CN101236205A - 欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，该方法是针对PRRSV VR－2332株的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX－6P－1－N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的氨基酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30－N，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型N蛋白，制备用于PRRS抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒，该抗体试剂盒与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法，为PRRS抗体分型检测打下基础。

Description

欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法

1、技术领域

本发明涉及生物技术领域内的兽病诊断技术，具体是一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法。

2、背景技术

PRRS的发生和流行，已给我国的养猪业造成了相当大的经济损失。但是目前，对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了更好地预防和控制本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS的方法。PRRS感染常用的诊断方法有细胞培养、RT-PCR。但是，这些诊断方法在应用中耗时长、工作量大、需要特殊的仪器和设备，远远不能满足当前诊断PRRS感染的需要，尤其不适合大规模的临床样本检测与开展流行病学调查。

PRRSV分为美洲型与欧洲型两种基因型，欧洲地区主要流行欧洲型，而美洲及亚太地区则以美洲型为主。目前，我国所分离获得的毒株大多数属于美洲型，赵耘等通过分子生物学及血清学方法鉴定了一株欧洲型PRRSV，预示现在我国猪群中可能同时存在欧、美型PRRSV。二者的ORF7编码的病毒结构蛋白都具有良好的抗原性，且N蛋白核苷酸序列型内保守，型间差异较大。因此，本研究在N蛋白的基础上剔除了欧、美型PRRSV型间保守的抗原表位，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRS抗体的间接ELISA方法，首次在国内人工合成了欧洲型PRRSV N蛋白型特异性抗原表位，建立了检测欧洲型PRRSV抗体的ELISA方法；以期为我国PRRS的诊断与检测和血清学调查提供快捷的技术手段。

3、发明内容

本发明的目的是研制一种能够区分欧、美洲型的PRRS抗体检测试剂盒，最终为大规模的临床样本检测与开展流行病学调查提供一种有效的试剂盒。

本发明专利是通过以下技术方案实现的：

1)目的蛋白的表达及纯化：

PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建了针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。

2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立：

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定了美洲型N蛋白抗原包被浓度为4.5μg/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8μg/mL；抗原包被条件均为37℃1h加4℃包被过夜；血清的稀释度均为1∶40，30min作为美洲型N蛋白包被时血清的最适工作时间，60min作为欧洲型N蛋白包被时血清的最适工作时间；均使用1％的BSA封闭，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度均为1∶1000，结合时间均为30min；美洲型N蛋白包被时，样本OD450≥0.43，判定为阳性；OD450值＜0.43的判定为阴性；欧洲型N蛋白包被时，样本OD450≥0.40，判定为阳性；OD450值＜0.40的判定为阴性。不论何种抗原包被，对猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的OD450值均小于0.40，均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳性血清没有交叉反应，说明ELISA方法具有良好的特异性，均可以用于PRRS抗体的检测。

欧洲型PRRSV阳性血清与美洲型N蛋白包被板发生交叉反应，美洲型PRRSV阳性血清与欧洲型N蛋白包被板也发生交叉反应，两者OD450值均略高于阴阳性临界值，但都远低于同型血清与同型抗原的反应值，表明所建立的针对欧洲型及美洲型PRRSV的间接ELISA方法可区分欧洲型及美洲型毒株的感染，但需进一步优化待检血清稀释度，使交叉反应的OD450均低于阴阳性临界值。

本发明的方发所具有的积极效果是，由于国内目前为止尚未发现欧洲型PRRSV感染，获得的欧洲型PRRSV阳性血清的量有限，交叉反应问题暂时还未得到解决。检测欧洲型PRRSV感染的ELISA检测方法的建立为猪病检测提供了技术储备。

4、附图说明

附图1是重组蛋白GST-N的纯化产物；

图中1：为全分子量蛋白质标准；2：为包涵体溶解后的上清；3～5：为过柱纯化后的蛋白。

附图2是重组蛋白HIS-N的纯化产物；

图中1低分子量蛋白Marker，2～5分别为亲和层析纯化收集第4管、第3管、第2管、第1管蛋白。

附图3是重组蛋白GST-N的Western-Blot分析；

图中1～3泳道均为纯化后GST-N融合蛋白。

附图4是HIS-N融合蛋白Western-Blot分析。

图中1～2泳道均为纯化后HIS-N融合蛋白。

附图5是重组美洲型PRRSV N蛋白的薄层凝胶扫描分析曲线；

附图6是重组欧洲型PRRSV N蛋白的薄层凝胶扫描分析曲线。

5、具体实施方式

1)目的蛋白的表达及纯化：

针对PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；设计并合成针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。

复性后的重组蛋白GST-N，经还原型谷胱甘肽洗脱，得到目的蛋白(如图1所示)。亲和层析纯化后目的蛋白纯度达到90％以上。重组融合蛋白HIS-N经镍亲和层析柱纯化后，存在极少量的杂蛋白，其纯度可达95％以上，纯化效果达到预期目的(如图2所示)。

1.1重组蛋白的Western-Blot分析

分别用猪PRRSV美洲型与欧洲型阳性血清对纯化后基因工程重组菌表所表达的蛋白进行Western-Blot分析。结果显示GST-N在大约32.1KDa处出现一条清晰的棕褐色印迹(见图3)。HIS-N在大约10.5KDa处也有一条清晰印迹(如图4所示)。表明重组蛋白均可被PRRSV阳性血清所识别，且具有良好反应原性。

将电泳后的SDS-PAGE凝胶进行薄层扫描，结果显示pGEX-6P-1-N表达的重组融合蛋白量占菌体总蛋白的47.8％，PQE30-N表达的重组融合蛋白量占菌体总蛋白的46.5％(如图5、6所示)。

2)重组蛋白抗原最适包被浓度和待检血清稀释浓度的确定

用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原GST-N分别作18μg/ml、9μg/ml、4.5μg/ml、2.25μg/ml、1.125μg/ml、0.56μg/m 0.30μg/ml 0.15μg/ml 8个倍比稀释度，包被酶标反应板，4℃过夜。用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原HIS-N分别作32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/m 0.5μg/ml 0.25μg/ml 8个倍比稀释度，包被酶标反应板，4℃过夜。用血清稀释液将PRRS阳性血清及阴性血清分别进行1∶20、1∶40、1∶80、1∶160倍比稀释，两种抗原各自组成方阵。将包被好的酶标板倾去孔内液体，进行洗涤，各孔加满PBS-T洗涤液(约300μl)，在室温下放置4min，倒掉，如此重复4次，在吸水纸上拍干，加入5％BSA封闭液，200μl/空，放入温箱内37℃封闭。封闭后，与前面一样进行洗涤(下同)，洗涤后，分别加入倍比稀释好的PCV2阳性血清和阴性血清，每个抗原稀释度加1孔阳性血清和1孔阴性血清，100μl/孔，37℃反应30min，洗涤后，按照方阵每孔加入稀释好的HRP-兔抗猪IgG(1∶1000)100μl，37℃反应30min，洗涤后，加入底物100μl/孔，室温显色10min，加2mol/L H₂SO₄ 50μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，比较阴阳性血清的OD₄₅₀值，选择阳性血清的OD₄₅₀值为1左右和阴性血清OD₄₅₀值低的抗原浓度和血清工作浓度，从而确定抗原最适包被浓度和血清的稀释度。

3)重组抗原包被条件的确定

以最适抗原浓度包被酶标板，100μl/孔，分成4组。第一组：37℃包被2个h加4℃过夜；第二组：37℃包被1个h加4℃过夜；第三组：4℃过夜。包被后，将包被好的酶标板进行洗涤，37℃封闭30min，封闭后每孔加入最适的血清稀释度，在37℃反应30min。洗涤后每孔加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，在37℃反应30min。洗涤后每孔加入底物溶液100μl/孔，室温显色10min，加2mol/L H₂SO₄ 50μ1终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，比较阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，以确定最佳的包被条件。

4)封闭液的确定

以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，分成4组：第一组：用含5％明胶的PBS-T封闭；第二组：用含5％的牛血清封闭；第三组：用1％的BSA封闭；第四组：用含5％的脱脂奶封闭。200μl/孔，37℃反应1h。PCV2阴、阳性血清分别作最适稀释100μl/孔，重复2孔，37℃反应30min，洗涤后，加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，在37℃反应30min。洗涤后每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄50μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，比较阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，以确定合适的封闭液。

5)血清最佳作用时间的确定

以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，洗涤后，分为4组，将PRRS阳性、阴性血清按最适稀释度稀释，37℃分别作用30min、60min、90min、120min，加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，在37℃反应30min。洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10min，2mol/LH₂SO₄50μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，比较阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，以确定合适的作用时间。

6)酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定

以最适的抗原浓度和最佳抗原包被条件包被酶标板，将PRRS阳性、阴性血清按最适稀释度稀释，37℃作用最佳时间。二抗按1∶1000与1∶2000稀释。每个稀释度作4个平行孔，作用20min、40min、60min和90min，洗涤后，每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10min，2mol/L H₂SO₄ 50μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，比较阴阳性血清的OD₄₅₀值和P/N值，以确定合适的稀释倍数和作用时间。

7)间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

随机收集送检无PRRSV感染的猪血清30份，30份血清经猪瘟、猪伪狂犬ELISA试剂盒检测，PRV、CSF抗体均为阴性。经猪细小病毒胶乳凝集试验试剂盒检测，PPV抗体为阴性。用已建立的间接ELISA方法检测，作1∶40倍稀释，100μl/孔，每份血清重复2孔，按照已经确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出OD₄₅₀值，计算出30份血清的OD₄₅₀值的平均值和标准差(SD)，阴阳性临界值等于阴性血清OD₄₅₀值的平均值X+3×标准差，从而算出阴阳性临界值。根据统计学原则，OD₄₅₀值＞X+3SD时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。

8)间接ELISA方法的特异性交叉试验

用纯化好的重组蛋白在最适包被条件下包被酶标反应板，洗涤封闭后，分别将猪瘟、猪伪狂犬病、猪日本乙型脑炎、猪细小病毒的阳性血清作1∶40稀释，同时作PRRS阳性和阴性血清对照，100μl/孔加入酶联反应板，37℃反应30min，洗涤后，加入1∶1000稀释的HRP-兔抗猪IgG二抗，100μl/孔，37℃反应30min，洗涤各孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，室温显色10min，2mol/L H₂SO₄50μl终止液终止反应，在酶联检测仪上读出OD₄₅₀值，进行结果判定。

9)间接ELISA方法的敏感性试验

取250份血清分别用本组建立的重组GST-N蛋白-ELISA方法与武汉科前动物生物制品责任有限公司的ELISA检测试剂盒进行检测，比较两者的检测结果。阴性血清中的阴性检出率即为特异性，阳性血清中的检出率即为相对灵敏度。两种方法检测结果均为阳性或阴性的血清样本总数占总检血清样本的比例即为两者的符合率。

10)重复性试验

10.1批内重复

用同一批制备的重组GST-N蛋白包被板条，取已知的阴阳性血清各一份，另外取三份待检血清，在其它条件不变的情况下，应用本方法进行检测，每份样品重复四孔，根据OD值判定批内重复性。

10.2批间重复

取不同时间制备并纯化的重组GST-N蛋白(处理方法同前所述)，用包被稀释液稀释至最佳包被浓度，经包被、封闭(同前所述)后对已知的阴阳性血清及另外三份待检血清进行检测，每份血清检测4孔，重复检测五次。根据OD值判定不同批次制备的抗原建立的ELISA的可重复性。

11)包被抗原保存期的确定

纯化蛋白以最佳工作浓度包被并经封闭后，用包装袋封好，置于4℃保存，以后每隔1月取出用已知阴阳性血清按所建立的方法进行检测，共检测6次。

当重组蛋白抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml～9μg/ml，血清1∶40稀释时，阳性血清的OD₄₅₀值在1.0左右，且阴性血清OD₄₅₀值低，P/N值高(4.75)。据此确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为1∶40。重组蛋白抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清1∶40稀释时，阳性血清的OD₄₅₀值在1.0左右，且阴性血清OD₄₅₀值低，P/N值高(4.76)。所以，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40。确定用1％的BSA作为封闭液，37℃1个h加4℃过夜作为两种抗原的包被条件。酶标抗体使用浓度为1∶1000，结合时间30min作为二抗的最佳反应条件。

针对美洲型N蛋白ELISA(GST-N-ELISA)，确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.43，即当样本OD₄₅₀≥0.43，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.43的判定为阴性。针对欧洲型N蛋白ELISA(HIS-N-ELISA)，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.40，即当样本OD₄₅₀≥0.40，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.40的判定为阴性。

批内重复试验的变异系数均值(C.V％)为5.30％，批间重复试验的变异系数均值(C.V％)为6.67％，表明该包被板具有良好的重复性。ELISA试剂盒保存期至少为五个月。用建立的间接ELISA方法检测来自济南、聊城、寿光、河北、海南等地区的983份血清，检测样品的平均阳性率为48.6％，与IDEXX试剂盒的符合率均可达到90％。

Claims (4)

1、欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

1)目的蛋白的表达及纯化：

针对PRRSV VR-2332的ORF7基因中欧、美型毒株的保守表位25aa～30aa，37aa～52aa及50aa～66aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原核表达载体pGEX-6P-1-N；针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2aa～12aa、40aa～46aa及67aa～128aa的核酸序列，建立针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用表达纯化的蛋白为抗原，建立欧洲型PRRS抗体试剂盒和美洲型PRRS抗体试剂盒；

2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立：

利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定美洲型N蛋白抗原包被浓度为4.5μg/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8μg/mL；抗原包被条件均为37℃1h加4℃包被过夜；血清的稀释度均为1∶40，30min作为美洲型N蛋白包被时血清的工作时间，60min作为欧洲型N蛋白包被时血清的工作时间；使用1％的BSA封闭，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度均为1∶1000，结合时间均为30min。

2、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，针对美洲型N蛋白ELISA(GST-N-ELISA)，确定抗原GST-N的包被浓度为4.5μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.43，即当样本OD₄₅₀≥0.43，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.43的判定为阴性。

3、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，针对欧洲型N蛋白ELISA(HIS-N-ELISA)，确定抗原HIS-N的包被浓度为8μg/ml，血清的稀释度为1∶40，样本阴阳性临界值为0.40，即当样本OD₄₅₀≥0.40，判定为阳性；OD₄₅₀值＜0.40的判定为阴性。

4、根据权利要求1所述的欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包被的抗原对猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的OD₄₅₀值均小于0.40，均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳性血清没有交叉反应，证明ELISA方法具有良好的特异性，适用于PRRS抗体的检测。

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