CN102944678B - 葡萄球菌肠毒素c化学发光酶联免疫分析检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒的内容物包括有：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准溶液，包被溶液、封闭溶液、洗涤液、化学发光液，以及化学发光酶联板，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，适合于疾病监控及快速定量检测食品及血液中金黄色葡萄球菌肠毒素C。

Description

葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，涉及一种超抗原检测的试剂盒，特别是一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒利用双抗体夹心化学发光酶联免疫分析法来定量检测食品中尤其是牛奶中的金黄色葡萄球菌肠毒素C含量。

背景技术

食品安全与人类健康密切相关，食品安全问题已成为社会关注的热点问题。借助于免疫学技术的发展，构建完善的食源性疾病监控体系，实施全方位的食品安全监控，将有助于提髙食品工业的产品质量，从而保障公众的健康。

金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物等温血动物的皮肤和鼻腔中。金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）产生的细菌性外毒素。依据SEs的血清型不同，可分为SEA到SEIV等23个血清型，其中SEA到SEI以及SER、SES和SET具有引起以呕吐为主要症状的中毒。SEs可溶于水，具有很强的热稳定性，被金黄色葡萄球菌污染的食物经过加热处理后，即使细菌被杀死，其产生的SE仍然具有生物活性。同时SEs可抵抗外源性蛋白酶比如胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化作用，一旦摄入，可引发中毒。据欧洲食品安全委员会统计报告，由SEs引起的食物中毒约占总发病例数的4.1%，但由于检验方法缺乏较好的灵敏度，比例被严重低估。美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33％。加拿大报告的发生率更高，占细菌性食物中毒的45％。我国每年发生此类中毒事件也非常多，全国各地均有报告，是疾病预防控制部门重点监测的疾病之一。绝大多数的牛皮毛和粘膜中携带有大量的金黄色葡萄球菌，人手皮肤也常携带有金黄色葡萄球菌，在食品生产中，这些细菌可在烹调不当的食物中大量繁殖并产生SEs。因此，在食品卫生检测中，SEs的检出是确定食物是被金黄色葡萄球菌污染的决定因素。由于SEs分子量较小（22-kDa到29-kDa），难以与食物蛋白相区分，检测主要依赖于免疫学检测方法，比如酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。

牛乳腺炎是严重影响乳品质量的多发病，流行病学调查显示，其发病率可高达56.5%，其中金黄色葡萄球菌是牛乳腺炎主要的致病菌。据国外文献报道，从患有隐性感染或有症状乳腺炎的牛乳腺分泌物中，均可检出多种金黄色葡萄球菌肠毒素，其中以检测到金黄色葡萄球菌肠毒素C最为常见，且浓度与牛乳腺炎严重程度相关。因此，对牛奶等进行金黄色葡萄球菌肠毒素C等毒素的检测，对食品安全具有十分重要的意义，开发灵敏的检测和定量手段，可以做为食品安全监控的重要手段。

金黄色葡萄球菌肠毒素C中毒剂量极低，仅需ng水平即可引起明显中毒症状。目前，检测金黄色葡萄球菌肠毒素C主要通过免疫学方法，有免疫琼脂扩散法、反向间接血凝法、免疫芯片法和酶联免疫吸附法等。免疫琼脂扩散法和反向间接血凝法的缺点是费时、影响分析的干扰因素较多、灵敏度低，特异性差。免疫芯片法存在价格昂贵，操作人员需要经过专业培训，影响分析的干扰因素较多，灵敏度低等不足。酶联免疫吸附法虽然操作简便，适合大通量检测，但是检测敏感性较差。

鉴于此，建立一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，对于在食品中快速、特异、灵敏的检测金黄色葡萄球菌肠毒素C具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒具备了酶联免疫法的特异性强、重复性好便于大通量检测的特点，同时还具有极高的灵敏度，非常适合于快速定量食品特别是牛奶中的金黄色葡萄球菌肠毒素C。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物包括有：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准溶液，包被溶液、封闭溶液、洗涤液、化学发光液，以及化学发光酶联板，其中：

所述化学发光酶联免疫板的各孔包被有抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体；其中所述包被抗体浓度优选2.5μg/mL。

所述辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，是由辣根过氧化酶标记的小鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体；使用时用封闭溶液配制成1:16000的工作浓度；

所述金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准溶液的浓度分别是0.003125ng/mL、0.00625ng/mL、0.0125ng/Ml、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL和0.4ng/mL。

所述包被溶液是1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L去离子水中的混合液，pH为9.5；

所述封闭溶液是每升溶液中含体积分数为0.05的小牛血清、pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤溶液是含有体积分数0.05吐温-20，pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述化学发光溶液选择ELISA超级发光液，A液与B液体积比为1:1的混合液。

在制备抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选，建立化学发光酶联免疫分析方法，用来定量检测食品及牛奶中的金黄色葡萄球菌肠毒素C。

本发明采用的定量检测方法包括：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体的制备和配对抗体的筛选，以及化学发光酶联免疫分析方法的建立。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的制备和配对抗体的筛选方法是将金黄色葡萄球菌肠毒素C作为免疫原，采用常规杂交瘤技术得到一组抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，将未标记的单克隆抗体作为包被抗体，将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，采用阵列法两两配对筛选检测金黄色葡萄球菌肠毒素C特异性强、敏感性最高的配对抗体。

按照上述抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液浓度和检测抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围，检测金黄色葡萄球菌肠毒素C标准曲线范围可以达到0.003125ng/mL~0.4ng/mL，灵敏度达到0.003125ng/mL。

本发明的葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。与传统的ELISA法比较，灵敏度可以提髙8-10倍。可在环境、食品和体液中金黄色葡萄球菌肠毒素C含量检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为鲁米诺化学发光体系作用机理图。图中，（A）是鲁米诺在过氧化物酶、氢氧化钠和双氧水的作用下，发生氧化还原反应，由基态跃迁到激发态，激发态不稳定再回到基态时释放能量发射光的过程。（B）是玻璃纤维管将化学发光反应中产生的光收集起来，传递给光电倍增管（photomultiplier，PMT），PMT将光信号转化为模拟信号，经甄别电路转化成数字信号传递给计算机分析系统的过程。

图2为球菌肠毒素A化学发光酶联免疫分析检测试剂盒的标准曲线。图中，金黄色葡萄球菌肠毒素A系列稀释浓度为0ng/mL、0.003125ng/mL、0.00625ng/mL、0.0125ng/mL、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL和0.4ng/mL时，获得线性回归方程为Y=3199.1X+42.998（其中Y为相对发光单位，X代表金黄色葡萄球菌肠毒素A浓度）。R²=0.9965，表明线性关系良好。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

申请人在制备抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的基础上，经过配对抗体的筛选和建立双抗体夹心化学发光酶联免疫分析方法，制备了一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，来定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素C。

葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒的内容物包括有：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准溶液，包被溶液、封闭溶液、洗涤液、化学发光液，以及化学发光酶联板。

上述试剂盒涉及的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准溶液，辣根过氧化物酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液，化学发光溶液和洗涤液及其配方，对检测的灵敏度影响很大。其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品溶液：金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品溶液为以常规方法配制浓度分别为0.003125ng/mL、0.00625ng/mL、0.0125ng/ML、0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL和0.4ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品溶液。

2、辣根过氧化物酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液为辣根过氧化物酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体原液，使用时用封闭溶液配制成1：16000的工作浓度。

3、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L去离子水中的混合液，pH为9.5。

4、抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液：抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体用封闭溶液稀释成1：1000的工作浓度，即2.5μg/ml。

5、封闭溶液：是每升溶液中含体积分数为0.05的新生牛血清pH 7.50.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

6、洗涤溶液：指含有体积分数0.0005吐温-20的pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

7、化学发光溶液：选择Pierce公司生产的ELISA超级发光液，其中A液与B液体积比为1:1的混合液。

其中，化学发光酶联板选择乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶联免疫板，化学发光酶联免疫板的包被是：将抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体置于设定的包被溶液中，加入到96孔化学发光酶联板，以设定的浓度在4℃中包被过夜。

化学发光酶联板所包被的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体在碱性环境下可以很好的结合在检测板塑料表面上，可以经受多次洗涤，采用的包被抗体浓度为2.5μg/mL。

包被好的化学发光酶联板用封闭溶液封闭。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液和检测抗体溶液的制备：

抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液和检测抗体溶液的浓度是决定化学发光酶联免疫分析试剂盒测定金黄色葡萄球菌肠毒素C范围及灵敏度的重要因素。本实施例中，抗金黄色葡萄球菌肠毒素C包被抗体溶液可以用封闭液稀释成1：1000的工作浓度。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液优选用封闭液配制的浓度为1：16000。

抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的制备方法是：将纯化的金黄色葡萄球菌产生的金黄色葡萄球菌肠毒素C作为免疫原，采用常规杂交瘤技术得到一组抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体。

配对抗体的筛选方法是：将得到的一组单克隆抗体逐一常规标记辣根过氧化物酶，分别将未标记的单克隆抗体作为包被抗体，将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，采用阵列法两两配对挑选最佳的配对抗体，建立双抗体夹心化学发光酶免疫分析的方法。最佳的配对抗体的挑选方法是：选择敏感性最高，即检测相同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素C的光吸收值最高，且特异性高，即检测无关蛋白的光吸收值最低，(即非特异本底最低）的配对抗体。

化学发光酶联免疫分析试验的方法是，在化学发光酶联板96孔中，加入2.5μg/mL包被抗体，4℃孵育过夜后用含4%新生牛血清的缓冲液封闭，洗涤后加入经系列稀释的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，孵育及洗涤后加入检测抗体，再次孵育及洗涤后加入化学发光底物液，用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度，以金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品的光吸收值为纵坐标，相应标准品浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测标本的光吸收值，经曲线拟合或换算，得出检测样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C的浓度。

以下是发明人给出的实施例：

实施例1：金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的制备与包被抗体和检测抗体配对的筛选

（1）抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体的制备：纯化的天然金黄色葡萄球菌肠毒素C抗原标准品由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。采用8周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，以金黄色葡萄球菌肠毒素C为免疫原，首次免疫剂量为50μg/mL，将免疫原溶于生理盐水和等体积福氏完全佐剂制成乳化剂，皮下多点注射。间隔3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次免疫，佐剂为福氏不完全佐剂。2~3周后进行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔免疫，腹腔注射7~10天后尾静脉采血测其效价，如小鼠血清效价达到要求加强免疫一次，剂量同上，不加佐剂。加强免疫3天后取脾制备成单个细胞悬液，采用常规杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选及克隆化，共得到26株抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，分别命名为FMU-SEC1～FMU-SEC26。

（2）用于双抗体夹心ELISA单克隆抗体的配对筛选：将得到的一组抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，逐一常规标记辣根过氧化物酶，分别将该组中未标记的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液稀释至2.5μg/mL，将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心ELISA两两配对方阵法确定最佳抗体配对。最佳配对抗体的挑选方法是：选择敏感性最高，即检测相同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素C的光吸收值最高，且特异性强（即检测无检测抗原或无关抗原的光吸收值最低，也即非特异本底最低）的配对抗体。具体步骤为：

A．96孔酶联板分别包被26株金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，4℃孵育过夜。

B．洗涤液充分洗板3次，分别加入用封闭溶液稀释的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，浓度为浓度为0.01ng/mL，只加封闭溶液的孔设为空白对照孔，37℃孵育1h。

C．洗涤液充分洗板3次，按照方阵法排列分别加入26株辣根过氧化物酶标记的检测抗体，100μl/孔，形成26×26方阵，37℃孵育1h。

D．洗涤液充分洗板后，加入2，2’-连氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸）底物显色液，100μl/孔，37℃孵育15min，用酶标仪检测405nm下的吸光度（OD）值。

经过抗体的配对筛选后，将FMU-SEC4单克隆抗体作为包被抗体，FMU-SEC8单克隆抗体作为检测抗体。

实施例2：化学发光酶联免疫方法的建立

（1）最佳包被抗体浓度的选择：

包被抗体按1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL的系列稀释度包被化学发光酶联板，100μL/孔，4℃孵育过夜，用洗涤液洗板3次；250μL/孔封闭溶液封闭，室温放置1小时，洗板3次；加入0.01ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准抗原，100μL/孔，同时每种包被抗体浓度均做空白对照孔，37℃孵育1小时，洗板3次；分别加入1：16000稀释的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体，37℃孵育1小时，洗板5次；加入100μL/孔的化学发光液，测定发光值。根据测定的不同包被抗体浓度与相应空白孔的发光值比值的大小筛选出最佳包被抗体的浓度为2.5μg/mL。

（2）检测抗体浓度的确定：

包被抗体按2.5μg/mL浓度包被化学发光酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜，用洗涤溶液洗板3次；250μL/孔封闭溶液封闭，室温放置1小时，洗板3次；加入0.01ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，100μL/孔，37℃孵育1小时，洗板3次，每次拍干；分别加入倍比稀释的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C酶标抗体1:500-1:64000于各反应孔中，100μL/孔，同时每种酶标抗体浓度均做空白对照孔，37℃孵育1小时，洗涤。加入100μL/孔的化学发光液，测定发光值。根据测定的不同酶标抗体浓度与相应空白孔的发光值比值的大小筛选出最佳酶标抗体的浓度为1:16000。

（3）检测下限的确定：

根据对包被抗体及检测抗体最佳浓度的筛选，申请人选择并确定包被抗体浓度为2.5μg/mL，抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体浓度为1：16000，确定化学发光酶联免疫检测方法的检测下限：

A．包被：用0.05M pH9.5碳酸盐包被溶液将包被抗体配成2.5μg/mL的溶液，化学发光酶联板每孔中加100μL，4℃过夜。次日弃去孔内溶液，用洗涤液洗3次，300μL/孔，每次5分钟，拍干。（此步骤简称洗涤，下同）。

B．封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的化学发光酶联板，250μL/孔，室温孵育1小时，洗涤。

C．加样：加入倍比稀释的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品于上述已封闭的化学发光酶联板中，100μL/孔，37℃孵育1小时，洗涤。

D．加检测抗体：分别加1:16000稀释的检测抗体于化学发光酶联板中，100μL/孔，37℃孵育1小时，洗涤。

E．发光：化学发光酶联板中加入发光溶液100μL/孔，反应5min后用酶标仪检测发光值。

实施例3：检测葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒在不同基质中的应用

该实施例用来评价本发明的葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒在不同基质中检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的准确性和实用性。

将金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品分别用环境基质河水、食品基质牛奶、体液基质人血清或人尿液稀释成不同浓度，用化学发光酶免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素C含量，计算所测量浓度与实际加入浓度的比值，即回收率。

（1）用包被抗体预包被化学发光酶联板：用包被溶液将包被抗体稀释成2.5μg/mL加入化学发光酶联板，100μL/孔，4℃过夜，弃掉包被液，每孔加入250μL洗涤液，洗涤3次，加入封闭液250μL/孔，37℃孵育1h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，用锡箔纸真空密封4℃保存备用。

（2）样品预处理

A．河水：将河水样品在4℃、10000转/分钟条件下离心15分钟，弃去沉淀。

B．牛奶：将购买的纯牛奶样品在4℃、10000转/分钟条件下离心15分钟，去掉脂肪层。

C．尿样；将收集的尿液样品在4℃、10000转/分钟条件下离心15分钟，去掉沉淀。

D．血清：将收集的血液样品在4℃静置过夜，30000转/分钟，离心15分钟，取血清。

E．分别用上述液体将金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品稀释成高（2.0ng/ml）、中（0.8ng/ml）、低（0.2ng/ml）3个浓度，分别掺入到相应基质中，在最佳包被抗体和检测抗体优化条件下，用化学发光酶联免疫分析法测定10次回收率，计算平均回收率。回收率计算方法为：

回收率＝（测定浓度/实际浓度）×100％。

（3）检测步骤

A．加样：向预先包被有包被抗体的化学发光酶联板中加金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品溶液或样品溶液，100μL/孔，37℃孵育1小时。

B．洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250μL，洗涤3次。

C．加检测抗体：加入抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，100μL/孔，37℃孵育1小时。

D．洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250μL，洗涤3次。

E．加发光溶液：加入发光溶液，100μL/孔。

F．检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

（4）结果判断

用所获得的标准品发光值作出工作曲线和方程式，根据样品的发光值计算出基质中的金黄色葡萄球菌肠毒素C浓度，依据公式计算回收率。

结果见下表：

实施例4：葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒精密度和准确度试验

取0.2ng/mL、0.4ng/mL、1.0ng/mL和2.0ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，加入人尿中，用葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒检测金黄色葡萄球菌肠毒素C回收率。每个浓度的批间变异系数以10天分别检测得到的10个重复数据进行计算；批内变异系数以同一天检测的10个重复样品数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程计算回收率。

结果见下表：

从上述测定结果看，变异系数低于10.58，回收率在86-104%之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。

Claims (1)

1.一种葡萄球菌肠毒素C化学发光酶联免疫分析检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的内容物包括：

1)化学发光酶联板，该化学发光酶联板的各孔包被有抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体；

2)辣根过氧化酶标记的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C检测抗体溶液，是由辣根过氧化酶标记的小鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体；使用时用封闭溶液配制成1:16000的工作浓度；

3)金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准品溶液，该金黄色葡萄球菌肠毒素C系列标准品溶液的浓度分别为3.125pg/mL、6.25pg/mL、12.5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL和400pg/mL；

4)包被溶液、封闭溶液、洗涤液和化学发光液；其中：

所述包被溶液是1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L去离子水中的混合液，pH为9.5；

所述封闭溶液是每升溶液中含体积分数为0.05的小牛血清、pH7.50.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述洗涤溶液是含有体积分数0.05吐温-20，pH7.5、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；

所述化学发光溶液选择Pierce公司生产的ELISA超级发光液，A液与B液体积比为1:1的混合液；

所述各孔包被有抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体为FMU-SEC4单克隆抗体，所述化学发光酶联免疫板的各孔包被的抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体的浓度为2.5μg/mL；

所述辣根过氧化酶标记的小鼠抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体为FMU-SEC8单克隆抗体；

所述FMU-SEC4单克隆抗体与FMU-SEC8单克隆抗体的制备和筛选方法如下：

(1)采用8周龄BALB/c小鼠作为免疫动物，以金黄色葡萄球菌肠毒素C为免疫原，首次免疫剂量为50μg/mL，将免疫原溶于生理盐水和等体积福氏完全佐剂制成乳化剂，皮下多点注射；间隔3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次免疫，佐剂为福氏不完全佐剂；2～3周后进行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔免疫，腹腔注射7～10天后尾静脉采血测其效价，如小鼠血清效价达到要求加强免疫一次，剂量同上，不加佐剂；加强免疫3天后取脾制备成单个细胞悬液，采用常规杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选及克隆化，共得到26株抗金黄色葡萄球菌肠毒素C的单克隆抗体，分别命名为FMU-SEC1～FMU-SEC26；

(2)将得到的一组抗金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，逐一常规标记辣根过氧化物酶，分别将该组中未标记的单克隆抗体作为包被抗体，用包被缓冲液稀释至2.5μg/mL，将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，采用双抗体夹心ELISA两两配对方阵法确定最佳抗体配对；配对抗体的挑选方法是：选择检测相同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素C的光吸收值最高，且检测无检测抗原或无关抗原的光吸收值最低的配对抗体，具体步骤为：

A.96孔酶联板分别包被26株金黄色葡萄球菌肠毒素C单克隆抗体，4℃孵育过夜。

B.洗涤液充分洗板3次，分别加入用封闭溶液稀释的金黄色葡萄球菌肠毒素C标准品，浓度为浓度为0.01ng/mL，只加封闭溶液的孔设为空白对照孔，37℃孵育1h；

C.洗涤液充分洗板3次，按照方阵法排列分别加入26株辣根过氧化物酶标记的检测抗体，100μl/孔，形成26×26方阵，37℃孵育1h；

D.洗涤液充分洗板后，加入2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物显色液，100μl/孔，37℃孵育15min，用酶标仪检测405nm下的吸光度(OD)值；

经过抗体的配对筛选后，得到FMU-SEC4单克隆抗体和FMU-SEC8单克隆抗体。