CN109490541A - 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法 - Google Patents

一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109490541A
CN109490541A CN201811141012.0A CN201811141012A CN109490541A CN 109490541 A CN109490541 A CN 109490541A CN 201811141012 A CN201811141012 A CN 201811141012A CN 109490541 A CN109490541 A CN 109490541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hsp70
indirect elisa
brucella abortus
brucella
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811141012.0A
Other languages
English (en)
Inventor
吴同垒
于秀剑
庞洪泽
李巧玲
杜万年
肖丽荣
张志强
史秋梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei Normal University of Science and Technology
Original Assignee
Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei Normal University of Science and Technology filed Critical Hebei Normal University of Science and Technology
Priority to CN201811141012.0A priority Critical patent/CN109490541A/zh
Publication of CN109490541A publication Critical patent/CN109490541A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，具体步骤如下：制备牛布鲁氏菌HSP70的融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；以获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；确定间接ELISA的临界值；间接ELISA结果判定标准；分析间接ELISA方法的敏感性和特异性。本发明具体通过对HSP70进行原核表达，获得纯化的蛋白，以纯化蛋白作为抗原，建立检测牛布鲁氏菌间接ELISA的方法，为布鲁氏菌病的血清学检测提供重要方法。

Description

一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法
技术领域
本发明涉及一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病严重影响畜牧业发展，对人类健康造成极大威胁。通常，人的感染主要通过接触带菌动物或消费被细菌污染的动物产品，因此，控制和清除带菌动物对于控制该病具有关键意义。动物布鲁氏菌病的筛查依赖于实验室诊断，国际兽医局(OIE)推荐的诊断方法有：布鲁氏菌的分离鉴定、虎红凝集试验、试管凝集试验、PCR技术和补体结合试验等。细菌分离是布鲁氏菌病诊断的“金标准”，但是布鲁氏菌属于危险病原，试验要求高，且分离率非常低，不适于大规模检疫；PCR检测方法敏感性高，特异性差；补体结合试验具有良好的特异性和敏感性，但是同样存在试验要求较高的缺点；虎红凝集试验和试管凝集试验敏感性较高，但容易造成假阳性。
因此，提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA(iELISA)的建立方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，具体步骤如下：
(1)制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；
(2)以步骤(1)获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；
(3)确定间接ELISA的临界值：临界值＝平均值+2.58×标准差；平均值为阴性血清间接ELISA结果的平均值，标准差为阴性血清间接ELISA结果的标准差；间接ELISA结果判定标准：布鲁氏菌血清样本的OD值大于等于临界值判断为阳性，布鲁氏菌血清样本的OD值小于临界值判断为阴性；
(4)分析间接ELISA方法的敏感性和特异性。
进一步，步骤(1)所述制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白的步骤如下：
1)PCR扩增HSP70基因；
2)构建重组表达载体pET32a-HSP70；
3)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；
4)将重组表达载体pET32a-HSP70转化BL21(DE3)菌株，获得重组表达菌株pET32a-HSP70/BL21(DE3)；
5)利用IPTG诱导重组表达菌株，获得融合蛋白；
6)利用SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况；
7)对融合蛋白进行Western blot验证。
进一步，检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA方法在鉴别牛布鲁氏菌中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了检测牛布鲁氏菌HSP70的间接 ELISA的建立方法，具体通过对HSP70进行原核表达，获得纯化的蛋白，以纯化蛋白作为抗原，建立检测牛布鲁氏菌间接ELISA的方法，为布鲁氏菌病的血清学检测提供重要方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明HSP70基因的PCR扩增；
M.DL2000 Marker；1.HSP70基因扩增；
图2为本发明SDS-PAGE分析融合蛋白在大肠杆菌中的表达；
M.蛋白Marker；1.pET32a-HSP70/BL21(DE3)菌体裂解物；2. pET32a/BL21(DE3)空载对照；
图3为本发明Western blot鉴定融合蛋白在大肠杆菌中的表达；
M.蛋白Marker；1.pET32a-HSP70/BL21(DE3)菌体裂解物；2. pET-32a/BL21(DE3)空载对照；
图4为本发明SDS-PAGE分析融合蛋白的表达形式；
M.DL2000 Marker；1.全菌；2.沉淀；3.上清；
图5为本发明SDS-PAGE分析纯化前后的融合蛋白；
M.DL2000 Marker；1.纯化前的融合蛋白；2.纯化后的融合蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 HSP70基因的PCR扩增
从Brucella.abortus 2308基因组中获取HSP70的基因序列，根据表达用质粒pET32a和基因序列分析，选取BamHI和XhoI为酶切位点，利用Primer Premier 5.0设计引物。
引物序列如下：
P1：5’-GCggatccATGGCTAAAGTTATTGGTATC-3’；BamH I；SEQ ID NO：1；
P2：5’-GCctcgagTTAGCGGATCTGGTGCTCCTT-3’；Xho I；SEQ ID NO： 2。
以Brucella.abortus 2308基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR 扩增，PCR反应体系为：
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，共30 个循环；最后72℃延伸5min。
反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，获得1485bp大小的条带，结果如图1所示。
实施例2重组表达载体和表达菌株的构建
将实施例1获得的HSP70基因和质粒pET32a分别进行双酶切，凝胶回收，连接、转化后涂布LB/Amp平板，温箱中倒置培养。挑取LB/Amp平板上的单克隆，摇菌后利用通用引物进行菌液PCR鉴定，获得阳性克隆pET32a-HSP70；
其中，通用引物序列如下：
S-Tag primer：5’-CGAACGCCAGCACATGGACA-3’；SEQ ID NO：3；
T7terminatorprimer：5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’；SEQ ID NO： 4。
PCR反应体系为：
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，共30 个循环；最后72℃延伸5min。
阳性克隆pET32a-HSP70经扩大培养，提取质粒pET32a-HSP70，酶切鉴定后送北京生工测序。
将测序正确的阳性质粒pET32a-HSP70转化大肠杆菌感受态 BL21(DE3)，并进行PCR鉴定，获得重组表达菌株 pET32a-HSP70/BL21(DE3)。
实施例3融合蛋白的诱导表达
利用终浓度为1mM的IPTG在37℃、200rpm条件下对重组表达菌株 pET32a-HSP70/BL21(DE3)进行诱导表达，同时设置pET32a/BL21(DE3)空载对照组；6h后收集菌体，煮样后进行SDS-PAGE分析，经过考马斯亮蓝染色和脱色，重组表达菌株pET32a-HSP70/BL21(DE3)经诱导获得约70kD的融合蛋白，大小符合预期；空载没有获得蛋白条带，结果如图2所示。
实施例4 Western blot验证
为了进一步验证融合蛋白表达，对融合蛋白进行针对表达标签His的 Westernblot鉴定。
诱导表达后，收集菌体，煮样后进行SDS-PAGE，同时设置空载对照组。转膜1h后抗体孵育：取出NC膜，使用5％脱脂奶，4℃封闭过夜；取出NC 膜，使用封闭液稀释的鼠源His标签单克隆抗体(1:4000稀释)37℃孵育1h， PBST洗膜3次，每次5min；使用HRP标记的羊抗鼠多克隆抗体(封闭液 1:8000稀释)37℃孵育1h，PBST洗膜3次，每次5min；显影、曝光。结果如图3所示，表明所表达的蛋白为目的蛋白。
实施例5融合蛋白表达形式鉴定和蛋白纯化
诱导表达后收集菌体，加入PBS重悬，超声裂解菌体，并离心分离上清和沉淀，SDS-PAGE分析表达形式。经过验证表达产物为包涵体表达，结果如图4所示，因此进行包涵体纯化。
蛋白诱导表达后，超声破碎，4℃，12000g离心10min；弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中，离心并弃上清，重复两次，直至包涵体沉淀呈洁净的乳白色；弃上清，加入Inclusion Body Binding Buffer，冰浴1h，使包涵体溶解；4℃，12000g离心20min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤； Ni琼脂糖凝胶灌柱，并使用Inclusion BodyBinding Buffer平衡；将蛋白液体负载上柱，自然流穿；使用15倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer冲洗柱子；使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
取适量洗脱液，加入5×蛋白电泳SDS Buffer煮样，SDS-PAGE分析，结果如图5所示，得到了纯度较高的融合蛋白。
实施例6牛布鲁氏菌血清抗体检测iELISA方法的建立
取牛布鲁氏菌阳性血清和阴性血清，以纯化的蛋白作为抗原建立iELISA 方法，检测布鲁氏菌血清抗体样品。在此过程中，优化抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液的种类、二抗稀释度及显色时间。
在确定最佳反应条件时，通常选择阳性OD值为1，且阳性OD值和阴性OD值差异明显，也就是阳性OD值/阴性OD值(P/N值)比较大时为最佳反应条件。
(1)确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度
首先优化抗原包被浓度和血清稀释度：抗原包被浓度梯度为4ng/μL、2 ng/μL、1ng/μL和0.5ng/μL，4℃包被过夜；血清稀释度为1/50、1/100、1/200 和1/400，37℃孵育1h。羊抗牛-HRP二抗稀释度1/4000，37℃孵育1h，显色10min后终止反应，检测OD值，结果如表1所示。根据OD值，计算P/N 值，确定最佳抗原包被浓度为2ng/μL，血清稀释度为1/200。
表1最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
(2)确定封闭液
以抗原浓度2ng/μL包被板子，选择不同种类的封闭液进行封闭。封闭液包括5％脱脂奶、10％脱脂奶、1％BSA、1％明胶和10％马血清。血清稀释度1/200，羊抗牛-HRP二抗稀释度1/4000，37℃孵育1h，显色10min后终止反应，检测OD值，结果如表2所示。根据OD值，计算P/N值，结果发现5％和10％脱脂奶封闭效果最好，因此本试验选择5％脱脂奶作为最佳封闭液。
表2封闭液的确定
(3)确定二抗稀释度和显色时间
以抗原浓度2ng/μL包被板子，以5％脱脂奶封闭，血清稀释度为1/200，37℃孵育1h。二抗选择不同的稀释度1/1000、1/2000、1/4000和1/6000，37℃孵育1h，显色时间分别是5min、10min、15min和20min，终止反应后测定 OD值，结果如表3所示。根据OD值，计算P/N值，二抗稀释度1/4000，显色10min为最佳反应条件。
表3二抗稀释度及反应时间的确定
实施例7 iELISA方法临界值(CUT OFF)的确定
经虎红凝集试验、微量凝集试验和Svanova牛布鲁氏菌抗体iELISA检测试剂盒(购自瑞士Svanova公司)确定临床牛血清样品的阴、阳性，并选择64份阴性血清用来确定本发明所建立iELISA方法的临界值。临界值＝平均值+2.58×标准差，即临床样品的OD值大于或等于临界值为阳性，OD值小于临界值为阴性。
选择64份阴性血清用来确定iELISA方法的临界值。血清iELISA结果如表4所示，计算临界值＝平均值+2.58×标准差，即临界值＝0.098+2.58×0.034＝0.186，平均值为阴性血清间接ELISA结果的平均值，标准差为阴性血清间接ELISA结果的标准差；即本研究建立iELISA方法，OD 值大于0.186即可判为阳性，小于0.186则为阴性。
表4 iELISA方法临界值的确定
实施例8 iELISA方法的敏感性和特异性分析
对试验前期临床采集的牛血清样品进行虎红凝集试验、微量凝集试验和 Svanova牛布鲁氏菌抗体iELISA检测试剂盒检测，分别选取48份阳性血清和48份阴性血清，按照本发明建立的方法进行iELISA试验。通过结果比较分析，确定本发明方法的敏感性和特异性。
对试验室前期临床采集的牛血清样品进行检测，确定阴阳性血清，并分别选取48份阳性血清和48份阴性血清，按照本发明建立的方法进行iELISA 检测。检测结果如表5和表6，计算得出敏感性：(48-6)/48×100％＝87.5％；特异性：(48-4)/48＝91.7％。
表5 iELISA方法的敏感性分析
表6 iELISA方法的特异性分析
布鲁氏菌病对养殖业和人类公共卫生健康造成巨大威胁，目前的检疫方法主要以虎红凝集试验和试管凝集试验为主，但是两种方法存在特异性不高、假阳性等缺点。本发明建立了牛布鲁氏菌血清抗体检测iELISA方法，其敏感性达到87.5％，特异性达到91.7％，能够用来进行临床牛布鲁氏菌病的诊断。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北科技师范学院
<120> 一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcggatccat ggctaaagtt attggtatc 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcctcgagtt agcggatctg gtgctcctt 29
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgaacgccag cacatggaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tgctagttat tgctcagcgg 20

Claims (3)

1.一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；
(2)以步骤(1)获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；
(3)确定间接ELISA的临界值：临界值＝平均值+2.58×标准差；平均值为阴性血清间接ELISA结果的平均值，标准差为阴性血清间接ELISA结果的标准差；间接ELISA结果判定标准：布鲁氏菌血清样本的OD值大于等于临界值判断为阳性，布鲁氏菌血清样本的OD值小于临界值判断为阴性；
(4)分析间接ELISA方法的敏感性和特异性。
2.根据权利要求1所述的一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，其特征在于，步骤(1)所述制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白的步骤如下：
1)PCR扩增HSP70基因；
2)构建重组表达载体pET32a-HSP70；
3)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；
4)将重组表达载体pET32a-HSP70转入BL21(DE3)菌株，获得重组表达菌株pET32a-HSP70/BL21(DE3)；
5)利用IPTG诱导重组表达菌株，获得融合蛋白；
6)利用SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况；
7)对融合蛋白进行Westernblot验证。
3.检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA方法在鉴别牛布鲁氏菌中的应用。
CN201811141012.0A 2018-09-28 2018-09-28 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法 Pending CN109490541A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811141012.0A CN109490541A (zh) 2018-09-28 2018-09-28 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811141012.0A CN109490541A (zh) 2018-09-28 2018-09-28 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109490541A true CN109490541A (zh) 2019-03-19

Family

ID=65690641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811141012.0A Pending CN109490541A (zh) 2018-09-28 2018-09-28 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109490541A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113607942A (zh) * 2021-07-30 2021-11-05 河北科技师范学院 一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007089571A (ja) * 2005-08-30 2007-04-12 Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine イヌのブルセラ症の血清学的診断法
US20090280471A1 (en) * 2001-03-02 2009-11-12 Ecker David J Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
US20110177127A1 (en) * 2009-12-07 2011-07-21 Andrews Gerard P Brucella Abortus Proteins and Methods of Use Thereof
JP2011163768A (ja) * 2010-02-04 2011-08-25 Yamaguchi Univ ブルセラ属細菌感染の検出方法及び診断キット
CN103344770A (zh) * 2013-07-15 2013-10-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒
CN103543261A (zh) * 2013-09-13 2014-01-29 中国农业科学院特产研究所 牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法
CN105067812A (zh) * 2015-08-06 2015-11-18 中国兽医药品监察所 牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN105445473A (zh) * 2015-11-13 2016-03-30 中国检验检疫科学研究院 一种牛布鲁氏菌elisa检测试剂盒
CN106432440A (zh) * 2016-07-21 2017-02-22 山东绿都生物科技有限公司 羊布鲁氏菌抗体ppa‑elisa检测试剂盒及其制备方法
KR20170023554A (ko) * 2015-08-24 2017-03-06 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법
CN106556701A (zh) * 2016-11-14 2017-04-05 中国兽医药品监察所 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN107656057A (zh) * 2017-09-06 2018-02-02 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090280471A1 (en) * 2001-03-02 2009-11-12 Ecker David J Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
JP2007089571A (ja) * 2005-08-30 2007-04-12 Obihiro Univ Of Agriculture & Veterinary Medicine イヌのブルセラ症の血清学的診断法
US20110177127A1 (en) * 2009-12-07 2011-07-21 Andrews Gerard P Brucella Abortus Proteins and Methods of Use Thereof
JP2011163768A (ja) * 2010-02-04 2011-08-25 Yamaguchi Univ ブルセラ属細菌感染の検出方法及び診断キット
CN103344770A (zh) * 2013-07-15 2013-10-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒
CN103543261A (zh) * 2013-09-13 2014-01-29 中国农业科学院特产研究所 牛羊布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒及其制备方法
CN105067812A (zh) * 2015-08-06 2015-11-18 中国兽医药品监察所 牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
KR20170023554A (ko) * 2015-08-24 2017-03-06 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 브루셀라 캐니스 항원의 제조 방법
CN105445473A (zh) * 2015-11-13 2016-03-30 中国检验检疫科学研究院 一种牛布鲁氏菌elisa检测试剂盒
CN106432440A (zh) * 2016-07-21 2017-02-22 山东绿都生物科技有限公司 羊布鲁氏菌抗体ppa‑elisa检测试剂盒及其制备方法
CN106556701A (zh) * 2016-11-14 2017-04-05 中国兽医药品监察所 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN107656057A (zh) * 2017-09-06 2018-02-02 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张俊波等: "羊种布氏杆菌M5-90 DnaK 的原核表达及免疫保护性研究", 《中国兽医科学》 *
陈诗涛: "牛布鲁氏菌和牛分支杆菌抗原的基因克隆、表达和抗原性鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113607942A (zh) * 2021-07-30 2021-11-05 河北科技师范学院 一种基于gL蛋白检测IBR的间接ELISA的建立方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111217920B (zh) 新冠病毒n-s优势表位融合蛋白、制备方法、应用，及表达蛋白、微生物、应用，试剂盒
CN105384803B (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用
CN105505897B (zh) 细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
CN110305871B (zh) 在日本血吸虫童虫中高表达的基因及其编码蛋白与应用
CN110330556B (zh) 在日本血吸虫童虫中高表达的基因及其编码蛋白与应用
CN108299551A (zh) 血清淀粉样蛋白a1突变体及其制备方法和应用
CN102183646A (zh) 一种检测梅毒血清抗体的rTpN15-17-47-ELISA的制备方法
CN109970851B (zh) Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法
CN108715857A (zh) 一种牛冠状病毒vpn基因、编码的重组蛋白及应用
CN110194797A (zh) 一种鸡mlp蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用
Sailleau et al. Experimental infection of calves with seven serotypes of Epizootic Hemorrhagic Disease virus: Production and characterization of reference sera
CN104086657B (zh) 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒
CN108776225A (zh) 猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用
CN113604438B (zh) 一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用
CN107759674A (zh) 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN110183527A (zh) 一种新孢子虫NcMIC26抗原及其应用
CN109490541A (zh) 一种检测牛布鲁氏菌hsp70的间接elisa的建立方法
CN106970210B (zh) 一种弓形虫病间接elisa诊断试剂盒
CN107167606B (zh) 多诊断试剂盒
CN109111507A (zh) 病毒重组糖蛋白及其真核细胞高效表达方法与应用
CN105254732B (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP5及其编码基因与应用
CN111596070A (zh) 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
CN103864907B (zh) 用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒
CN104151411B (zh) 用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物
CN105218668A (zh) 马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190319