CN107656057A - 一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用。所述试剂盒包括布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板、HRP标记的布鲁氏杆菌抗原、阴性对照品、阳性对照品、显色剂A、显色剂B、终止液以及浓缩洗涤液。本发明试剂盒依据双抗原夹心酶联免疫分析法原理，首先将待测样本加入微孔板中，样本中的未知抗体与固相抗原结合，经洗涤后形成稳固的未知抗体‑抗原复合物，再加入标记抗原使其与IgM抗体的空白位点结合，形成标记抗原‑IgM抗体‑抗原复合物，经洗涤后加入显色剂，颜色的深浅与浓度的高低呈正相关的函数关系。在450nm下测得吸光度OD值，然后根据临界值对待检样本进行判定。本发明的试剂盒可用于检测猪、牛、羊布鲁氏杆菌病的早期急性感染监测。

Description

一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种ELISA试剂盒及其应用，特别涉及一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒及其应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
布鲁氏杆菌(Brucella Blues)是革兰氏阴性胞内寄生菌，无鞭毛、质粒，无荚膜。其根据宿主和致病性的不同可分为猪(Bsuis)、牛(B.abortus)、羊(B.melitensis)、沙林鼠(B.neotomae)、绵羊(B.ovis)、犬(B.canis)布氏杆菌6种19型，其中猪、牛、羊3种16型可通过气溶胶感染人类，寄生于单核巨噬细胞，破坏机体的免疫系统，是世界范围内广泛流行的亚种。由布鲁氏杆菌引起的疾病统称为布鲁氏杆菌病，可感染多种动物，导致母畜早产、流产甚至不孕不育，公畜引发睾丸炎、机体发育不良等症状。人类感染，可引起波浪热、关节疼痛、睾丸和肝脾肿大等生理系统的病变。它是世界上最为普遍的人畜共患病之一。
当前布鲁氏杆菌的检测方法有多种，布鲁氏杆菌的分离培养是诊断布鲁氏杆菌病的“金标准”，但分离率低、耗时长、生物安全要求较高、不适用于广泛应用；PCR方法和基因探针方法特异性强、敏感性高，但基因组DNA的提取也涉及到生物安全问题；虎红平板凝集试验操作简单、价格便食、操作快速，但易出现假阳性；试管凝集试验和补体结合试验是我国诊断布鲁氏杆菌病的法定确诊方法，但操作相对复杂、方法繁琐费事、反应时间长、不适用于现场操作，而酶联免疫吸附试验是20世纪70年代发展起来的一种新型布鲁氏杆菌病快速检测技术，该方法简单、快速、敏感性高、特异性高、结果易于判定、易于标准化、可实现高通量检测，具有良好的应用前景。2004年，竞争ELISA(rELISA)被世界动物卫生组织(OIE)列为诊断和消灭牛布鲁氏杆菌病的推荐方法。
病原感染机体后，产生的抗体主要为IgG、IgM、IgA三种，IgG是血清中浓度最大的一类球蛋白，约占免疫球蛋白含量的70～80％。机体受到抗原初次刺激后，其产生时间仅次于IgM，在抗体介导的抗感染免疫中起主要作用。目前市面的布鲁氏杆菌ELISA检测试剂盒主要检测的就是布鲁氏杆菌阳性血清中的IgG。
IgM由5个球蛋白单位组成的五聚体，在血清中的含量仅次于IgG，是体内最大的球蛋白。抗原初次刺激机体后，IgM出现最早，主要分布在血管内，可以通过激活补体发挥溶菌、溶细胞及中和病毒的作用。因其是五聚体，免疫作用很强，是IgG的100倍，但由于含量仅为IgG的1/10，且持续时间短，所以检测难度较大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过检测血清中IgM抗体含量，进而用于布鲁氏杆菌病的早期诊断及急性感染检测的ELISA试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒，包括布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板、HRP标记的布鲁氏杆菌抗原、阴性对照品、阳性对照品、显色剂A、显色剂B、终止液以及浓缩洗涤液。
在本发明中，优选的，所述的布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板按照以下方法制备得到：
(1)布鲁氏杆菌抗原的制备
在生物安全环境条件下无菌操作，将布鲁氏杆菌接种于TSB液体培养基中，密封器皿口，37℃培养至对数期收菌，将菌液灭活后，离心收集沉淀，将沉淀重悬于PBS溶液中，超声破碎处理，离心，收集上清，即为布鲁氏杆菌抗原；
(2)用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将布鲁氏杆菌抗原稀释成4.0μg/mL，用微量移液器将稀释好的抗原加入到微孔板各孔内，每孔100μL，将微孔板置于4℃过夜，弃去微孔板孔内的包被液，加入PBST洗涤液，室温下振荡洗涤，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，将微孔板甩干，之后每孔加入封闭剂，37℃反应60min，弃去孔内封闭液，用上述方法洗涤3次，排干反应板，得到布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，用铝箔袋真空包装，4℃保存备用。
其中，优选的，所述的PBST洗涤液为含有0.05v/v％Tween20的0.01mol/L PBS，pH7.4。
其中，优选的，所述的封闭剂为含0.5w/w％明胶以及5w/w％蔗糖PBST溶液。
在本发明中，优选的，所述的阴性对照品为布鲁氏杆菌阴性的动物血清，所述的阳性对照品为布鲁氏杆菌阳性的动物血清。
在本发明中，优选的，所述的显色剂A、显色剂B按照以下方法制配制：
显色剂A溶液：称取EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，含有10mg/ml TMB的DMSO溶液0.2g，去离子水500ml，混合均匀；
显色剂B溶液：称取醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30w/w％H2O2 0.3ml，去离子水500ml，混合均匀。
在本发明中，优选的，所述的终止液为6.9v/v％的硫酸水溶液。
在本发明中，优选的，所述的浓缩洗涤液按照以下方法制备：
称取氯化钠200g，氯化钾5g，十二水磷酸氢二钠72.5g，磷酸二氢钾5g和12.5ml吐温-20，加无离子水至1000ml，调节pH值为7.4。
使用本发明所述的ELISA试剂盒检测布鲁氏杆菌病IgM抗体时，按照以下方法进行：
(1)加待检测样本:
取出布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，在微孔板的微孔中分别加入100微升的阴、阳性对照品和待检测样本；
(2)孵育：
用封口贴密封已加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒，将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育120分钟；
(3)洗涤：
孵育完毕后，弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次，洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体；
(4)加酶标记抗体：
在清洗后的微孔中加入HRP标记的布鲁氏杆菌抗原100微升；
(5)孵育：
用封口贴密封已加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒，将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育60分钟；
(6)洗涤：
孵育完毕后，揭开封口贴弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次；洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体，并将微孔板外部的液体与指纹擦拭干净；
(7)显色:
将清洗后的微孔板平置于操作台上，每孔加入50微升的显色剂A，再加入50微升的显色剂B，或预先按照显色剂A与显色剂B 1:1体积比例混匀后加入，混匀后，置于避光环境中，室温18～25℃静置30分钟；
(8)终止：
将微孔板从避光环境中取出，每孔加入100微升的终止液，轻摇混匀；
(9)测量：
将以终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm测量读取各孔的吸光度值，数据读取应在30分钟内完成；
(10)判定
待检测样本OD450nm值≥0.37，判定为阳性；待检测样本OD450nm值＜0.37，判定为阴性。
进一步的，本发明还提出了所述的ELISA试剂盒在制备检测布鲁氏杆菌病IgM抗体试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
病原感染机体后，首先产生的抗体即为IgM，但持续时间不长，本发明试剂盒依据双抗原夹心酶联免疫分析法原理，首先将待测样本加入微孔板中，样本中的未知抗体与固相抗原结合，经洗涤后形成稳固的未知抗体-抗原复合物，依据IgM的结构特性，再加入标记抗原使其与IgM抗体的空白位点结合，形成标记抗原-IgM抗体-抗原复合物，经洗涤后加入显色剂，颜色的深浅与浓度的高低呈正相关的函数关系。将酶标仪虑光片设置为检测波长450nm，测得吸光度OD值，对待检样本中IgM抗体进行判定。本发明的试剂盒可用于检测猪、牛、羊布鲁氏杆菌病的早期急性感染监测。
附图说明
图1为免疫绵羊IgM抗体消长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒的制备及组装
1、包被抗原的制备
1.1流产布鲁氏菌CCVV12菌株由中国兽医监察所引入，由兰州兽医研究所保存。
1.2在生物安全环境条件下无菌操作，将保存的CVCC12株F2代培养物1mL，接种于100mL TSB液体培养基中，密封器皿口，37℃摇培48h左右待生长至对数期收菌。将菌液80℃作用30min进行灭活，灭活后4℃，8000rpm离心20min收集沉淀。称取1g沉淀稀释与30mLPBS溶液中，超声破碎处理，4℃低温12000rpm离心30min，收集上清，即为包被抗原。
2、阴、阳性血清的制备
2.1阳性血清的制备
2.1.1制造用动物
选用体重1.5～2.0kg健康公兔。
2.1.2免疫原制备
按上述1.2节制备的免疫抗原。
2.1.3弗氏完全和不完全佐剂抗原的配制
弗氏完全佐剂抗原：弗氏完全佐剂(Sigma，USA)3ml加抗原3ml。
弗氏不完全佐剂抗原：弗氏不完全佐剂(Sigma，USA)3ml加抗原3ml。
上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。
2.1.4免疫程序
取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔耳后及背部皮下多点接种，免疫剂量100μg抗原/只，7日以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉两点，背部皮下多点接种，进行加强免疫，免疫剂量100μg抗原/只。
2.1.5试血
加强免疫后第7日耳静脉采少量血，用间接ELISA法检测，若效价达1:1000以上时，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第二次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，间隔7日后再进行试血。如血清效价仍不合格，须将免疫兔淘汰。
2.1.6采血
将间接ELISA检测血清效价分离血清＞1：1000的兔子由颈动脉采血。
2.1.7提取血清
用自然凝结法无菌分离血清，分装为1ml/瓶，2～8℃保存。
2.2阴性血清的制备
2.2.1制造用动物
1.5～2.0kg健康公兔。
2.2.2血清制造
无菌由颈动脉采血，用自然凝结法无菌分离血清，分装为1ml/瓶，2～8℃保存。
3、HRP标记抗原的制备
称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加20ul 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5mg纯化的抗原在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4溶液，混匀，4℃静置2小时。将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。3000rpm离心30分钟，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少0.15M pH7.4的PBS中。将上述溶液加入透析袋，对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，收集透析袋中的上清液即为HRP标记抗原，加入40％甘油于-20℃下保存。
4、抗原包被微孔板的制备
用包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)将布鲁氏杆菌抗原稀释成一个单位(4.0μg/mL)，用微量移液器将稀释好的抗原加入到微孔板各孔内，每孔100μL，将微孔板置于4℃过夜。弃去微孔板孔内的包被液，加入洗涤液PBST(0.01mol/L PBS pH 7.4加0.05％Tween20)，室温下振荡洗涤2min，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，将微孔板甩干，之后每孔加入100μL封闭剂(含0.5w/w％明胶+5w/w％蔗糖PBST溶液)，37℃反应60min，弃去孔内封闭液，用上述方法洗涤3次，排干反应板，用铝箔袋真空包装，4℃保存备用。
5、试剂盒组份的配制
5.1 25倍PBST浓缩洗涤液的配制(25×PBST)
氯化钠200g，氯化钾5g，十二水磷酸氢二钠72.5g，磷酸二氢钾5g和12.5ml吐温-20，加无离子水至1000ml，pH值为7.4。室温保存备用。50ml/瓶分装。粘贴标签后，置室温保存。
5.2TMB底物溶液的配制
显色剂A溶液：EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB(四甲基联苯胺)(用DMSO溶解为10mg/ml后在加)0.2g，去离子水500ml；
显色剂B溶液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，H2O2(30％)0.3ml，去离子水500ml。
配制完成后，显色剂A溶液和B溶液均6mL/瓶进行分装，贴标签，4℃保存备用。
5.3终止液
浓硫酸34.5ml，加无离子水至500ml。6mL/瓶分装。粘贴标签后，置4℃保存。
6、试剂盒组装
试剂盒的组装见下表1所示：
表1试剂盒的组装
名称 规格 数量 备注
抗原包被板 8孔×12条 1块 冷藏储存
酶标记抗原 10毫升 1瓶 冷藏储存
阴性对照品 0.5毫升 1瓶 冷藏储存
阳性对照品 0.5毫升 1瓶 冷藏储存
显色剂A 6毫升 1瓶 冷藏储存
显色剂B 6毫升 1瓶 冷藏储存
终止液 6毫升 1瓶 冷藏储存
浓缩洗涤液 50毫升 1瓶1:25稀释 冷藏储存
高分子吸水纸 16厘米×10厘米 3张 常温保存
封口贴 16厘米×10厘米 3张 常温保存
7、操作说明
7.1加待检测样本:
在相应微孔中分别加入100微升的阴、阳性对照品和待检测样本，对照品的瓶塞应盖在原有对应的瓶口上，切勿混用。
7.2孵育：
用封口贴密封以加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒。将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育120分钟。
7.3洗涤：
孵育完毕后，弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次，洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体。
7.4加酶标记抗体：
在清洗后的微孔中加入HRP标记的布鲁氏杆菌抗原100微升。
7.5孵育：
用封口贴密封已加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒。将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育60分钟。
7.6洗涤：
孵育完毕后，揭开封口贴弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次。洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体，并将微孔板外部的液体与指纹擦拭干净。
7.7显色:
将清洗后的微孔板平置于操作台上，每孔加入50微升的显色剂A，再加入50微升的显色剂B(或预先按照1:1体积比例混匀后加入)，混匀后，置于避光环境中，室温18～25℃静置30分钟。
7.8终止：
将微孔板从避光环境中取出，每孔加入100微升的终止液，轻摇混匀。
7.9测量：
将以终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm测量读取各孔的吸光度值，数据读取应在30分钟内完成。
实施例2用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒的阴阳性临界值的确定
应用本发明的试剂盒检测120份免疫前经虎红、试管凝集、竞争ELISA法测抗体试剂盒检测均为阴性的布鲁氏杆菌阴性血清，每份血清重复测两孔，按照实施例1的操作说明进行检测，读出OD450nm值，计算出120份血清的OD平均值和标准差，阴阳性临界值＝阴性血清OD平均值+3倍的标准差，从而计算出阴阳性的临界值。根据统计学原理，OD450nm值≥X+3SD时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，故可得出实验结果的判定标准，结果如下表2所示。
表2 120份血清的OD平均值
经上表数据可计算出120份阴性血清OD450nm平均值X＝0.148，标准差SD＝0.073，所以阴阳性临界值＝X+3×SD＝0.148+3×0.073＝0.367，为判定方便取临界值为0.37。即：在规定的实验条件下，待检样本OD450nm值≥0.37，判定为阳性；待检样本OD450nm值＜0.37，判定为阴性。
实施例3用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒的特异性试验
用本发明的试剂盒检测沙门氏菌(S.E.)、小肠耶尔森菌0:9、李氏杆菌、乙型副伤寒杆菌及大肠杆菌0:157阳性血清及布鲁氏杆菌牛阴性血清10份、羊阴性血清10份进行试剂盒特异性试验。其中沙门氏菌、小肠耶尔森、乙型副伤寒杆菌由中国兽用药品监察所细菌制品检测室提供；李氏杆菌及大肠杆菌由中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病团队提供；布鲁氏杆菌阴性血清由本实验室保存。
试验结果如表3-表5所示，该结果显示：用本试剂盒检测沙门氏菌(S.E.)、小肠耶尔森菌0:9、李氏杆菌、乙型副伤寒杆菌及大肠杆菌0:157阳性血清及牛羊阴性血清结果OD450nm值均＜0.37，判定为阴性。本实验结果说明本试剂盒良好的特异性。
表3沙门氏菌(S.E.)、小肠耶尔森菌0:9、李氏杆菌、乙型副伤寒杆菌及大肠杆菌0:157的检测结果
表4牛阴性血清的检测结果
表5羊阴性血清的检测结果
实施例4用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒的敏感性试验
用本发明的试剂盒检测梯度稀释的布鲁氏杆菌阳性血清，当稀释至1:2560仍检测为阳性，结果如下表6所示。本实验结果说明本试剂盒具有良好的敏感性。
表6布鲁氏杆菌阳性血清的检测结果
实施例5用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒对不同布鲁氏杆菌疫苗免疫羊后抗体消长规律研究
用不同的商品化布鲁氏杆菌弱毒疫苗免疫羊，共分4组，其中S2灌服组85头、M5灌服组71头、M5皮下注射组69头和A19皮下注射组33头。免疫后进行采血至90天，用布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒通过对不同种类的疫苗、不同免疫方法产生的免IgM抗体进行消长规律研究。结果如表7以及图1所示。
表7不同疫苗免疫后ELISA检测IgM阳性率统计
由上表7可以看出，M5皮下注射组免疫7天后IgM抗体阳性率即达到最高，A19皮下注射组、M5灌服组、S2灌服组均免疫后15天IgM抗体到达峰值，21天4组阳性率均迅速下落，45天时4组检测IgM抗体均为阴性。
该实验结果说明当抗原初次刺激机体后，IgM出现最早，并且持续时间很短，这与之前的研究相符。因此，本发明的试剂盒利用双抗原捕获原理建立的检测血清中IgM抗体含量，可用于布鲁氏杆菌病的早期诊断及急性感染。

Claims (10)

1.一种用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于包括布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板、HRP标记的布鲁氏杆菌抗原、阴性对照品、阳性对照品、显色剂A、显色剂B、终止液以及浓缩洗涤液。
2.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板按照以下方法制备得到：
(1)布鲁氏杆菌抗原的制备
在生物安全环境条件下无菌操作，将布鲁氏杆菌接种于TSB液体培养基中，密封器皿口，37℃培养至对数期收菌，将菌液灭活后，离心收集沉淀，将沉淀重悬于PBS溶液中，超声破碎处理，离心，收集上清，即为布鲁氏杆菌抗原；
(2)用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将布鲁氏杆菌抗原稀释成4.0μg/mL，用微量移液器将稀释好的抗原加入到微孔板各孔内，每孔100μL，将微孔板置于4℃过夜，弃去微孔板孔内的包被液，加入PBST洗涤液，室温下振荡洗涤，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，将微孔板甩干，之后每孔加入封闭剂，37℃反应60min，弃去孔内封闭液，用上述方法洗涤3次，排干反应板，得到布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，用铝箔袋真空包装，4℃保存备用。
3.如权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的PBST洗涤液为含有0.05v/v％Tween20的0.01mol/L PBS，pH 7.4。
4.如权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的封闭剂为含0.5w/w％明胶以及5w/w％蔗糖PBST溶液。
5.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照品为布鲁氏杆菌阴性的动物血清，所述的阳性对照品为布鲁氏杆菌阳性的动物血清。
6.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的显色剂A、显色剂B按照以下方法制配制：
显色剂A溶液：称取EDTA-Na 0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，含有10mg/ml TMB的DMSO溶液0.2g，去离子水500ml，混合均匀；
显色剂B溶液：称取醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30w/w％H2O2 0.3ml，去离子水500ml，混合均匀。
7.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的终止液为6.9v/v％的硫酸水溶液。
8.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液按照以下方法制备：
称取氯化钠200g，氯化钾5g，十二水磷酸氢二钠72.5g，磷酸二氢钾5g和12.5ml吐温-20，加无离子水至1000ml，调节pH值为7.4。
9.如权利要求1-8任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，用于检测布鲁氏杆菌病IgM抗体时，按照以下方法进行：
(1)加待检测样本:
取出布鲁氏杆菌抗原包被的微孔板，在微孔板的微孔中分别加入100微升的阴、阳性对照品和待检测样本；
(2)孵育：
用封口贴密封已加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒，将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育120分钟；
(3)洗涤：
孵育完毕后，弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次，洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体；
(4)加酶标记抗体：
在清洗后的微孔中加入HRP标记的布鲁氏杆菌抗原100微升；
(5)孵育：
用封口贴密封已加样的微孔板，使用微量振荡器或手工方式，震动30秒，将以密封的微孔板放置于水浴箱37℃中孵育60分钟；
(6)洗涤：
孵育完毕后，揭开封口贴弃尽微孔内液体，加入220～300微升按照25倍稀释好的洗涤液，清洗微孔板3～5次；洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余的液体，并将微孔板外部的液体与指纹擦拭干净；
(7)显色:
将清洗后的微孔板平置于操作台上，每孔加入50微升的显色剂A，再加入50微升的显色剂B，或预先按照显色剂A与显色剂B 1:1体积比例混匀后加入，混匀后，置于避光环境中，室温18～25℃静置30分钟；
(8)终止：
将微孔板从避光环境中取出，每孔加入100微升的终止液，轻摇混匀；
(9)测量：
将以终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm测量读取各孔的吸光度值，数据读取应在30分钟内完成；
(10)判定
待检测样本OD450nm值≥0.37，判定为阳性；待检样本OD450nm值＜0.37，判定为阴性。
10.权利要求1-9任一项所述的ELISA试剂盒在制备检测布鲁氏杆菌病IgM抗体试剂中的用途。
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