CN102323416A - 一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测技术领域。本发明利用甲醛灭活的金黄色葡萄球菌免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品（牛奶）中金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒，为金黄色葡萄球菌在食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限为10⁵cfu/mL，适合样品的大批量检测。

Description

一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法

技术领域

一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒及检测方法，属于免疫学检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界中广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。人和动物均有较高的带菌率，健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素(SE)的菌株，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。所以，对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。

传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以，建立快速而准确的检测方法一直是病原微生物检验研究的核心问题。免疫测定法，以其准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点，成为检验中广泛应用的方法之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，以便可以简便，快速、灵敏地检测样品中的金黄色葡萄球菌，尤其适合各种样品的大批量检测

本发明的技术方案：利用市售的金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）作为免疫原免疫健康新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了食品中金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA 法的试剂盒。

本发明的试剂盒由以下几部分组成：

（1）以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被96孔酶标板中，每孔100μL。4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤为试剂盒中的反应板。

（2）金黄色葡萄球菌阳性对照标准品和阴性对照标准品。

（3）以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清。

（4）以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(IgG-HRP)。

（5）显色液A，显色液B，使用前将A与B以5:1体积混合。

（6）终止液（2M 硫酸溶液）。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1）配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O           3.62 g 

KH₂PO₄                  0.2 g 

NaCl                     0.2g

KCl                      8.0g

加超纯水稀释至1000 mL。

2）配制碳酸盐0.05M、pH9.6（CBS）缓冲溶液：

    Na₂CO₃                 1.59g

    NaHCO₃                        2.93g

加超纯水稀释至1000 mL。

3）配制PBST溶液：含0.05% Tween–20 和0.15mol/L NaCl的PBS溶液。

4）配制封闭液：含0.1%明胶的包被缓冲液（0.01M PBS缓冲液）。

5）配制抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液。

6）显色液：

A液：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，用超纯水定容至100 mL。 

B液：60 mg  3,3^/,5,5^/-四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；

使用前将A与B以5:1体积混合。

7）终止液：2M的H₂SO₄。

本发明所提供的检测试剂盒使用步骤如下：

    预先配制PBST溶液(0. 01 mol/L pH7. 4，0.15mo1/L NaCl，0. 5%Tween-20)。

a、分别在反应板内加入待测样品、阳性标准品、阴性标准品，100μL /孔，于37℃温育1h。

b、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板。

c、加入以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清，100μL /孔，37℃反应1h。

d、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板。

e、加酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP )，100μL /孔，37 C反应1h。

f、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板。

g、显色：加显色液100μL /孔，显色15min。

h、终止：加终止液100μL /孔。

i、测定：用酶标仪检测OD_450nm，即吸光值A450。

当[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，待测样品呈阳性；

当[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＜2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，待测样品呈阴性。

本发明的有益效果：本发明建立的金黄色葡萄球菌的双抗夹心ELISA检测方法，对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测，检测灵敏度为10⁵cfu/mL。在4h内即可完成检测，可以快速准确完成检测，特别适合样品的大批量检测。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1．免疫原和阳性标准品的准备

金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）接种在Baird-Parker平板上，37℃培养24h，挑取单菌落于10% 氯化钠胰酪胨大豆肉汤37℃、200r/min振荡培养17h，计数，用1%甲醛4℃过夜灭活，生理盐水调整浓度至5×10⁹cfu/mL，为免疫原；用PBS缓冲液调整浓度为10⁷cfu/mL为阳性对照标准品，PBS缓冲液为阴性对照标准品。

实施例2．包被抗血清的制备

1)实验动物：选3只2月龄、体重为1.5–2 kg的健康新西兰大白兔为实验动物。

2)乳化：将0.5mL免疫原与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，直至将一滴乳剂滴入水中，不散开漂在水面上为止。

3)免疫方法：初次免疫将乳化好的试剂于兔子背部多点注射，1 mL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，加强免疫为肌肉注射，每两周加强免疫一次，剂量与初次免疫相同。

4)采血：3次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求（1︰128000）后，采用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清，收集于50 mL灭菌塑料离心管中。

5)抗体的纯化和保存：将抗血清X mL用等量的生理盐水稀释至2X mL，然后在搅拌下逐滴加入与稀释后血清等量（2X）的饱和硫酸铵，4℃放置3小时使其充分沉淀。3000r/min离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至X mL，再逐渐滴加饱和硫酸铵(X/2)mL。4℃放置3小时使其充分沉淀，重复上述第二步过程1次，将末次离心后所得沉淀物以0.02mol/L PBS(pH 7.4)溶解至X mL，装入透析袋中0.02mol/L PBS(pH 7.4)充分透析，期间换液3次，透析完浓缩，用包被缓冲液稀释到3μg/mL作为多克隆抗血清。

实施例3．单克隆抗血清的制备

1)实验动物：选3只8周龄，体重20g左右、雌性BALB/C小鼠为实验动物。

2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0.2mL免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。

3)采血：3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按常规方法进行细胞融合。

4)细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50% PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37℃、5% CO₂培养箱培养。

5)杂交瘤细胞筛选：采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。

6)克隆培养及抗体制备：用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3-4次，直至阳性率达到100 %。将杂交瘤细胞扩大培养， 注射于经石蜡油预处理的BALB/C小鼠腹腔，每只2×10⁶个杂交瘤细胞，7～10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸—硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体，用抗体稀释液稀释到1μg/mL作为单克隆抗血清。

实施例3、人工污染样品双抗夹心ELISA反应过程：

将包被血清用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干为试剂盒中封闭好的反应板。

1)取阴性样本（灭菌牛奶）为代表性样品，25mL脱脂灭菌乳加到225mL 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤培养基无菌锥形瓶中，振荡混匀。分别接种100μL已用0.9%生理盐水10倍稀释的金黄色葡萄球菌菌液，37℃、200r/min振荡培养17h，接种Baird-Parker平板，进行计数，确定样品中金黄色葡萄球菌含量。

2)分别在不同反应板内加入不同浓度的待测样品、阳性标准品、阴性标准品，100μL /孔，于37℃温育1h。

3)加入以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清，100μL/孔，37℃反应1h后洗涤、拍干。

4)加酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP )，100μL /孔，37 C反应1h后洗涤、拍干。

5)加显色液(TMB与底物液比例为1:5)100μL /孔，暗处37 ℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。

当[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，说明待测样品呈阳性；[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＜2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，说明待测样品呈阴性。将不同浓度的样品进行检测，结果表明，浓度为10⁵cfu/mL时，反应结果为阳性，浓度为10⁴cfu/mL时，反应结果为阴性，检测限为10⁵cfu/mL。

实施例4、特异性研究

将沙门氏菌、副溶血弧菌、鲍氏志贺氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌菌液（浓度10⁷cfu/mL）作为待测样品，进行交叉反应研究，结果试剂盒反应结果均为阴性。

Claims (3)

1.一种金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于利用甲醛灭活的金黄色葡萄球菌免疫原免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体作为包被抗体，免疫BALB/C小鼠并进行细胞融合得到单克隆抗体作为二抗，建立了金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫法的试剂盒；所述试剂盒由以下几部分组成：

（1）以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，包被96孔酶标板中，每孔100μL；4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法封闭洗涤，为试剂盒中的反应板；

（2）金黄色葡萄球菌阳性对照标准品；阴性对照标准品；

金黄色葡萄球菌ATCC 29213接种在Baird-Parker平板上，37℃培养24h，挑取单菌落于10% 氯化钠胰酪胨大豆肉汤37℃、200r/min振荡培养17h，计数，用1%甲醛4℃过夜灭活，生理盐水调整ATCC 29213浓度至5×10⁹cfu/mL，为免疫原；

用PBS缓冲液调整ATCC 29213浓度为10⁷cfu/mL为阳性对照标准品，PBS缓冲液为阴性对照标准品；

（3）以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清；

抗体稀释液：含0.1%明胶的PBST溶液；

（4）以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP；

（5）显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，用超纯水定容至100 mL；

显色液B：60 mg 3,3^/,5,5^/-四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇中；

使用前将A与B以5:1体积混合；

（6）终止液：2M 硫酸溶液。

2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于步骤（1）中以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释的多克隆抗体，稀释至多克隆抗体浓度为3μg/mL；步骤（3）中以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清，稀释至单克隆抗体浓度为1μg/mL；步骤（4）以抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP，稀释至1μg/mL。

3.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于步骤如下：

    预先配制PBST溶液：pH7.4、0.01mol/L PBS溶液中含0.15mo1/L NaCl及0.5% Tween-20；

a、分别在反应板内加入待测样品、阳性对照标准品、阴性对照标准品，100μL /孔，于37℃温育1h；

b、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板；

c、加入以抗体稀释液稀释的单克隆抗体抗血清，100μL/孔，37℃反应1h；

d、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板；

e、加酶标二抗：羊抗鼠IgG-HRP，100μL /孔，37 C反应1h；

f、洗涤：用PBST洗涤反应板3-5次，每次3min，220μL/孔，然后甩干反应板；

g、显色：加显色液 100μL /孔，避光显色15min；

h、终止：加终止液100μL /孔；

i、测定：用酶标仪450nm测吸光值OD，即吸光值A450；

当[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，待测样品呈阳性；

当[(样品的吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＜2.1，且[(阳性标准品吸光值A450)/(阴性标准品吸光值A450)]＞2.1时，待测样品呈阴性。