WO2009087254A1 - Conjugado de ácido hialurónico para el tratamiento cosmético y procedimiento de preparación - Google Patents

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WO2009087254A1
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conjugate compound
oligomer
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linker
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PCT/ES2009/000001
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Marc Ramis Castelltort
Isaac Ojea Jimenez
Joaquin Querol Sastre
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Endor Nanotechnologies, S.L.
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Definitions

  • the present invention relates to a new conjugated compound of hyaluronic acid and a metal nanoparticle, as well as to a process for obtaining it. Likewise, the invention refers to its use in cosmetic treatments.
  • Hyaluronic acid or HA is a natural glycosaminoglycan very abundant in all mesodermal tissues, in vitreous humor and in Wharton's jelly of the umbilical cord. It is present in the intercellular matrix of tissues, in the different tissues of all animal species and plays an important role in the structure of the skin, being responsible for its elasticity. It has the ability to retain around it a large amount of water providing volume to the tissues. Its structure consists of alternating disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine linked by ⁇ -1-3 and ⁇ -1-4 glycosidic bonds.
  • the HA does not have a definite shape in space, but extends randomly tending to occupy a very large volume due to electrostatic repulsion of the carboxyl groups of glucuronic acid. At the same time, it forms meshes that retain a large amount of water.
  • HA has a decisive role as a connective element of tissues. About 56% of the HA in the body is concentrated in the skin. The body dermis has a network of collagen fibers within an interstitial substance whose composition is largely constituted by HA. The elastic properties of this acid provide resistance against compression, and this is how the skin protects the underlying structures against external aggressions, while the non-Newtonian properties of HA allow collagen fibers to move easily through The interstitial substance. This lubrication process by HA allows the skin to adapt to the changes in shape and volume that take place when the bones and ligaments move.
  • HA has been used in cosmetics since 1996, it can be of animal origin (from the crest of the hens and the eyeball of the fish) or of biological origin (bacterial culture extracts).
  • the HA is responsible for the elasticity of the skin. It is a great remedy against wrinkles, because it increases the volume in folds, grooves and skin depressions. Its periodic application causes the regeneration of the collagen itself.
  • the advantage of this product is that it is a substance compatible with all tissues, therefore it does not require any type of skin test as occurs with collagen.
  • Cosmetic treatments are known in the state of the art based on HA.
  • the cosmetic application of HA entails the loss of the conformation of HA, and as a consequence the decrease in stability and the ability to retain water.
  • the inventors have surprisingly discovered that the conjugation of HA oligomers to the surface of a metal nanoparticle through a linker, improves the properties of physical structure, stability and durability, and in general the properties of transdermal penetration.
  • the cosmetic application of this conjugate thus provides an effect on the wrinkle filler skin, effective and durable, which can replace other less effective treatments.
  • Figure 1 represents an illustrative model of a conjugate compound of the invention, comprising a metal nanoparticle and 2 (6-mer) oligomers of thiopropionylhydrazide-HA, in which each of the oligomers is derivatized through an amide chemical bond, and in which each linker binds each oligomer of
  • Figure 2 represents an illustrative model of a conjugate compound containing a metal nanoparticle and 2 HA (4-mer) oligomers, in which each of the oligomers is derivatized in the carboxylic acid positions with two linkers, which join each HA oligomer to the metal nanoparticle.
  • Figure 3 represents an illustrative model of a conjugate compound consisting of 1 8-mer oligomer of HA derivatized at the carboxylic acid positions through chemical amide bonds with 4 linkers, which bind the oligomer to 1 metal nanoparticle.
  • Figure 4 represents an illustrative model of a conjugate compound consisting of 1 8-mer oligomer conjugated to 4 metal nanoparticles.
  • Figure 5 shows a scheme of a conjugate compound consisting of an HA oligomer with n monomers each linked by a linker to a metal nanoparticle.
  • FIG 6 Electron transmission microscopy (TEM) images captured with a Hitachi H-7000 transmission electron microscope with an acceleration voltage of 75 Kv of the conjugate compound obtained in Example 1.
  • Figure 7 UV-Vis absorption spectra of a solution of gold nanoparticles and the conjugate compound obtained in Example 1, recorded with a Shimadzu UV-240IPC spectroscope. A represents the absorbance and ⁇ the wavelength (nm).
  • Figure 8 represents the Z-potential recorded by a Zetasizer Nano ZS, Malvern of the conjugate compound obtained in Example 1, where I represents the intensity and zeta represents the potential in mV.
  • Figure 9 Scheme of an HA 2-mer oligomer of n monomers derivatized through an amide bond with thiopropionylhydrazide.
  • FIG. 10 Electron transmission microscopy (TEM) images captured with a Hitachi H-7000 transmission electron microscope with an acceleration voltage of 75 Kv of the conjugate compound obtained in Example 3.
  • FIG 11 UV-Vis absorption spectra of a solution of gold nanoparticles and a conjugate compound according to the invention (Example 3) recorded with a Shimadzu UV-240IPC spectroscope.
  • A represents the absorbance and ⁇ the wavelength (nm).
  • Figure 12 represents the Z-potential recorded by a Zetasizer Nano ZS, Malvern of the conjugate compound obtained in Example 3, where I represents the intensity, and zeta represents the potential in mV.
  • An object of the present invention refers to a new conjugate compound comprising: - at least one metal nanoparticle; Y
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond
  • linker comprising a group -S- through which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, with the condition of that when the HA oligomer has a number of monomers n, being n> 1000, and the nanoparticle is gold with a size of 20 nm, the linker is different from H 2 N-CH 2 -CH 2 -SH.
  • Another object of the present invention relates to various synthesis procedures for obtaining the new conjugate compound.
  • a further object refers to a conjugate compound obtainable by one of the synthesis methods of the present invention.
  • Another additional object relates to a multi-conjugate compound comprising:
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond, with at least one linker comprising a group -S- by which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, and - at least , a molecule conjugated to at least one metallic nanoparticle.
  • Another additional object refers to a cosmetic composition, hereinafter cosmetic composition of the invention, comprising at least one compound selected from: A conjugate compound comprising:
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond, with at least one linker comprising a group -S- through which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, and
  • a multi-conjugate compound of the invention together with at least one physiologically acceptable excipient.
  • Another additional object concerns the use of at least one compound selected from:
  • a conjugate compound comprising:
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond, with at least one linker comprising a group -S- through which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, and
  • a multi-conjugate compound of the invention in the preparation of a cosmetic composition for topical application or for application by injection into the skin.
  • a further object refers to a cosmetic treatment comprising the topical or injected application of the cosmetic composition of the present invention.
  • the invention is therefore related to a new conjugate compound comprising:
  • At least one HA oligomer derivatized through at least one chemical bond, with at least one linker comprising a group -S- by which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle,
  • linker refers to an organic molecule that covalently binds to an HA oligomer, as explained below, and joins said HA oligomer with the metal nanoparticle.
  • the linker in the present invention contains at least one sulfur atom that binds to the metal nanoparticle.
  • the linker can have in general diverse and numerous chemical structures, provided that the linker fulfills its function of joining the HA oligomer and the metal nanoparticle.
  • the linker has one of the general formulas described below.
  • the term "monomer" of HA in the present description refers to a unit consisting of two consecutive residues of D-glucuronic acid and N-acei ⁇ - D-glucosamine.
  • mer of HA in the present description refers to a saccharide unit, being indistinctly both D-glucuronic acid and N-acet ⁇ - D-glucosamine.
  • HA polymer is used in the present invention to refer to a natural HA oligomer, which is obtained from a natural biological source, such as those mentioned in the Background of the invention, and can be acquired from various companies that They commercialize it.
  • HA polymer and HA oligomer refer to the same compound, when they have the same number of monomers and structure, as well as their corresponding derivatives “derivatized HA polymer” and “oligomer. of derivatized HA ".
  • HA polymer is made in the present description for reasons of clarity, to refer to the starting product of natural HA that is used in the invention to obtain the conjugated or multi-conjugated compounds of the invention, in some of the procedures of the invention, and which has not been subjected to enzymatic hydrolysis as described below.
  • the conjugate compound can have very different structures, properties, and in it the various parameters that characterize them can vary. Among other parameters, the following can be mentioned: the size of the metal nanoparticle, which can be in turn, either a nanoparticle or a core particle. breastplate and which may comprise a metal as described below; the number of metal nanoparticles in the conjugate compound that is generally comprised between 1 and a maximum number that can be determined in each case by physical characterization techniques, and which depends, among other factors, on the total number of linkers of the HA oligomer; the molecular weight of the HA oligomer and therefore the number of HA monomers; the type of linker, that is to say its chemical formula, and the number of linkers that bind the HA oligomer to the metal nanoparticle; and depending on the linker, the type of chemical bond that covalently binds the HA oligomer to the linker that can be amide, ester and ether.
  • a conjugate compound may comprise more than one conjugated
  • the conjugate compound has a structure comprising: a) a metal nanoparticle and one or more HA oligomers, in which each of the HA oligomers is derivatized with a linker through a chemical bond, and in which each linker binds each HA oligomer to the metal nanoparticle, (see a specific example of this type of structure in
  • the conjugate compound has a structure comprising:
  • a metal nanoparticle and one or more HA oligomers in which each of the oligomers is derivatized with at least two linkers which link each HA oligomer to the metal nanoparticle, (see a specific example of this type of structure in Fig. 2)
  • the conjugate compound has a structure comprising:
  • Figure 5 shows the scheme of a compound conjugated with a structure according to the previous particular embodiment c), in which an HA oligomer has n monomers each linked by a linker to a metal nanoparticle. Since the size of the metal nanoparticle is much larger than the separation between the positions by which the HA oligomer is derivatized, it is possible that the same metal nanoparticle is conjugated to the oligomer by more than one position ( Figure 3).
  • the metal nanoparticle of the conjugate compound can be selected from the group consisting of nanoparticles and core-shell particles.
  • the nanoparticle, the core and the shell can be independently constituted by a material selected from the group formed by the metals Au, Ag, Pt, Co, Fe, the oxides derived from any one of the above metals and TiO 2 .
  • the nanoparticle is gold. Both gold nanoparticles and gold core-shell particles have a very versatile surface to functionalize it with various types of biomolecules such as HA. It is a noble element and very little reactive in biological media.
  • the metal nanoparticle has an average size of variable diameter generally between 2 and 100 nm. In a preferred embodiment the average diameter size is between 4-50 nm. In another more preferred embodiment the average diameter size is between 6-30 nm, and in an even more preferred embodiment the average diameter size is between 8-15 nm.
  • the HA oligomer or derivatized HA oligomer generally comprises between 1 and a maximum number of monomers, determined by the biological nature of the hyaluronic acid itself. Generally, this maximum number is around 50,000 HA monomers.
  • the hiauluronic acid oligomer comprises between 1-1000 HA monomers; in another particular embodiment it comprises between 1-100 HA monomers, and in another particular embodiment It comprises between 2-25 HA monomers.
  • the derivatized HA comprises 3 monomers.
  • the HA oligomer is derivatized with at least one linker and through at least one covalent chemical bond that is selected from an amide, ester and ether bond depending on the functional group of the HA that is It reacts in the derivatization reaction and the linker formula used.
  • the bond is amide -CONH-, formed between a free acid group of a mer (glucuronic acid) of HA and a linker of general formula H 2 NR 1 -SR 2 in the that:
  • n represents an integer between 1 and 20.
  • R 2 represents a group selected from
  • R 1 represents a group selected from
  • the linker is thiopropionylhydrazide and has the formula NH 2 -NH-CO- (CH 2 ) n -SH, where n is 2.
  • the HA oligomer already derivatized with this linker can be obtained from commercial form (Glycosil TM, Glycosan Biosystems Inc.) for its subsequent use in obtaining a conjugate compound according to some of the methods of the present invention described below.
  • the HA oligomer is derivatized according to one of the following alternatives: a) through at least one chemical ester bond -COO- formed between a carboxylic acid group of a mer (glucuronic acid) of HA and a linker of general formula HO-R 1 -SR 2 , or b) through at least one ether chemical bond, -O- formed between a group -OH of the HA oligomer and a general formula linker GS-R 1 -SR 2 ,
  • R 2 represents a group selected from
  • R 1 represents a group selected from
  • GS represents an outgoing group.
  • the conjugate compound has a ratio number of mers of HA / number of metal nanoparticles generally comprised between 2 and 100,000.
  • the number of metal nanoparticles in the conjugate compound is generally between 1 and a maximum number that can be determined by physical characterization techniques, and which depends on various factors such as the total number of linkers of the HA oligomer.
  • the conjugate compound is obtained according to the procedure described in Example 1.
  • the conjugate compound has been visualized by Transmission Electron Microscopy (TEM) ( Figure 6).
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • the gold nanoparticles show optical properties due to the surface resonance plasmon, in this way it is possible to accurately measure the adsorption of molecules in general to the metal surface.
  • the TEM image shows that gold nanoparticles concentrate on separate and scattered groups.
  • the UV-Vis Spectrum of the gold nanoparticles stabilized with sodium citrate is shown, and as the conjugation of the oligomers of HA derivatized to them, it induces a displacement of the absorption peak at a greater wavelength, in this case at 522 nm with respect to the unconjugated gold nanoparticles (519 nm).
  • Figure 8 shows the Z potential where it is observed that the conjugation of the derivatized HA oligomers induces a displacement of the Z potential peak at -19.1 mV with respect to the -50.8 mV peak corresponding to the unconjugated gold nanoparticles.
  • the conjugate compound is the one that has a general structure like the one shown in Figure 5.
  • the conjugate compound comprises gold nanoparticles of approximately 8 nm, and an oligomer of derivatized HA, whose formula is shown in Figure 9, "thiopropionylhydrazide-HA". This conjugate compound is obtained according to the procedure described in Example 3 and has been characterized.
  • Figure 10-A shows that gold nanoparticles without conjugating HA tend to be arranged forming characteristic clusters, where the distance between nanoparticles is the minimum possible due to their stabilization with sodium citrate.
  • the gold nanoparticles stabilized with sodium citrate show a characteristic peak at 521.2 nm (approx.).
  • the conjugate compound has great stability and resistance to be absorbed by the organism due to its conjugation with the metal nanoparticles.
  • the HA maintains its great capacity to retain water.
  • the metal nanoparticle could act as an inhibitor of the activity of the hyaluronidase enzyme on HA, which could also have an additional effect on the durability of the properties. of HA.
  • the invention relates to processes for the preparation of a conjugate compound comprising:
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond
  • linker comprising a group -S- through which the derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, with the condition of that when the HA oligomer has a number of monomers n, where n> 1000, and the nanoparticle is 20 nm gold, the linker is different from H 2 N-CH 2 -CH 2 -SH.
  • the preparation of the conjugated compounds can be done according to one or more of the following procedures described below, all of which are objects of the present invention.
  • gold nanoparticles are prepared, and the method for this is based on synthetic methods widely described in the literature as the so-called sodium citrate, (Turkevich, J., PC Stevenson, et al. (1951). " [The nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.]. "Discussions of the Faraday Society 11: 55-75) or also by reduction with NaBH 4
  • Procedure A comprises the following stages:
  • the previous stage to at least one metal nanoparticle.
  • Procedure B comprises the following stages:
  • Procedure C comprises the following stages:
  • step (ii) consists of the enzymatic hydrolysis of a HA polymer.
  • the starting HA polymer is obtained commercially as mentioned above.
  • the HA polymer in turn comprises oligomers of different number of mers of HA, which are hydrolyzed to give oligosaccharide fragments (oligomeric fragments) of smaller size and variable structure by means of the action of two possible types of enzymes a) and b), such and how do I know Represented in Scheme 1:
  • a) Hydrolysis with a hyaluronidase (hyaluronate 4-glucanhydrolase, EC 3.2.1.35). Hydrolysis occurs in the ⁇ -1-3 bonds of the HA polymer and results in structures of type D-GIcA- (I ⁇ 3) - [D-GlcNAc- (1 ⁇ 4) ⁇ D-GlcA] n -D -GlcNAc with a saturated uronic acid at the hydrolyzed end.
  • the oligosaccharides are prepared by the digestion of HA polymer with BTH ( "Bovine Hyaluronidase Testicular") (30 U / mg HA) at 37 0 C and different reaction times as described in the literature (Bertrand, P. and B. Delpech (1985), "Interaction of hyaluronectin with hyaluronic acid oligosaccharides.” J Neurochem 45 (2): 434-9;
  • step (ii) takes place in which the oligomeric fragments of different sizes resulting from the enzymatic degradation are optionally purified by a series of conventional techniques such as centrifugation, chromatography, misalignment and lyophilization. Subsequently, the purified oligomeric fragments are derivatized (iii) by chemical reaction with a linker. The derivatization thereof is carried out by modification of one of the following two types of functional groups: the carboxylic acid groups (COOH) or the alcohols (OH), both primary and secondary, of the disaccharide unit indicated in Scheme 2 :
  • COOH carboxylic acid groups
  • OH alcohols
  • the carboxylic acid (COOH) groups of the glucuronic acid present along the HA oligomer can be derivatized with a linker by means of the formation of two types of bond as shown in Scheme 3:
  • R 2 represents a group selected from
  • R 1 represents a group selected from
  • R 2 represents a group selected from
  • R 1 represents a group selected from
  • n is a value between 1 and 20;
  • the alcohols (OH), both primary and secondary, of the disaccharide unit (Scheme 2), can be derivatized with a linker of general formula:
  • R 2 represents a group selected from
  • R 1 represents a group selected from
  • GS represents an outgoing group
  • reaction conditions such as the proportion of the reagents, quantity and / or type of solvent, pH, temperature and the reaction time, the majority functionalization of the primary alcohol against the secondary ones and the amount of mono-, di- or tri-substitution of secondary alcohols.
  • step (iv) of procedure A at least one of the oligomeric fragments of derivatized HA is conjugated to at least one metal nanoparticle.
  • an aqueous solution with a concentration generally around 10 12 metal nanoparticles per milliliter is typically stirred in the presence of a large excess of the derivatized HA oligomer in question, at room temperature for 1 hour.
  • the proportion of HA oligomer with respect to the concentration of metal nanoparticles is calculated as follows: a) the number of metal atoms in the surface of a sphere is calculated, by theoretical calculation of the surface area thereof, and assuming that each atom occupies 1-2 nm 2 . It is assumed that each sulfur atom of the linker is conjugated with a single atom of the metal nanoparticle. Taking into account the number of metallic nanoparticles in solution, a 100-fold excess of derivatized HA oligomer is added.
  • the conjugate compound obtained is purified and then isolated by dialysis according to the method described in Example 2.1.4.
  • procedure D) of obtaining a conjugate compound which comprises:
  • the method E) for the preparation of a conjugate compound comprises: (i) conjugation of a derivatized HA polymer with a linker comprising a group -S- through at least one amide, ester or ether chemical bond to at least one metal nanoparticle;
  • both the procedure D) and the procedure E] of the present invention it is based on a previously derivatized HA polymer, commercially available, such as Glycosil TM (Glycosan Biosystems Inc., see Example 1) .
  • Glycosil TM can therefore be conjugated to a metal nanoparticle in the first place, and then be hydrolyzed to generate derivatized HA oligomeric fragments and already attached to the metal nanoparticle (method E))
  • Glycosil TM can first be hydrolyzed to generate fragments derivatized HA oligomers that are subsequently conjugated to a metal nanoparticle (method D).
  • HA oligomers of up to 1000 kDa are obtained by biosynthesis, by means of the action of a Hyaluronate Syntase in a conventional manner, as described in the state of the art . See examples in: APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2005, 71, No. 7, p. 3747-3752;
  • the biosynthesized HA oligomers of up to 1000 kDa are derivatized through the -OH group of position 3 or 4 of the initial or final removal of the oligomer with a linker of general formula GS-R 1 -SR 2 .
  • a conjugate compound comprising:
  • the linker is different from H 2 N-CH 2 -CH 2 - SH.
  • Procedure G comprises the following stages:
  • the procedure G is characterized by the absence of an enzymatic hydrolysis stage.
  • the starting HA polymer or oligomer for process G is obtained from any biological source of HA from various marketing companies. Derivatization is carried out by modification of one of the two types of functional groups: the carboxylic acid (COOH) groups or the alcohols (OH), both primary and secondary, according to any of the methods described above. Then the stage of conjugation following the method already described.
  • the invention relates to a conjugate compound obtainable by at least one of the procedures described above.
  • the various conjugated compounds are easily obtainable by one skilled in the art in view of the content of the present description, of the Examples, and of the common general knowledge by varying the parameters described above, such as, for example, the size of the metal nanoparticles used, the oligomers, the type of linker, as well as the reaction conditions.
  • multi-conjugate compound of the invention which comprises:
  • a peptide a protein
  • an inhibitor of HA hydrolysis a compound selected from the group formed by the inhibitors of the hydrolysis of HA produced by an enzyme of the family of hyaluronidases.
  • the multi-conjugate compound of the invention which also comprises another additional conjugated molecule, can be easily obtained by means of multi-conjugation techniques of molecules to the surface of a metal nanoparticle known to a person skilled in the art.
  • Each molecule to be conjugated to the metal nanoparticle is previously derivatized with a specific linker.
  • the multi-conjugation techniques are based on the difference in affinity of the linker by which each type of molecule has been derivatized and the difference in concentration of each type of molecule in the conjugation reaction to the metal nanoparticle.
  • the invention relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising at least one compound selected from: a conjugate compound comprising:
  • the cosmetic composition can be prepared for topical application or by injection.
  • the invention relates to the use of at least one compound selected from: a conjugate compound comprising:
  • HA oligomer derivatized through at least one chemical bond
  • linker comprising an -S- group through which a derivatized HA oligomer is attached to the metal nanoparticle, or a multi-conjugated compound of the invention, in the elaboration of a cosmetic composition, in particular for its topical application or by injection into the skin.
  • another additional aspect of the invention refers to a cosmetic treatment of the skin of a human comprising the application of the cosmetic composition of the present invention.
  • Cosmetic treatment has advantages with respect to cosmetic treatments of the state of the art based on HA in that it improves the physical structure and stability of HA.
  • the conjugate compound absorbs water in the deep layers of the skin making the filling effect necessary to attenuate wrinkles and folds.
  • the binding of the HA oligomer to the metal nanoparticle seems to protect HA oligomers to the organism from its direct absorption to the organism and allows supply HA in high concentration, by concentrating several HA oligomers in a single conjugate compound.
  • the inventors consider that the mechanisms by which the conjugation to a metal nanoparticle protects the HA from being absorbed, could be the following: On the one hand, the structure of the HA oligomers covering the metal nanoparticle It has a spatial distribution that is less reactive against absorption metabolism.
  • the conjugate compound could chemically protect the parts of HA capable of degrading due to enzyme activity and that the metal nanoparticle is conjugated by a structural place close to the functional group by which said enzyme fragments the oligomer. In this way, the action of the hyaluronidase on the HA oligomer would be hindered.
  • the cosmetic treatment is topical, and presents, among others, the advantages of being within the reach of each individual in the sense that, he himself can implement it on the skin without any risk, being painless, comfortable and more economically affordable than an injection treatment.
  • the conjugate or multi-conjugate compound for topical application preferably comprises HA oligomers of a molecular weight of less than 1000 kDa that can easily penetrate into the dermis. In this way, the conjugated HA oligomer absorbs water in the deep layers of the skin, making the filling effect necessary to attenuate wrinkles and folds.
  • the cosmetic treatment is by injection and It also has some advantages.
  • the conjugation of HA oligomers to nanoparticles improves the stability of the HA oligomer, obtaining a product that maintains its corrective effect of wrinkles and folds for longer, spacing the need for injected treatments and thus improving the quality of life of the user.
  • the conjugate or multi-conjugate compound for application by injection preferably comprises HA oligomers of a molecular weight greater than 500 kDa since once injected into the deep layers of the skin, its durability is greater.
  • EXAMPLE 1.1 Synthesis of gold nanoparticles An aqueous solution (150 mL) of sodium citrate (2.2 mM) was heated to a boil with vigorous stirring. The next step was to add 1 mL of an aqueous solution (23.4 mM) of HAuCI 4 on the boiling solution. The reduction took place in approximately 2 minutes and a solution of gold nanoparticles was formed, which underwent a color change indicative of violet to deep red. Finally, the reactor was separated from the heat source and allowed to cool to room temperature. The gold nanoparticles thus obtained were characterized by UV-Vis. The average size of 8 nm of the gold nanoparticles was determined by computer treatment of the images obtained by TEM, the diameter of a random sample of nanoparticles was also measured and the Gaussian size distribution was performed.
  • EXAMPLE 1.2 Functionalization of gold nanoparticles with oligomer (21-monomers) of derivatized HA 1.2.1 Enzymatic hydrolysis of thiopropionylhydrazide-HA (derivatized HA polymer)
  • Thiopropionylhydrazide-HA (Glycosil TM, Glycosan Biosystems Inc.) was depolymerized by the action of the enzyme hyaluronate 4-glucanhydrolase ("Bovine Testicular
  • Hyaluronidase (BTH)) (E.C. 3.2.1.35) (Hyaluronidase Type I-S, Sigma-Aldrich).
  • aqueous buffer solution 100 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 8.
  • the HA-derivatized oligomer mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 30 min and the supernatant was concentrated and lyophilized. Then, the lyophilized sample was reconstituted in distilled water. (Glycobiology, 2002 Jul; 12 (7): 421-6).
  • EXAMPLE 1.3 Conjugation of gold nanoparticles to oligomers (21- monomers) of derivatized HA
  • the 8 nm gold nanoparticles obtained according to Example 1.1 were functionalized with the derivatized oligomers (thiopropionylhydrazide-HA, MW 1455 g / mol) obtained in Ia previous step, by adding 100 ⁇ l of a 1.5 mM solution of oligomer derivatized by 5 mL of gold nanoparticle solution.
  • the reaction was carried out at room temperature and with magnetic stirring for 30 minutes. The reaction was stopped by lowering the temperature (inside the refrigerator).
  • the purification was done by dialysis (molecular weight cut off (MWCO) 16 mm) against sodium citrate (2.3 mM, 3.25 g / 5L H 2 O).
  • the conjugate compound was obtained
  • the UV-Vis absorption spectra of the solution of the conjugate and purified compound obtained in the previous stage were recorded.
  • the conjugation to a nanoparticle of the oligomers of derivatized HA induces a displacement of the absorption peak at a greater wavelength (in this case at 522 nm) as shown in Figure 7 with respect to the absorption peak of unconjugated gold nanoparticles (519 nm).
  • TEM images of the conjugate compound ( Figure 6) obtained were captured.
  • the samples for TEM studies were prepared by depositing a drop of the aqueous solution of the conjugate and purified compound obtained on TEM gratings coated with a carbon membrane.
  • the Z-potential of the conjugate compound was determined.
  • the conjugation to a nanoparticle of the derivatized HA oligomers induces a displacement of the Z potential peak at -19.1 mV as shown in Figure 8 with respect to the -50.8 mV peak corresponding to the unconjugated gold nanoparticles.
  • EXAMPLE 2.1 Functionalization of gold nanoparticles with HA oligomers 2.1.1 Enzymatic hydrolysis of an HA polymer
  • HA sodium salt, from Streptococcus eq., Sigma-Aldrich
  • BTH Bovine Testicular Hyaluronidase
  • hyaluronate 4-glucanhydrolase EC 3.2.1.35
  • Hyaluronidase Type IS Sigma-Aldrich
  • HA oligomers The mixture of HA oligomeric fragments was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes and the supernatant was concentrated and lyophilized. Next, the HA oligomers were purified by Centricon Plus 20 centrifuge tubes with a molecular weight cut of 10 kDa. Finally, a mixture of HA oligomers of sizes between 2 and 26 monomers was obtained (Glycobiology, 2002 Jul; 12 (7): 421-6) which was used in the next stage.
  • the carboxyl groups (-COOH) free of glucuronic acid present along the chain were derivatized with a "linker” by means of the formation of an amide bond using the carbodiimide method.
  • the oligomer of HA (8 KDa) (0.1 g, approx. 12.5 mmol) was dissolved in 25 ml of distilled water, stirred for 30 minutes and then the pH was adjusted to 5-5.5 with 0.1 N HCI (sometimes depending on Ia commercial house from which the HA is acquired there is no need to adjust the pH because the pH is already below 5).
  • the mixture of the resulting reaction was extensively dialyzed with a dialysis membrane with a molecular weight cutoff of 3500 Da against (i) NaCI (3Og, 100 mM) + 0.1 N HCI (15 mi, 0.3 mM) (4 days) and ( ii) 0.1 N HCI (15 mi, 0.3 mM) (4 days) and finally against distilled and demineralized water (2 days).
  • the 8 nm gold nanoparticles obtained in Example 1.1 were conjugated with the derivatized oligomers (21 -monomers) obtained in 2.1.3, by adding 100 ⁇ l of a 1.5 mM solution of derivatized oligomers per 5 mL of nanoparticle solution .
  • the reaction was carried out at room temperature and with magnetic stirring for 30 minutes. The reaction was stopped by lowering the temperature to 4 0 C.
  • the purification was done by dialysis (MWCO 16 kDa) against sodium citrate (2.3 mM, 3.25 g / 5L H 2 O).
  • the 8 nm gold nanoparticles were conjugated with a derivatized HA polymer, by adding 100 ⁇ l of a 1.5 mM solution of thiopropionylhydrazide-HA (Glycosil TM) for 5 ml of gold nanoparticle solution.
  • the reaction was carried out at room temperature and with magnetic stirring for 30 minutes (Macromolecules 2006, 39, 23-25). The reaction was stopped by lowering the temperature to 4 0 C.
  • Z-potential was determined.
  • the nanoparticle conjugation of the derivatized HA oligomers induces a displacement of the Z potential peak at -18.2 mV as shown in Figure 12 with respect to the -48.5 mV peak corresponding to the unconjugated gold nanoparticles.

Abstract

La presente invención describe un nuevo compuesto conjugado que comprende al menos un oligómero de HA derivatizado a través de un linker tiolado, por el que se une a al menos una nanopartícula metálica, como por ejemplo una nanopartícula de oro. Asimismo, se describen procedimientos para su obtención, así como su uso en un tratamiento cosmético, y composiciones cosméticas que los contienen.

Description

CONJUGADO DE ÁCIDO H1ALURÓNICO PARA EL TRATAMIENTO COSMÉTICO Y PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un nuevo compuesto conjugado de ácido hialurónico y una nanopartícula metálica, así como a un procedimiento para su obtención. Asimismo Ia invención se refiere a su uso en tratamientos cosméticos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El ácido hialurónico o HA, es un glicosaminoglicano natural muy abundante en todos los tejidos mesodérmicos, en el humor vitreo y en Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical. Está presente en Ia matriz intercelular de los tejidos, en los diferentes tejidos de todas las especies animales y desempeña una importante función en Ia estructura de Ia piel, siendo responsable de Ia elasticidad de la misma. Tiene Ia capacidad de retener a su alrededor una gran cantidad de agua aportando volumen a los tejidos. Su estructura consiste en unidades de disacárido alternantes de ácido D- glucurónico y N-acetil-D-glucosamina unidos por enlaces glicosídicos β-1-3 y β-1-4. A diferencia de otros polisacáridos, el HA no tiene una forma definida en el espacio, sino que se extiende aleatoriamente tendiendo a ocupar un volumen muy grande debido a Ia repulsión electrostática de los grupos carboxilo del ácido glucurónico. Al mismo tiempo, forma mallas que retienen una gran cantidad de agua.
El HA tiene un papel decisivo como elemento conjuntivo de los tejidos. En Ia piel se concentra cerca del 56% del HA existente en el cuerpo. La dermis corporal posee una red entramada de fibras de colágeno dentro de una sustancia intersticial cuya composición está ampliamente constituida por HA. Las propiedades elásticas de este ácido proporcionan resistencia contra Ia compresión, y es así como Ia piel protege las estructuras subyacentes contra las agresiones externas, a Ia vez que las propiedades no-Newtonianas del HA permiten que las fibras de colágeno se muevan fácilmente a través de Ia sustancia intersticial. Este proceso de lubricación mediante HA permite que Ia piel se adapte a las alteraciones de forma y volumen que tienen lugar cuando se mueven los huesos y los ligamentos.
Cuando envejecemos, disminuye Ia cantidad de HA (HA) de Ia piel, dado que las células cutáneas van perdiendo su capacidad de producción. Además, el peso molecular del HA disminuye con Ia edad, de tal modo que ya no conserva el agua, como Io hacía anteriormente. Esta reducción de volumen es Ia que da origen a las arrugas. Se estima que a Ia edad de 40 años Ia cantidad de HA en piel se ha reducido a Ia mitad. Después de los 60 solo queda un 10%.
El HA se utiliza en cosmética desde 1996, puede ser de origen animal (de Ia cresta de las gallinas y del globo ocular de los peces) o de origen biológico (extractos de cultivo de bacterias). El HA es el responsable de Ia elasticidad de Ia piel. Es un gran remedio contra las arrugas, pues aumenta el volumen en pliegues, surcos y depresiones cutáneas. Su aplicación periódica provoca Ia regeneración del colágeno propio. La ventaja de este producto es que es una sustancia compatible con todos los tejidos, por Io tanto no requiere de ningún tipo de prueba cutánea como ocurre con el colágeno.
Se conocen tratamientos cosméticos en el estado de Ia técnica a base de HA. Sin embargo, Ia aplicación cosmética de HA, conlleva Ia pérdida de Ia conformación del HA, y como consecuencia Ia disminución de Ia estabilidad y de Ia capacidad de retener agua.
Por tanto sigue existiendo Ia necesidad en el estado de Ia técnica de proporcionar nuevos compuestos de HA que mejoren el tiempo de vida y Ia estabilidad del HA para su utilización en tratamientos cosméticos.
En este sentido los inventores han descubierto sorprendentemente que Ia conjugación de oligómeros de HA de a Ia superficie de una nanopartícula metálica a través de un linker, mejora las propiedades de estructura física, estabilidad y durabilidad, y en general las propiedades de penetración transdérmica. La aplicación cosmética de este conjugado proporciona por tanto un efecto sobre Ia piel rellenador de arrugas, eficaz y duradero, que puede sustituir a otros tratamientos menos eficaces.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: representa un modelo ilustrativo de un compuesto conjugado de Ia invención, que comprende una nanopartícula metálica y 2 oligómeros (de 6-mer) de tiopropionilhidrazida-HA, en el que cada uno de los oligómeros está derivatizado a través de un enlace químico amida, y en Ia que cada linker une cada oligómero de
HA a Ia nanopartícula metálica.
Figura 2: representa un modelo ilustrativo de un compuesto conjugado que contiene una nanopartícula metálica y 2 oligómeros de HA (de 4-mer), en Ia que cada uno de los oligómeros está derivatizado en las posiciones ácido carboxílico con dos linkers, los cuales unen cada oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica.
Figura 3: representa un modelo ilustrativo de un compuesto conjugado que consiste en 1 oligómero de 8-mer de HA derivatizado en las posiciones ácido carboxílico a través de enlaces químicos amida con 4 linkers, los cuales unen el oligómero a 1 nanopartícula metálica.
Figura 4: representa un modelo ilustrativo de un compuesto conjugado que consiste en 1 oligómero de 8-mer conjugado a 4 nanopartículas metálicas.
Figura 5: muestra un esquema de un compuesto conjugado que consiste en un oligómero de HA con n monómeros unidos cada uno mediante un linker a una nanopartícula metálica.
Figura 6: imágenes de microscopía de transmisión electrónica (TEM) capturadas con un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000 con un voltaje de aceleración de 75 Kv del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 1. Figura 7: espectros de absorción de UV-Vis de una disolución de nanopartículas de oro y del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 1 , registrados con un espectroscopio Shimadzu UV-240IPC. A representa Ia absorbancia y λ Ia longitud de onda (nm).
Figura 8: representa el potencial-Z registrado mediante un Zetasizer Nano ZS, Malvern del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 1 , donde I representa Ia intensidad y zeta representa el potencial en mV.
Figura 9: esquema de un oligómero HA 2-mer de n monómeros derivatizado a través de un enlace amida con tiopropionilhidrazida.
Figura 10: Imágenes de microscopía de transmisión electrónica (TEM) capturadas con un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7000 con un voltaje de aceleración de 75 Kv del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 3.
Figura 11: espectros de absorción de UV-Vis de una disolución de nanopartículas de oro y de un compuesto conjugado según Ia invención (Ejemplo 3) registrados con un espectroscopio Shimadzu UV-240IPC. A representa Ia absorbancia y λ Ia longitud de onda (nm).
Figura 12: representa el potencial-Z registrado mediante un Zetasizer Nano ZS, Malvern del compuesto conjugado obtenido en el Ejemplo 3, donde I representa Ia intensidad, y zeta representa el potencial en mV.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Un objeto de Ia presente invención se refiere a un nuevo compuesto conjugado que comprende: - al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, con Ia condición de que cuando el oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y Ia nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es distinto de H2N-CH2-CH2-SH.
Otro objeto de Ia presente invención se refiere a diversos procedimientos de síntesis para Ia obtención del nuevo compuesto conjugado.
Un objeto adicional se refiere a un compuesto conjugado obtenible mediante uno de los procedimientos de síntesis de Ia presente invención.
Otro objeto adicional se relaciona con un compuesto multiconjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, y - al menos, una molécula conjugada a, al menos, una nanopartícula metálica.
Otro objeto adicional se refiere a una composición cosmética, en adelante composición cosmética de Ia invención, que comprende al menos un compuesto seleccionado entre: Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, y
Un compuesto multiconjugado de Ia invención, junto con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.
Otro objeto adicional se refiere al empleo de al menos un compuesto seleccionado entre:
Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, y
Un compuesto multiconjugado de Ia invención, en Ia elaboración de una composición cosmética para su aplicación tópica o para su aplicación mediante inyección en Ia piel.
Un objeto adicional se refiere a un tratamiento cosmético que comprende Ia aplicación tópica o inyectada de Ia composición cosmética de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un primer aspecto, Ia invención se relaciona, por tanto, con un nuevo compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica,
con Ia condición de que cuando el oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y Ia nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es distinto de H2N-CH2-CH2-SH. En el contexto de Ia invención el término "linker" (enlazador) se refiere a una molécula orgánica que se une de forma covalente a un oligómero de HA, como se explica más adelante, y une dicho oligómero de HA con Ia nanopartícula metálica. El linker en Ia presente invención contiene al menos un átomo de azufre que se une a Ia nanopartícula metálica. El linker puede tener en general diversas y numerosas estructuras químicas, siempre que el linker cumpla su función de unir el oligómero de HA y Ia nanopartícula metálica. Dichas estructuras pueden ser variables y fácilmente reconocidas por un experto en Ia materia. En una realización particular de Ia invención el linker presenta una de las fórmulas generales que se describen más abajo. El término "monómero" de HA en Ia presente descripción se refiere a una unidad constituida por dos residuos consecutivos de ácido D-glucurónico y N-acei\\-D- glucosamina unidos.
El término "mer" de HA en Ia presente descripción se refiere a una unidad de sacárido, tratándose indistintamente tanto de ácido D-glucurónico como de N-acet\\-D- glucosamina.
El término "polímero de HA" se utiliza en Ia presente invención para referirse a un oligómero de HA natural, que se obtiene de una fuente biológica natural, como por ejemplo las citadas en los Antecedentes de Ia invención, y puede adquirirse de diversas empresas que Io comercializan. En casos es evidente que "polímero de HA" y "oligómero de HA" se refieren al mismo compuesto, cuando tienen el mismo número de monómeros y estructura, así como en ocasiones son iguales sus correspondientes derivados "polímero de HA derivatizado" y "oligómero de HA derivatizado". El empleo del término "polímero de HA" se hace en Ia presente descripción por motivos de claridad, para referirse al producto de partida de HA natural que se utiliza en Ia invención para obtener los compuestos conjugados o multconjugados de Ia invención, en algunos de los procedimientos de Ia invención, y que no ha sido sometido a hidrólisis enzimática como se describe más adelante.
En Ia presente descripción términos en singular tales como "un", "uno", "una", "el", "Ia" o "del" se pueden referir en cada caso a Ia forma singular o plural.
El compuesto conjugado puede presentar muy diversas estructuras, propiedades, y en él pueden variar los diversos parámetros que los caracterizan. Entre otros parámetros cabe mencionar los siguientes: el tamaño de Ia nanopartícula metálica, que puede ser a su vez, bien una nanopartícula o bien una partícula núcleo- coraza y que puede comprender un metal como se describe más abajo; el número de nanopartículas metálicas en el compuesto conjugado que está generalmente comprendido entre 1 y un número máximo que puede ser determinado en cada caso mediante técnicas de caracterización física, y que depende, entre otros factores del número total de linkers del oligómero de HA; el peso molecular del oligómero de HA y por tanto del número de monómeros de HA; el tipo de linker, es decir su fórmula química, y el número de linkers que unen el oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica; y dependiendo del linker el tipo de enlace químico que une covalentemente el oligómero de HA al linker que puede ser amida, éster y éter. Asimismo, un compuesto conjugado puede comprender más de un oligómero conjugado, con distintos números de monómeros cada uno.
Como se desprende de Ia presente descripción son muy numerosos los compuestos conjugados definidos en Ia presente invención.
De acuerdo con una realización particular de Ia invención, el compuesto conjugado presenta una estructura que comprende: a) una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en el que cada uno de los oligómeros de HA está derivatizado con un linker a través de un enlace químico, y en Ia que cada linker une cada oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica, (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en
Ia Figura 1)
En otra realización particular de Ia invención el compuesto conjugado presenta una estructura que comprende:
b) una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en Ia que cada uno de los oligómeros está derivatizado con al menos dos linkers los cuales unen cada oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica, (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en Ia Fig.2)
En otra realización particular de Ia invención el compuesto conjugado presenta una estructura que comprende:
c) uno o más oligómeros de HA derivatizados con más de un linker cada uno, los cuales unen cada oligómero de HA a una o más nanopartículas metálicas (ver un ejemplo concreto de este tipo de estructura en Ia Fig. 3 y otro Ejemplo en Ia Figura 4).
La Figura 5 muestra el esquema de un compuesto conjugado con una estructura de acuerdo con Ia realización particular anterior c), en el que un oligómero de HA presenta n monómeros cada uno unido mediante un linker a una nanopartícula metálica. Dado que el tamaño del nanopartícula metálica es mucho mayor que Ia separación entre las posiciones por las que el oligómero de HA se derivatiza, es posible que una misma nanopartícula metálica se conjugue al oligómero por más de una posición (Figura 3).
La nanopartícula metálica del compuesto conjugado puede seleccionarse de entre el grupo formado por nanopartículas y partículas núcleo-coraza. La nanopartícula, el núcleo y Ia coraza pueden estar independientemente constituidos por un material seleccionado del grupo formado por los metales Au, Ag, Pt, Co, Fe, los óxidos derivados de uno cualquiera de los metales anteriores y TiO2. En una realización preferente Ia nanopartícula es de oro. Tanto las nanopartículas de oro como las partículas núcleo-coraza de oro presentan una superficie muy versátil para funcionalizarla con diversos tipos de biomoléculas como el HA. Se trata de un elemento noble y muy poco reactivo en medios biológicos.
La nanopartícula metálica presenta un tamaño medio de diámetro variable generalmente comprendido entre 2 y 100 nm. En una realización preferida el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 4 - 50nm. En otra realización más preferida el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 6-30nm, y en una realización aún más preferida el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 8-15nm.
El oligómero de HA o el oligómero de HA derivatizado comprende en general entre 1 y un número máximo de monómeros, determinado por Ia naturaleza biológica del propio ácido hialurónico. Generalmente, este número máximo está entorno a 50,000 monómeros de HA. En una realización particular el oligómero de ácido hiaulurónico comprende entre 1-1000 monómeros de HA; en otra realización particular comprende entre 1-100 monómeros de HA, y en otra realización particular comprende entre 2-25 monómeros de HA. Finalmente en una realización preferida el HA derivatizado comprende 3 monómeros.
En el compuesto conjugado el oligómero de HA se encuentra derivatizado con, al menos, un linker y a través de, al menos, un enlace químico covalente que se selecciona de entre un enlace amida, éster y éter en función del grupo funcional del HA que se hace reaccionar en Ia reacción de derivatización y de Ia fórmula del linker que se utiliza. En este sentido, en una realización particular de Ia invención, el enlace es amida -CONH-, formado entre un grupo ácido libre de un mer (ácido glucurónico) de HA y un linker de fórmula general H2N-R1-S-R2 en el que:
R2 representa un grupo seleccionado entre H, -CH3, -(CH2)n-CH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2)I,-, -NH-CO-(CHz)n-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20.
En una realización preferida, en el linker de fórmula general H2N-R1-S-R2
R2 representa un grupo seleccionado de entre
H, -CH3, -CH2-CH3 y -CH2-CH=CH2 y R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)(COOH)(CH2)n- donde n es 1 ó 2.
En una realización más preferida el linker es tiopropionilhidrazida y presenta Ia fórmula NH2-NH-CO-(CH2)n-SH, donde n es 2. En particular, el oligómero de HA ya derivatizado con este linker, se puede obtener de forma comercial (Glycosil™, Glycosan Biosystems Inc.) para su posterior empleo en Ia obtención de un compuesto conjugado según algunos de los procedimientos de Ia presente invención que se describen más abajo.
De acuerdo con otra realización particular el oligómero de HA está derivatizado según una de las siguientes alternativas: a) a través de, al menos, un enlace químico éster -COO-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer (ácido glucurónico) de HA y un linker de fórmula general HO-R1-S-R2, ó b) a través de, al menos, un enlace químico éter, -O- formado entre un grupo -OH del oligómero de HA y un linker de fórmula general GS-R1-S-R2,
donde
R2 representa un grupo seleccionado entre
H, -CH3, -(CH2)n-CH3 , -(CHs)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y
R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2)n-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
GS representa un grupo saliente.
En una realización preferente, en las fórmulas generales HO-R1-S-R2 y GS- R1-S-R2
R2 representa un grupo seleccionado de entre H, -CH3, -CH2-CH3 y -CH2-CH=CH2 y R1 representa un grupo -(CH2)n- donde n es un valor comprendido entre 1 y 20.
El compuesto conjugado presenta una relación número de mers de HA/ número de nanopartículas metálicas comprendida generalmente entre 2 y 100000.
En una realización particular entre 4 y 2000; de acuerdo con otra realización particular entre 4 y 200; y según otra realización particular entre 4 y 50.
El número de nanopartículas metálicas en el compuesto conjugado está generalmente comprendido entre 1 y un número máximo que puede ser determinado mediante técnicas de caracterización físicas, y que depende de diversos factores tales como el número total de linkers del oligómero de HA.
En una realización particular el compuesto conjugado se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. El compuesto conjugado ha sido visualizado mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) (Figura 6). Las nanopartículas de oro muestran propiedades ópticas debido al plasmón de resonancia de Ia superficie, de este modo es posible medir con precisión Ia adsorción de moléculas en general a Ia superficie del metal.
La imagen de TEM muestra que las nanopartículas de oro se concentran en grupos separados y dispersos. En Ia Figura 7, se muestra el Espectro UV-Vis de las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato sódico, y como Ia conjugación de los oligómeros de HA derivatizado a ellas, induce a un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de onda mayor, en este caso a 522 nm con respecto al de las nanopartículas de oro sin conjugar (519 nm). La Figura 8 muestra el potencial Z donde se observa que Ia conjugación de los oligómeros de HA derivatizado induce a un desplazamiento del pico de potencial Z a -19.1 mV con respecto al pico de -50.8 mV correspondiente a las nanopartículas de oro no conjugadas.
Como se mencionó anteriormente de acuerdo a una realización particular el compuesto conjugado es el que presenta una estructura general como Ia que se representa en Ia Figura 5. En un caso más particular el compuesto conjugado comprende nanopartículas de oro de 8 nm aproximadamente, y un oligómero de HA derivatizado, cuya fórmula se muestra en Ia Figura 9, "tiopropionilhidrazida-HA". Este compuesto conjugado se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 y ha sido caracterizado.
En este sentido el compuesto conjugado ha sido visualizado mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). En Ia Figura 10-A se observa que las nanopartículas de oro sin conjugar al HA tienden a ordenarse formando agrupaciones características, donde Ia distancia entre nanopartículas es Ia mínima posible debido a su estabilización con citrato sódico.
En cambio, en el caso de que Ia nanopartícula de oro se conjugue al HA (Figura 10-B), se observa que las nanopartículas de oro están más distanciadas y se pierde su agrupación característica inicial de las nanopartículas sin conjugar. En este caso, se intuye que las nanopartículas de oro se agrupan a Io largo de las cadenas de oligómeros de HA, que, a Ia vez, se entrecruzan (efecto cross-linking) formando una maya del compuesto conjugado.
En esta realización particular, las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato sódico muestran un pico característico a 521 ,2 nm (aprox.). En cambio cuando se conjugan a oligómeros de HA derivatizados se puede observar que se produce un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de onda mayor en este caso a 523,8 nm (Figura 11). El compuesto conjugado presenta gran estabilidad y resistencia a ser absorbido por el organismo debido a su conjugación con las nanopartículas metálicas. Como consecuencia el HA mantiene su gran capacidad de retener agua. Además parece, aunque en este sentido los inventores no desean verse ligados a ninguna teoría, que Ia nanopartícula metálica podría actuar como inhibidor de Ia actividad de Ia enzima hialuronidasa sobre el HA, Io cual podría tener también un efecto adicional sobre Ia durabilidad de las propiedades del HA.
De acuerdo con un otro aspecto, Ia invención se relaciona con procedimientos para Ia preparación de un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, con Ia condición de que cuando el oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y la nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es distinto de H2N-CH2-CH2-SH.
La preparación de los compuestos conjugados puede hacerse de acuerdo a uno o más de los siguientes procedimientos que se describen a continuación, todos ellos objetos de Ia presente invención.
Los procedimientos que se describen a continuación comprenden una etapa común, Ia preparación de una nanopartícula metálica que se lleva a cabo con control de forma y tamaño mediante reacciones químicas bien conocidas para un experto en
Ia materia. En una realización particular se preparan nanopartículas de oro, y el método para ello se basa en métodos sintéticos ampliamente descritos en la literatura como el denominado del citrato de sodio, (Turkevich, J., P. C. Stevenson, et al. (1951). "[The nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.]." Discussions of the Faraday Society 11 : 55-75) o también por reducción con NaBH4
(Haiss, W., N. T. Thanh, et al. (2007). "Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-vis spectra." Anal Chem 79(11): 4215-21).
Los distintos procedimientos se describen a continuación: El Procedimiento A) comprende las siguientes etapas:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de HA; (iii) derivatización de los fragmentos oligómeros de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(iv) conjugación de al menos un fragmento oligómero de HA derivatizado obtenido en
Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica.
El Procedimiento B) comprende las siguientes etapas:
(i) derivatización de un polímero de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- por formación de al menos un enlace químico amida, éster o éter; (ii) hidrólisis enzimática del polímero de HA derivatizado;
(iii) obtención de fragmentos oligómeros de HA derivatizados; y
(iv) conjugación de al menos uno de los fragmentos obtenidos en Ia etapa anterior con al menos una nanopartícula metálica.
El Procedimiento C) comprende las siguientes etapas:
(i) derivatización de un polímero de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(ii) conjugación del polímero de HA derivatizado obtenido en Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica;
(iii) hidrólisis enzimática del polímero de HA derivatizado; (iv) obtención del compuesto conjugado.
De acuerdo al Procedimiento A, Ia etapa (ii) consiste en Ia hidrólisis enzimática de un polímero de HA. El polímero de HA de partida, se obtiene de forma comercial como se ha mencionado anteriormente. El polímero de HA comprende a su vez oligómeros de diferente número de mers de HA, los cuales se hidrolizan para dar fragmentos oligosacáridos (fragmentos oligómeros) de menor tamaño y estructura variable mediante Ia acción de dos tipos de enzimas posibles a) y b), tal y como se representa en el Esquema 1 :
a) Hidrólisis con una hialuronidasa (hialuronato 4-glucanohidrolasa, E. C. 3.2.1.35). La hidrólisis se produce en los enlaces β-1-3 del polímero de HA y resulta en estructuras del tipo D-GIcA-(I →3)-[D-GlcNAc-(1→4)~D-GlcA]n-D-GlcNAc con un ácido urónico saturado en el extremo hidrolizado. Los oligosacáridos se preparan mediante Ia digestión de polímero de HA con BTH ("Bovine Testicular Hyaluronidase") (30 U/mg HA) a 37 0C y diferentes tiempos de reacción según se describe en Ia literatura (Bertrand, P. and B. Delpech (1985), "Interaction of hyaluronectin with hyaluronic acid oligosaccharides." J Neurochem 45(2): 434-9;
Courel, M. N., C. Maingonnat, et al. (2002). "Importance of hyaluronan length in a hyaladherin-based assay for hyaluronan." Anal Biochem 302(2): 285-90.; Tawada, A., T. Masa, et al. (2002). "Large-scale preparation, purification, and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers." Glycobiology 12(7): 421-6). El tamaño de oligosacárido final varía en función del tiempo de incubación.
b) Hidrólisis con una hialuronato Nasa (E.C. 4.2.2.1). La hidrólisis se produce en los enlaces β-1-4 y se obtienen oligosacáridos con un ácido urónico Δ4-insaturado del extremo hidrolizado para dar oligosacáridos de estructuras L-4dthrHex4enA- (1→3)-[D-GlcNAc-(1→4)-D-GlcA]n-(1→3)-D-GlcNAc (ver Ponnuraj, K. and M. J.
Jedrzejas (2000), "Mechanism of hyaluronan binding and degradation: structure of Streptococcus pneumoniae hyaluronate lyase in complex with hyaluronic acid disaccharide at 1.7 A resolution." J Mol Biol 299(4): 885-95).
Figure imgf000017_0001
enlace beta- 1,3 enlace beta- 1,4 Liasa
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000017_0004
Esquema 1
A continuación en el procedimiento A tiene lugar Ia etapa (ii) en Ia que los fragmentos oligómeros de diferentes tamaños resultantes de Ia degradación enzimática se purifican, opcionalmente, mediante una serie de técnicas convencionales tales como centrifugación, cromatografías, desalineación y liofilización. Posteriormente los fragmentos oligómeros purificados se derivatizan (iii) por reacción química con un linker. La derivatización de los mismos se lleva a cabo por modificación de uno de los dos tipos de grupos funcionales siguientes: los grupos ácido carboxílico (COOH) o los alcoholes (OH), tanto primarios como secundarios, de Ia unidad disacárido señalados en el Esquema 2:
alcohol primario
Figure imgf000018_0001
Esquema 2
Los grupos ácido carboxílico (COOH) del ácido glucurónico presente a Io largo del oligómero de HA se pueden derivatizar con un linker mediante Ia formación de dos tipos de enlace como se representa en el Esquema 3:
1) Mediante Ia formación de un enlace amida (empleando el método de Ia activación con carbodiimida) con un linker que contiene un grupo amina de fórmula general:
H2N-R1-S-R2 donde
R2 representa un grupo seleccionado entre
H, -CH3, -(CH2VCH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y
R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CHz)1T, -NH-CO-(CH2)n-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20;
Véase ejemplos en los siguientes documentos:(Shu, X. Z., Y. Liu, et al. (2002). "Disulfide cross-linked hyaluronan hydrogels." Biomacromolecules 3(6): 1304- 11; Lee, H., S.-H. Choi, et al. (2006). "Direct Visualization of Hyaluronic Acid Polymer Chain by Self-Assembled One-Dimensional Array of GoId Nanoparticles." Macromolecules 39(1): 23-25; Kafedjiiski, K., R. K. Jetti, et al. (2007). "Synthesis and in vitro evaluation of thiolated hyaluronic acid for mucoadhesive drug delivery." lnt J Pharm 343(1-2): 48-58).
2) Mediante una reacción de esterificación empleando un linker que comprende un grupo alcohol de fórmula general: HO-R1-S-R2 donde
R2 representa un grupo seleccionado entre
H, -CH3, -(CH2)π-CH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y
R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2)H-, donde n es un valor comprendido entre 1 y 20;
(Véase ejemplos)(Campocc¡a, D., P. Doherty, et al. (1998). "Semlsynthetic resorbable materials from hyaluronan esterification." Biomaterials 19(23): 2101-27).
Figure imgf000019_0001
Esquema 3
Los alcoholes (OH), tanto primarios como secundarios, de Ia unidad disacárido (Esquema 2), se pueden derivatizar con un linker de fórmula general:
GS-R1-S-R2, donde
R2 representa un grupo seleccionado entre
H, -CH3, -(CH2)H-CH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2)n-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
GS representa un grupo saliente
mediante Ia formación de enlaces tipo éter como se representa en el Esquema 4. (Véase ejemplos en: Mlcochova, P., V. Hajkova, et al. (2007). "Preparation and characterization of biodegradable alkylether derivatives of hyaluronan." Carbohydrate Polymers 69(2): 344-352)
Variando las condiciones de reacción como Ia proporción de los reactivos, cantidad y/o tipo de disolvente, pH, temperatura y el tiempo de reacción, se controla Ia funcionalización mayoritaria del alcohol primario frente a los secundarios y Ia cantidad de mono-, di- o tri-substitución de los alcoholes secundarios.
Figure imgf000020_0001
Esquema 4
Asimismo, en el caso de los diferentes fragmentos de oligómeros provenientes de Ia degradación enzimática con Hialuronidasa, aparece un alcohol secundario adicional situado en el extremo hidrolizado de Ia unidad de disacárido terminal, el cual también es proclive a ser derivatizado en condiciones similares a las de los otros alcoholes secundarios según se representa en el siguiente Esquema 5:
Figure imgf000021_0001
Esquema 5
En Ia etapa (iv) del procedimiento A, se conjuga al menos uno de los fragmentos oligómeros de HA derivatizados, a, al menos, una nanopartícula metálica. Para Ia reacción de conjugación una disolución acuosa con una concentración generalmente entorno a 1012 nanopartículas metálicas por mililitro, se agita típicamente en presencia de un gran exceso del oligómero de HA derivatizado en cuestión, a temperatura ambiente durante 1 hora. La proporción de oligómero de HA respecto a Ia concentración de nanopartículas metálicas se calcula de Ia siguiente forma: a) se calcula el número de átomos metálicos que hay en Ia superficie de una esfera, mediante el cálculo teórico del área superficial de Ia misma, y asumiendo que cada átomo ocupa 1-2 nm2. Se asume que cada átomo de azufre del linker se conjuga con un solo átomo de Ia nanopartícula metálica. Teniendo en cuenta el número de nanopartículas metálicas en disolución se añade un exceso de 100 veces más de oligómero de HA derivatizado.
El compuesto conjugado obtenido se purifica y se aisla a continuación por diálisis según Ia metódica descrita en el ejemplo 2.1.4.
Los procedimientos B) y C) de Ia invención se llevan a cabo de forma sencilla por un experto en Ia materia modificando el orden de las etapas de reacción (i) a (iv) del procedimiento A), a Ia vista del contenido de Ia presente descripción y el conocimiento del experto en Ia materia. Otro procedimiento adicional, es el procedimiento D) de obtención de un compuesto conjugado, que comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; (ii) obtención de los fragmentos oligómeros de HA derivatizados; y
(iii) conjugación de al menos un fragmento oligómero de HA derivatizado obtenido en Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica.
El procedimiento E) para Ia preparación de un compuesto conjugado comprende: (i) conjugación de un polímero de HA derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter a al menos una nanopartícula metálica;
(ii) hidrólisis enzimática del producto resultante de Ia etapa anterior; y (iii) obtención del compuesto conjugado.
En una realización preferente tanto del procedimiento D) como del procedimiento E] de Ia presente invención, se parte de un polímero de HA previamente derivatizado, asequible de forma comercial, como por ejemplo el Glycosil™ (Glycosan Biosystems Inc., ver Ejemplo 1). El Glycosil™ puede por tanto conjugarse a una nanopartícula metálica en primer lugar, y a continuación ser hidrolizado para generar fragmentos oligómeros de HA derivatizados y unidos ya a Ia nanopartícula metálica (procedimiento E)).Alternativamente, el Glycosil™ puede hidrolizarse primero para generar fragmentos oligómeros de HA derivatizados que posteriormente se conjugan a una nanopartícula metálica (procedimiento D).
De acuerdo con el procedimiento F) para Ia obtención de un compuesto conjugado, los oligómeros de HA de hasta 1000 kDa, se obtienen mediante biosíntesis, mediante Ia acción de una Hialuronato Sintasa de manera convencional tal y como se describe en el estado de Ia técnica. Véanse los ejemplos en: APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2005, 71, No. 7, p. 3747-3752;
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOI. 278, No. 37, pp. 35199-35203, 2003; JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VoI. 279, No. 40, pp. 42345^2349, 2004; JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VoI. 280, No. 10, pp. 8813-8818, 2005). Después de Ia biosíntesis de los oligómeros de HA, éstos se derivatizan mediante cualquiera de los métodos y linkers descritos en Ia presente invención. Finalmente, los oligómeros de HA derivatizados se conjugan a, al menos, una nanopartícula metálica según Ia metódica descrita en esta invención.
Según una realización particular, los oligómeros biosintetizados de HA de hasta 1000 kDa, se derivatizan a través del grupo -OH de Ia posición 3 o 4 del sacando inicial o final del oligómero con un linker de fórmula general GS-R1-S-R2.
Por último mediante el procedimiento G. se puede preparar un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un polímero u oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, con Ia condición de que cuando el polímero u oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y Ia nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es distinto de H2N-CH2-CH2-SH.
El Procedimiento G comprende las siguientes etapas:
(i) partir de un polímero u oligómero de HA,
(ii) derivatizarlo con al menos un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(iii) conjugar un polímero u oligómero de HA derivatizado a una o más nanopartículas metálicas, y
(iv) obtención del compuesto conjugado.
El procedimiento G se caracteriza, por Ia ausencia de una etapa de hidrólisis enzimática. El polímero u oligómero de HA de partida para el procedimiento G, se obtiene de una fuente biológica cualquiera de HA de diversas empresas comercializadoras. La derivatización se lleva a cabo por modificación de uno de los dos tipos de grupos funcionales: los grupos ácido carboxílico (COOH) o los alcoholes (OH), tanto primarios como secundarios, de acuerdo con cualquiera de los métodos arriba descritos. A continuación se lleva a cabo Ia etapa de conjugación siguiendo la metódica ya descrita.
En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un compuesto conjugado obtenible mediante al menos uno de los procedimientos descritos arriba. Los diversos compuestos conjugados son fácilmente obtenibles por un experto en Ia materia a Ia vista del contenido de la presente descripción, de los Ejemplos, y del conocimiento general común variando los parámetros anteriormente descritos, como por ejemplo, el tamaño de las nanopartículas metálicas utilizadas, los oligómeros, el tipo de linker, así como de las condiciones de reacción.
En otro aspecto adicional la invención se relaciona con un compuesto multiconjugado, en adelante compuesto multiconjugado de Ia invención, que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y - al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une la molécula de HA derivatizada a Ia nanopartícula metálica, y
- al menos, una molécula conjugada a, al menos, una nanopartícula metálica. Entre las distintas moléculas que pueden emplearse en Ia presente invención cabe destacar, por ejemplo y entre otras, un péptido, una proteína, un inhibidor de Ia hidrólisis del HA. En una realización particular de la invención dicha molécula es un compuesto seleccionado del grupo formado por los inhibidores de la hidrólisis del HA producida por una enzima de Ia familia de hialuronidasas.
El compuesto multiconjugado de Ia invención, que comprende además otra molécula conjugada adicional, puede obtenerse fácilmente mediante técnicas de multiconjugación de moléculas a Ia superficie de una nanopartícula metálica conocidas para un experto en Ia materia. Cada molécula a conjugar a Ia nanopartícula metálica se derivatiza previamente con un linker determinado. Las técnicas de multiconjugación se basan en Ia diferencia de afinidad del linker por el cual se ha derivatizado cada tipo de molécula y a Ia diferencia en concentración de cada tipo de molécula en Ia reacción de conjugación a Ia nanopartícula metálica.
En otro aspecto adicional Ia invención se refiere a una composición cosmética que comprende al menos un compuesto seleccionado entre: un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une al oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, o un compuesto multiconjugado de Ia invención, junto con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable. Dichos excipientes pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en Ia materia en función, entre otros aspectos, de las propiedades y características del compuesto conjugado concreto. La composición cosmética puede prepararse para su aplicación tópica o mediante inyección.
En otro aspecto adicional, Ia invención se refiere al empleo de al menos un compuesto seleccionado entre: un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une un oligómero de HA derivatizado a la nanopartícula metálica, o un compuesto multiconjugado de Ia invención, en Ia elaboración de una composición cosmética, en particular para su aplicación tópica o mediante inyección en Ia piel.
Por tanto otro aspecto adicional de Ia invención, se refiere a un tratamiento cosmético de Ia piel de un humano que comprende Ia aplicación de Ia composición cosmética de Ia presente invención.
El tratamiento cosmético presenta ventajas con respecto a los tratamientos cosméticos del estado de Ia técnica basados en HA en cuanto a que mejora Ia estructura física y Ia estabilidad del HA. El compuesto conjugado absorbe agua en las capas profundas de la piel realizando el efecto de relleno necesario para atenuar las arrugas y pliegues.
La unión del oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica parece proteger a los oligómeros de HA al organismo de su absorción directa al organismo y permite suministrar HA en gran concentración, por concentrar en un solo compuesto conjugado varios oligómeros de HA. Sin querer verse ligados a ninguna teoría, los inventores consideran que los mecanismos por los que Ia conjugación a una nanopartícula metálica protege el HA de ser absorbidos, podrían ser los siguientes: Por una parte, Ia estructura de los oligómeros de HA recubriendo Ia nanopartícula metálica presenta una distribución espacial que es menos reactiva frente al metabolismo de absorción.
Por otra, Ia competencia entre el enlace a través de un linker, del oligómero de HA-nanopartícula metálica, frente a las reacciones que lo degradarían, desplaza el equilibrio bioquímico alargando Ia vida media del HA.
Finalmente, en el caso de un oligómero conjugado a una nanopartícula metálica por varias posiciones, se obtiene un efecto de cross-linking debido a Ia distribución del oligómero sobre Ia superficie de Ia nanopartícula metálica por haberse unido a ella por varias posiciones. Esto podría dificultar aún más Ia acción de Ia hialuronidasa aumentando por tanto Ia estabilidad y durabilidad del HA.
De nuevo y sin querer verse vinculados a ninguna teoría los inventores opinan que es posible, cuando el oligómero se vea expuesto a degradación enzimática (normalmente hialuronidasa), el compuesto conjugado podría proteger químicamente las partes del HA hábiles de degradarse por Ia actividad del enzima ya que Ia nanopartícula metálica se conjuga por un lugar estructural cercano al grupo funcional por el que dicho enzima fragmenta al oligómero. De este modo se dificultaría Ia acción de Ia hialuronidasa sobre el oligómero de HA.
En una realización particular el tratamiento cosmético es tópico, y presenta entre otras las ventajas Ia de estar al alcance de cada individuo en el sentido de que, él mismo Io puede poner en práctica sobre Ia piel sin riesgo alguno, siendo indoloro, cómodo y más asequible económicamente que un tratamiento mediante inyección. El compuesto conjugado o multiconjugado para aplicación tópica comprende, preferiblemente, oligómeros de HA de un peso molecular inferior a 1000 kDa que pueden penetrar fácilmente hasta Ia dermis. De este modo el oligómero de HA conjugado absorbe agua en las capas profundas de Ia piel realizando el efecto de relleno necesario para atenuar las arrugas y pliegues.
En otra realización particular el tratamiento cosmético es mediante inyección y presenta asimismo algunas ventajas. En este sentido, mientras que los tratamientos actuales mantienen su efectividad entre 4 y 6 meses, después de los cuales desaparece el efecto de relleno, Ia conjugación de oligómeros de HA a nanopartículas mejora Ia estabilidad del oligómero de HA, obteniendo un producto que mantiene su efecto corrector de arrugas y pliegues durante más tiempo, espaciando Ia necesidad de los tratamientos inyectados y mejorando así Ia calidad de vida del usuario. En una realización particular, el compuesto conjugado o multiconjugado para aplicación mediante inyección comprende, preferiblemente, oligómeros de HA de un peso molecular superior a 500 kDa ya que una vez inyectados en las capas profundas de Ia piel, su durabilidad es mayor.
A continuación se presentan ejemplos ilustrativos de Ia presente invención que se exponen para una mejor comprensión de la invención y en ningún caso deben considerarse una limitación del alcance de Ia misma.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Obtención de un compuesto conjugado
EJEMPLO 1.1: Síntesis de nanopartículas de oro Una disolución acuosa (150 mL) de citrato de sodio (2.2 mM) se calentó a ebullición con agitación vigorosa. El siguiente paso fue añadir 1 mL de una disolución acuosa (23.4 mM) de HAuCI4 sobre Ia disolución a ebullición. La reducción tuvo lugar en aproximadamente 2 minutos y se formó una disolución de nanopartículas de oro, Ia cual experimentó un cambio de color indicativo de violáceo a rojo intenso. Finalmente se separó el reactor de Ia fuente de calor y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Las nanopartículas de oro así obtenidas se caracterizaron mediante UV- Vis. El tamaño medio de 8 nm de las nanopartículas de oro se determinó mediante tratamiento informático de las imágenes obtenidas por TEM, asimismo se midió el diámetro de una muestra aleatoria de nanopartículas y se realizó Ia distribución Gaussiana de tamaños.
EJEMPLO 1.2: Funcionalización de nanopartículas de oro con oligómero (21- monómeros) de HA derivatizado 1.2.1 Hidrólisis enzimática de tiopropionilhidrazida-HA (polímero de HA derivatizado)
Tiopropionilhidrazida-HA (Glycosil™, Glycosan Biosystems Inc.) se despolimerizó mediante Ia acción del enzima hialuronato 4-glucanohidrolasa ("Bovine Testicular
Hyaluronidase (BTH)) (E.C. 3.2.1.35) (Hyaluronidase Type I-S, Sigma-Aldrich). A una solución que contenía 5 mg de oligómeros de tiopropionilhidrazida-HA en 25 ml_ de disolución tampón acuosa (100 mM fosfato de sodio, 150 mM cloruro de sodio, pH
5.3) se Ie añadieron 5*104 U de BTH y se dejó incubar durante 40 horas a 37 0C. La reacción enzimática se detuvo mediante la ebullición de Ia muestra durante 20 min.
(Glycobiology, 2002 Jul;12(7):421-6).
1.2.2 Purificación de los oligómeros de HA derivatizados
La mezcla de oligómeros de HA-derivatizado se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 min y el sobrenadante se concentró y liofilizó. A continuación, Ia muestra liofilizada se reconstituyó en agua destilada. (Glycobiology, 2002 Jul;12(7):421-6).
EJEMPLO 1.3 Conjugación de nanopartículas de oro a oligómeros (21- monómeros) de HA derivatizado Las nanopartículas de oro de 8 nm obtenidas según el Ejemplo 1.1 , se funcionalizaron con los oligómeros derivatizados (tiopropionilhidrazida-HA, MW 1455 g/mol) obtenidos en Ia etapa anterior, mediante Ia adición de 100 μl de una disolución 1.5 mM de oligómero derivatizado por 5 mL de disolución de nanopartículas de oro. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30 minutos. La reacción se paró disminuyendo Ia temperatura (dentro de Ia nevera). La purificación se hizo por diálisis (molecular weight cut off (MWCO) 16 mm) contra citrato de sodio (2.3 mM, 3,25 g/5L H2O). Se obtuvo el compuesto conjugado
EJEMPLO 1.4 Caracterización del compuesto conjugado obtenido 1.4.1 Espectro de UV-Vis
Se registraron los espectros de absorción de UV-Vis de Ia disolución del compuesto conjugado y purificado obtenido en Ia etapa anterior. La conjugación a una nanopartícula de los oligómeros de HA derivatizado, induce a un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de onda mayor (en este caso a 522 nm) como se muestra en Ia Figura 7 con respecto al pico de absorción de las nanopartículas de oro no conjugadas (519 nm).
1.4.2 Visualización del compuesto conjugado mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).
Se capturaron las imágenes de TEM del compuesto conjugado (Figura 6) obtenido. Las muestras para estudios de TEM fueron preparadas depositando una gota de Ia disolución acuosa del compuesto conjugado y purificado obtenido sobre rejillas de TEM recubiertas de una membrana carbono.
1.4.3 Espectro de Potencial Z del compuesto conjugado
Se determinó el potencial-Z del compuesto conjugado. La conjugación a una nanopartícula de los oligómeros de HA derivatizado induce a un desplazamiento del pico de potencial Z a -19.1 mV como se muestra en Ia Figura 8 con respecto al pico de -50.8 mV correspondiente a las nanopartículas de oro no conjugadas.
EJEMPLO 2: Obtención de un compuesto conjugado
EJEMPLO 2.1: Funcionalización de nanopartículas de oro con oligómeros de HA 2.1.1 Hidrólisis enzimática de un polímero de HA
El polímero de HA (HA, sal de sodio, de Streptococcus eq., Sigma-Aldrich) se despolimerizó mediante Ia acción del enzima ("Bovine Testicular Hyaluronidase (BTH)") hialuronato 4-glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.35) (Hyaluronidase Type I-S, Sigma-Aldrich). A una solución que contenía 5 mg de HA en 25 mL de disolución tampón acuosa (100 mM fosfato de sodio, 150 mM cloruro de sodio, pH 5.3) se Ie añadieron 5*104 U de BTH y se agitó durante 40 horas a 37 0C. La reacción enzimática se detuvo mediante Ia ebullición de Ia muestra durante 20 minutos. (Glycobiology, 2002 JuI; 12(7):421-6).
2.1.2 Purificación de los oligómeros de HA La mezcla de fragmentos oligómeros de HA se centrifugó a 10,000 rpm durante 30 minutos y el sobrenadante se concentró y liofilizó. A continuación, los oligómeros de HA se purificaron mediante tubos de centrifugación Centricon Plus 20 con un corte de peso molecular de 10 kDa. Finalmente, se obtuvo una mezcla de oligómeros de HA de tamaños comprendidos entre 2 y 26 monómeros (Glycobiology, 2002 Jul;12(7):421-6) que fue utilizada en Ia etapa siguiente.
2.1.3 Derivatización de los oligómeros (21 -monómeros) de HA
Los grupos carboxilo (-COOH) libres del ácido glucurónico presentes a Io largo de Ia cadena se derivatizaron con un "linker" mediante Ia formación de un enlace amida empleando el método de Ia carbodiimida. El oligómero de HA (8 KDa) (0.1 g, aprox. 12.5 mmol) fue disuelto en 25 mi de agua destilada, agitado durante 30 minutos y luego el pH fue ajustado a 5-5.5 con HCI 0.1 N (algunas veces dependiendo de Ia casa comercial de Ia que se adquiere el HA no hay necesidad de ajustar el pH porque el pH ya está por debajo de 5). Un exceso de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida hidrocloruro (EDC) (0.25 g) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (0.15 g) fueron añadidos (el pH fue ajustado a 5.5 cuando fue necesario) y Ia reacción se agitó por 30 minutos más. Se añadió una cantidad de cistamina HCI igual a 0.3 g (el pH cambió a 4.3) y Ia reacción se agitó toda Ia noche aprox. 12 horas. Finalmente se añadió ditiotreitol (DTT) (0.31 g) y Ia reacción se agitó por 2 horas más. La mezcla de Ia reacción resultante se dializó exhaustivamente con una membrana de diálisis de corte de peso molecular de 3500 Da contra (i) NaCI (3Og, 100 mM) + HCI 0.1 N (15 mi, 0.3 mM) (4 días) y (ii) HCI 0.1 N (15 mi, 0.3 mM) (4 días) y finalmente contra agua destilada y desmineralizada (2 días).
2.1.4 Conjugación de nanopartículas de oro a oligómeros (21 -monómeros) de HA derivatizados
Las nanopartículas de oro de 8 nm obtenidas en el Ejemplo 1.1 se conjugaron con los oligómeros (21 -monómeros) derivatizados obtenidos en 2.1.3, mediante Ia adición de 100 μl de una disolución 1.5 mM de oligómeros derivatizados por 5 mL de disolución de nanopartículas. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30 minutos. La reacción se paró disminuyendo Ia temperatura a 40C. La purificación se hizo por diálisis (MWCO 16 kDa) contra citrato de sodio (2.3 mM, 3,25 g/5L H2O).
EJEMPLO 3: Obtención de un compuesto conjugado
EJEMPLO 3.1 : Conjugación de nanopartículas de oro a un polímero de HA derivatizado
Las nanopartículas de oro de 8 nm se conjugaron con un polímero de HA derivatizado, mediante Ia adición de 100 μl de una disolución 1.5 mM de thiopropionylhydrazide-HA (Glycosil TM) por 5ml_ de disolución de nanopartículas de oro. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y con agitación magnética durante 30 minutos (Macromolecules 2006, 39, 23-25). La reacción se paró disminuyendo Ia temperatura a 40C.
EJEMPLO 3.2 Caracterización del compuesto conjugado 3.2.1 Visualización mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).
Se capturaron imágenes de TEM tanto de las nanopartículas de oro (Figura 10-A) como del conjugado (Figura 10-B) para mostrar Ia diferente morfología adoptada por el conjugado de nanopartícula de oro con polímero de HA. Las muestras para estudios de TEM fueron preparadas depositando una gota de Ia disolución acuosa correspondiente de nanopartículas de oro o del conjugado de HA-nanopartícula de oro, sobre rejillas de TEM recubiertas de carbono.
3.2.2 Espectro de UV-Vis
Se registraron los espectros de absorción de UV-Vis de las disoluciones de nanopartículas de oro y del compuesto conjugado obtenido. Las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato muestran un pico característico a 521.2 nm. En cambio cuando se conjugan a HA se produce un desplazamiento del pico de absorción a una longitud de onda mayor en este caso a 523,8nm.
3.2.3 Espectro de Potencial Z del compuesto conjugado
Se determinó el potencial-Z. La conjugación a nanopartículas de los oligómeros de HA derivatizados induce a un desplazamiento del pico de potencial Z a -18.2 mV como se muestra en Ia Figura 12 con respecto al pico de -48.5 mV correspondiente a las nanopartículas de oro no conjugadas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y - al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une el oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica,
con Ia condición de que cuando el oligómero de HA presenta un número de monómeros n, siendo n > 1000, y Ia nanopartícula es de oro con un tamaño de 20 nm, el linker es distinto de H2N-CH2-CH2-SH.
2. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 1 , que presenta una estructura que comprende: una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en el que cada uno de los oligómeros de HA está derivatizado con un linker a través de un enlace químico, y en Ia que cada linker une cada oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica.
3. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 1 , que presenta una estructura que comprende: una nanopartícula metálica y uno o más oligómeros de HA, en Ia que cada uno de los oligómeros está derivatizado con al menos dos linkers los cuales unen cada oligómero de HA a Ia nanopartícula metálica.
4. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 1 , que presenta una estructura que comprende: uno o más oligómeros de HA derivatizados con más de un linker cada uno, los cuales unen cada oligómero de HA a una o más nanopartículas metálicas.
5. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que Ia nanopartícula metálica se selecciona de entre el grupo formado por nanopartículas y partículas núcleo-coraza y en el que Ia nanopartícula, el núcleo y Ia coraza pueden estar independientemente constituidos por un material seleccionado del grupo formado por los metales Au, Ag, Pt, Co, Fe, los óxidos derivados de uno cualquiera de los metales anteriores y TiO2.
6. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 5, en el que Ia nanopartícula metálica es una nanopartícula de oro.
7. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que Ia nanopartícula metálica presenta un tamaño medio de diámetro comprendido entre 2 y 100 nm.
8. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 7, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 4 - 50 nm.
9. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 8, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 6-30 nm.
10. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 9, en el que el tamaño medio de diámetro está comprendido entre 8-15nm.
11. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre 1 y un número máximo de monómeros determinado por Ia naturaleza biológica del propio HA.
12. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 11 , en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre 1-1000 monómeros de HA.
13. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 12, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre 1-100 monómeros de HA.
14. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 13, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende entre 2-25 monómeros de HA.
15. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 14, en el que el oligómero de HA derivatizado comprende 3 monómeros de HA.
16. Compuesto conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 11 a 15, en el que el oligómero de HA está derivatizado a través de al menos un enlace químico amida -CONH-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer de HA y un linker de fórmula general H2N-R1-S-R2 en el que:
R2 representa un grupo seleccionado entre H, -CH3, -(CH2)n-CH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2)P-, -NH-CO-(CH2)n-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20.
17. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 16, en el que
R2 representa un grupo seleccionado de entre H, -CH3, -CH2-CH3 y -CH2-CH=CH2 y R1 representa
-(CH)(COOH)(CH2)n- donde n es 1 ó 2.
18. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 16, en Ia que el linker presenta Ia fórmula NH2-NH-CO-(CH2)n-SH, donde n es 2.
19. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 11 a 15, en el que el oligómero de HA está derivatizado según una de las siguientes alternativas: a) a través de, al menos, un enlace químico éster -COO-, formado entre un grupo ácido carboxílico de un mer de HA y un linker de fórmula general HO-
R1-S-R2, ó b) a través de, al menos, un enlace químico éter, -O- formado entre un grupo -OH del oligómero de HA y un linker de fórmula general GS-R1-S-R2,
donde
R2 representa un grupo seleccionado entre
H, -CH3, -(CHz)n-CH3 , -(CH2)n-CH=CH2 y -S-R1-NH2 y R1 representa un grupo seleccionado de entre
-(CH)n-, -(CH)(COOH)(CH2),!-, donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 20; y
GS representa un grupo saliente.
20. Compuesto conjugado según Ia reivindicación 19, en el que
R2 representa un grupo seleccionado de entre H, -CH3, -CH2-CH3 y -CH2-CH=CH2 y R1 representa un grupo -(CH2)n- donde n representa un número entero comprendido entre 1 y 21.
21. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que presenta una relación número de mers de HA/ número de nanopartículas metálicas comprendida entre 2 y 100000.
22. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 que comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de HA; (iii) derivatización de los fragmentos oligómeros de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(iv) conjugación de al menos un fragmento oligómero de HA derivatizado obtenido en
Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica.
23. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , que comprende:
(i) derivatización de un polímero de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- por formación de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) hidrólisis enzimática del polímero de HA derivatizado;
(¡ii) obtención de fragmentos oligómeros de HA derivatizados; y
(iv) conjugación de al menos uno de los fragmentos obtenidos en Ia etapa anterior con al menos una nanopartícula metálica.
24. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende:
(i) derivatización de un polímero de HA por reacción química con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; y
(ii) conjugación del polímero de HA derivatizado obtenido en Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica, (iii) hidrólisis enzimática del polímero de HA derivatizado; (iv) obtención del compuesto conjugado.
25. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 , que comprende:
(i) hidrólisis enzimática de un polímero de HA derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(ii) obtención de los fragmentos oligómeros de HA derivatizados; y (iii) conjugación de al menos un fragmento oligómero de HA derivatizado obtenido en Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica.
26. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 , que comprende:
(i) conjugación de un polímero de HA derivatizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter a al menos una nanopartícula metálica; (ii) hidrólisis enzimática del producto resultante de Ia etapa anterior; y
(iii) obtención del compuesto conjugado.
27. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 , que comprende: (i) biosíntesis mediante Ia acción de una Hialuronato Sintasa de un fragmento oligómero de HA;
(ii) derivatización del fragmento oligómero biosintetizado con un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter; (iii) obtención de los fragmentos oligómeros de HA derivatizados; y (iv) conjugación de al menos un fragmento oligómero de HA derivatizado obtenido en Ia etapa anterior a al menos una nanopartícula metálica.
28. Procedimiento para Ia preparación de un compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-21 , que comprende:
(v) partir de un polímero u oligómero de HA,
(vi) derivatizarlo con al menos un linker que comprende un grupo -S- a través de al menos un enlace químico amida, éster o éter;
(vii) conjugar un polímero u oligómero de HA derivatizado a una o más nanopartículas metálicas, y
(viii) obtención del compuesto conjugado.
29. Compuesto conjugado obtenible mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28.
30. Compuesto conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , que comprende, además, al menos, otra molécula conjugada a, al menos, una nanopartícula metálica.
31. Compuesto multiconjugado según Ia reivindicación 30, en el que Ia molécula es un compuesto seleccionado del grupo formado por péptidos, proteínas, e inhibidores de Ia hidrólisis del HA.
32. Composición cosmética que comprende al menos un compuesto seleccionado entre: un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une al oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, o un compuesto multiconjugado según Ia reivindicación 30 o 31, junto con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.
33. Composición cosmética según Ia reivindicación 32, para su aplicación tópica o para su aplicación mediante inyección.
34. Composición cosmética según Ia reivindicación 33, para su aplicación tópica que comprende oligómeros de HA de peso molecular inferior a 1000 kDa.
35. Composición cosmética según Ia reivindicación 33, para su aplicación mediante inyección que comprende oligómeros de HA de peso molecular superior a 500 kDa.
36. Empleo de al menos un compuesto seleccionado entre: un compuesto conjugado que comprende:
- al menos una nanopartícula metálica; y
- al menos un oligómero de HA derivatizado a través de, al menos, un enlace químico, con al menos un linker que comprende un grupo -S- por el que se une un oligómero de HA derivatizado a Ia nanopartícula metálica, o un compuesto multiconjugado según Ia reivindicación 30 o 31 , en Ia elaboración de una composición cosmética para su aplicación tópica o para su aplicación mediante inyección en Ia piel.
37. Tratamiento cosmético sobre el cuerpo humano que comprende Ia aplicación de una composición cosmética según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35.
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