的方法，步骤如下：
(1)取出预包被抗原的酶标板，在不同孔中分别加入阳性标准血清和阴性标准血清；然后在其他孔内加入稀释后的待检猪血清，反应，弃反应液，洗涤；
(2)加入1:20000倍稀释的兔抗猪的酶标二抗，反应，弃反应液，洗涤；
(3)加入TMB显色液避光显色，加入反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值；
(4)若阳性标准血清OD450≥0.45，阴性标准血清OD450<0.45，且阳性对照血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.10，则判定为试验成立；若试验成立，依据待检猪血清的OD450数值进行判断，OD450≥0.45即为阳性，反之为阴性。
本发明的有益效果为：本发明提供的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接ELISA检测试剂盒可以准确的测定美洲型猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒的抗体，其操作简单，所需1.5h，仅为法国LISSEU公司的检测美洲型PRRSA的ELISA检测试剂盒检测方法的一半，且与其具有良好的一致性，可以用于大量样品检测和流行病学调查。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为原核表达系统纯化产物的SDS-PAGE检测结果，其中M为蛋白marker；1为空白，2为纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白基因。
图2为原核表达系统纯化产物的western blot检测结果，1对照，2为表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒的核蛋白基因。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒的组成及制备方法为：
1、猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达系统表达的核蛋白的制备、包被及封闭：
美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白接种大肠杆菌表达系统在37℃培养16h，收集培养物利用镍柱进行重组蛋白纯化，包被时用包被液(包被液为碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)稀释成234ng/ml，取50μl/孔的量加到酶联板上，4℃包被过夜；以PBST洗涤3遍，每孔加入100μl封闭液(5％脱脂奶粉和5％的马血清)，37℃放置2h。弃掉洗涤液，PBST洗涤3遍，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。该封闭液能很好地封闭非特异型反应。
2、标准阳性血清的制备：
以美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒按照免疫程序接种20kg的猪，采集免疫前和免疫后2周的血清，分离血清，测定血清抗体效价，无菌分装备用。OD450≥0.45为合格。
3、标准阴性血清的制备：
选用20kg左右、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体阴性的健康断奶仔猪4头，无菌采血，分离血清，－25℃保存。按《中华人民共和国兽药典》进行无菌检验，猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体OD450＜0.215为合格。
4、酶标记物：兔抗猪的酶标二抗。含有淡红色指示剂。指示剂是为了在检测时防止漏加，同时指示抗体稀释液的PH值；所述的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
5、标准阴阳性血清和待检血清稀释度的选择：
棋盘滴定确定标准阴阳性血清和待检血清稀释度为1:200。
6、抗原抗体最适宜浓度的选择：
棋盘滴定确定酶标抗体的工作浓度为1:20000，标准阴阳性血清和待检血清稀释度为1:200,相应抗原的最适包被浓度为234ng/ml。
7、TMB显色液1瓶，购自Sigma公司。
8、终止液1瓶，为1.25M的硫酸。
9、25×PBST为1瓶。
10、样品稀释液1瓶，为含2％吐温-20的PBS，且含有淡绿色指示剂。指示剂是为了在检测时，防止漏加，同时指示血清稀释液的pH值。
11、真空包装铝箔盒包装的试剂盒2个。
12、说明书一份。
试剂盒的组成具体参见表1，按照表1所列的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒内容，装配试剂盒，组成后装于4℃保存。
表1美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体竞争ELISA检测试剂盒
本发明的试剂盒的使用方法如下：
(1)以灭菌水将PBST(25×)洗液稀释至工作浓度。
(2)打开包装袋，取出预包被抗原的酶标板，取阳性标准血清依次加入A1和B1孔，阴性标准血清加入C1和D1孔，50μl/孔；然后取内待检猪血清1μl，加入到200μl的样品稀释液中混合均匀，依次加入96孔板中，每个样品50μl/孔。每个样品两个重复，37℃反应30min，弃反应液，用1×PBST洗涤3遍，每次3分钟。
(3)加入1:20000倍稀释的兔抗猪的酶标二抗，50μl/孔，反应时间为30min，弃反应液，用1×PBST洗涤3遍，每次3分钟。
(4)加入TMB显色液，50μl/孔，37℃避光显色10min，取出加入50μl的反应终止液，终止时间为10min，在酶标仪上读取OD450数值。
(5)阳性对照、阴性对照血清孔各有两个值,需计算平均吸光度值，阳性标准血清OD450≥0.45，阴性标准血清OD450<0.45，且阳性对照血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.10判定为试验成立。
本发明的试剂盒的性能试验如下：
1、特异性试验：
按照本发明的方法研制三批美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA免疫试剂盒(20140230、20140305和20140310)，分别对口蹄疫阳性血清、猪细小病毒阳性血清、BVDV阳性血清各10份和未免疫健康猪血清10份进行检测，结果见下表2：
表2美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA免疫试剂盒对不同病原阳性血清的检测结果
从表2可知，用三批试剂盒检测口蹄疫阳性血清、猪细小病毒阳性血清、BVDV阳性血清和未免疫健康猪血清各10份，结果全部OD值＜0.215，说明该试剂盒具有很好的特异性。
2、敏感性试验
分别用(20140230、20140305、20140310)三批试剂盒对46份PRRSV免疫猪血清、65份PRRSV感染猪血清以及猪繁殖与呼吸综合征阳性梯度稀释的血清按本发明所述的ELISA操作步骤进行检测，并与IHA、TA、AGP作为比较，结果见表3、4。
表3 46份免疫猪血清的检测结果
从表3可知，用本发明的间接ELISA免疫试剂盒检测,全部被检血清的OD≥0.45，阳性率为100％。IHA阳性率为97.8％，TA阳性率为95.7％，AGP阳性率为93.5％。由此可知，本发明的间接ELISA免疫试剂盒对免疫猪血清的检出率较高，敏感性高于IHA、TA、AGP。
表4 65份感染猪血清的检测结果
从表4可知，用本发明的间接ELISA免疫试剂盒检测,全部被检血清的S/N≥2.10，阳性率为100％。IHA阳性率为96.9％，TA阳性率为95.4％，AGP阳性率为93.8％。由此可知，本发明的间接ELISA免疫试剂盒对免疫猪血清的检出率较高，敏感性高于IHA、TA、AGP。
3、重复性试验
用20140230、20140305和20140310三批试剂盒检测65份PRRSV感染猪血清、30份健康猪血清、40份免疫猪血清为免疫后30天所采血清和300份田间猪血清,70份临床健康猪血清进行检测。
3.1批间可重复试验
用20140230、20140305和20140310三批试剂盒分别检测65份感染猪血清、15份健康猪血清、40份免疫猪血清(为免疫后30天所采血清)和300份田间猪血清，结果见表5。
表5批间可重复试验
从表5可知，对65份PRRSV JX2006人工感染猪血清和30份未免疫健康猪血清进行检测，变异系数为0。对免疫猪血清和300份田间猪血清检测的差异均只有一份血清，变异系数为0.01468和0.02987。从而表明三批试剂盒批间差异很小，批间可重复性试验很好。
3.2批内可重复试验
分别用20140230、20140305和20140310批试剂盒先后四次检测对上述70份临床健康猪血清进行检测。检测结果见表6。
表6试剂盒批内可重复试验
从表6可知，三批试剂盒四次检测的变异系数为0。以上结果说明，三批试剂盒的批内差异很小，批内可重复性很好。
4试剂盒保存期试验
为了验证该试剂盒的保存期，将三批试剂盒(20140230、20140305和20140310131230)于2～8℃保存，每隔一段时间对其物理性状、效价、特异性、敏感性、重复性进行检测，具体实验如下。
4.1标准阳性血清检测结果如表7所示：
表7试剂盒阳性血清保存期效价测定
从表7看出，试剂盒在2～8℃保存6个月PRRSV阳性血清OD值与藏前基本一致，到第7个月时开始下降，但到第9个月效价依然保持较高，可以继续用于检测。
4.2特异性的检测
用上述三批试剂盒(20140230、20140305和20140310131230)在不同保存时间分别对口蹄疫阳性血清、猪细小病毒阳性血清各6份和未免疫健康猪血清15份进行检测，结果参见表8：
表8试剂盒保存期特异性的检测
从表8看出，试剂盒在2～8℃保存7个月特异性良好。
4.3敏感性的检测
用上述三批试剂盒(20140230、20140305和20140310131230)在不同保存时间对20份改为阳性血清按本发明所述的ELISA操作步骤进行检测，结果参见表9。
表9试剂盒保存期敏感性的检测
从表9看出，试剂盒在2～8℃保存7个月时其敏感性良好。
4.5重复性检测
用上述三批试剂盒(20140230、20140305和20140310131230)对20份改为阳性血清按本发明所述的ELISA操作步骤进行检测，结果参见表10。
表10试剂盒保存期重复性检验
从表10看出，试剂盒在2～8℃保存7个月时重复检测3次的符合率均为100％，说明其重复性良好。
综上所述，试剂盒在保存7个月时，物理性状均未发生改变、特异性、敏感性、重复性良好，但阳性血清和阴性血清的OD值开始下降，所以保存期暂定为6个月。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，包括已包被抗原的酶联板，其特征在于：所述包被抗原为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的重组核蛋白；所述试剂盒还包括兔抗猪的酶标二抗，所述酶为辣根过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，其特征在于：包被抗原时使用的封闭液为5%脱脂奶粉和5%的马血清。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，其特征在于：所述包被抗原的包被浓度为234ng/ml。
4.根据权利要求1或2所述的用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗的工作浓度为1:20000。
5.根据权利要求3或4所述的用于检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准血清、显色液、终止液。
6.权利要求1-5所述的试剂盒在检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中的应用。
7.应用权利要求1-5所述的试剂盒检测美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）取出预包被抗原的酶标板，在不同孔中分别加入阳性标准血清和阴性标准血清；然后在其他孔内加入稀释后的待检猪血清，反应，弃反应液，洗涤；
（2）加入1:20000倍稀释的兔抗猪的酶标二抗，反应，弃反应液，洗涤；
（3）加入TMB显色液避光显色，加入反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值；
（4）若阳性标准血清OD450≥0.45，阴性标准血清OD450<0.45，且阳性对照血清OD450/阴性对照血清OD450≥2.10，则判定为试验成立；若试验成立，依据待检猪血清的OD450数值进行判断，OD450≥0.45即为阳性，反之为阴性。
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