CN101846675B

CN101846675B - 脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN101846675B
Application number: CN 201010137779
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 王明丽; 李京培
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2030-03-26
Also published as: CN101846675A

Abstract

本发明公开了一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，包被酶标反应板是将A型和C型脑膜炎奈瑟菌等量混合后全菌抗原包被包被酶标反应板，采用间接ELISA法方便快速地检出血清中特异性脑膜炎奈瑟菌IgM；试剂盒由脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成。本发明建立了敏感快速的ELISA抗体捕获血清中脑膜炎奈瑟菌特异性IgM抗体的方法，具有高特异性，高稳定性，主要供实验室研究和临床诊断使用。

Description

脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及脑膜炎奈瑟菌的检测，具体是一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒。

背景技术

脑膜炎奈瑟菌是一种革兰氏阴性双球菌，通过呼吸道传染引起的流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是一种对人类危害严重的传染性疾病，此外还可引起菌血症、肺炎、关节炎、结膜炎、心肌炎、泌尿系统等多种炎症，曾在全球引起多次大流行，在我国几乎每年都有发生，主要在春季或冬春之交易造成流行，是一种常见和多发疾病。脑膜炎奈瑟球菌可分为A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W 135共13个血清群，对人类致病的多属A、B、C群，其他类群在带菌者中经常发现，但很少致病。我国的流脑流行菌群仍以A群为主，但近年来也发现在某些地区出现C群以及一些新的血清群。

人群中的绝大多数人对脑膜炎奈瑟球菌易感，该菌可寄生于正常人的鼻咽腔内，处于这种寄生状态的细菌并不导致任何病理变化，亦不引起任何疾病症状。这种带菌状态可以持续1周到数月之久，这种处于潜伏感染状态的带菌者在人群中的比例可高达50％～85％，人群中的带菌者是造成流行性脑脊髓膜炎流行的最重要的传染源，由于脑膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群较为密集的场所，容易造成细菌的高效率的传播，特别是在儿童、中小学生为最易感人群，极易在短时间内造成儿童发病流行，所以，控制人群中的带菌者传染源成为控制流脑流行的重要环节之一。

目前国内市场上脑膜炎奈瑟菌的各种免疫诊断试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给脑膜炎奈瑟菌的预防和诊治造成严重障碍。目前虽有国外试剂商提供同类商品化诊断试剂盒用于检测，但是此种试剂盒价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。本发明将A型和C型脑膜炎奈瑟菌等量混合后全菌抗原包被包被酶标反应板，采用间接ELISA法方便快速地检出血清中特异性脑膜炎奈瑟菌IgM抗体，该检测结果与美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒一致性高，灵敏度为95％，特异度为99.5％。

发明内容

本发明提供了一种脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒，为临床诊断流行性脑脊髓膜炎提供快速、准确、简便的检测工具。

本发明的技术方案为：

脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、在96孔酶标板的每孔内加入0.1M NaHCO₃稀释的5％戊二醛200μl，于37℃温箱中放置60-70分钟，然后用去离子水洗涤96孔酶标板3-5次，甩干，备用；

(2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按1∶1000的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105μl；然后于37℃温箱中烘干20-25小时；

(3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200μl用PBS稀释的10％小牛血清的填满，然后于35-38℃下封闭1-2小时，得到抗原包被酶标反应板。

所述的脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于：所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为2×10⁹cfu/ml。

应用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、底物液、终止液构成，具体组份为：

(1)、标本稀释液：含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液；

(2)、洗涤液：含有0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液；

(3)、酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；

(4)、底物液：TMB-H₂O₂尿素溶液；

(5)、终止液：2mol/L H₂SO₄溶液。

所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述的标本稀释液中2％抗人IgG的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液是由NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4制得；

所述的洗涤液是由NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、Tween-200.5ml、硫柳汞0.1g、加双蒸水至1000ml，调至pH7.4制得；

所述的底物液是经200mg 3、3‘、5、5‘-四甲基联苯胺、100ml无水乙醇、加双蒸水至1000ml得底物液A；Na₂HPO₄14.60g、柠檬酸9.33g、0.75％过氧化氢尿素6.4ml、加双蒸水至1000ml，调至pH5.05.4得底物液B；将底物液A和底物液B按1∶1-1.2的体积比混合制得；

所述的终止液是由100ml浓硫酸缓慢滴加引入600ml双蒸水中不断搅拌，然后加双蒸水至900ml制得。

本发明试剂盒的检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgM ELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为95％，特异度为99.5％。

具体实施方式

(1)、试剂

包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，Na₂N₃ 0.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6；

标本稀释液(含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4)，PBS：NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4，即得；

封闭液：(10％小牛血清/PRS溶液)小牛血清100ml，1×PBS(pH7.4)900ml；

洗涤液(PBST，pH7.4)：NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl0.2g、Tween 200.5ml、硫柳汞0.1g、加双蒸水至1000ml，调至pH7.4；

酶标二抗(HRP*鼠抗人IgM单抗)：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；

底物液(TMB-H₂O₂尿素溶液)：

①底物液A(3、3‘、5、5‘-四甲基联苯胺，TMB)：TMB200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml；

②底物液B缓冲液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0～5.4)：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调至pH5.0-5.4；

③「将底物液A和B按1∶1混合，即成TMB-H₂O₂尿素溶液。

终止液：(2mol/L H₂SO₄溶液)：双蒸水600ml，浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。

(2)、主要仪器

酶标仪：BIO-RAD Model 550；ELISA反应板：Corning Incorporated costarR 96 Well EIA/RIA plate。

(3)、方法

酶标二抗最适滴度的选择：

取96孔酶标板一块，用100ng/ml人IgM 100μl/孔4℃包被过夜，洗涤液洗板3次，350μl/孔，甩干；

将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，100μl/孔，37℃孵育40min，后用洗板3次，350μl/孔，甩干；

加底物显色，每孔加入底物液100μl，37℃或室温避光显色15分钟；后加入终止液50μl终止反应、，在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标二抗的最适滴度为1∶1000。

棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度：

取96孔酶标板一块；每孔加入0.1mol/L的NaHCO₃稀释的5％戊二醛200μl，37℃温箱放置1小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟菌A与C型(2×10⁹cfu/ml)等体积混合后，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔100μl；37℃温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200μl PBS稀释的10％小牛血清37℃封闭1.5小时，得到梯度稀释抗原包被酶标反应板；

将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用标本稀释液按1∶100倍稀释，加样，保温，洗涤。

加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。

加底物显色，加酸终止反应后在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值；

选择强阳性参考血清的A值为0.8-1.0间、阴性参考血清的A值小于0.2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被脑膜炎奈瑟菌全菌抗原的稀释度为2×10⁵cfu/ml，100μl/孔。

脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被反应板的制备方法：

取96孔酶标板一块；每孔加入0.1mol/L的NaHCO₃稀释的5％戊二醛200μl，37℃温箱放置1小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟球菌A与C型(2×10⁹cfu/ml)等体积混合后，用包被液1∶1000稀释包板，每孔100μl；37℃温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200μl PBS稀释的10％小牛血清37℃封闭1.5小时，得到抗原包被酶标反应板；

脑膜炎奈瑟菌IgM型ELISA检测试剂盒，由上述脑膜炎奈瑟球菌全菌包被酶标反应板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、底物液、终止液及参考血清构成。

具体分为：

标本稀释液：含10％小牛血清和2％抗人IgG的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；

洗涤液：含有0.05％Tween 20的0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)；

酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；

底物液：TMB-H₂O₂尿素溶液；

终止液：2mol/L H₂SO₄溶液。

利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中脑膜炎奈瑟菌IgM抗体：

(1)待检血清，加入用标本稀释液1∶100稀释的待检血清到包被好的酶标反应板，100μl/孔，同时另设两孔分别加入强阳性参考血清和阴性参考血清100μl/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗板3次，350μl/孔，甩干；

(2)加酶标物，加入HRP(辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IgM单抗，100μl/孔，37℃孵育40min，洗涤液洗板3次，350μl/孔，甩干；

(3)显色，用洗涤液洗板后每孔加入底物液100μl，37℃或室温避光显色15分钟；

(4)每孔加入终止液50μl，终止反应；

(5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即OD₄₅₀值，强阳性参考血清的A值需≥0.8、阴性参考血清的A值需＜0.2则证明试剂盒结果正确。

(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N≥2.1为阳性，P/N＜2.1为阴性。

特异性实验：

以脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、麻疹病毒IgM阳性血清、风疹病毒IgM阳性血清、人巨细胞病毒阳性血清和脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阴性血清采用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板ELISA试剂盒检测，P/N值分别为6.23、1.22、1.15、1.27和1.06，说明该试剂盒特异性良好。

重复性实验：

随机抽取20份脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性、阴性血清分别于不同的时间进行ELISA重复检测，同一份血清检测结果的P/N值上下浮动均不超过0.05，变异系数均＜5％，证明该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。

临床标本检测：

采用美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒检测474例正常人血清血清，其中IgM抗体阳性40例，阴性434例，采用脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板法检测结果与R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒相比灵敏度为95％，特异度为99.5％。

表1两种试剂盒IgM检测结果比较

计算灵敏度＝95％，特异度＝99.5％。

Claims

1.脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按1∶1000的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105μl；然后于37℃温箱中烘干20-25小时；包被液为0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，由Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，Na₂N₃ 0.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH9.6制得；

2.根据权利要求1所述的脑膜炎奈瑟菌全菌抗原包被酶标反应板的制备方法，其特征在于：所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为2×10⁹cfu/ml。