CN103439491B - 一种制备透明质酸化学发光定量测定试剂盒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法，用来测定人血清及其他体液中的透明质酸的含量，其组份包括透明质酸校准品、透明质酸-巯基磁珠连接物试剂、酶结合物、化学发光底物和清洗液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法，本发明试剂盒将透明质酸包被巯基磁珠和化学发光技术相结合，使反应处在近均相的体系中，使反应时间较其他透明质酸试剂盒明显缩短，并且试剂盒的性能指标更为优异。

Description

一种制备透明质酸化学发光定量测定试剂盒的方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种透明质酸化学发光定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，下文简写为HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成线形多糖结构，由间质细胞合成，经淋巴循环进入血液，半衰期为2.5-5.5分钟，由特异性的透明质酸酶水解，代谢部位主要在肝脏。研究发现，肝组织病理的变化与血清中透明质酸的浓度变化密切相关，因此，通过检测血清中透明质酸含量的变化可以检验肝组织受损程度。

透明质酸的线性多糖重复结构使它的分子量分布很宽，对于透明质酸的分析检测己知的方法有很多，包括分光光度法、荧光分析法、凝胶高效液相层析法、电化学分析法、共振瑞利散射法和免疫分析法等，其中免疫分析法由于其灵敏度高、特异性强、对临床样本适用性强等特点而在各种方法中脱颖而出，在临床的透明质酸检测中得到了广泛的应用。

免疫分析法也有多种检测原理和方式，最初HA的免疫检测是使用放射免疫，但很快由于放射免疫的污染、操作复杂等局限性而被酶联免疫法和化学发光免疫法所取代，目前市场上的透明质酸检测试剂盒最常见的检测方式为免疫竞争法检测(无论是酶联免疫还是化学发光免疫)，具体步骤一般是：将待测样本中加入到包被有透明质酸的微孔板中，再加入一定量透明质酸结合蛋白(Hyaluronic acid binding protein，下文简写为HABP)，微孔板上包被的透明质酸和样本中待测的透明质酸竞争与HABP结合，形成固相HA-HABP复合物，再加入酶标记的抗HABP的抗体进行反应，形成固相HA-HABP-抗HABP抗体-酶的复合物后最后加入底物测定发光值或者吸光值，最后通过定标液曲线测定样本浓渡。这种方法主要存在如下两个问题：

1)在固相载体(例如微孔板)上包被HA，所采用的方式是将HA与大分子蛋白(例如：牛血清白蛋白，下文简写为BSA)连接形成复合物，利用96孔板吸附大分子蛋白的特性在96孔板上包被HA-蛋白复合物，由于HA属于线性多糖结构，在与大分子蛋白连接后，HA的特征性结构会很大程度上被大分子蛋白所包裹，影响它与HABP结合的亲和力和稳定度，对检测灵敏度造成影响；

2)为保证各组份之间反应完全，需要将HABP及抗HABP抗体分步加入，存在反应体系中参与反应的成份多、检测步骤繁琐、检测时间长的缺陷，同时试剂灵敏度和稳定性也受反应步骤多、反应体系成份多的影响进一步降低。

除了上文介绍的最常见的透明质酸免疫竞争法之外，近年来透明质酸免疫检测方法还有：

1)将铕标记引入免疫竞争法体系的透明质酸检测方法：

专利CN102095847A公开了一种一步法检测血清、体液或组织匀浆中透明质酸(HA)含量的方法：在固相载体(例如96孔微孔板)上包被HA-BSA，在HABP上标记铕(Eu³⁺)，反应体系中与样本中的HA共同与限量的HABP-Eu³⁺在适宜的条件下进行竞争性结合反应，形成一种HA-HABP-Eu³⁺结合物。校准品或样本中HA含量越高，在包被板上形成的HA-HABP-Eu³⁺结合物就越少。加样时只需向微孔中连续加入样本及HABP-Eu³⁺，反应1小时即可完成。Eu³⁺的荧光强度随样本中HA浓度的增加而减少，因此可以计算出HA的准确含量。此专利通过一步法克服了上述常见免疫竞争法的方法的第2个问题，即步骤繁琐、时间长、反应体系成份多，但仍未解决第1个问题，即HA与大分子BSA连接后再包被所造成的HA特征性结构被包裹降低灵敏度的问题。

文献《时间分辨荧光免疫分析检测血清透明质酸方法的建立和临床应用》(《中华检验医学杂志》，2006年6月第29卷第6期，p533～534)中也介绍了采用铕标记的试剂盒，但与专利中的区别是，在文献中铕标记的是HA-BSA，包被的是羊抗兔多抗，同时文献方法在实验过程中未使用一步法，而需要 加入兔源抗HABP抗体，再加入HABP，再加入待测样品，反应步骤极其复杂，因此常见免疫竞争法的两个缺点此方法均存在。

2)将HABP和抗HABP酶连接物合并反应成HA酶结合物，引入免疫竞争法体系的透明质酸检测方法：

专利CN102692408A中公开了一种一步法检测透明质酸的方法，其反应原理为：预先在固相载体(例如96孔微孔板)上包被HA-BSA，再一次加入校准品或样品和HA酶结合物，反应过程中固相包被HA与样本中HA共同与限量的HABP-anti-HABP-HRP进行竞争性结合反应，经过一定的反应温度和反应时间，经洗涤除去某些游离成分，最终在固相板上形成HABP-anti-HABP-HRP的复合物。校准品或样品中的HA含量越高，在包被板上形成的复合物就越少，因此可以通过测定光子数计算出样本中HA的准确含量。该方法为一步法，其实质是将HABP与anti-HABP-HRP这两种组份按一定比例提前反应合并成了一个组份。该方法仍存在透明质酸常见免疫竞争法的第1个问题，并且仅部分解决了透明质酸常见免疫竞争法的第2个问题，解决了分步加入HABP和抗HABP抗体的问题，但反应体系成份仍很复杂。

3)用免疫夹心法替代免疫竞争法的透明质酸检测方法：

在专利CN101533028A中，作者描述了一种夹心法检测HA含量的方法，其原理如下：HA与标记生物素的HA抗体结合形成生物素HA抗体-HA复合物，然后与标记酶的HABP形成生物素HA抗体-HA-酶标HABP的复合物，最终复合物通过生物素与固相包被亲和素进行连接。校准品或样品中的HA含量越高，在包被板上形成的复合物就越多，因此可以通过测定光子数计算出样本中HA的准确含量。该方法中不含有HA-BSA，因此不存在竞争法的第1个问题，但依然有如下缺陷：1、HA是线性多糖重复结构，其分子量变化范围很大，其中小分子量的HA分子无法同时结合两种蛋白(在本方法中分别是HABP和抗透明质酸抗体)，将无法被检测到。2、生物素标记HA抗体与酶标HABP在结合HA时存在竞争关系，不能同时加入，不是一步法，导致反应步骤仍比较繁琐、反应时间较长。

文献《人血清透明质酸夹心化学发光免疫检测方法的建立》(《中国医药生物技术》，2012年10月第7卷第5期，p346～351)中描述了另外一种夹心法，将HABP既用于包被固相载体，也用于连接辣根过氧化物酶，在检测时，可形成HABP-HA-酶标HABP复合物，加入化学发光底物在酶的作用下发光，通过测定光子数计算出样本中HA的准确含量。此方法有如下缺陷：1、HA是线性多糖重复结构，其分子量变化范围很大，其中小分子量的HA分子无法同时结合两种蛋白(在本方法中分别是HABP和HABP)，将无法被检测到；2、HABP多用，结合位点一样，会进一步造成部分有多个结合位点的HA无法同时与固相载体上的HABP和酶标HABP反应，结果不准确。

综上所述，现存文献和专利中描述的透明质酸免疫检测方法主要有以下不足：

1.现存免疫竞争法的不足：

1)目前专利或文献中的检测方法中均未提供HA直接与固相载体或酶连接的方法，HA在被使用前都需大分子蛋白质相连，这种方式有以下2种缺陷：

a)HA与蛋白相连后导致抗原特异性和与HABP及抗HA抗体之间的亲和力受到影响，主要原因如下：首先，HA为线性分子，且分子量大小不一，而蛋白为肽链经过折叠后的结构复杂的大分子，当两者偶联时，必然会有一部分HA分子受到蛋白分子的包裹而导致HA活性基团不能完全暴露，进而影响其与HABP的结合；其次，蛋白分子结构一般较为复杂，因此可能会引起与HABP的非特异性结合，进而会影响试剂灵敏度和检测结果准确性；

b)HA分子大小不一，而大分子HA与小分子HA偶联蛋白时所暴露出的活性基团数目是不一样的，因此每一批次进行偶联时都会有较大的批间差。

2)除了其中的铕标记的一步法，反应体系组份较简单外，其它竞争法的反应体系组份均很多，导致反应步骤繁琐，反应时间长。

2.现存免疫夹心法的不足：

对于HA这种线性多糖重复结构、分子量变化范围很大的物质，采用夹心法原理的硬伤在于：必然会存在小分子量、没有多个结合位点的HA分子无法同时与固相载体和酶或标记物两边结合，导致 其无法被检测到。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：弥补上述现有技术的不足，提出一种检测透明质酸化学发光试剂盒及其制备方法，该试剂盒具有灵敏度更高、反应时间更短，适用于各种发光仪器等特点。

本发明的技术问题通过以下技术方案予以解决：

本发明提供了一种一步法测定人血清或其他体液中的透明质酸(HA)含量的磁微粒化学发光试剂盒，包括以下组份：1)HA校准品；2)HA-巯基磁珠连接物试剂；3)酶结合物；4)化学发光底物；5)清洗液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述的HA校准品含有经过准确定值的HA抗原。

根据本发明的试剂盒，其中，所述的HA-巯基磁珠连接物试剂的主要成份是HA偶联巯基磁珠连接物。

根据本发明的试剂盒，其中，所述的巯基磁珠粒径为1μm-4.5μm，表面活性基团为巯基(-SH)。

根据本发明的试剂盒，其中，所述的酶结合物的主要成份是碱性磷酸酶标记的HABP。

根据本发明的试剂盒，其中，所述的化学发光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐)，简称AMPPD。

本发明提供了一种制备上述透明质酸磁微粒化学发光试剂盒的方法，包含以下几个步骤：

1)配制透明质酸校准品；

2)将透明质酸连接到巯基磁珠上制备连接物，用磁珠缓冲液稀释连接物到一定浓度，制备出连接物试剂；

3)用酶标记透明质酸结合蛋白，制备酶结合物；

4)配制化学发光底物；

5)配制清洗液； 

6)分装以上各试剂，组成成品。

根据本发明的方法，优选，HA-巯基磁珠试剂的制备过程包括以下步骤：

1)准确称取透明质酸5mg，溶解于纯水中，终浓度为0.5mg/ml；

2)在上一步的透明质酸溶液中加入1M NaOH溶液使溶液pH达到10±0.1，室温水解8-10小时，将透明质酸分子中的酰胺基进行水解，使其暴露出伯氨基(-NH₂)基团，反应过程中充分混匀；

3)将反应后的透明质酸溶液用透析袋透析2小时，除去溶液中的NaOH，然后浓缩至约2mg/ml；

4)按照如下方法配制pH＝7.0的50mmol/l的磷酸盐缓冲液：称取NaH₂PO₄·H₂O2.69g，Na₂HPO₄·2H₂O5.43g，NaCl5.85g，加入800ml纯化水，用1M盐酸或氢氧化钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

5)配制10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解；

6)将浓缩后的透明质酸溶液中加入50μl10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)进行活化，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

7)量取5mg巯基磁珠，将巯基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为25mg/ml；

8)将活化后的透明质酸溶液加入清洗后的巯基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为2mg/ml，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

9)按照如下方法配制磁珠缓冲液：称取Tris碱12.11g，NaCl8.78g，0.5ml吐温-20，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1。加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

10)反应完成后移除上清，用50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存。使用时用磁珠缓冲液稀释100倍即为工作液，浓度为0.05mg/ml。

根据本发明的方法，优选，酶结合物的制备过程包括如下步骤：

1)取碱性磷酸酶0.5mg，将浓度调整为5mg/ml；

2)称取2mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，终浓度为10mg/ml，加入5μl至碱性磷酸酶中，室温(17-23℃)反应20分钟；

3)用分子筛层析法根据分子量的差别对反应混合物进行纯化，收集活化后的碱性磷酸酶溶液；

4)取纯品HABP0.5mg，加入活化后的碱性磷酸酶缓冲液中，2-8℃反应4h，最后用分子筛层析法将酶标记的HABP提纯出来； 

5)酶结合物缓冲液配制：称取Tris12.11g，NaCl8.78g，5g甘油，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1。加入10gBSA，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

6)将结合物用酶结合物缓冲液稀释至酶标记的HABP浓度为1μg/ml即为工作液。

根据本发明的方法，优选，发光底物的配制过程包括以下步骤：

准确称取AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐)1g，Tri s24g，氯化钠(NaCl)160g，CTAC0.0255g，纯化水定溶至1000ml，调整化学发光底物溶液pH值为9.7±0.05。本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要在2-8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。

根据本发明的方法，优选，清洗液的配制方法如下：

称取Tris1211.4mg，NaCl9g，吐温-201g，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用1M盐酸溶液调整溶液pH值到8.0±0.1，补加纯化水定容至1000ml，过滤后待用。

上述本发明的试剂盒中，首先通过发光值与校准品浓度值的拟合得出标准曲线，然后通过样本发光值在标准曲线上得出相应浓度值。

本发明试剂盒反应原理为竞争法，具体如下：先加入样本或者校准品，然后连续加入透明质酸偶联磁珠和碱性磷酸酶标记的HABP，反应过程中样本中HA与磁珠偶联的HA竞争结合碱性磷酸酶标记的HABP，反应完成后放置于磁板上进行分离，使得磁珠-HA-HABP-碱性磷酸酶复合物最终进行富集，样本中HA浓度越高，磁珠-HA-HABP-碱性磷酸酶复合物就越少，加入化学发光底物后发光值也就越低。

本试剂盒的突出技术优势具体在于：在常见免疫竞争法的基础上研发了HA与固相载体直接稳定连接的方法，既可保证与固相载体连接的稳定性、又能保证HA分子得到充分暴露，同时还通过引入磁性微粒扩大有效反应面积、用碱性磷酸酶替代常用的辣根过氧化物酶、使用碱性磷酸酶对应的化学发光底物的方式，建立了灵敏度更高、反应时间更短、对于不同分子量的HA均能识别并检测的HA化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

具体实施方式

实施例1：制备本发明的透明质酸化学发光定量测定试剂盒

一、HA校准品的制备：

1)校准品缓冲液的配制：

配制过程如下：称取Tris碱6.06g，NaCl8.78g，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.0±0.1。加入5g BSA，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1。0.22μm过滤后于2-8℃保存。

2)将HA纯品粉末用校准品缓冲液溶解，配制成为100μg/ml的浓溶液，随后依次稀释出5个浓度，分别为：20，80，320，640，1600ng/ml。加上0点，共6个浓度的校准品梯度值。

二、HA-巯基磁珠连接物试剂的制备：

1)准确称取透明质酸5mg，溶解于纯水中，终浓度为0.5mg/ml；

2)在上一步的透明质酸溶液中加入1M NaOH溶液使溶液pH达到10±0.1，室温水解8-10小时，将透明质酸分子中的酰胺基进行水解，使其暴露出伯氨基(-NH₂)基团，反应过程中充分混匀；

3)将反应后的透明质酸溶液用透析袋透析2小时，除去溶液中的NaOH，然后浓缩至约2mg/ml；

4)按照如下方法配制pH＝7.0的50mmol/l的磷酸盐缓冲液：称取NaH₂PO₄·H₂O2.69g，Na₂HPO₄·2H₂O5.43g，NaCl5.85g，加入800ml纯化水，用1M盐酸或氢氧化钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

5)配制10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解；

6)将浓缩后的透明质酸溶液中加入50μl10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)进行活化，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

7)量取5mg巯基磁珠，将巯基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为25mg/ml；

8)将活化后的透明质酸溶液加入清洗后的巯基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为2mg/ml，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

9)按照如下方法配制磁珠缓冲液：称取Tris碱12.11g，NaCl8.78g，0.5ml吐温-20，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1。加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存。

10)反应完成后移除上清，用50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存。使用时用磁珠缓冲液稀释100倍即为工作液，浓度为0.05mg/ml。

三、HABP碱性磷酸酶结合物的制备：

1)取碱性磷酸酶0.5mg，将浓度调整为5mg/ml；

2)称取2mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，终浓度为10mg/ml，加入5μl至碱性磷酸酶中，室温(17-23℃)反应20分钟；

3)用分子筛层析法根据分子量的差别对反应混合物进行纯化，收集活化后的碱性磷酸酶溶液；

4)取纯品HABP0.5mg，加入活化后的碱性磷酸酶缓冲液中，2-8℃反应4h，最后用分子筛层析法将酶标记的HABP提纯出来； 

5)酶结合物缓冲液配制：称取Tris12.11g，NaCl8.78g，5g甘油，1g迭氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1。加入10gBSA，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

6)将结合物用酶结合物缓冲液稀释至酶标记的HABP浓度为1μg/ml即为工作液。

四、发光底物的制备：

准确称取AMPPD1g，Tris24g，NaCl160g，CTAC0.0255g，纯化水定溶至1000ml，调整化学发光底物溶液pH值为9.7±0.05。本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要在2-8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。

五、清洗液的制备：

称取Tris1211.4mg，NaCl9g，吐温-201g，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用1M盐酸溶液调整溶液pH值到8.0±0.1，补加纯化水定容至1000ml，过滤后混匀待用。

实施例2：本发明的透明质酸化学发光定量测定试剂盒的具体的检测步骤为：

1)向平底试管中加入30μl样本或者校准品；

2)向平底试管中加入30μl磁分离试剂；

3)向平底试管中加入60μlHABP碱性磷酸酶结合物；

4)将平底试管放置在涡旋混匀仪上混匀30秒，然后置于37℃反应30分钟；

5)将平底试管放置在磁架上静置2分钟后倒掉上清，拍干，加入清洗液300μl，混匀30秒；

6)重复步骤5两次；

7)将拍干的平底试管放入免疫分析仪中进行检测。

实施例3：本发明的透明质酸化学发光定量测定试剂盒的性能指标测定按照本领域常规制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见表1：

表1

说明本发明试剂盒的各项指标(剂量-反应曲线线性，准确度，灵敏度，精密度，特异性)完全合格。

实施例4：本发明透明质酸化学发光测定试剂盒的参考值范围的确定：

医学上参考值(范围)系指正常人的解剖、生理、生化等各种指标的波动范围，它主要用于划分正常和异常的界限。在医疗卫生工作中，常需要检查一些指标，并以其结果确定被检者的该项指标是否属于正常范围。制定参考值(范围)常以正常人作为研究对象，正常人并不是指机体任何器官、组织的形态和机能无任何病症的人，而是排除了影响所研究指标的疾病和有关因素后，所确定的同质人群。

本次参考值(范围)的确定方法为非参数法，具体如下：

1)根据试剂盒的检测步骤先对收集的血清样本进行检测，记录检测结果。

2)对检测结果从小到大排序，进行离群值分析，剔除与整体样本差异较大的异常值(用D/R，1/3规则：D是指一个极端测量值(大的或小的)与紧邻的极端测量值(第二大或第二小的值)之间的绝对差值，R是指所有值的全距，即最大极值与最小极值的差值，如果一个极端值的D/R等于或大于1/3的话，该值应被剔除)。

3)剔除离群值后，将剩余样本的结果进行统计分析：首先确定参考值的可信限，本试剂盒定为95％，然后根据可信限和样本数量计算最高检测限的相应观测值，最高观测值r＝95％×(n+1)，n为剩余样本数量。

表2试剂盒参考范围结果

结果表明，本发明试剂盒参考范围为0-120ng/ml。

实施例5：本发明透明质酸化学发光测定试剂盒的样本测值相关性比较：

使用实施例1中制备的试剂盒与郑州安图绿科生物技术有限公司所生产的透明质酸化学发光试剂盒(批准文号：豫食药监械(准)字2009第2400036号)测定120例临床样本，其中阳性样本为82例、阴性38例。严格按照试剂盒说明书操作，对检验的结果进行t检验，相关性r和四格表统计分析，结果见表3：

表3本发明试剂盒与安图化学发光试剂盒结果一致性比较

Claims (5)

1.一种制备透明质酸化学发光定量测定试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)配制透明质酸校准品；

2)将透明质酸连接到巯基磁珠上制备连接物，用磁珠缓冲液稀释连接物到一定浓度，制备出连接物试剂；

3)用酶标记透明质酸结合蛋白，制备酶结合物；

4)配制化学发光底物；

5)配制清洗液；

6)分装以上各试剂，组成成品；

所述连接物试剂的制备过程包括以下步骤：

a1、准确称取透明质酸5mg，溶解于纯水中，终浓度为0.5mg/ml；

a2、在上一步的透明质酸溶液中加入1M NaOH溶液使溶液pH达到10±0.1，室温水解8-10小时，将透明质酸分子中的酰胺基进行水解，使其暴露出伯氨基(-NH₂)基团，反应过程中充分混匀；

a3、将反应后的透明质酸溶液用透析袋透析2小时，除去溶液中的NaOH，然后浓缩至约2mg/ml；

a4、按照如下方法配制pH＝7.0的50mmol/l的磷酸盐缓冲液：称取NaH₂PO₄·H₂O 2.69g，Na₂HPO₄·2H₂05.43g，NaCl 5.85g，加入800ml纯化水，用1M盐酸或氢氧化钠将pH值调节至7.0±0.1，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

a5、配制10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解；

a6、将浓缩后的透明质酸溶液中加入50μl 10mg/ml的磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)进行活化，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

a7、量取5mg巯基磁珠，将巯基磁珠放置于磁架上静置2分钟，移除上清，用pH＝7.0的50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入磷酸盐缓冲液保存，使磁珠浓度为25mg/ml；

a8、将活化后的透明质酸溶液加入清洗后的巯基磁珠中，并将反应液中磁珠浓度调整为2mg/ml，室温反应30分钟，反应过程中充分混匀；

a9、按照如下方法配制磁珠缓冲液：称取Tris碱12.11g，NaCl 8.78g，0.5ml吐温-20，1g叠氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1，加入1g干酪素钠，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

a10、反应完成后移除上清，用50mmol/l磷酸盐缓冲液洗涤三次后加入1ml磁珠缓冲液进行保存，使用时用磁珠缓冲液稀释100倍即为工作液，浓度为0.05mg/ml。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶结合物的制备过程包括以下步骤：

b1、取碱性磷酸酶0.5mg，将浓度调整为5mg/ml；

b2、称取2mg磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)，用二甲基亚砜(DMSO)进行溶解，终浓度为10mg/ml，加入5μl至碱性磷酸酶溶液中，17-23℃反应20分钟；

b3、用分子筛层析法根据分子量的差别对反应混合物进行纯化，收集活化后的碱性磷酸酶溶液；

b4、取纯品HABP 0.5mg，加入到活化后的碱性磷酸酶溶液中，2-8℃反应4小时，最后用分子筛层析法将酶标记的HABP提纯出来；

b5、酶结合物缓冲液配制：称取Tris12.11g，NaCl 8.78g，5g甘油，1g叠氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.4±0.1，加入10gBSA，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.4±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

b6、将结合物用酶结合物缓冲液稀释至酶标记的透明质酸结合蛋白浓度为1μg/ml即为工作液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物的配制包括以下步骤：

准确称取AMPPD(3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐)1g，Tris24g，氯化钠160g，CTAC 0.0255g，纯化水定溶至1000ml，调整化学发光底物溶液pH值为9.7±0.05。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准品的制备过程包括以下步骤：

c1、校准品缓冲液的配制：

称取Tris碱6.06g，NaCl 8.78g，1g叠氮钠，加入800ml纯化水，用4mol/l盐酸将pH值调节至7.0±0.1，加入5g BSA，定容至1000ml后复测pH值，使之处于7.0±0.1，0.22μm过滤后于2-8℃保存；

c2、将HA纯品粉末用校准品缓冲液溶解，配制成为100μg/ml的浓溶液，随后依次稀释出5个浓度，分别为：20，80，320，640，1600ng/ml，加上0点，共6个浓度的校准品梯度值。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗液的制备过程包括以下步骤：

称取Tris 1211.4mg，NaCl 9g，吐温-20 1g，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用1M盐酸溶液调整溶液pH值到8.0±0.1，补加纯化水定容至1000ml，过滤后混匀待用。