CN103543261B - 牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法，属于人畜共患传染病病原体的检测领域，解决了现有采用其他抗原检测布鲁氏菌存在敏感性低、特异性差的问题，该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原包被酶标板，加入待检血清、兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成。本发明利用原核表达载体SUMO在大肠杆菌BL21中高效可溶地表达了布鲁氏菌BCSP31蛋白，用于布鲁氏菌ELISA检测方法的建立，检测的重复性、特异性较好，利用此方法可以快速有效的检测牛羊布鲁氏菌。

Description

牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及人畜共患传染病病原体的检测技术领域，具体涉及一种牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
布鲁氏菌表面蛋白31（Brucellacellsurfaceprotein31ku，BCSP31）基因于1988年被克隆测序和体外表达，它编码了大小为31ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白质，除了绵羊附睾布鲁氏菌外，在其他6种布鲁氏菌中均可检测到BCSP31蛋白的表达。布鲁氏菌BCSP31基因在8株不同属来源的布鲁氏菌菌株中同源性达99.3%，是布鲁氏菌种属特异性基因，具有高度保守性。
目前，已有学者利用真核表达的方法表达了BCSP31蛋白，并利用其真核表达产物免疫小鼠，研究其在小鼠体内的抗布鲁氏菌感染的能力；也有学者利用原核表达载体pGEX4p-1表达了BCSP31蛋白，并研制了BCSP31蛋白的单克隆抗体。
目前，布鲁氏菌PCR快速分子生物学诊断方法的建立通常是基于布鲁氏菌BCSP31基因的克隆，获得特异性的目的片段进行诊断布鲁氏菌病。然而，目前利用布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原建立布鲁氏菌病血清学诊断方法还没有报道。
发明内容
为了解决现有采用其他抗原检测牛羊布鲁氏菌病存在的敏感性低、特异性不高的问题，本发明提供一种牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法，本发明利用BCSP31蛋白作为抗原建立了牛羊布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测方法，并研制了相应的检测试剂盒。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原包被酶标板，分别加入待检血清和二抗，并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成，所述二抗为兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG。
所述抗原的制备方法如下：
（1）布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达、纯化及检测
①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白序列设计引物：
上游引物P1：5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，
下游引物P2：5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’；
②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M、羊种布鲁氏菌疫苗株M5及牛种布鲁氏菌标准菌株544A的基因组DNA为模板，PCR扩增BCSP31基因片段；
③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化，获得BCSP31克隆质粒；
④选择SUMO载体为表达载体，用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒；
⑤回收酶切产物，用T4连接酶连接，16℃过夜，构建SUMO-BCSP31重组表达质粒；
⑥将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得阳性克隆质粒；
⑦将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，终浓度为1mM的IPTG诱导6h后，超声裂解菌体，离心收取上清和沉淀，所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中；
⑧将上述细胞上清经镍柱纯化，再用BCA法测定纯化的BCSP31蛋白的浓度，在53kDa处得到单一目的条带。
⑨将获得的重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白冻干保存。
所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。
所述封闭液的配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，摇匀，得到封闭液。
所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，其配制方法为：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入98%的浓硫酸21.7ml，得到终止液。
制备牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的方法，该方法的条件和步骤如下：
（1）抗原包被酶标板
包被：以在大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原，用抗原稀释液稀释纯化的冻干抗原，得到浓度为119μg/mL的抗原稀释液，每孔加入100μL抗原稀释液，包被酶标板，4℃过夜，
洗涤：弃掉抗原溶液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min，
封闭：将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1～2h，
洗涤：弃掉封闭液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
（2）一抗孵育
用抗体稀释液按待检血清︰抗体稀释液=1︰80的比例稀释待检血清，
将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL经过稀释的待检血清，37℃温箱中孵育1～2h，
洗涤：弃掉待检血清，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
（3）酶标二抗的孵育
用抗体稀释液按照兔抗牛HRP-IgG︰抗体稀释液=1︰5000的比例稀释兔抗牛HRP-IgG，用抗体稀释液按照兔抗羊HRP-IgG︰抗体稀释液=1︰8000的比例稀释兔抗羊HRP-IgG，
将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL经过稀释的兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，37℃温箱中孵育1～2h，
洗涤：弃掉兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
（4）显色
将酶标板置于滤纸上拍干至无水印为止，每孔加入50μL新鲜的TMB底物溶液，37℃温箱中孵育10～15min；
（5）终止
每孔加入50μL终止液即2mol/L的硫酸溶液终止反应，
终止反应后，迅速采用酶联免疫检测仪测定酶标板的OD450nm值，当OD450nm值≥0.433时判为阳性，OD450nm值≤0.366时判为阴性。
所述抗原稀释液为pH=9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其配制方法为：称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，混合，用双蒸水溶解至1000mL，于4℃储存，备用，保存时间不超过1个月。
所述抗体稀释液为含有1%BSA的PBST溶液，其配制方法为:称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g和氯化钾0.2g，量取1mL吐温20，混合，用双蒸水溶解至1000mL，加入1%BSA，摇匀，得到抗体稀释液。
所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。
所述封闭液为含有2%BSA的PBST溶液，其配制方法为:称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，摇匀，得到封闭液。
本发明的有益效果是：本发明的试剂盒是利用重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原，利用ELISA检测方法组装的，基于对布鲁氏菌BCSP31蛋白免疫原性的分析，结果表明其可以作为布鲁氏菌ELISA检测方法很好的候选抗原，用于布鲁氏菌ELISA检测方法的建立，检测的敏感性、特异性、重复性较好；
本发明的试剂盒的制备方法中，利用原核表达载体SUMO在大肠杆菌BL21中高效可溶地表达了布鲁氏菌BCSP31蛋白，并对其反应原性和免疫原性进行了检测，并将其用于布鲁氏菌病间接ELIISA抗体检测试剂盒的研制，采用的抗原稀释液以及抗体稀释液对抗原和抗体按照最佳稀释比进行稀释，并且采用最佳浓度的抗原包被酶标板，使得最终得到的试剂盒具有重复性和特异性较好的效果，利用此方法可以快速有效的检测牛羊布鲁氏菌，比利用其他抗原的试剂盒具有更好的检测效果。
附图说明
图1为SUMO-BCSP31重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达结果图，图1中：M为蛋白Marker，1、2、3和4均为诱导表达的重组BCSP31蛋白；
图2为诱导的SUMO-BCSP31重组蛋白在细胞上清中的表达结果图，图2中：1和2均为细胞上清产物，3和4均为细胞沉淀产物；
图3为重组蛋白SUMO-BCSP31经镍柱纯化结果图，图3中：M为蛋白Marker，1、2和3均为镍柱洗脱产物，4为镍柱结合后剩余产物；
图4为小鼠血清抗体效价检测结果图；
图5为小鼠血清亚型IgG1和IgG2aELISA检测结果图。
具体实施方式
一、材料来源
1、（1）羊种布鲁氏菌标准菌株16M（B.melitensis16M）、羊种布鲁氏菌疫苗株M5（B.melitensisM5）、牛种布鲁氏菌标准菌株544A（B.abortus544A）、牛/羊布鲁氏菌病阳性血清和牛/羊布鲁氏菌病阴性血清均购自中国兽药监察所；
（2）IPTG购自Sigma公司，货号为16758；TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液购自sigma公司，货号为T0440；1%BSA（牛血清白蛋白）购自sigma公司，货号为A1933；2%BSA（牛血清白蛋白）均购自sigma公司，货号为A1933；兔抗牛HRP-IgG（抗牛二抗）为兔抗牛辣根过氧化物酶标记的IgG，购自sigma公司，货号为A5295；兔抗羊HRP-IgG（抗羊二抗）为兔抗羊辣根过氧化物酶标记的IgG，购自sigma公司，货号为SAB3700257；
（3）Blunt载体和T4连接酶均购自NEB公司；
（4）SUMO载体购自Invitrogen公司；
（5）大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌BL21购自北京全式金公司，保存在-80℃冰箱中；
（6）酶标板为聚苯乙烯96孔板，购自美国Costar公司；
（7）大肠杆菌阳性血清、沙门氏菌阳性血清、巴氏杆菌阳性血清和链球菌阳性血清均由中国农业科学院特产研究所保存。
2、本发明中的抗原稀释液为pH=9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，主要成分为碳酸钠和碳酸氢钠，其具体配制方法为：称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，混合，用双蒸水溶解至1000mL，于4℃储存，备用，保存时间不超过1个月。
3、本发明中的洗涤缓冲液为PBST溶液，其具体配制方法为:称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。
4、本发明中的封闭液为含有2%BSA的PBST溶液，其配制方法为:称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2%BSA，摇匀，得到封闭液。
5、待检血清（一抗）为临床上采集的牛/羊血清，其具体制备方法如下：用促凝管采集牛/羊血液5ml，37℃放置30min，4℃放置2h，3000rpm，离心15min，析出的血清收集在EP管中，于-20℃储存，备用。
6、本发明中的抗体稀释液为含有1%BSA（牛血清白蛋白）的PBST溶液，其具体配制方法为:称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl）8.0g和氯化钾（KCl）0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，加入1%BSA（牛血清白蛋白），摇匀，得到抗体稀释液。
7、本发明中的终止液为2mol/L的硫酸溶液，其具体配制方法为：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入98%的浓硫酸21.7ml。
8、制备抗原
（1）布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达、纯化及检测
①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白序列设计引物：
上游引物P1：5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，
下游引物P2：5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’；
②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M（B.melitensis16M）、羊种布鲁氏菌疫苗株M5（B.melitensisM5）及牛种布鲁氏菌标准菌株544A（B.abortus544A）的基因组DNA为模板，PCR扩增BCSP31基因片段；
③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化，获得BCSP31克隆质粒；
④选择SUMO载体为表达载体，用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒，SUMO空载体质粒可以高效的诱导可溶性表达，增加表达量，表达后的蛋白全部是可溶性的蛋白；
⑤回收酶切产物，用T4连接酶连接，16℃过夜，构建SUMO-BCSP31重组表达质粒；
⑥将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得阳性克隆质粒；
⑦将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，终浓度为1mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导6h后，超声裂解菌体，离心收取上清和沉淀，分别进行SDS-PAGE分析（聚丙烯酰氨凝胶电泳），检测可溶性蛋白的表达，SDS-PAGE分析结果如图1所示，1、2、3和4均为诱导表达的重组BCSP31蛋白，可溶性蛋白的表达结果如图2所示，所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中；
⑧将上述细胞上清经镍柱（GE-Healthcare，货号28-4020-89）纯化，再用BCA法测定纯化的BCSP31蛋白的浓度，细胞上清经镍柱纯化的结果如图3所示，在53kDa处得到单一目的条带。
⑨将获得的重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白冻干保存。
（2）重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白免疫原性的检测及分析
分别利用临床上采集的布鲁氏菌阳性血清，重组的BCSP31蛋白免疫小鼠后血清进行免疫印迹分析（Western-blotting）检测其反应原性和抗原性，并检测重组的BCSP31蛋白免疫小鼠后血清中的IgG1和IgG2a的分泌水平。
①ELISA检测小鼠血清IgG
将免疫后小鼠每隔7天尾尖采血，直到免疫后第8周，收集血清，间接酶联免疫吸附检测免疫后小鼠血清抗体效价，结果如图4所示，表达有免疫重组菌SUMO-BCSP31的大肠杆菌BL21从免疫后第7天开始，血清效价逐渐上升，直到免疫后第8周还没有下降，最高血清效价为1︰5600。
②小鼠血清IgG亚型的检测
利用ELISA检测试剂盒检测小鼠血清IgG1和IgG2a的表达量，结果如图5所示，免疫重组菌SUMO-BCSP31的小鼠诱导产生的IgG亚型是以IgG1为主，说明该免疫重组菌SUMO-BCSP31诱导了TH2型免疫反应，以血清抗体免疫为主，羊种布鲁氏菌疫苗株M5则同时诱导产生IgG1和IgG2a，说明布鲁氏菌弱毒疫苗株能够同时刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应，而PBS对照组则无明显的IgG1和IgG2a产生。
二、牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的组成
该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原包被酶标板，分别加入待检血清、二抗（兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG），并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成。
三、牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法
将重组的BCSP31蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA板，采用方阵滴定法进行最佳抗原和抗体浓度的确定，并对ELISA进行最佳检测条件的优化，确定最佳抗原包被浓度、一抗和二抗作用时间及浓度，并确定最佳判定标准，并对ELISA的敏感性、特异性、重复性进行检测，最后对新建的ELISA检测方法进行临床初步应用并与传统的方法进行了对比性实验。
本发明的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法，该方法的条件和步骤如下：
1、抗原包被酶标板
（1）包被：以在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原，用抗原稀释液稀释纯化的冻干抗原，得到浓度为119μg/mL的抗原稀释液，每孔加入100μL抗原稀释液，包被酶标板，4℃过夜，
（2）洗涤：弃掉抗原溶液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min，
（3）封闭：将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1～2h，
（4）洗涤：弃掉封闭液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
2、一抗孵育
（1）用抗体稀释液按照待检血清（一抗）︰抗体稀释液=1︰80的比例稀释待检血清，
（2）将酶标板置于滤纸上拍干至无水印为止，每孔加入100μL经过稀释的待检血清，37℃温箱中孵育1～2h，
（3）洗涤：弃掉待检血清，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
3、酶标二抗的孵育
（1）用抗体稀释液按照兔抗牛HRP-IgG︰抗体稀释液=1︰5000的比例稀释兔抗牛HRP-IgG（抗牛二抗），用抗体稀释液按照兔抗羊HRP-IgG︰抗体稀释液=1︰8000的比例稀释兔抗羊HRP-IgG（抗羊二抗），
（2）将酶标板置于滤纸上拍干至无水印为止，每孔加入100μL经过稀释的兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，37℃温箱中孵育1～2h，
（3）洗涤：弃掉兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
4、显色
将酶标板置于滤纸上拍干至无水印为止，每孔加入50μL新鲜的TMB底物溶液，37℃温箱中孵育10～15min；
5、终止
（1）每孔加入50μL终止液终止反应，
（2）终止反应后，迅速采用酶联免疫检测仪测定酶标板的OD450nm值，当OD450nm值≥0.433时判为阳性，OD450nm值≤0.366时判为阴性。
本发明的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法中反应条件的确定如下：
1、抗原抗体最佳浓度的确定
利用方阵滴定法对重组的BCSP31蛋白即抗原的最佳包被浓度及待检血清的最佳稀释度进行筛选，结果显示，当抗原的包被浓度为119μg/mL，待检血清的稀释倍数为1︰80时，阳性血清OD450nm值可达到2.056，而阴性血清的OD450nm值为0.208。
2、ELISA阴阳性临界值的确定结果
通过对40份牛布鲁氏菌病阴性血清进行间接ELISA测定，其平均值X为0.232，标准差SD为0.067，即当样本OD450nm值≥X＋3SD=0.232+0.134=0.433时判为阳性，当样本OD450nm值≤X＋2SD=0.232+2×0.067=0.366时判为阴性，样品OD450nm值处于两者之间判为可疑。
实施例1特异性试验
利用已确定的ELISA反应条件，组装牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，以重组的BCSP31蛋白抗原包被酶标板，大肠杆菌阳性血清、沙门氏菌阳性血清、巴氏杆阳性血清菌、链球菌阳性血清进行ELISA检测分析交叉试验，以及牛布鲁氏菌病阳性血清、阴性血清各一份作对照。结果如表1所示：大肠杆菌阳性血清、沙门氏菌阳性血清、巴氏杆阳性血清菌、链球菌阳性血清的OD450nm值均小于0.366，因此，这几种细菌阳性血清在该ELISA反应体系下均为阴性，而牛布鲁氏菌病阳性血清的OD450nm值大于0.433，由此表明本发明的试剂盒的特异性较好。
表1
实施例2敏感性试验
利用已确定的ELISA反应条件，组装牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，以重组的BCSP31蛋白抗原的最佳包被浓度包被酶标板，将牛布鲁氏菌病阳性血清按照1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560这八个稀释度进行稀释，其它条件按最佳反应条件进行ELISA检测试验。结果如表2所示：重组的BCSP31蛋白抗原的阳性血清稀释度为1:640时，OD450nm值处于临界值。
表2
实施例3重复性试验
利用已确定的ELISA反应条件，组装牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，取8份牛布鲁氏菌病阳性血清，用两批包被的酶标板各重复检测3次，计算标准偏差。结果表明重复试验中变异系数最大为5.84%，最小为1.14%，8份血清的变异系数都较小，由此表明本发明的试剂盒具有较好的重复性。
实施例4ELISA检测与虎红平板凝集试验的对比性试验
采用布鲁氏菌试管凝集试验、虎红平板凝集试验和本发明的抗体检测试剂盒分别对采自吉林省部分地区的238份未经免疫的牛血清样品进行检测，同时对虎红平板凝集试验阳性的血清与ELISA检测进行交叉试验，确定其敏感性和符合率，检测结果如表3所示：利用本发明的对虎红平板凝集试验阳性的43份牛血清样品进行重组的BCSP31蛋白抗原的ELISA检测试验，结果43份均为阳性，阳性符合率为100%。
表3
检测方法 阳性头份 阴性头份 阳性检出率 阴性检出率
虎红平板凝集试验 43 195 18.07% 81.9%
ELISA检测 48 190 20.1% 79.8%

Claims (9)

1.牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，
该试剂盒是以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原包被酶标板，分别加入待检血清和二抗，并配以洗涤缓冲液、封闭液、TMB底物溶液和终止液组装而成，所述二抗为兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG；
所述抗原的制备方法如下：
(1)布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达、纯化及检测
①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白序列设计引物：
上游引物P1：5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’，
下游引物P2：5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’；
②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M、羊种布鲁氏菌疫苗株M5及牛种布鲁氏菌标准菌株544A的基因组DNA为模板，PCR扩增BCSP31基因片段；
③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化，获得BCSP31克隆质粒；
④选择SUMO载体为表达载体，用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒；
⑤回收酶切产物，用T4连接酶连接，16℃过夜，构建SUMO-BCSP31重组表达质粒；
⑥将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，获得阳性克隆质粒；
⑦将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达，终浓度为1mM的IPTG诱导6h后，超声裂解菌体，离心收取上清和沉淀，所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中；
⑧将上述细胞上清经镍柱纯化，再用BCA法测定纯化的BCSP31蛋白的浓度，在53kDa处得到单一目的条带；
⑨将获得的重组的布鲁氏菌BCSP31蛋白冻干保存。
2.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。
3.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液的配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2％BSA，摇匀，得到封闭液。
4.根据权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液，其配制方法为：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入98％的浓硫酸21.7ml，得到终止液。
5.制备权利要求1所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法的条件和步骤如下：
(1)抗原包被酶标板
包被：以SUMO为表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原，用抗原稀释液稀释纯化的冻干抗原，得到浓度为119μg/mL的抗原稀释液，每孔加入100μL稀释抗原，包被酶标板，4℃过夜，
洗涤：弃掉抗原溶液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min，
封闭：将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL封闭液，37℃孵育1～2h，
洗涤：弃掉封闭液，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
(2)一抗孵育
用抗体稀释液按待检血清︰抗体稀释液＝1︰80的比例稀释待检血清，将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL经过稀释的待检血清，37℃温箱中孵育1～2h，
洗涤：弃掉待检血清，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
(3)酶标二抗的孵育
用抗体稀释液按照兔抗牛HRP-IgG︰抗体稀释液＝1︰5000的比例稀释兔抗牛HRP-IgG，用抗体稀释液按照兔抗羊HRP-IgG︰抗体稀释液＝1︰8000的比例稀释兔抗羊HRP-IgG，
将酶标板置于滤纸上拍干至无水为止，每孔加入100μL经过稀释的兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，37℃温箱中孵育1～2h，
洗涤：弃掉兔抗牛HRP-IgG或兔抗羊HRP-IgG，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤，重复洗涤三次，每次3～5min；
(4)显色
将酶标板置于滤纸上拍干至无水印为止，每孔加入50μL新鲜的TMB底物溶液，37℃温箱中孵育10～15min；
(5)终止
每孔加入50μL终止液即2mol/L的硫酸溶液终止反应，
终止反应后，迅速采用酶联免疫检测仪测定酶标板的OD450nm值，当OD450nm值≥0.433时判为阳性，OD450nm值≤0.366时判为阴性。
6.根据权利要求5所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗原稀释液为pH＝9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其配制方法为：称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，混合，用双蒸水溶解至1000mL，于4℃储存，备用，保存时间不超过1个月。
7.根据权利要求5所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述抗体稀释液为含有1％BSA的PBST溶液，其配制方法为:称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g和氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，量取1mL吐温20，混匀，加入1％BSA，摇匀，得到抗体稀释液。
8.根据权利要求5所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液为PBST溶液，其配制方法为：称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液。
9.根据权利要求5所述的牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述封闭液为含有2％BSA的PBST溶液，其配制方法为:称取磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，用双蒸水溶解至1000mL，再加入1mL吐温20，混匀，得到PBST溶液，量取PBST溶液100ml，加入2％BSA，摇匀，得到封闭液。
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