CN101441216A - 水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液及检测方法 - Google Patents

水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液及检测方法 Download PDF

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王秀娟
朱琳
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Abstract

一种水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液及检测方法，涉及环境科学水处理领域，具体地说，涉及水体中的粪肠球菌的快速检测方法。本发明的一组快速检测粪肠球菌的溶液，包括PBS缓冲液、包被液、洗涤液、还包括稀释液、封闭液、二抗、底物溶液、终止液。一种快速检测粪肠球菌的方法，包括以下步骤：A.抗血清获得；B.抗血清与屎肠球菌、盲肠肠球菌、坚强肠球菌、鸟肠球菌、金黄色葡萄球菌反应，离心去除发生交叉反应部分；C.建立间接ELISA反应等。本发明适用于实验室培养或者野外样品处理后，粪肠球菌的快速检测，具有以下优点：具有极高的灵敏度和专一性，所需试剂配制方便，检测过程操作简单。不需要使用复杂的仪器，反应过程简单，不需要专业人员、不需要特殊的培训即可进行。

Description

水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液及检测方法
技术领域
本发明涉及环境科学水处理领域，具体地说，涉及水体中的粪肠球菌的快速检测方法。
背景技术
粪肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰氏阳性细菌，无芽孢、无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。肠球菌主要存在人类或动物的肠道，是人体肠道的正常菌群，在人类粪便中的数量仅次于大肠菌群，其致病力较弱。生活污水、处理后废水及各种用于娱乐水体中均可检出常见菌株粪肠球菌。但目前对实际环境中粪肠球菌的定性、定量检测研究较少，国外仅见利用PCR技术检测粪肠球菌及利用酶联免疫技术测定粪肠球菌表面蛋白Esp和荚膜多糖的报道，因此建立快速检测粪肠球菌的方法对完善淡水、海水水质检测标准具有重要的意义和实际应用价值。
目前对实际环境中粪肠球菌的定性、定量检测研究较少，究其原因，可能存在一下几个方面的问题：
1.日常水质检测指标大肠菌群不包含粪肠球菌，因而一直以来未得到足够的重视。
2.该菌对营养要求较高，培养较困难。
3.目前对粪肠球菌的研究多为临床分离菌株的耐药机制、不同菌株的耐药类型、致病基因、膜蛋白及胞外酶等，对粪肠球菌的定量检测研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速检测水体中的粪肠球菌的酶联免疫检测溶液和检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一组快速检测粪肠球菌的溶液，包括
pH7.4的PBS缓冲液：KCl：KH2PO4：Na2HPO4—12 H2O：NaCl重量比为1：1.2：14.5：40；用于ELISA过程中所有样品的稀释和洗板。
包被液：Na2CO3：NaHCO3重量比为1：1.9～2.0；用于稀释抗原，使抗原与酶标板结合力更高。
PBST洗涤液：1000ml PBS缓冲液加Tween-20 0.5ml；用于洗板的溶液，Tween-20为表面活性剂，使清洗更加彻底。
稀释液：PBS加1％牛血清白蛋白(BSA)；用于抗血清和二抗的稀释，BSA可以使一抗、二抗更加稳定，减少非特异性反应。
封闭液：PBS加2％BSA；包被之后，用于堵塞酶标板上没有结合抗原的部分，减少后续加入的各种蛋白质对酶标板的吸附，防止非特异性反应的发生。
二抗：羊抗兔IgG—HRP酶标抗体；与抗血清结合，故称为二抗或者抗抗体，HRP为辣根过氧化物酶，是迄今在ELISA中使用最广泛的标记酶，其性质稳定，与抗原或抗体耦联后，活性很少受损失。
底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)可溶性单组分底物溶液；TMB为HRP色原底物，与HRP反应后在波长450nm处有最大吸光度，其具有灵敏度高，无毒性等优点。
终止液：2M的H2SO4；可使TMB与HRP反应的产物稳定存在。
一种快速检测粪肠球菌的方法，包括以下步骤：
A、抗血清获得：粪肠球菌置于0.05％甲醛溶液中，30℃下灭活8h；灭活菌体用生理盐水反复洗涤，重复离心三次，制成终浓度为1×1010CFU/mL的抗原；雄性新西兰大白兔2只，耳缘静脉注射灭活抗原，第一次1mL/只，此后每次增加0.1mL；第二次免疫距第一次2周，此后每周一次，共6次；末次注射后一周，耳动脉采血，玻片凝集法测定效价，达到1280：1以上即从心脏取血；取血后将血清置于室温凝固1h，后4℃静置过夜，4℃3000r/min离心15min，分离上清液，得到抗血清；
B、抗血清与屎肠球菌(Enterococcus faecium)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecoum)、坚强肠球菌(Enterococcus durans)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)反应，4℃3000r/min离心去除发生交叉反应部分；
C、建立间接ELISA反应：用包被液稀释粪肠球菌菌体抗原，每孔200μL，60℃烘干；洗板机洗涤3次，甩干；加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入稀释的抗血清和阴性血清，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入1：10000酶标抗体，每孔200μL，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入底物溶液，每孔100μL，室温避光反应10min；加入50μL终止液；酶标仪测定450nm吸光度。
所述的包被浓度为1×105～1×107CFU/mL。
所述的检测用抗血清最佳稀释度为1：100000～256000，二抗稀释度为1：10000。
使用的酶标板为可拆卸聚乙烯高吸附力酶标板。
所述抗血清稀释度为1：128000。
本发明适用于实验室培养或者野外样品处理后，粪肠球菌的快速检测，具有以下优点：
1.具有极高的灵敏度和专一性。去除交叉反应菌体后，抗血清仅与粪肠球菌发生免疫学反应，本酶联免疫法的检测限能够达到1.5×103CFU/mL左右，非常灵敏。
2.所需试剂配制方便。所有试剂均为常用盐类，没有毒性，各种溶液常温保存即可。
3.检测过程操作简单。不需要使用复杂的仪器，反应过程简单，不需要专业人员、不需要特殊的培训即可进行。
附图说明
图1为间接ELISA检测粪肠球菌的敏感性曲线
其中，横坐标为log抗原浓度(CFU/mL)，纵坐标为吸光度(A)。
具体实施方式：
实施例1
用包被液系列稀释已知浓度粪肠球菌菌体抗原，每孔200μL，60℃烘干；
洗板机洗涤3次，甩干；
加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；
洗涤3次，甩干；
加入不同稀释度(如表2、3)的抗血清和阴性血清，37℃温育1h；
洗涤3次，甩干；
加入1：10000HRP标记的酶标抗体，每孔200μL，37℃温育1h；
洗涤3次，甩干；
加入底物溶液，每孔100μL，室温避光反应10min，加入50μL终止液；
酶标仪测定450nm吸光度。
通过上述过程得到标准曲线。按照同样操作测定待测样品吸光度，计算出样品中粪肠球菌菌体浓度。
表1 粪肠球菌抗血清吸附前后效价
 
菌株 吸附前效价 吸附后效价
粪肠球菌屎肠球菌鸟肠球菌坚强肠球菌盲肠肠球菌金黄色葡萄球菌 1：20480001：6401：1601：401：401：4 1：1024000—————
—：表示没有凝集反应
表2 抗原最适包被浓度
 
抗原稀释度 1：1 1：10 1：100 1：1000 1：10000 1：100000 空白
阳性血清OD450阴性血清OD450 2.140.11 2.360.083 2.100.064 1.310.070 1.210.079 0.700.062 0.0610.059
表3 抗血清最佳稀释度
 
血清稀释度 1：16* 1：32* 1：64* 1：128* 1：256* 1：512* 1：1024* 空白
阳性血清OD450阴性血清OD450 1.680.085 1.450.064 1.270.081 1.200.073 0.750.062 0.360.072 0.210.074 0.0630.060
*×1000

Claims (6)

1.一组快速检测粪肠球菌的溶液，其特征在于，包括
pH7.4的PBS缓冲液：KCl∶KH2PO4∶Na2HPO4—12 H2O∶NaCl重量比为1∶1.2∶14.5∶40；
包被液：Na2CO3∶NaHCO3重量比为1∶1.9～2.0；
PBST洗涤液：每1000ml PBS缓冲液加Tween-20 0.5ml，Tween-20为表面活性剂；
稀释液：PBS缓冲液加1％牛血清白蛋白(BSA)；
封闭液：PBS加2％BSA；
二抗：羊抗兔IgG—HRP酶标抗体；
底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)可溶性单组分底物溶液；
终止液：2M的H2SO4。
2.一种快速检测粪肠球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、抗血清获得：粪肠球菌置于0.05％甲醛溶液中，30℃下灭活8h；灭活菌体用生理盐水反复洗涤，重复离心三次，制成终浓度为1×1010CFU/mL的抗原；雄性新西兰大白兔2只，耳缘静脉注射灭活抗原，第一次1mL/只，此后每次增加0.1mL；第二次免疫距第一次2周，此后每周一次，共6次；末次注射后一周，耳动脉采血，玻片凝集法测定效价，达到1280：1以上即从心脏取血；取血后将血清置于室温凝固1h，后4℃静置过夜，4℃3000r/min离心15min，分离上清液，得到抗血清；
B、抗血清与屎肠球菌(Enterococcus faecium)、盲肠肠球菌(Enterococcuscecoum)、坚强肠球菌(Enterococcus durans)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)反应，4℃ 3000r/min离心去除发生交叉反应部分；
C、建立间接ELISA反应：用包被液稀释粪肠球菌菌体抗原，每孔200μL，60℃烘干；洗板机洗涤3次，甩干；加入封闭液，每孔200μL，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入稀释的抗血清和阴性血清，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入1：10000酶标抗体，每孔200μL，37℃温育1h；洗涤3次，甩干；加入底物溶液，每孔100μL，室温避光反应10min；加入50μL终止液；酶标仪测定450nm吸光度。
3、如权利要求2所述的快速检测粪肠球菌的方法，其特征在于：
包被浓度为1×105～1×107CFU/mL。
4、如权利要求2所述的快速检测粪肠球菌的方法，其特征在于：
检测用抗血清最佳稀释度为1：100000～256000，二抗稀释度为1：10000。
5、如权利要求2所述的快速检测粪肠球菌的方法，其特征在于：使用的酶标板为可拆卸聚乙烯高吸附力酶标板。
6、如权利要求4所述的快速检测粪肠球菌的方法，其特征在于：
所述抗血清稀释度为1：128000。
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