ES2326721B1 - Conjugado de acido hialuronico para el tratamiento cosmetico y procedimiento de preparacion. - Google Patents
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Abstract
Conjugado de ácido hialurónico para el
tratamiento cosmético y procedimiento de preparación.
La presente invención describe un nuevo
compuesto conjugado que comprende al menos un oligómero de HA
derivatizado a través de un linker tiolado, por el que se une a al
menos una nanopartícula metálica, como por ejemplo una
nanopartícula de oro. Asimismo, se describen procedimientos para su
obtención, así como su uso en un tratamiento cosmético, y
composiciones cosméticas que los contienen.
Description
Conjugado de ácido hialurónico para el
tratamiento cosmético y procedimiento de preparación.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto conjugado de ácido hialurónico y una nanopartícula
metálica, así como a un procedimiento para su obtención. Asimismo
la invención se refiere a su uso en tratamientos cosméticos.
El ácido hialurónico o HA, es un
glicosaminoglicano natural muy abundante en todos los tejidos
mesodérmicos, en el humor vítreo y en la gelatina de Wharton del
cordón umbilical. Está presente en la matriz intercelular de los
tejidos, en los diferentes tejidos de todas las especies animales y
desempeña una importante función en la estructura de la piel,
siendo responsable de la elasticidad de la misma. Tiene la capacidad
de retener a su alrededor una gran cantidad de agua aportando
volumen a los tejidos.
Su estructura consiste en unidades de disacárido
alternantes de ácido D-glucurónico y
N-acetil-D-glucosamina
unidos por enlaces glicosídicos
\beta-1-3 y
\beta-1-4. A diferencia de otros
polisacáridos, el HA no tiene una forma definida en el espacio,
sino que se extiende aleatoriamente tendiendo a ocupar un volumen
muy grande debido a la repulsión electrostática de los grupos
carboxilo del ácido glucurónico. Al mismo tiempo, forma mallas que
retienen una gran cantidad de agua.
El HA tiene un papel decisivo como elemento
conjuntivo de los tejidos. En la piel se concentra cerca del 56%
del HA existente en el cuerpo. La dermis corporal posee una red
entramada de fibras de colágeno dentro de una sustancia
intersticial cuya composición está ampliamente constituida por HA.
Las propiedades elásticas de este ácido proporcionan resistencia
contra la compresión, y es así como la piel protege las estructuras
subyacentes contra las agresiones externas, a la vez que las
propiedades no-Newtonianas del HA permiten que las
fibras de colágeno se muevan fácilmente a través de la sustancia
intersticial. Este proceso de lubricación mediante HA permite que
la piel se adapte a las alteraciones de forma y volumen que tienen
lugar cuando se mueven los huesos y los ligamentos.
Cuando envejecemos, disminuye la cantidad de HA
(HA) de la piel, dado que las células cutáneas van perdiendo su
capacidad de producción. Además, el peso molecular del HA disminuye
con la edad, de tal modo que ya no conserva el agua, como lo hacía
anteriormente. Esta reducción de volumen es la que da origen a las
arrugas. Se estima que a la edad de 40 años la cantidad de HA en
piel se ha reducido a la mitad. Después de los 60 solo queda un
10%.
El HA se utiliza en cosmética desde 1996, puede
ser de origen animal (de la cresta de las gallinas y del globo
ocular de los peces) o de origen biológico (extractos de cultivo de
bacterias). El HA es el responsable de la elasticidad de la piel.
Es un gran remedio contra las arrugas, pues aumenta el volumen en
pliegues, surcos y depresiones cutáneas. Su aplicación periódica
provoca la regeneración del colágeno propio. La ventaja de este
producto es que es una sustancia compatible con todos los tejidos,
por lo tanto no requiere de ningún tipo de prueba cutánea como
ocurre con el colágeno.
Se conocen tratamientos cosméticos en el estado
de la técnica a base de HA. Sin embargo, la aplicación cosmética de
HA, conlleva la pérdida de la conformación del HA, y como
consecuencia la disminución de la estabilidad y de la capacidad de
retener agua.
Por tanto sigue existiendo la necesidad en el
estado de la técnica de proporcionar nuevos compuestos de HA que
mejoren el tiempo de vida y la estabilidad del HA para su
utilización en tratamientos cosméticos.
En este sentido los inventores han descubierto
sorprendentemente que la conjugación de oligómeros de HA de a la
superficie de una nanopartícula metálica a través de un linker,
mejora las propiedades de estructura física, estabilidad y
durabilidad, y en general las propiedades de penetración
transdérmica. La aplicación cosmética de este conjugado proporciona
por tanto un efecto sobre la piel rellenador de arrugas, eficaz y
duradero, que puede sustituir a otros tratamientos menos
eficaces.
Figura 1: representa un modelo ilustrativo de un
compuesto conjugado de la invención, que comprende una nanopartícula
metálica y 2 oligómeros (de 6-mer) de
tiopropionilhidrazida-HA, en el que cada uno de los
oligómeros está derivatizado a través de un enlace químico amida, y
en la que cada linker une cada oligómero de HA a la nanopartícula
metálica.
Figura 2: representa un modelo ilustrativo de un
compuesto conjugado que contiene una nanopartícula metálica y 2
oligómeros de HA (de 4-mer), en la que cada uno de
los oligómeros está derivatizado en las posiciones ácido
carboxílico con dos linkers, los cuales unen cada oligómero de HA a
la nanopartícula metálica.
Figura 3: representa un modelo ilustrativo de un
compuesto conjugado que consiste en 1 oligómero de
8-mer de HA derivatizado en las posiciones ácido
carboxílico a través de enlaces químicos amida con 4 linkers, los
cuales unen el oligómero a 1 nanopartícula metálica.
Figura 4: representa un modelo ilustrativo de un
compuesto conjugado que consiste en 1 oligómero de
8-mer conjugado a 4 nanopartículas metálicas.
Figura 5: muestra un esquema de un compuesto
conjugado que consiste en un oligómero de HA con n monómeros unidos
cada uno mediante un linker a una nanopartícula metálica.
Figura 6: imágenes de microscopía de transmisión
electrónica (TEM) capturadas con un microscopio electrónico de
transmisión Hitachi H-7000 con un voltaje de
aceleración de 75 Kv del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo
1.
Figura 7: espectros de absorción de
UV-Vis de una disolución de nanopartículas de oro y
del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 1, registrados con
un espectroscopio Shimadzu UV-240IPC. A representa
la absorbancia y \lambda la longitud de onda (nm).
Figura 8: representa el
potencial-Z registrado mediante un Zetasizer Nano
ZS, Malvern del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 1, donde
I representa la intensidad y zeta representa el potencial en mV.
Figura 9: esquema de un oligómero HA
2-mer de n monómeros derivatizado a través de un
enlace amida con tiopropionilhidrazida.
Figura 10: Imágenes de microscopía de
transmisión electrónica (TEM) capturadas con un microscopio
electrónico de transmisión Hitachi H-7000 con un
voltaje de aceleración de 75 Kv del compuesto conjugado obtenido en
el Ejemplo 3.
Figura 11: espectros de absorción de
UV-Vis de una disolución de nanopartículas de oro y
de un compuesto conjugado según la invención (Ejemplo 3)
registrados con un espectroscopio Shimadzu
UV-240IPC. A representa la absorbancia y \lambda
la longitud de onda (nm).
Figura 12: representa el
potencial-Z registrado mediante un Zetasizer Nano
ZS, Malvern del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 3, donde
I representa la intensidad, y zeta representa el potencial en
mV.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto de la presente invención se refiere a
un nuevo compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica,
con la condición de que cuando el oligómero de
HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y la
nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es
distinto de
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-SH.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la presente invención se refiere
a diversos procedimientos de síntesis para la obtención del nuevo
compuesto conjugado.
Un objeto adicional se refiere a un compuesto
conjugado obtenible mediante uno de los procedimientos de síntesis
de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto adicional se relaciona con un
compuesto multiconjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, y
- al menos, una molécula conjugada a, al menos,
una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto adicional se refiere a una
composición cosmética, en adelante composición cosmética de la
invención, que comprende al menos un compuesto seleccionado
entre:
Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, y
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto multiconjugado de la invención,
junto con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto adicional se refiere al empleo de al
menos un compuesto seleccionado entre:
Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, y
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto multiconjugado de la invención, en
la elaboración de una composición cosmética para su aplicación
tópica o para su aplicación mediante inyección en la piel.
Un objeto adicional se refiere a un tratamiento
cosmético que comprende la aplicación tópica o inyectada de la
composición cosmética de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un primer aspecto, la invención
se relaciona, por tanto, con un nuevo compuesto conjugado que
comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica,
con la condición de que cuando el oligómero de
HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y la
nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es
distinto de
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-SH.
En el contexto de la invención el término
"linker" (enlazador) se refiere a una molécula orgánica que se
une de forma covalente a un oligómero de HA, como se explica más
adelante, y une dicho oligómero de HA con la nanopartícula
metálica. El linker en la presente invención contiene al menos un
átomo de azufre que se une a la nanopartícula metálica. El linker
puede tener en general diversas y numerosas estructuras químicas,
siempre que el linker cumpla su función de unir el oligómero de HA
y la nanopartícula metálica. Dichas estructuras pueden ser
variables y fácilmente reconocidas por un experto en la materia. En
una realización particular de la invención el linker presenta una
de las fórmulas generales que se describen más abajo.
El término "monómero" de HA en la presente
descripción se refiere a una unidad constituida por dos residuos
consecutivos de ácido D-glucurónico y
N-acetil-D-glucosamina unidos.
El término "mer" de HA en la presente
descripción se refiere a una unidad de sacárido, tratándose
indistintamente tanto de ácido D-glucurónico como de
N-acetil-D-glucosamina.
El término "polímero de HA" se utiliza en
la presente invención para referirse a un oligómero de HA natural,
que se obtiene de una fuente biológica natural, como por ejemplo las
citadas en los Antecedentes de la invención, y puede adquirirse de
diversas empresas que lo comercializan. En casos es evidente que
"polímero de HA" y "oligómero de HA" se refieren al mismo
compuesto, cuando tienen el mismo número de monómeros y estructura,
así como en ocasiones son iguales sus correspondientes derivados
"polímero de HA derivatizado" y "oligómero de HA
derivatizado". El empleo del término "polímero de HA" se
hace en la presente descripción por motivos de claridad, para
referirse al producto de partida de HA natural que se utiliza en la
invención para obtener los compuestos conjugados o multiconjugados
de la invención, en algunos de los procedimientos de la invención,
y que no ha sido sometido a hidrólisis enzimática como se describe
más adelante.
En la presente descripción términos en singular
tales como "un", "uno", "una", "el", "la" o
"del" se pueden referir en cada caso a la forma singular o
plural.
El compuesto conjugado puede presentar muy
diversas estructuras, propiedades, y en él pueden variar los
diversos parámetros que los caracterizan. Entre otros parámetros
cabe mencionar los siguientes: el tamaño de la nanopartícula
metálica, que puede ser a su vez, bien una nanopartícula o bien una
partícula núcleo-coraza y que puede comprender un
metal como se describe más abajo; el número de nanopartículas
metálicas en el compuesto conjugado que está generalmente
comprendido entre 1 y un número máximo que puede ser determinado en
cada caso mediante técnicas de caracterización física, y que
depende, entre otros factores del número total de linkers del
oligómero de HA; el peso molecular del oligómero de HA y por tanto
del número de monómeros de HA; el tipo de linker, es decir su
fórmula química, y el número de linkers que unen el oligómero de HA
a la nanopartícula metálica; y dependiendo del linker el tipo de
enlace químico que une covalentemente el oligómero de HA al linker
que puede ser amida, éster y éter. Asimismo, un compuesto conjugado
puede comprender más de un oligómero conjugado, con distintos
números de monómeros cada uno.
Como se desprende de la presente descripción son
muy numerosos los compuestos conjugados definidos en la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización particular de la
invención, el compuesto conjugado presenta una estructura que
comprende:
- a)
- una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en el que cada uno de los oligómeros de HA está derivatizado con un linker a través de un enlace químico, y en la que cada linker une cada oligómero de HA a la nanopartícula metálica, (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en la Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización particular de la invención
el compuesto conjugado presenta una estructura que comprende:
- b)
- una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en la que cada uno de los oligómeros está derivatizado con al menos dos linkers los cuales unen cada oligómero de HA a la nanopartícula metálica, (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en la Fig.2).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización particular de la invención
el compuesto conjugado presenta una estructura que comprende:
- c)
- uno o más oligómeros de HA derivatizados con más de un linker cada uno, los cuales unen cada oligómero de HA a una o más nanopartículas metálicas (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en la Fig. 3 y otro Ejemplo en la Figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 muestra el esquema de un compuesto
conjugado con una estructura de acuerdo con la realización
particular anterior c), en el que un oligómero de HA presenta n
monómeros cada uno unido mediante un linker a una nanopartícula
metálica. Dado que el tamaño del nanopartícula metálica es mucho
mayor que la separación entre las posiciones por las que el
oligómero de HA se derivatiza, es posible que una misma
nanopartícula metálica se conjugue al oligómero por más de una
posición (Figura 3).
La nanopartícula metálica del compuesto
conjugado puede seleccionarse de entre el grupo formado por
nanopartículas y partículas núcleo-coraza. La
nanopartícula, el núcleo y la coraza pueden estar independientemente
constituidos por un material seleccionado del grupo formado por los
metales Au, Ag, Pt, Co, Fe, los óxidos derivados de uno cualquiera
de los metales anteriores y TiO_{2}. En una realización
preferente la nanopartícula es de oro. Tanto las nanopartículas de
oro como las partículas núcleo-coraza de oro
presentan una superficie muy versátil para funcionalizarla con
diversos tipos de biomoléculas como el HA. Se trata de un elemento
noble y muy poco reactivo en medios
biológicos.
biológicos.
La nanopartícula metálica presenta un tamaño
medio de diámetro variable generalmente comprendido entre 2 y 100
nm. En una realización preferida el tamaño medio de diámetro está
comprendido entre 4 – 50 nm. En otra realización más preferida el
tamaño medio de diámetro está comprendido entre 6-30
nm, y en una realización aún más preferida el tamaño medio de
diámetro está comprendido entre 8-15 nm.
El oligómero de HA o el oligómero de HA
derivatizado comprende en general entre 1 y un número máximo de
monómeros, determinado por la naturaleza biológica del propio ácido
hialurónico. Generalmente, este número máximo está entorno a 50,000
monómeros de HA. En una realización particular el oligómero de ácido
hiaulurónico comprende entre 1-1000 monómeros de
HA; en otra realización particular comprende entre
1-100 monómeros de HA, y en otra realización
particular comprende entre 2-25 monómeros de HA.
Finalmente en una realización preferida el HA derivatizado
comprende 3 monómeros.
En el compuesto conjugado el oligómero de HA se
encuentra derivatizado con, al menos, un linker y a través de, al
menos, un enlace químico covalente que se selecciona de entre un
enlace amida, éster y éter en función del grupo funcional del HA
que se hace reaccionar en la reacción de derivatización y de la
fórmula del linker que se utiliza. En este sentido, en una
realización particular de la invención, el enlace es amida -CONH-,
formado entre un grupo ácido libre de un mer (ácido glucurónico) de
HA y un linker de fórmula general
H_{2}N-R_{1}-S-R_{2}
en el
que:
que:
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, -NH-CO-(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, en el linker de
fórmula general
H_{2}N-R_{1}-S-R_{2}
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado de entre H, -CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3} y -CH_{2}-CH=CH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}- donde n es 1 ó 2.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida el linker es
tiopropionilhidrazida y presenta la fórmula
NH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{n}-SH,
donde n es 2. En particular, el oligómero de HA ya derivatizado con
este linker, se puede obtener de forma comercial (Glycosil^{TM},
Glycosan Biosystems Inc.) para su posterior empleo en la obtención
de un compuesto conjugado según algunos de los procedimientos de la
presente invención que se describen más abajo.
De acuerdo con otra realización particular el
oligómero de HA está derivatizado según una de las siguientes
alternativas:
- a)
- a través de, al menos, un enlace químico éster -COO-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer (ácido glucurónico) de HA y un linker de fórmula general HO-R_{1}-S-R_{2}, ó
- b)
- a través de, al menos, un enlace químico éter, -O- formado entre un grupo -OH del oligómero de HA y un linker de fórmula general GS-R_{1}-S-R_{2},
- donde
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
- GS representa un grupo saliente.
En una realización preferente, en las fórmulas
generales
HO-R_{1}-S-R_{2}
y
GS-R_{1}-S-R_{2}
R_{2} representa un grupo seleccionado de
entre H, -CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3} y
-CH_{2}-CH=CH_{2} y
R_{1} representa un grupo
-(CH_{2})_{n}- donde n es un valor comprendido entre 1 y
20.
El compuesto conjugado presenta una relación
número de mers de HA/número de nanopartículas metálicas comprendida
generalmente entre 2 y 100000. En una realización particular entre 4
y 2000; de acuerdo con otra realización particular entre 4 y 200; y
según otra realización particular entre 4 y 50.
El número de nanopartículas metálicas en el
compuesto conjugado está generalmente comprendido entre 1 y un
número máximo que puede ser determinado mediante técnicas de
caracterización físicas, y que depende de diversos factores tales
como el número total de linkers del oligómero de HA.
En una realización particular el compuesto
conjugado se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1. El compuesto conjugado ha sido visualizado mediante
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) (Figura 6). Las
nanopartículas de oro muestran propiedades ópticas debido al plasmón
de resonancia de la superficie, de este modo es posible medir con
precisión la adsorción de moléculas en general a la superficie del
metal.
La imagen de TEM muestra que las nanopartículas
de oro se concentran en grupos separados y dispersos. En la Figura
7, se muestra el Espectro UV-Vis de las
nanopartículas de oro estabilizadas con citrato sódico, y como la
conjugación de los oligómeros de HA derivatizado a ellas, induce a
un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de onda
mayor, en este caso a 522 nm con respecto al de las nanopartículas
de oro sin conjugar (519 nm). La Figura 8 muestra el potencial Z
donde se observa que la conjugación de los oligómeros de HA
derivatizado induce a un desplazamiento del pico de potencial Z a
-19.1 mV con respecto al pico de -50.8 mV correspondiente a las
nanopartículas de oro no conjugadas.
Como se mencionó anteriormente de acuerdo a una
realización particular el compuesto conjugado es el que presenta
una estructura general como la que se representa en la Figura 5. En
un caso más particular el compuesto conjugado comprende
nanopartículas de oro de 8 nm aproximadamente, y un oligómero de HA
derivatizado, cuya fórmula se muestra en la Figura 9,
"tiopropionilhidrazida-HA". Este compuesto
conjugado se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito en el
Ejemplo 3 y ha sido caracterizado.
En este sentido el compuesto conjugado ha sido
visualizado mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).
En la Figura 10-A se observa que las nanopartículas
de oro sin conjugar al HA tienden a ordenarse formando agrupaciones
características, donde la distancia entre nanopartículas es la
mínima posible debido a su estabilización con citrato sódico.
En cambio, en el caso de que la nanopartícula de
oro se conjugue al HA (Figura 10-B), se observa que
las nanopartículas de oro están más distanciadas y se pierde su
agrupación característica inicial de las nanopartículas sin
conjugar. En este caso, se intuye que las nanopartículas de oro se
agrupan a lo largo de las cadenas de oligómeros de HA, que, a la
vez, se entrecruzan (efecto cross-linking) formando
una maya del compuesto conjugado.
En esta realización particular, las
nanopartículas de oro estabilizadas con citrato sódico muestran un
pico característico a 521,2 nm (aprox.). En cambio cuando se
conjugan a oligómeros de HA derivatizados se puede observar que se
produce un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de
onda mayor en este caso a 523,8 nm (Figura 11).
El compuesto conjugado presenta gran estabilidad
y resistencia a ser absorbido por el organismo debido a su
conjugación con las nanopartículas metálicas. Como consecuencia el
HA mantiene su gran capacidad de retener agua. Además parece,
aunque en este sentido los inventores no desean verse ligados a
ninguna teoría, que la nanopartícula metálica podría actuar como
inhibidor de la actividad de la enzima hialuronidasa sobre el HA,
lo cual podría tener también un efecto adicional sobre la
durabilidad de las propiedades del HA.
De acuerdo con un otro aspecto, la invención se
relaciona con procedimientos para la preparación de un compuesto
conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica,
con la condición de que cuando el oligómero de
HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y la
nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es
distinto de
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-SH.
La preparación de los compuestos conjugados
puede hacerse de acuerdo a uno o más de los siguientes
procedimientos que se describen a continuación, todos ellos objetos
de la presente invención.
Los procedimientos que se describen a
continuación comprenden una etapa común, la preparación de una
nanopartícula metálica que se lleva a cabo con control de forma y
tamaño mediante reacciones químicas bien conocidas para un experto
en la materia. En una realización particular se preparan
nanopartículas de oro, y el método para ello se basa en métodos
sintéticos ampliamente descritos en la literatura como el denominado
del citrato de sodio, (Turkevich, J., P. C. Stevenson, et
al. (1951). "[The nucleation and growth processes in the
synthesis of colloidal gold.]". Discussions of the Faraday
Society 11: 55-75) o también por reducción con
NaBH_{4} (Haiss, W., N. T. Thanh, et al. (2007).
"Determination of size and concentration of gold nanoparticles
from UV-vis spectra". Anal Chem 79(11):
4215-21).
\vskip1.000000\baselineskip
Los distintos procedimientos se describen a
continuación:
El Procedimiento A) comprende las
siguientes etapas:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de
HA;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de
HA;
(iii) derivatización de los fragmentos
oligómeros de HA por reacción química con un linker que comprende un
grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o
éter; y
(iv) conjugación de al menos un fragmento
oligómero de HA derivatizado obtenido en la etapa anterior a al
menos una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
El Procedimiento B) comprende las
siguientes etapas:
(i) derivatización de un polímero de HA por
reacción química con un linker que comprende un grupo -S- por
formación de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) hidrólisis enzimática del polímero de HA
derivatizado;
(iii) obtención de fragmentos oligómeros de HA
derivatizados; y
(iv) conjugación de al menos uno de los
fragmentos obtenidos en la etapa anterior con al menos una
nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
El Procedimiento C) comprende las
siguientes etapas:
(i) derivatización de un polímero de HA por
reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través
de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(ii) conjugación del polímero de HA derivatizado
obtenido en la etapa anterior a al menos una nanopartícula
metálica;
(iii) hidrólisis enzimática del polímero de HA
derivatizado;
(iv) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo al Procedimiento A, la etapa
(ii) consiste en la hidrólisis enzimática de un polímero de HA. El
polímero de HA de partida, se obtiene de forma comercial como se ha
mencionado anteriormente. El polímero de HA comprende a su vez
oligómeros de diferente número de mers de HA, los cuales se
hidrolizan para dar fragmentos oligosacáridos (fragmentos
oligómeros) de menor tamaño y estructura variable mediante la acción
de dos tipos de enzimas posibles a) y b), tal y como se representa
en el Esquema 1:
a) Hidrólisis con una hialuronidasa
(hialuronato 4-glucanohidrolasa, E.C. 3.2.1.35). La
hidrólisis se produce en los enlaces
\beta-1-3 del polímero de HA y
resulta en estructuras del tipo
D-GlcA-(1\rightarrow3)-[D-GlcNAc-(1\rightarrow4)-D-GlcA]_{n}-D-GlcNAc
con un ácido urónico saturado en el extremo hidrolizado. Los
oligosacáridos se preparan mediante la digestión de polímero de HA
con BTH ("Bovine Testicular Hyaluronidase") (30 U/mg HA) a 37ºC
y diferentes tiempos de reacción según se describe en la literatura
(Bertrand, P. and B. Delpech (1985), "Interaction of hyaluronectin
with hyaluronic acid oligosaccharides". J Neurochem
45(2): 434-9; Courel, M. N., C. Maingonnat,
et al. (2002). "Importance of hyaluronan length in a
hyaladherin-based assay for hyaluronan". Anal
Biochem 302(2): 285-90.; Tawada, A., T.
Masa, et al. (2002). "Large-scale
preparation, purification, and characterization of hyaluronan
oligosaccharides from 4-mers to
52-mers". Glycobiology 12(7):
421-6). El tamaño de oligosacárido final varía en
función del tiempo de incubación.
b) Hidrólisis con una hialuronato liasa (E.C.
4.2.2.1). La hidrólisis se produce en los enlaces
\beta-1-4 y se obtienen
oligosacáridos con un ácido urónico
\Delta^{4}-insaturado del extremo hidrolizado
para dar oligosacáridos de estructuras
L-4dthrHex4enA-(1\rightarrow3)-[D-GlcNAc-(1\rightarrow4)-D-GlcA]_{n}-(1\rightarrow3)-D-GlcNAc
(ver Ponnuraj, K. and M. J. Jedrzejas (2000), "Mechanism of
hyaluronan binding and degradation: structure of Streptococcus
pneumoniae hyaluronate lyase in complex with hyaluronic acid
disaccharide at 1.7 A resolution". J Mol Biol 299(4):
885-95).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
1
A continuación en el procedimiento A
tiene lugar la etapa (ii) en la que los fragmentos oligómeros de
diferentes tamaños resultantes de la degradación enzimática se
purifican, opcionalmente, mediante una serie de técnicas
convencionales tales como centrifugación, cromatografías,
desalinización y liofilización. Posteriormente los fragmentos
oligómeros purificados se derivatizan (iii) por reacción química con
un linker. La derivatización de los mismos se lleva a cabo por
modificación de uno de los dos tipos de grupos funcionales
siguientes: los grupos ácido carboxílico (COOH) o los alcoholes
(OH), tanto primarios como secundarios, de la unidad disacárido
señalados en el Esquema 2:
Esquema
2
Los grupos ácido carboxílico (COOH) del ácido
glucurónico presente a lo largo del oligómero de HA se pueden
derivatizar con un linker mediante la formación de dos tipos de
enlace como se representa en el Esquema 3:
1) Mediante la formación de un enlace amida
(empleando el método de la activación con carbodiimida) con un
linker que contiene un grupo amina de fórmula general:
H_{2}N-R_{1}-S-R_{2}
\newpage
\global\parskip0.920000\baselineskip
donde
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, -NH-CO-(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20;
Véase ejemplos en los siguientes
documentos:(Shu, X. Z., Y. Liu, et al. (2002). "Disulfide
cross-linked hyaluronan hydrogels".
Biomacromolecules 3(6): 1304-11; Lee, H.,
S.-H. Choi, et al. (2006). "Direct Visualization of
Hyaluronic Acid Polymer Chain by Self-Assembled
One-Dimensional Array of Gold Nanoparticles".
Macromolecules 39(1): 23-25; Kafedjiiski,
K., R. K. Jetti, et al. (2007). "Synthesis and in
vitro evaluation of thiolated hyaluronic acid for mucoadhesive
drug delivery". Int J Pharm 343(1-2):
48-58).
2) Mediante una reacción de esterificación
empleando un linker que comprende un grupo alcohol de fórmula
general:
HO-R_{1}-S-R_{2}
donde
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, donde n es un valor comprendido entre 1 y 20;
(Véase ejemplos)(Campoccia, D., P. Doherty,
et al. (1998). "Semisynthetic resorbable materials from
hyaluronan esterification". Biomaterials 19(23):
2101-27).
Esquema
3
Los alcoholes (OH), tanto primarios como
secundarios, de la unidad disacárido (Esquema 2), se pueden
derivatizar con un linker de fórmula general:
GS-R_{1}-S-R_{2},
donde
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
- \quad
- GS representa un grupo saliente
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
mediante la formación de enlaces tipo éter como
se representa en el Esquema 4. (Véase ejemplos en: Mlcochova, P.,
V. Hajkova, et al. (2007). "Preparation and
characterization of biodegradable alkylether derivatives of
hyaluronan". Carbohydrate Polymers 69(2):
344-352).
Variando las condiciones de reacción como la
proporción de los reactivos, cantidad y/o tipo de disolvente, pH,
temperatura y el tiempo de reacción, se controla la
funcionalización mayoritaria del alcohol primario frente a los
secundarios y la cantidad de mono-, di- o
tri-substitución de los alcoholes secundarios.
Esquema
4
Asimismo, en el caso de los diferentes
fragmentos de oligómeros provenientes de la degradación enzimática
con Hialuronidasa, aparece un alcohol secundario adicional situado
en el extremo hidrolizado de la unidad de disacárido terminal, el
cual también es proclive a ser derivatizado en condiciones similares
a las de los otros alcoholes secundarios según se representa en el
siguiente Esquema 5:
Esquema
5
En la etapa (iv) del procedimiento A, se
conjuga al menos uno de los fragmentos oligómeros de HA
derivatizados, a, al menos, una nanopartícula metálica. Para la
reacción de conjugación una disolución acuosa con una concentración
generalmente entorno a 10^{12} nanopartículas metálicas por
mililitro, se agita típicamente en presencia de un gran exceso del
oligómero de HA derivatizado en cuestión, a temperatura ambiente
durante 1 hora. La proporción de oligómero de HA respecto a la
concentración de nanopartículas metálicas se calcula de la siguiente
forma: a) se calcula el número de átomos metálicos que hay en la
superficie de una esfera, mediante el cálculo teórico del área
superficial de la misma, y asumiendo que cada átomo ocupa
1-2 nm^{2}. Se asume que cada átomo de azufre del
linker se conjuga con un solo átomo de la nanopartícula metálica.
Teniendo en cuenta el número de nanopartículas metálicas en
disolución se añade un exceso de 100 veces más de oligómero de HA
derivatizado.
El compuesto conjugado obtenido se purifica y se
aísla a continuación por diálisis según la metódica descrita en el
ejemplo 2.1.4.
Los procedimientos B) y C) de la
invención se llevan a cabo de forma sencilla por un experto en la
materia modificando el orden de las etapas de reacción (i) a (iv)
del procedimiento A), a la vista del contenido de la presente
descripción y el conocimiento del experto en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento adicional, es el
procedimiento D) de obtención de un compuesto conjugado, que
comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA
derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de
al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de
HA derivatizados; y
(iii) conjugación de al menos un fragmento
oligómero de HA derivatizado obtenido en la etapa anterior a al
menos una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento E) para la preparación
de un compuesto conjugado comprende:
(i) conjugación de un polímero de HA
derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al
menos un enlace químico amida, éster o éter a al menos una
nanopartícula metálica;
(ii) hidrólisis enzimática del producto
resultante de la etapa anterior; y
(iii) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferente tanto del
procedimiento D) como del procedimiento E) de la
presente invención, se parte de un polímero de HA previamente
derivatizado, asequible de forma comercial, como por ejemplo el
Glycosil^{TM} (Glycosan Biosystems Inc., ver Ejemplo 1). El
Glycosil^{TM} puede por tanto conjugarse a una nanopartícula
metálica en primer lugar, y a continuación ser hidrolizado para
generar fragmentos oligómeros de HA derivatizados y unidos ya a la
nanopartícula metálica (procedimiento E)).Alternativamente,
el Glycosil^{TM} puede hidrolizarse primero para generar
fragmentos oligómeros de HA derivatizados que posteriormente se
conjugan a una nanopartícula metálica (procedimiento D).
De acuerdo con el procedimiento F) para
la obtención de un compuesto conjugado, los oligómeros de HA de
hasta 1000 kDa, se obtienen mediante biosíntesis, mediante la
acción de una Hialuronato Sintasa de manera convencional tal y como
se describe en el estado de la técnica. Véanse los ejemplos en:
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2005, 71, No. 7, p.
3747-3752; JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278,
No. 37, pp. 35199-35203, 2003; JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 40, pp.
42345-42349, 2004; JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
Vol. 280, No. 10, pp. 8813-8818, 2005). Después de
la biosíntesis de los oligómeros de HA, éstos se derivatizan
mediante cualquiera de los métodos y linkers descritos en la
presente invención. Finalmente, los oligómeros de HA derivatizados
se conjugan a, al menos, una nanopartícula metálica según la
metódica descrita en esta invención.
Según una realización particular, los oligómeros
biosintetizados de HA de hasta 1000 kDa, se derivatizan a través
del grupo -OH de la posición 3 o 4 del sacárido inicial o final del
oligómero con un linker de fórmula general
GS-R_{1}-S-R_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Por último mediante el procedimiento G,
se puede preparar un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un polímero u oligómero de HA
derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos
un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero
de HA derivatizado a la nanopartícula metálica,
con la condición de que cuando el polímero u
oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n >
1000, y la nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker
es distinto de
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-SH.
\vskip1.000000\baselineskip
El Procedimiento G comprende las
siguientes etapas:
(i) partir de un polímero u oligómero de HA,
\newpage
(ii) derivatizarlo con al menos un linker que
comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida,
éster o éter;
(iii) conjugar un polímero u oligómero de HA
derivatizado a una o más nanopartículas metálicas, y
(iv) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento G se caracteriza, por la
ausencia de una etapa de hidrólisis enzimática. El polímero u
oligómero de HA de partida para el procedimiento G, se obtiene de
una fuente biológica cualquiera de HA de diversas empresas
comercializadoras. La derivatización se lleva a cabo por
modificación de uno de los dos tipos de grupos funcionales: los
grupos ácido carboxílico (COOH) o los alcoholes (OH), tanto
primarios como secundarios, de acuerdo con cualquiera de los
métodos arriba descritos. A continuación se lleva a cabo la etapa de
conjugación siguiendo la metódica ya descrita.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con un compuesto conjugado obtenible mediante al menos
uno de los procedimientos descritos arriba.
Los diversos compuestos conjugados son
fácilmente obtenibles por un experto en la materia a la vista del
contenido de la presente descripción, de los Ejemplos, y del
conocimiento general común variando los parámetros anteriormente
descritos, como por ejemplo, el tamaño de las nanopartículas
metálicas utilizadas, los oligómeros, el tipo de linker, así como
de las condiciones de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto adicional la invención se
relaciona con un compuesto multiconjugado, en adelante compuesto
multiconjugado de la invención, que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une la molécula de HA
derivatizada a la nanopartícula metálica, y
- al menos, una molécula conjugada a, al menos,
una nanopartícula metálica.
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Entre las distintas moléculas que pueden
emplearse en la presente invención cabe destacar, por ejemplo y
entre otras, un péptido, una proteína, un inhibidor de la
hidrólisis del HA. En una realización particular de la invención
dicha molécula es un compuesto seleccionado del grupo formado por
los inhibidores de la hidrólisis del HA producida por una enzima de
la familia de hialuronidasas.
El compuesto multiconjugado de la invención, que
comprende además otra molécula conjugada adicional, puede obtenerse
fácilmente mediante técnicas de multiconjugación de moléculas a la
superficie de una nanopartícula metálica conocidas para un experto
en la materia. Cada molécula a conjugar a la nanopartícula metálica
se derivatiza previamente con un linker determinado. Las técnicas
de multiconjugación se basan en la diferencia de afinidad del
linker por el cual se ha derivatizado cada tipo de molécula y a la
diferencia en concentración de cada tipo de molécula en la reacción
de conjugación a la nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto adicional la invención se
refiere a una composición cosmética que comprende al menos un
compuesto seleccionado entre:
un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une al oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, o
un compuesto multiconjugado de la invención,
junto con al menos un excipiente
fisiológicamente aceptable. Dichos excipientes pueden ser
seleccionados fácilmente por un experto en la materia en función,
entre otros aspectos, de las propiedades y características del
compuesto conjugado concreto. La composición cosmética puede
prepararse para su aplicación tópica o mediante inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto adicional, la invención se
refiere al empleo de al menos un compuesto seleccionado entre:
un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une un oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, o
un compuesto multiconjugado de la invención,
en la elaboración de una composición cosmética,
en particular para su aplicación tópica o mediante inyección en la
piel.
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Por tanto otro aspecto adicional de la
invención, se refiere a un tratamiento cosmético de la piel de un
humano que comprende la aplicación de la composición cosmética de
la presente invención.
El tratamiento cosmético presenta ventajas con
respecto a los tratamientos cosméticos del estado de la técnica
basados en HA en cuanto a que mejora la estructura física y la
estabilidad del HA. El compuesto conjugado absorbe agua en las
capas profundas de la piel realizando el efecto de relleno necesario
para atenuar las arrugas y pliegues.
La unión del oligómero de HA a la nanopartícula
metálica parece proteger a los oligómeros de HA al organismo de su
absorción directa al organismo y permite suministrar HA en gran
concentración, por concentrar en un solo compuesto conjugado varios
oligómeros de HA. Sin querer verse ligados a ninguna teoría, los
inventores consideran que los mecanismos por los que la conjugación
a una nanopartícula metálica protege el HA de ser absorbidos,
podrían ser los siguientes:
Por una parte, la estructura de los oligómeros
de HA recubriendo la nanopartícula metálica presenta una
distribución espacial que es menos reactiva frente al metabolismo
de absorción.
Por otra, la competencia entre el enlace a
través de un linker, del oligómero de
HA-nanopartícula metálica, frente a las reacciones
que lo degradarían, desplaza el equilibrio bioquímico alargando la
vida media del HA.
Finalmente, en el caso de un oligómero conjugado
a una nanopartícula metálica por varias posiciones, se obtiene un
efecto de cross-linking debido a la distribución del
oligómero sobre la superficie de la nanopartícula metálica por
haberse unido a ella por varias posiciones. Esto podría dificultar
aún más la acción de la hialuronidasa aumentando por tanto la
estabilidad y durabilidad del HA.
De nuevo y sin querer verse vinculados a ninguna
teoría los inventores opinan que es posible, cuando el oligómero se
vea expuesto a degradación enzimática (normalmente hialuronidasa),
el compuesto conjugado podría proteger químicamente las partes del
HA hábiles de degradarse por la actividad del enzima ya que la
nanopartícula metálica se conjuga por un lugar estructural cercano
al grupo funcional por el que dicho enzima fragmenta al oligómero.
De este modo se dificultaría la acción de la hialuronidasa sobre el
oligómero de HA.
En una realización particular el tratamiento
cosmético es tópico, y presenta entre otras las ventajas la de
estar al alcance de cada individuo en el sentido de que, él mismo lo
puede poner en práctica sobre la piel sin riesgo alguno, siendo
indoloro, cómodo y más asequible económicamente que un tratamiento
mediante inyección. El compuesto conjugado o multiconjugado para
aplicación tópica comprende, preferiblemente, oligómeros de HA de
un peso molecular inferior a 1000 kDa que pueden penetrar fácilmente
hasta la dermis. De este modo el oligómero de HA conjugado absorbe
agua en las capas profundas de la piel realizando el efecto de
relleno necesario para atenuar las arrugas y pliegues.
En otra realización particular el tratamiento
cosmético es mediante inyección y presenta asimismo algunas
ventajas. En este sentido, mientras que los tratamientos actuales
mantienen su efectividad entre 4 y 6 meses, después de los cuales
desaparece el efecto de relleno, la conjugación de oligómeros de HA
a nanopartículas mejora la estabilidad del oligómero de HA,
obteniendo un producto que mantiene su efecto corrector de arrugas
y pliegues durante más tiempo, espaciando la necesidad de los
tratamientos inyectados y mejorando así la calidad de vida del
usuario. En una realización particular, el compuesto conjugado o
multiconjugado para aplicación mediante inyección comprende,
preferiblemente, oligómeros de HA de un peso molecular superior a
500 kDa ya que una vez inyectados en las capas profundas de la
piel, su durabilidad es mayor.
A continuación se presentan ejemplos
ilustrativos de la presente invención que se exponen para una mejor
comprensión de la invención y en ningún caso deben considerarse una
limitación del alcance de la misma.
\newpage
Ejemplo
1
Ejemplo
1.1
Una disolución acuosa (150 mL) de citrato de
sodio (2.2 mM) se calentó a ebullición con agitación vigorosa. El
siguiente paso fue añadir 1mL de una disolución acuosa (23.4 mM) de
HAuCl_{4} sobre la disolución a ebullición. La reducción tuvo
lugar en aproximadamente 2 minutos y se formó una disolución de
nanopartículas de oro, la cual experimentó un cambio de color
indicativo de violáceo a rojo intenso. Finalmente se separó el
reactor de la fuente de calor y se dejó enfriar hasta temperatura
ambiente. Las nanopartículas de oro así obtenidas se caracterizaron
mediante UV-Vis. El tamaño medio de 8 nm de las
nanopartículas de oro se determinó mediante tratamiento informático
de las imágenes obtenidas por TEM, asimismo se midió el diámetro de
una muestra aleatoria de nanopartículas y se realizó la
distribución Gaussiana de tamaños.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Tiopropionilhidrazida-HA
(Glycosil^{TM}, Glycosan Biosystems Inc.) se despolimerizó
mediante la acción del enzima hialuronato
4-glucanohidrolasa ("Bovine Testicular
Hyaluronidase" (BTH)) (E.C. 3.2.1.35) (Hyaluronidase Type
I-S, Sigma-Aldrich). A una solución
que contenía 5 mg de oligómeros de
tiopropionilhidrazida-HA en 25 mL de disolución
tampón acuosa (100 mM fosfato de sodio, 150 mM cloruro de sodio, pH
5.3) se le añadieron 5*10^{4} U de BTH y se dejó incubar durante
40 horas a 37ºC. La reacción enzimática se detuvo mediante la
ebullición de la muestra durante 20 min. (Glycobiology, 2002
Jul;12(7):421-6).
La mezcla de oligómeros de
HA-derivatizado se centrifugó a 10,000 rpm durante
30 min y el sobrenadante se concentró y liofilizó. A continuación,
la muestra liofilizada se reconstituyó en agua
destilada.(Glycobiology, 2002
Jul;12(7):421-6).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
Las nanopartículas de oro de 8 nm obtenidas
según el Ejemplo 1.1, se funcionalizaron con los oligómeros
derivatizados (tiopropionilhidrazida-HA, MW 1455
g/mol) obtenidos en la etapa anterior, mediante la adición de 100
\mul de una disolución 1.5 mM de oligómero derivatizado por 5 mL
de disolución de nanopartículas de oro. La reacción se llevó a cabo
a temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30 minutos.
La reacción se paró disminuyendo la temperatura (dentro de la
nevera). La purificación se hizo por diálisis (molecular weight cut
off (MWCO) 16 mm) contra citrato de sodio (2.3 mM, 3,25 g/5L
H_{2}O). Se obtuvo el compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
Se registraron los espectros de absorción de
UV-Vis de la disolución del compuesto conjugado
obtenido en la etapa anterior. La conjugación a una nanopartícula
de los oligómeros de HA derivatizado, induce a un desplazamiento
del pico de absorción a una longitud de onda mayor (en este caso a
522 nm) como se muestra en la Figura 7 con respecto al pico de
absorción de las nanopartículas de oro no conjugadas (519 nm).
Se capturaron las imágenes de TEM del compuesto
conjugado (Figura 6) obtenido. Las muestras para estudios de TEM
fueron preparadas depositando una gota de la disolución acuosa del
compuesto conjugado obtenido sobre rejillas de TEM recubiertas de
carbono.
Se determinó el potencial-Z del
compuesto conjugado. La conjugación a una nanopartícula de los
oligómeros de HA derivatizado induce a un desplazamiento del pico
de potencial Z a -19.1 mV como se muestra en la Figura 8 con
respecto al pico de -50.8 mV correspondiente a las nanopartículas de
oro no conjugadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Ejemplo
2.1
El polímero de HA (HA, sal de sodio, de
Streptococcus eq., Sigma-Aldrich) se despolimerizó
mediante la acción del enzima ("Bovine Testicular Hyaluronidase
(BTH)") hialuronato 4-glucanohidrolasa (E.C.
3.2.1.35) (Hyaluronidase Type I-S,
Sigma-Aldrich). A una solución que contenía 5 mg de
HA en 25 mL de disolución tampón acuosa (100 mM fosfato de sodio,
150 mM cloruro de sodio, pH 5.3) se le añadieron 5*10^{4} U de BTH
y se agitó durante 40 horas a 37ºC. La reacción enzimática se
detuvo mediante la ebullición de la muestra durante 20 minutos.
(Glycobiology, 2002 Jul;12(7):421-6).
La mezcla de fragmentos oligómeros de HA se
centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos y el sobrenadante se
concentró y liofilizó. A continuación, los oligómeros de HA se
purificaron mediante tubos de centrifugación Centricon Plus 20 con
un corte de peso molecular de 10 kDa. Finalmente, se obtuvo una
mezcla de oligómeros de HA de tamaños comprendidos entre 4 y
52-mer (Glycobiology, 2002
Jul;12(7):421-6) que fue utilizada en la
etapa siguien-
te.
te.
Los grupos carboxilo (-COOH) libres del ácido
glucurónico presentes a lo largo de la cadena se derivatizaron con
un "linker" mediante la formación de un enlace amida empleando
el método de la carbodiimida. Los oligómeros (20 g, 50 mmol) se
disolvieron en agua (2 L) y se ajustó el pH a 4.8 con HCl 1.0 N. Los
grupos ácidos se activaron químicamente mediante la adición de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC)(100 mmol). A continuación, se añadió una cantidad del linker
ditiobis(propanodihidrazina)
NH_{2}-NH-CO-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{2}-CO-NH-NH_{2}
(100 mmol) en una proporción 1:2 oligómero: linker,
respectivamente, y se volvió a reajustar el pH al mismo nivel que
anteriormente. La mezcla de la reacción se incubó a temperatura
ambiente durante un período de 12 horas. La reacción se paró
mediante la adición de NaOH 1.0 N aumentando el pH hasta 7. A
continuación se añadió ditiotreitol (650 mg) y se aumentó el pH
hasta 8 mediante la adición de NaOH 1.0 N. La reacción se agitó
durante 24 horas y luego se acidificó a pH 3.5 con HCl 1.0.
La mezcla de la reacción resultante se dializó
exhaustivamente con una membrana de diálisis de corte de peso
molecular de 3,5 kDa contra HCl diluido (pH = 3.5) conteniendo 1% de
NaCl, y finalmente contra agua destilada y desmineralizada. Se
obtuvo una mezcla de oligómeros entre 4 y 52-mer de
HA derivatizados.
Las nanopartículas de oro de 8 nm obtenidas en
el Ejemplo 1.1 se conjugaron con los oligómeros derivatizados
obtenidos en 2.1.3, mediante la adición de 100 \mul de una
disolución 1.5 mM de oligómeros derivatizados por 5 mL de
disolución de nanopartículas. La reacción se llevó a cabo a
temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30 minutos.
La reacción se paró disminuyendo la temperatura a 4ºC. La
purificación se hizo por diálisis (MWCO 16 mm) contra citrato de
sodio (2.3 mM, 3,25 g/5L H_{2}O).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Ejemplo
3.1
Las nanopartículas de oro de 8 nm se conjugaron
con un polímero de HA derivatizado, mediante la adición de 100
\mul de una disolución 1.5 mM de
thiopropionylhydrazide-HA (Glycosil TM) por
5mL de disolución de nanopartículas de oro. La reacción se llevó a
cabo a temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30
minutos (Macromolecules 2006, 39, 23-25). La
reacción se paró disminuyendo la temperatura a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.2
Se capturaron imágenes de TEM tanto de las
nanopartículas de oro (Figura 10-A) como del
conjugado (Figura 10-B) para mostrar la diferente
morfología adoptada por el conjugado de nanopartícula de oro con
polímero de HA. Las muestras para estudios de TEM fueron preparadas
depositando una gota de la disolución acuosa correspondiente de
nanopartículas de oro o del conjugado de
HA-nanopartícula de oro, sobre rejillas de TEM
recubiertas de carbono.
Se registraron los espectros de absorción de
UV-Vis de las disoluciones de nanopartículas de oro
y del compuesto conjugado obtenido. Las nanopartículas de oro
estabilizadas con citrato muestran un pico característico a 521.2
nm. En cambio cuando se conjugan a HA se produce un desplazamiento
del pico de absorción a una longitud de onda mayor en este caso a
523,8 nm.
Se determinó el potencial-Z. La
conjugación a nanopartículas de los oligómeros de HA derivatizados
induce a un desplazamiento del pico de potencial Z a -18.2 mV como
se muestra en la Figura 12 con respecto al pico de -48.5 mV
correspondiente a las nanopartículas de oro no conjugadas.
Claims (37)
1. Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica,
con la condición de que cuando el oligómero de
HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y la
nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es
distinto de
H_{2}N-CH_{2}-CH_{2}-SH.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto conjugado según la reivindicación
1, que presenta una estructura que comprende:
- \quad
- una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en el que cada uno de los oligómeros de HA está derivatizado con un linker a través de un enlace químico, y en la que cada linker une cada oligómero de HA a la nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Compuesto conjugado según la reivindicación
1, que presenta una estructura que comprende:
- \quad
- una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en la que cada uno de los oligómeros está derivatizado con al menos dos linkers los cuales unen cada oligómero de HA a la nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Compuesto conjugado según la reivindicación
1, que presenta una estructura que comprende:
- \quad
- uno o más oligómeros de HA derivatizados con más de un linker cada uno, los cuales unen cada oligómero de HA a una o más nanopartículas metálicas.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la nanopartícula metálica se
selecciona de entre el grupo formado por nanopartículas y partículas
núcleo-coraza y en el que la nanopartícula, el
núcleo y la coraza pueden estar independientemente constituidos por
un material seleccionado del grupo formado por los metales Au, Ag,
Pt, Co, Fe, los óxidos derivados de uno cualquiera de los metales
anteriores y TiO_{2}.
6. Compuesto conjugado según la reivindicación
5, en el que la nanopartícula metálica es una nanopartícula de
oro.
7. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 5 o 6, en el que la nanopartícula metálica
presenta un tamaño medio de diámetro comprendido entre 2 y 100
nm.
8. Compuesto conjugado según la reivindicación
7, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 4 -
50 nm.
9. Compuesto conjugado según la reivindicación
8, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre
6-30 nm.
10. Compuesto conjugado según la reivindicación
9, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre
8-15 nm.
11. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el oligómero de HA derivatizado
comprende entre 1 y un número máximo de monómeros determinado por la
naturaleza biológica del propio HA.
12. Compuesto conjugado según la reivindicación
11, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre
1-1000 monómeros de HA.
13. Compuesto conjugado según la reivindicación
12, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre
1-100 monómeros de HA.
14. Compuesto conjugado según la reivindicación
13, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre
2-25 monómeros de HA.
15. Compuesto conjugado según la reivindicación
14, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende 3 monómeros
de HA.
\global\parskip0.900000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
16. Compuesto conjugado según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 o 11 a 15, en el que el oligómero de HA
está derivatizado a través de al menos un enlace químico amida
-CONH-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer de HA y
un linker de fórmula general
H_{2}N-R_{1}-S-R_{2}
en el que:
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, -NH-CO-(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Compuesto conjugado según la reivindicación
16, en el que
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado de entre H, -CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3} y -CH_{2}-CH=CH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}- donde n es 1 ó 2.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Compuesto conjugado según la reivindicación
16, en la que el linker presenta la fórmula
NH_{2}-NH-CO-
(CH_{2})_{n}-SH, donde n es 2.
(CH_{2})_{n}-SH, donde n es 2.
19. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y 11 a 15, en el que el oligómero de HA está
derivatizado según una de las siguientes alternativas:
- a)
- a través de, al menos, un enlace químico éster -COO-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer de HA y un linker de fórmula general HO-R_{1}-S-R_{2}, ó
- b)
- a través de, al menos, un enlace químico éter, -O- formado entre un grupo -OH del oligómero de HA y un linker de fórmula general GS-R_{1}-S-R_{2},
- donde
- R_{2} representa un grupo seleccionado entre H, -CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH_{3}, -(CH_{2})_{n}-CH=CH_{2} y -S-R_{1}-NH_{2} y
- R_{1} representa un grupo seleccionado de entre -(CH)_{n}-, -(CH)(COOH)(CH_{2})_{n}-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
- GS representa un grupo saliente.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Compuesto conjugado según la reivindicación
19, en el que
- \quad
- R_{2} representa un grupo seleccionado de entre H, -CH_{3}, -CH_{2}-CH_{3} y -CH_{2}-CH=CH_{2} y
- \quad
- R_{1} representa un grupo -(CH_{2})_{n}- donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 21.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, que presenta una relación número de mers
de HA/número de nanopartículas metálicas comprendida entre 2 y
100000.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21
que comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de
HA;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de
HA;
(iii) derivatización de los fragmentos
oligómeros de HA por reacción química con un linker que comprende un
grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o
éter; y
(iv) conjugación de al menos un fragmento
oligómero de HA derivatizado obtenido en la etapa anterior a al
menos una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
21, que comprende:
(i) derivatización de un polímero de HA por
reacción química con un linker que comprende un grupo -S- por
formación de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) hidrólisis enzimática del polímero de HA
derivatizado;
\newpage
(iii) obtención de fragmentos oligómeros de HA
derivatizados; y
(iv) conjugación de al menos uno de los
fragmentos obtenidos en la etapa anterior con al menos una
nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende:
(i) derivatización de un polímero de HA por
reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través
de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(ii) conjugación del polímero de HA derivatizado
obtenido en la etapa anterior a al menos una nanopartícula
metálica.
(iii) hidrólisis enzimática del polímero de HA
derivatizado;
(iv) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA
derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de
al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de
HA derivatizados; y
(iii) conjugación de al menos un fragmento
oligómero de HA derivatizado obtenido en la etapa anterior a al
menos una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
26. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende:
(i) conjugación de un polímero de HA
derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al
menos un enlace químico amida, éster o éter a al menos una
nanopartícula metálica;
(ii) hidrólisis enzimática del producto
resultante de la etapa anterior; y
(iii) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
27. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende:
(i) biosíntesis mediante la acción de una
Hialuronato Sintasa de un fragmento oligómero de HA;
(ii) derivatización del fragmento oligómero
biosintetizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de
al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(iii) obtención de los fragmentos oligómeros de
HA derivatizados; y
(iv) conjugación de al menos un fragmento
oligómero de HA derivatizado obtenido en la etapa anterior a al
menos una nanopartícula metálica.
\vskip1.000000\baselineskip
28. Procedimiento para la preparación de un
compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende:
(v) partir de un polímero u oligómero de HA,
(vi) derivatizarlo con al menos un linker que
comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida,
éster o éter;
(vii) conjugar un polímero u oligómero de HA
derivatizado a una o más nanopartículas metálicas, y
(viii) obtención del compuesto conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
29. Compuesto conjugado obtenible mediante un
procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a
28.
30. Compuesto conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, que comprende, además, al menos, otra
molécula conjugada a, al menos, una nanopartícula metálica.
31. Compuesto multiconjugado según la
reivindicación 30, en el que la molécula es un compuesto
seleccionado del grupo formado por péptidos, proteínas, e
inhibidores de la hidrólisis del HA.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Composición cosmética que comprende al menos
un compuesto seleccionado entre:
un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une al oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, o
un compuesto multiconjugado según las
reivindicaciones 30 o 31,
junto con al menos un excipiente
fisiológicamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
33. Composición cosmética según la
reivindicación 32, para su aplicación tópica o para su aplicación
mediante inyección.
34. Composición cosmética según la
reivindicación 33, para su aplicación tópica que comprende
oligómeros de HA de peso molecular inferior a 1000 kDa.
35. Composición cosmética según la
reivindicación 33, para su aplicación mediante inyección que
comprende oligómeros de HA de peso molecular superior a 500
kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
36. Empleo de al menos un compuesto seleccionado
entre:
un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a
través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que
comprende un grupo -S- por el que se une un oligómero de HA
derivatizado a la nanopartícula metálica, o
un compuesto multiconjugado según las
reivindicaciones 30 o 31,
en la elaboración de una composición cosmética
para su aplicación tópica o para su aplicación mediante inyección
en la piel.
\vskip1.000000\baselineskip
37. Tratamiento cosmético sobre el cuerpo humano
que comprende la aplicación de una composición cosmética según
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.
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