CN114502599B - 一种超支化聚甘油多缩水甘油醚及其作为多糖交联剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子量为750至15000Da和环氧当量为183至7000g/eq的超支化聚甘油多缩水甘油醚。本发明还涉及可通过将多糖与超支化聚甘油多缩水甘油醚交联而获得的交联多糖。本发明还涉及它们的制备方法及其在治疗、化妆品、农业和食品领域中的用途。

Description

一种超支化聚甘油多缩水甘油醚及其作为多糖交联剂的用途

本申请要求2019年10月1日提交的欧洲专利申请19200803.5的权益。

本发明涉及一种超支化聚甘油多缩水甘油醚。尤其是分子量为750至15000Da和环氧当量为183至7000g/eq的超支化聚甘油多缩水甘油醚。本发明还涉及可通过将多糖与超支化聚甘油多缩水甘油醚交联而获得的交联多糖、它们的制备方法以及它们在食品、制药、化妆品和农业行业中的用途。

背景技术

碳水化合物也被称为多糖，是地球上最丰富、最容易获得、最便宜的生物分子和可再生资源，其年形成速度超过世界合成聚合物的生产速度几个数量级。它们是由太阳能合成的可持续材料，可完全生物降解。多糖存在于所有活的生物体中，并且被大自然设计用于执行各种特定功能。

除了作为关键化学原料和能源生产的潜在用途外，多糖还被认为在各种复杂的生物过程中发挥着关键作用。它们通过与蛋白质和其他生物实体的相互作用在很大程度上参与介导识别过程；和细胞识别过程，包括细胞生长调节、分化、粘附、癌细胞转移、细胞运输、细菌和病毒引起的炎症以及免疫反应。

最知名的多糖之一是纤维素。纤维素是至少三分之一高级植物的成分，因此，它无疑是最丰富的天然存在的可再生有机化合物。在其最简单的形式中，纤维素由β-1,4-连接的葡聚糖链组成，这些葡聚糖链可以以不同的方式排列，从而产生不同形式的纤维素。其化学结构对应于下式：

在自然界中，纤维素以分级方式生产，其中葡聚糖链彼此缔合以形成结晶和非结晶区域，这些区域组装成更高级的结构，例如微纤维。纤维素通常以纤维素I结晶形式获得，其中葡聚糖链彼此平行排列。两种形式的天然结晶聚合物，纤维素Iα和Iβ，已显示以从不同来源获得的不同量存在。

特别地，羧甲基纤维素钠(NaCMC)被定义为直接从纤维状植物材料的天然菌株获得的纤维素的羧甲基醚的钠盐。NaCMC分子是以β-D-葡萄糖单元为基础的聚合物，其游离羟基部分被羧甲基取代。其化学结构对应于下式，其中R是H或CH₂CO₂Na：

纤维素衍生物NaCMC最初被用作淀粉和天然树胶的替代品。这种纤维素衍生物大量用于造纸、纺织加工、洗涤剂、钻井液和保护涂料。纯化级，称为纤维素胶，广泛用于食品、制药和化妆品行业。

另一种常用的多糖是淀粉，它含量丰富且天然存在。它存在于所有绿色植物的叶子以及大多数植物的种子、果实、茎、根和块茎中。大多数淀粉由两种多糖组成，一种是直链α-(1→4)连接的葡聚糖，称为直链淀粉，另一种是具有4.2至5.9％α-(1→6)支链的α-(1→4)连接的葡聚糖，称为支链淀粉。直链淀粉和支链淀粉单元的化学结构分别对应于下式：

淀粉是光合作用的最终产物，是地球上太阳能量的化学储存形式。据估计，人类摄入的热量中有60-70％来自淀粉。所有淀粉都以不溶于水的颗粒或颗粒形式储存在植物中，存在于叶子的叶绿体和其他植物组织的淀粉体中。颗粒是相对致密的致密分子颗粒，具有半结晶特性。

水解淀粉的α-(1→4)键的主要酶类是α-淀粉酶。这些酶无处不在，由细菌、真菌、植物和动物产生。在哺乳动物中，有两个特定的来源，将酶分泌到口腔中的唾液腺和将酶分泌到小肠中的胰腺。α-淀粉酶是内切作用酶，它攻击聚合淀粉链的内部，使粘度迅速下降。由于这些特性，它们有时被称为液化酶。当α-淀粉酶遇到淀粉链并水解α-(1→4)键时，它们还通过称为对最初裂解的两条链之一的多重攻击的过程产生低分子量麦芽糖糊精。淀粉是广泛用于许多食品和非食品应用的常见成分。然而，天然淀粉的应用往往受到限制，因为它们的物理化学性质存在低剪切阻力和热稳定性、热分解和高回生倾向等缺点。

淀粉用作食品加工的添加剂，食品淀粉通常用作食品中的增稠剂、增量剂、乳化稳定剂，并且是加工肉类中的特殊粘合剂。在制药行业中，淀粉还用作赋形剂、片剂崩解剂、粘合剂和血浆扩容剂。可以对淀粉进行化学改性，以使淀粉在加工或储存过程中经常遇到的条件下正常发挥作用，例如高温、高剪切、低pH、冷冻/解冻和冷却。抗性淀粉是一种在健康个体的小肠中逃脱消化的淀粉。它被用作加工食品中的不溶性膳食纤维，并作为其健康益处的膳食补充剂。抗性淀粉有助于提高胰岛素敏感性、增加饱腹感并改善结肠功能标志物。

此外，另一种支链多糖是糖原，它是葡萄糖的多支链多糖，在动物、真菌和细菌中用作能量储存的一种形式。多糖结构代表了葡萄糖在体内的主要储存形式，糖原是淀粉的类似物，具有类似支链淀粉的结构，但更广泛地分枝和致密。

最后，透明质酸(HA)，也称为透明质酸或透明质酸钠，是一种阴离子非硫酸化糖胺聚糖(GAG)。HA是一种线性高分子量多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的重复单体组成，通过交替的β-(1→4)和β-(1→3)糖苷键连接。其化学结构对应于下式：

HA广泛分布于人体，是结缔组织、上皮组织和神经元组织的组成部分，是细胞外基质(ECM)包括脑ECM中的主要成分，其缺陷或缺乏可能导致癫痫障碍。它存在于几乎所有的生物体液中，包括滑液和眼睛的玻璃体液。它充当润滑剂和减震器，特别是在关节中，防止由软骨不断受到的物理压力引起的细胞损伤，有助于保持它们的健康。最大量的HA存在于皮肤中，占体内总含量的50％以上。在正常状态下，HA以游离聚合物的形式存在，但在某些组织中，它与不同的蛋白质相连以产生蛋白多糖或与特定的细胞受体相连。

HA的主要功能是增加体积并为组织提供润滑剂，维持开放、水合和稳定的细胞外空间，其中细胞和其他ECM成分(如胶原蛋白和弹性蛋白纤维)被牢固地维持在其中。HA还参与细胞活动，负责调节细胞粘附、细胞迁移和细胞增殖。特别是，高分子量HA表现出抗血管生成和抗炎特性，而低分子量片段(<100kDa)具有相反的生物活性；它们具有炎症性、免疫刺激性和血管生成性。已经广泛公开了HA和HA片段在伤口愈合以及肿瘤生长和癌症增殖中的功能，在此期间CD44细胞受体过度表达。由于HA与人体组织中的非常相似的独特的生物学特性，因此多年来引起了人们的极大关注和兴趣。这些特性使HA可以用于不同的生物医学应用，例如伤口愈合、骨关节炎中的润滑剂、组织增强和作为药物输送系统的载体。然而，由于其较差的机械性能和体内快速降解，天然HA的应用非常有限。

在现有技术中已经公开了多糖可以被广泛降解。多糖、特别是HA的降解可以看作是由糖苷键断裂介导的解聚过程；主要涉及两种机制：酶促降解(由透明质酸酶特异性酶选择性和非常迅速地促进)；和氧化降解(在组织炎症期间可能存在的自由基(ROS)和促氧化酶活性促进的非选择性和较慢的速度)。此外，除了上述机制外，由于组织中的水和电解质，总是存在水解非选择性降解机制。

具体而言，假设HA降解是一个高度组织和严格控制的过程，以生成具有精确定义大小的HA片段，以实现所需的生物学功能。HYAL1和HYAL2是表达最广泛的透明质酸酶。HYAL2(锚定在细胞膜上)将高分子量HA(>1MDa)切割成20kDa的片段，HYAL1(存在于溶酶体中)随后将这些片段进一步切割成四糖，然后通过透明质酸酶家族的几种酶(例如，β-葡萄糖醛酸酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)将四糖转化为单糖。由于这些降解产物是对于人体而言是天然的，它们遵循自然消除过程。如上所述，HA也可以在生物体内被活性氧(ROS)自然降解。HA降解的机制因所涉及的ROS而异。无论大小如何，对组织环境的干扰都会激活人体的免疫系统，导致短暂的炎症反应。在填充剂注射过程中因针刺入而对组织造成的机械损伤也可能导致这种反应。由于上述降解机制，注射天然多糖后的体内周转时间非常短，例如小于24小时的透明质酸，这取决于其植入组织的特定酶活性。然而，由于ROS和促炎酶的存在，在氧化应激降解后，其体内持续时间及其治疗效果会进一步降低。

为了克服与多糖、特别是HA的稳定性和生物相容性有关的这些缺点，已经公开了几种调节多糖的物理和机械性质以延长HA的体内半衰期的策略。

这些策略之一意味着具有增强的稳定性和更长的停留时间(即较低的降解速率)的交联多糖例如交联HA的制备。在现有技术中已经开发了几种方法来生产交联的多糖，特别是交联HA。所得交联HA是具有由共价交联键形成的三维(3D)网络结构的交联HA水凝胶，其将水保留在其网络中但不溶于水。

化学交联的水凝胶是稳定的材料，并且由于HA链和交联剂之间形成桥和分子间键，因此比天然HA显示出更高的抗酶促降解能力。此外，这种3D结构还有助于抵抗氧化降解，因为它们具有抗炎活性(多元醇)。上述具有羟基改性的交联HA水凝胶允许它们用于开发真皮填充剂。在该系列中，现有技术中已经公开了几种化学交联剂作为用于制备交联多糖的合适交联剂，包括甲基丙烯酰胺、酰肼、碳二亚胺(EDC)、二乙烯基砜(DVS)、表氯醇和一些二环氧化合物和二缩水甘油醚例如1,2,7,8二环氧辛烷、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、聚(乙二醇)二缩水甘油醚(PEGDE)和甘油二缩水甘油醚(GDE)。

在现有技术中已知具有较高交联度的交联多糖(例如交联HA水凝胶)是优选的，因为它们在体内具有较高的寿命和机械强度。更强的交联HA水凝胶还可以提供足够的力来提升组织并抵抗随后的变形。然而，从健康的角度来看，在HA改性中加入高含量的化学交联剂是不可行的。过量的交联剂通常对植入后与水凝胶接触的细胞和组织有毒。此外，过量的有毒交联剂会干扰细胞分化和增殖，此外，还会与水凝胶基质中掺入的其他生物活性成分(游离多元醇、抗氧化剂、氨基酸、缓冲剂、麻醉剂、药物等)发生不想要的反应。

在BDDE推出之前，二乙烯基砜(DVS)是用于交联大多数市场上真皮填充剂的交联剂，目前仍在一些商业产品中使用。它作为交联剂的能力归因于分子两端存在的活化乙烯基的反应性。该反应通过加成存在于多糖链上羟基(在碱性环境中带负电(亲核试剂))的双乙烯基键而发生，随后形成醚键。该反应是亲核加成，化学反应后没有分子或基团释放。然而，DVS交联透明质酸真皮填充剂存在一些酶促降解问题，可能与作为酶抑制剂的磺酸基团的存在有关，因此填充剂很难通过注射透明质酸酶去除，以防植入后出现不良反应。因此，DVS逐渐被放弃，取而代之的是BDDE等其他交联剂。此外，DVS是一种外来分子，其具有合成来源并且具有一定程度的毒性甚至优于BDDE，它具有很强的挥发性和刺激性，即使对于真皮填充剂制造商来说也存在问题。

在现有技术中已经公开了1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)及其与HA的反应。具体而言，HA溶液在碱性条件下与BDDE混合，形成醚键。该反应涉及环氧开环过程并且在碱性介质中进行，其中环氧环优先与羟基反应形成醚键。BDDE通常用于制备目前市场上可用的基于HA的真皮填充剂。其交联能力归因于分子两端存在的环氧基团的反应性。尽管已发现未反应的BDDE在果蝇模型生物中具有致突变性，但尚未在小鼠中观察到明确的致癌作用。尽管如此，并且由于其潜在的致突变性，真皮填充剂中未反应的BDDE的量必须保持在痕量(即残留水平)。经过美国食品和药物管理局(FDA)的安全风险评估，该痕量水平已被确定为安全的。另一方面，水解BDDE是由BDDE中的环氧基团水解或交联BDDE水解裂解产生的二醇醚。然而，水解的BDDE的代谢在现有技术中没有描述，可以理解为通过称为细胞色素P450的酶家族的醚键裂解进行。相反，天然BDDE和代谢的丁二醇都是外来分子，其具有合成来源(石油)并具有一定程度的毒性。

因此，由于BDDE及其代谢衍生分子的潜在毒性，以及对BDDE用量的严格监管，BDDE也逐渐被其他安全交联剂所取代。

为了提供用于制备具有改进的物理和化学性质的安全交联多糖的安全交联剂，一些研究公开了甘油二缩水甘油醚(GDE)的用途。GDE是甘油的双取代缩水甘油醚。具体而言，GDE的化学结构可以对应于1,3-GDE和1,2-GDE，如下式所示：

然而，在现有技术中，GDE被错误地称为“聚甘油多缩水甘油醚”或“聚甘油二缩水甘油醚”(PPE)，因为其化学结构不确定，通常作为甘油的双取代缩水甘油醚与甘油的单取代甚至三取代的缩水甘油醚的混合物在市场上销售。

使用GDE是特别有利的，因为甘油是天然存在于所有人体组织中的内源性分子，无论是以循环游离形式还是以脂肪组织中的甘油三酯或细胞膜的磷脂形式结合。事实上，甘油参与身体的代谢和分解代谢过程，因此是一种安全的分子。因此，尽管存在DVS和BDDE，但GDE和/或其主要降解产物(甘油)的存在并不意味着潜在的毒性问题。然而，使用GDE的主要问题是，为了降低所得GDE交联多糖的降解速率，需要高含量的交联剂。

然而，具有高交联度的交联多糖表现出不合适的差流动性，这是由于除了粘性之外还具有弹性，因此它们难以通过细针挤出，特别是在用于注射应用时(美容填充剂、治疗骨关节炎等)。事实上，在现有技术中已经报道了与用于HA稳定化的化学交联剂相关的各种并发症和副作用，特别是对于用过量交联剂处理的HA填充剂，例如应用后患者的不良疼痛和医生不好处理。HA基填充剂产生的任何副作用或过敏反应都被认为是由交联剂引起的，这些交联剂在制造过程中未去除，随后在水凝胶水解后在体内被释放。

因此，这一研究领域目前受到相当大的关注，并已成为水凝胶制造(即交联多糖)中的主要挑战问题之一。然而，当减少交联剂的量并因此降低交联度时，机械性能和/或耐降解性受到损害。此外，由于化学反应动力学相关问题，低水平的交联剂可能无法在合理的时间内定量完成化学反应，导致仅接枝而没有聚合物的有效交联，或者更糟的是，在水凝胶中留下大量的游离未反应交联剂，难以去除并导致高毒性物质，降低产品对患者的安全性。

因此，从本领域已知的情况来看，仍然需要提供具有低量交联剂和低交联度并具有足够的机械和酶促/氧化降解抗性的安全交联多糖。

发明内容

本发明的发明人出人意料地提供了一种安全的交联多糖，该多糖具有合适的机械性能、低酶促/氧化降解速率和用于体内应用的足够生物相容性。

具体而言，本发明人发现本发明的具有750至15000Da的分子量和183-7500g/eq的环氧当量的超支化聚甘油二缩水甘油醚(PPE)可用作能够与多糖的羟基反应并允许制备具有低交联度、合适的机械性能和降解速率同时对于将其施加到皮肤中是安全的本发明的交联多糖的交联剂。

不受任何理论的束缚，本发明人将本发明的PPE交联多糖的机械性能和抗降解性归因于本发明的超支化PPE的结构和量的组合效应，连同本发明的多糖和超支化PPE之间的共价和非共价相互作用产生的内聚性性质。本发明的超支化PPE与多糖的相互作用产生致密的三维HA网络，其保持水凝胶基质完整并限制酶渗入植入物和降解三维HA网络的能力，即使在低交联度下也是如此。

本发明的超支化PPE通过包括起始材料(即GDE或非超支化PPE)的自聚合步骤的方法制备。自聚合步骤意味着将GDE或非超支化PPE置于允许具有如本发明所定义的适当分子量和环氧当量的温度和时间的反应条件下。

最后，本发明的PPE交联多糖表现出良好的流动性，因此易于处理和通过细针挤出，尤其是在用于注射应用时。此外，本发明的PPE交联多糖的注射使患者在其应用期间和之后的疼痛感觉低或无疼痛感觉。

然后，本发明提供了一种基于多糖的水凝胶，其具有低交联度、低化学改性，因此在分子和结构上与天然多糖非常相似，具有高生物相容性和安全性的优点。令人惊讶的是，即使是低交联的，基于多糖的水凝胶也表现出具有高交联度的足够的机械性能和对酶促和氧化降解的抗性，具有体内寿命长的优点。

因此，本发明的第一方面涉及式(I)的超支化PPE化合物，

或者

式(II)的化合物

其中

R₁各自独立地选自R₂和R₃；

R₂是

R₃是

b是选自1至70的整数；c是选自1至70的整数；d是选自1至70的整数；具有通过液相色谱法测量的750至15000Da的分子量(M_w)；和通过HCl超声辅助快速滴定测量的183至7000g/eq的环氧当量。

本发明的第二方面涉及式(III)的交联多糖

或者，式(IV)的交联多糖

其中：R₁各自独立地选自R₂、R₃、R₄和R₅；R₂是

R₃是

R₄是

R₅是

PS是多糖；和所述交联多糖的交联百分比为0.077至0.450％；特别是0.077至0.269％。

本发明的第三方面涉及制备本发明的第一方面的化合物(I)或式(II)化合物的方法；其中：当化合物是式(I)的化合物时，则所述方法包括：a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；或者，当化合物是式(II)的化合物时，则所述方法包括：c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

本发明的第四方面涉及制备本发明的第二方面的交联多糖的方法，其包括将多糖与如本发明的第一方面所定义的式(I)的化合物交联；或者将多糖与如本发明的第一方面所定义的式(II)的化合物交联。

本发明的第五方面涉及组合物，其包含一种或多种本发明的第二方面的交联多糖。

本发明的第六方面涉及本发明的第一方面的超支化PPE作为交联剂的用途。

最后，本发明的第二方面的交联多糖在制药、化妆品、食品和农业领域的用途。

具体而言，如本发明的第二方面所定义的交联多糖是本发明的一部分，其中所述多糖是用于治疗的透明质酸。并且，如本发明的第二方面所定义的交联多糖作为皮肤填充剂的用途，其中多糖是透明质酸。

发明详述

除非另有说明，否则本申请中使用的所有术语均应按照本领域已知的它们的普通含义来理解。如在本申请中使用的其他更具体的定义术语如下所述并且旨在在整个说明书和权利要求书中统一应用，除非另外明确阐述的定义提供更广泛的定义。

为了本发明的目的，给出的任何范围都包括该范围的下端点和上端点。除非特别说明，否则所给出的范围，例如温度、时间、重量等，应视为近似值。

术语“重量％”是指每个部分或每种成分相对于总重量的百分比。

如上所述，本发明的第一方面是式(I)的化合物；或式(II)的化合物。

式(I)化合物通过将1,3-GDE或由1,3-GDE获得的非超支化PPE进行本发明方法中定义的自聚合步骤而获得。或者，式(II)化合物通过将1,2-GDE或由1,2-GDE获得的非超支化PPE进行本发明方法中定义的自聚合步骤而获得。

为了本发明的目的，现有技术中公开的PPE是支化PPE而不是超支化PPE。现有技术的支化PPE是通过甘油和环氧氯丙烷的反应制备的，其分子量可以通过增加环氧氯丙烷的量来调节。然而，这些方法不包括作为本发明方法的自聚合步骤。因此，现有技术的支化PPE(以商品名商购)在结构上不同于本发明的超支化PPE。特别地，现有技术中公开的支化PPE的结构，其落在本发明的范围之外，如下：

式(I)化合物或式(II)化合物具有通过液相色谱法测量的750至15000Da的分子量(M_w)；和通过HCl超声辅助快速滴定测量的183至7000g/eq的环氧当量。

术语“环氧当量”、“平均EEW”和缩写“EEW”具有相同的含义，它们可以互换使用。EEW是交联剂的重量，以克为单位，其中包含一克当量的环氧。EEW是指1克本发明所公开的交联剂中环氧基团的含量，以g/eq表示。EEW是使用现有技术(He,Z.等,“Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containingepoxy resin”.Analytical Methods,2014,vol.6(12),第4257-4261页)中公开的用于快速测定环氧化物的HCl定量超声辅助滴定测量的。

分子量和多分散指数的测量通过液相色谱进行，特别是使用配备有光散射检测器的GPC仪器。

在一个实施方案中，式(I)化合物或式(II)化合物具有通过液相色谱法测量的800至7000Da的分子量；和通过HCl超声辅助快速滴定测量的195至700g/eq的环氧当量。在一个实施方案中，式(I)化合物或式(II)化合物具有通过液相色谱法测量的900至4500Da的分子量；和通过HCl超声辅助快速滴定测量的200至600g/eq的环氧当量。

在一个实施方案中，式(I)化合物或式(II)化合物具有通过液相色谱法测量的等于或小于1.8的多分散指数。在一个实施方案中，式(I)化合物或式(II)化合物通过液相色谱法测量的等于或小于1.6的多分散指数，特别是通过使用配备有光散射检测器的GPC仪器。

术语“多分散性指数”、“异质性指数”和“分散性”具有相同的含义并且可以互换使用。它们是指混合物中分子或颗粒大小的不均匀性的量度，特别是给定聚合物样品中的分子量分布。它由符号表示。为了本发明的目的，多分散性指数是指分子量，可以使用以下等式计算

其中M_w是重均摩尔质量，M_n是数均摩尔质量。

术语“分子量”、“平均分子量”、“重均摩尔质量”、“质均摩尔质量”、“平均Mw”和缩写“M_W”具有相同的含义并且它们可以互换使用。质均摩尔质量通过以下等式计算：

其中N_i是分子质量M_i的分子数。质均分子量可以通过静态光散射、小角中子散射、X射线散射和沉降速度来确定。

术语“数均摩尔质量”和缩写“Mn”具有相同的含义并且它们可以互换使用。Mn是一种确定聚合物分子量的方法。聚合物分子，例如多糖，即使是相同类型的，具有不同的大小(链长，对于线性聚合物)，因此平均分子量将取决于平均方法。数均分子量是单个大分子的分子量的普通算术平均值或平均值。它是通过测量n个聚合物分子的分子量、将质量相加并除以n来确定的。Mn由以下等式计算：

其中N_i是分子质量M_i的分子数。聚合物的数均分子量可以通过凝胶渗透色谱法、通过(Mark-Houwink方程)的粘度测定法、诸如蒸气压渗透压法、端基测定或质子NMR等依数法测定。

不同分子量的聚合物碎片可以先用GPC仪器通过液相色谱分离，并通过配备的光散射检测器显示或检测，然后评估每个片段的重均摩尔质量“Mw”和数均摩尔质量“Mn”，由仪器本身执行并使用具有认证Mw的标准。

在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-16的化合物：

其中平均Mw为3530克/摩尔；平均EEW为589g/eq，Mw/Mn为1.53。

在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-22的化合物：

其中平均Mw为910克/摩尔；平均EEW为229g/eq，Mw/Mn为1.36。

在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-23的化合物：

其中平均Mw为2400克/摩尔；平均EEW为404g/eq，Mw/Mn为1.54。在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-14的化合物：

其中平均Mw为940克/摩尔；平均EEW为234g/eq，Mw/Mn为1.36。在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-28的化合物：

其中平均Mw为990克/摩尔；平均EEW为247g/eq，Mw/Mn为1.37。在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-26的化合物：

其中平均Mw为2200克/摩尔；平均EEW为365g/eq，Mw/Mn为1.47。

在一个实施方案中，本发明的超支化PPE是式(I)-21的化合物：

其中平均Mw为4200克/摩尔；平均EEW为585g/eq，Mw/Mn为1.55。

本发明的另一方面是制备式(I)化合物或式(II)化合物的方法。

制备本发明的式(I)的化合物的方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

制备本发明的式(II)的化合物的方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

1,3-GDE和1,2-GDE先前已在现有技术中公开，它们是可商购的(参见实验部分)。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自以下的碱：生理学上可接受的碱金属或铵氢氧化物(Na、K)、碱土金属氢氧化物(Mg、Ca、Sr)、生理上可接受的重金属氢氧化物(Fe,Al,Co,Cu,Se,Zn,Cr,Ni)、生理上可接受的季铵阳离子氢氧化物、生理上可接受的重金属或碳酸氢铵(NH₄,Fe,Al,Co,Cu,Se、Zn、Cr、Ni)及其混合物。

术语“生理上可接受的”是指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的无毒材料。优选地，生物系统是活的有机体，例如哺乳动物，特别是人类。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化铵及其混合物的碱金属氢氧化物或氢氧化铵；特别是氢氧化钠。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶及其混合物的碱土金属氢氧化物。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自氢氧化铁、氢氧化铝、氢氧化钴、氢氧化硒、氢氧化锡、氢氧化铬、氢氧化镍及其混合物的重金属氢氧化物。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含式HONR₆R₇R₈R₉的季铵氢氧化物，其中R₆、R₇、R₈和R₉中的每一个独立地选自(C₁-C₈)烷基，或者R₅、R₆、R₇和R₉中的两个形成(C₅-C₆)环烷基环。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自碳酸氢铁、碳酸氢铝、碳酸氢钴、碳酸氢铜、碳酸氢硒、碳酸氢锌、碳酸氢铬、碳酸氢镍、碳酸氢铵及其混合物的重金属碳酸氢盐或碳酸氢铵；特别是碳酸氢钠。

在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含1至50重量％的1,3-GDE或1,2-GDE。在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含碱性氢氧化物并且包含1至50重量％的1,3-GDE或1,2-GDE。在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含选自氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)及其混合物的碱性氢氧化物，并且包含1-50重量％的1,3-GDE或1,2-GDE的。在一个实施方案中，步骤a)或步骤c)的碱性溶液包含氢氧化钠(NaOH)并且包含1至50重量％的1,3-GDE或1,2-GDE。

在一个实施方案中，本发明方法的步骤a)或步骤c)在室温下进行。术语“室温”是指约25至35℃的温度。在一个实施方案中，本发明方法的步骤a)或可选地步骤c)在溶剂的存在下进行。在一个实施方案中，本发明方法的步骤a)或步骤c)在选自水、(C₁-C₄)烷基-OH、(C₁-C₄)烷基-OH、CO-(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷基-CO-O-(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷基-CN及其混合物的溶剂的存在下进行。在一个实施方案中，本发明方法的步骤a)或步骤c)在选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯及其混合物的溶剂的存在下进行；特别是溶剂是水。

术语“烷基”是指饱和直链或支链烃链，其包含说明书或权利要求中指定的碳原子数。实例特别包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基等基团。

在一个实施方案中，步骤b)或步骤d)通过在10至80℃的温度下使1,3-GDE或1,2-GDE持续1分钟至30天的时间段来进行，在此期间GDE发生自聚合。

在一个实施方案中，步骤b)或步骤d)通过在50至80℃的温度范围内使1,3-GDE或1,2-GDE持续1分钟至500分钟的时间段来进行。在一个实施方案中，步骤b)或步骤d)通过在50至80℃的温度范围内使1,3-GDE或1,2-GDE持续5至60分钟的时间段来进行。

在一个实施方案中，步骤b)或步骤d)通过在10至40℃范围内的温度下使1,3-GDE或1,2-GDE持续1天至30天的时间段来进行。在一个实施方案中，步骤b)或步骤d)通过在10至40℃的温度下使1,3-GDE或1,2-GDE持续2天至7天的时间段来进行。

可通过如上定义的方法获得的式(I)化合物或式(II)化合物也是本发明的一部分，其包括如上定义的自聚合步骤b)，或步骤d)。

为了本发明的目的，表述“可获得的”、“获得的”和等效表述可互换使用，并且在任何情况下，表述“可获得的”包括表述“获得的”。

以上公开的制备式(I)化合物或式(II)化合物的方法的所有实施方案也适用于可通过本发明的该方法获得的式(I)化合物或式(II)化合物。

本发明的超支化PPE用作交联剂也是本发明的一部分。

本发明的第二方面涉及具有0.077至0.450％的交联百分比的式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖具有0.077至0.360％的交联百分比。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖具有0.077至0.269％的交联百分比。

在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.077至0.450％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.077至0.360％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.077至0.269％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.077至0.140％的交联多糖。式(III)的多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.140至0.450％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.140至0.360％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.140至0.269％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.270至0.450％的交联多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的透明质酸并且交联百分比为0.270至0.360％的交联多糖。

在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的直链淀粉并且交联百分比为0.124至0.204％的多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的直链淀粉并且交联百分比为0.155至0.182％的多糖。在一个实施方案中，式(III)的交联多糖或式(IV)的交联多糖是其中多糖是如下定义的羧甲基纤维素钠并且交联百分比为0.140至0.204％的多糖。

在一个实施方案中，在式(III)和(IV)的交联多糖中，基于式(III)和(IV)的交联多糖的总重量，R₂的量低于R₅。在一个实施方案中，在式(III)和(IV)的交联多糖中，R₂的量低于式(III)和(IV)的交联多糖总重量的2ppm。R₂的量是使用He,Z.等,“Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxide values in polymer mixtures containingepoxy resin”.Analytical Methods,2014,vol.6(12),第4257-4261页中公开的用于快速测定环氧化物的HCl定量超声辅助滴定测量的。

本发明的多糖是“交联(crosslinked)”多糖。术语“交联(crosslinked)”是指具有三维交联网络的多糖，其中该网络由已经被一种或多种交联剂破坏的起始多糖形成。术语“交联(crosslinking)”在聚合物科学领域是指使用交联来促进聚合物(多糖)物理性质的差异。术语“交联”是指本发明的超支化PPE交联剂的环氧环的开孔与聚合物(多糖)的羟基形成的键。本文可互换使用的术语“交联剂”(“crosslinker”或“crosslinking agent”)是指具有交联一个或多个聚合物链的能力的化合物。

术语“交联百分比”、“交联百分比(％)”、“交联度”和缩写“C.D.”具有相同的含义，它们可以互换使用。它们是指PPE改性多糖单体单元与未改性多糖单体单元的比例，以百分比表示。通常，材料的交联度(C.D.)的测量可以使用现有技术中众所周知的不同方法来评估。有些方法是直接的，例如¹H NMR或酶消化后聚合物片段的定量GPC分析。通过流变测量、压缩或振动测试的其他方法是间接的。通常所有这些方法都是比较的，可以区分同一聚合物家族中不同的交联度。在本发明中，交联度值由通过流变测量获得的G'值使用以下等式1数学计算：

其中

MW_重复单元是多糖单体重复单元的分子量，

透明质酸的MW_重复单元＝401Da；

直链淀粉/糖原的MW_重复单元＝162Da；

羧甲基纤维素钠的MW_重复单元＝242Da。

Me使用以下等式2的逆式进行数学计算：

其中：

G’是使用旋转流变仪通过流变测量实验获得的，

R·T是热能，

c是多糖浓度，

M_n是多糖的数均分子量。

在本发明中，每种交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率是用数学方法计算的。根据多糖底物，三种方法用于监测交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率。

第一种方法是基于在降解过程中对储能模量G'等流变参数的监测，降解速率_rheo由等式3计算。

在交联多糖水凝胶的降解过程中观察到储能模量G'的降低，这是由水凝胶网络的破坏引起的，G’_t<G’_t0并且需要负号才能具有正的降解速率。第一种方法适用于测定含有透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶的交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率。

第二种方法是基于粘性参数的监测，如降解过程中的动态粘度η，降解速率_visc由等式4计算。

在交联多糖水凝胶的降解过程中观察到动态粘度η的降低，这是由聚合物链长度的减少引起的，η_t<η_t0并且需要负号才能具有正的降解速率。第二种方法适用于测定含有透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶的交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率。

第三种方法是基于在降解过程中使用分光光度计仪器使用咔唑测定比色监测糖醛酸浓度，降解速率_颜色由等式5计算。

在交联多糖水凝胶的降解过程中观察到糖醛酸浓度的增加，这是由于聚合物链长度的减少和糖醛酸单体单元的形成，[糖醛酸]_t>[糖醛酸]_t0在这种情况下，任何需要负号才能具有正的降解速率。第三种方法适用于测定含有透明质酸、果胶、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、黄原胶、葡糖醛酸、海藻酸(藻酸盐)的交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率。

在本发明中，还对交联多糖水凝胶的绝对酶促降解速率和氧化降解速率进行了比较。在固定的时间段内，每种交联多糖水凝胶的相对酶促和氧化降解率计算为交联多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率值与用作参考的本领域已知的GDE交联的多糖水凝胶的绝对酶促和氧化降解速率值的百分比。因此，它是从等式6计算的。

其中：

降解速率_xl是与BDDE、PEGDE和PPE交联的多糖水凝胶的绝对降解速率降解速率_GDE是用本领域已知的GED交联的多糖水凝胶的绝对降解速率。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖的相对酶促降解率是对比GDE交联多糖(用作参考值和内参)的酶促降解速率的100％至37％。用作内值的GDE交联多糖是通过多糖与市售GDE反应得到的(如实验部分所示)。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有85至40％的相对酶促降解率。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有0.1528至0.1877％的交联百分比和84至37％的相对酶促降解率。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖的相对氧化降解率是对比GDE交联多糖(用作参考值和内参)的氧化降解速率的100％至76％。用作内值的GDE交联多糖是通过多糖与市售GDE反应得到的(如实验部分所示)。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有90至75％的相对氧化降解率。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有0.1528至0.1877％的交联百分比和76至87％的氧化降解率。

如上所述，本发明的交联多糖的绝对酶促和氧化降解速率等于或低于用作内参的对比GDE交联多糖的绝对酶促和氧化降解速率，并且具有较低的交联度。这是有利的，因为水凝胶的稳定性以及患者的安全性和舒适性都增加了。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有0.8至3.5毫摩尔/小时的绝对酶促降解速率；和3.0至4.3毫摩尔/小时的绝对氧化降解速率。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有0.8至2.6毫摩尔/小时的绝对酶促降解速率；3.0至3.4毫摩尔/小时的绝对氧化降解速率。在一个实施方案中，本发明的交联多糖具有0.1528至0.1877％的交联百分比、0.8至2.7毫摩尔/小时的酶促降解速率和3.0至3.4毫摩尔/小时的氧化降解速率。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中两个交联基团之间的平均距离(D_N)为21nm至42nm的交联多糖。在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中两个交联基团之间的平均距离(D_N)为21nm至低于27nm的交联多糖。在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中两个交联基团之间的平均距离(D_N)等于或高于27nm至42nm的交联多糖。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖的浓度为1至50mg/ml的交联多糖。多糖的浓度可以通过现有技术中公开的任何合适的方法来测量。在本发明中，多糖的浓度通过在105℃的通风烘箱中将水凝胶脱水适当时间后获得的干燥残余物的重量测量来测量。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中通过粘度计测量的粘度为1至200Pa·s的交联多糖。在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中通过粘度计测量的粘度为10至100Pa·s的交联多糖。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中所述多糖选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶的交联多糖。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是透明质酸的交联多糖。为了本发明的目的，术语“透明质酸”、“透明质酸”和缩写“HA”具有相同的含义并且可以互换使用。它们是指天然的非硫酸化阴离子形式的糖胺聚糖，CAS编号为9004-61-9，由N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的几个重复二糖单元组成；并且也指透明质酸的药学上可接受或化妆品可接受的盐。

为了本发明的目的，术语“透明质酸”还包括其药学上可接受或化妆品可接受的透明质酸盐。在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中的多糖是透明质酸的药学上可接受或化妆品可接受的盐。对可以使用的透明质酸盐的类型没有限制，只要它们在用于治疗目的时是药学上可接受或美容上可接受的。透明质酸及其盐在某些物理性质上可能不同，但它们对于本发明的目的是等效的，并且透明质酸的亲肤性质可扩展到药学上可接受或化妆品可接受的盐，特别是其钠盐(或透明质酸钠)和钾盐(透明质酸钾)。术语“药学上可接受的盐”是指适合用于制备医疗用组合物的药物技术的盐，并且在本文中可互换使用的术语“化妆品可接受的盐”或“皮肤病学上可接受的盐”是指适合用于人体皮肤接触，无毒性、不相容性、不稳定性、不合适的过敏反应等的盐。具体而言，术语“药用或化妆品上可接受的盐”涵盖常用的盐，例如碱金属盐。透明质酸的药学上可接受的盐的制备可以通过本技术中已知的方法进行。适用于本发明的透明质酸的药学上可接受或化妆品可接受的盐的非限制性实例包括无机盐，例如透明质酸钠、透明质酸镁、透明质酸钾、透明质酸锌和透明质酸钴，以及有机盐，例如透明质酸四丁基铵。在一个实施方案中，透明质酸的药学上可接受或化妆品可接受的盐是钠盐(CAS No:9067-32-7)或钾盐(CAS No:31799-91-4)的选定碱金属盐。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是高分子量透明质酸的交联多糖。术语“高分子量透明质酸”是指分子量为300kDa或更大的透明质酸。在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是分子量为300kDa至5000kDa、特别是500kDa至2000kDa的高分子量透明质酸的交联多糖。在一个具体实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是分子量为1000kDa至2000kDa的高分子量透明质酸的交联多糖。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-4，具有：

0.2688％的交联度

2.8毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

3.3毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-22。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-9，具有：

0.1127％的交联度

3.6毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

4.3毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-16。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-8，具有：

0.1358％的交联度

3.5毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

4.3毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-22。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-5，具有：

0.1877％的交联度

0.8毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

3.0毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-23。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-6，具有：

0.1528％的交联度

2.7毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

3.4毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-16。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-14，具有：

0.3911％的交联度

2.8毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

2.6毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-22。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-15，具有：

0.3049％的交联度

1.1毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

2.3毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-23。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是交联多糖(III)-16，具有：

0.2723％的交联度

2.9毫摩尔/小时的酶促降解速率；和

2.6毫摩尔/小时的氧化降解速率；

其中：

多糖是透明质酸，并且

用作起始材料的超支化PPE是化合物(I)-16。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是淀粉或其衍生物的交联多糖。为了本发明的目的，术语“淀粉”是指由通过糖苷键连接的大量葡萄糖单元组成的多糖碳水化合物。淀粉是所有绿色植物产生的能量储存，是人类的主要食物来源。为了本发明的目的，术语“淀粉衍生物”或“改性淀粉”具有相同的含义并且可以互换使用。它们指的是经过反应以改变其特性的淀粉。淀粉衍生物的实例是羟烷基、羧基烷基化、烷基羰基化、磷酸化、硫酸化、接枝衍生化和烷基化淀粉。在一个实施方案中，淀粉衍生物选自羟丙基淀粉、羟基乙酸淀粉钠和羧甲基淀粉。

在一个实施方案中，本发明的交联多糖是其中多糖是纤维素或其衍生物的交联多糖。对于本发明的目的，术语“纤维素”是指具有由通过β-1,4-糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单元形成的主链的多糖。术语“改性纤维素”或“纤维素衍生物”具有相同的含义并且可互换使用。它们指的是任何具有纤维素主链的化合物，即通过β-1,4-糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单元结构，通过引入纯纤维素中不包含的侧基部分对其进行化学修饰。纤维素衍生物的非限制性实例包括甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、L-羟丙基纤维素(低取代)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠或羧甲基羟乙基纤维素。

对于本发明的交联多糖所公开的所有上述实施方案，也分别适用于上述具体列出的多糖中的每一种，即透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶。

本发明的另一个方面是制备本发明的式(III)或式(IV)的交联多糖的方法。

在一个实施方案中，制备本发明的交联多糖(III)的方法包括将多糖与本发明的第一方面所定义的式(I)化合物交联。

在一个实施方案中，制备本发明的式(III)交联多糖的方法包括将多糖与本发明的第一方面所定义的式(I)化合物交联；其中式(I)化合物可通过包括进行如上定义的步骤a)和b)的方法获得。因此，制备本发明的式(III)的交联多糖的方法包括使多糖与式(I)的化合物交联，其中式(I)的化合物通过包括以下的方法获得：a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

在一个实施方案中，制备本发明的交联多糖(III)的方法包括使多糖与本发明的第一方面所定义的式(II)化合物交联。

在一个实施方案中，制备本发明的式(IV)交联多糖的方法包括将多糖与本发明的第一方面所定义的式(II)化合物交联；其中式(II)化合物可通过包括进行如上定义的步骤a)和b)的方法获得。因此，制备本发明的交联多糖的方法包括使多糖与式(II)的化合物交联，其中式(II)的化合物通过包括以下的方法获得：a)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

以上公开的多糖、式(I)化合物、式(II)化合物和交联多糖；以及制备本发明的交联多糖的方法的步骤a)-d)的反应条件的所有实施方案同样适用于本方法得到的交联多糖。

在一个实施方案中，制备式(III)的交联多糖的方法包括：

e)将多糖与本发明的第一方面定义的式(I)化合物交联；并且任选地

g)分离本发明的式(III)的交联多糖。

在一个实施方案中，制备式(III)的交联多糖的方法的步骤e)包括：

e1)提供多糖的5至15重量％的碱性溶液；

e2)提供包含式(I)的化合物的碱性溶液；和

e3)将步骤e1)中获得的溶液和步骤e2)中获得的溶液混合以获得包含多糖和式(I)的化合物的碱性溶液；和

e4)将步骤e3)中获得的碱性溶液在20℃至50℃的温度下保持1至48小时的时间段。

在一个实施方案中，制备式(IV)的交联多糖的方法包括：

f)将多糖与本发明的第一方面定义的式(II)化合物交联；并且任选地

g)分离本发明的式(IV)的交联多糖。

在一个实施方案中，制备式(IV)的交联多糖的方法的步骤f)包括：

f1)提供多糖的5至15重量％的碱性溶液；

f2)提供包含式(II)的化合物的碱性溶液；和

f3)将步骤f1)中获得的溶液和步骤f2)中获得的溶液混合以获得包含多糖和式(II)的化合物的碱性溶液；和

f4)将步骤f3)中获得的碱性溶液在20℃至50℃的温度下保持1至48小时的时间段。

在一个实施方案中，步骤e3)或步骤f3)的碱性溶液包含浓度为5-15重量％的多糖。

在一个实施方案中，在步骤e3)或步骤f3)中获得的碱性溶液包含0.25至0.75M的碱性碱；特别是0.40至0.60M的碱性碱。

在一个实施方案中，在步骤e3)或步骤f3)中获得的碱性溶液包含5至15重量％的多糖；特别是8至10重量％的多糖。

在一个实施方案中，在步骤e3)或步骤f3)中获得的碱性溶液包含0.2至1重量％的式(I)化合物或式(II)化合物；特别是0.3至0.5重量％。

在一个实施方案中，在步骤e3)或步骤f3)中获得的碱性溶液包含式(I)化合物与多糖之间的重量比或式(II)化合物与多糖之间的重量比为2至40％w/w；特别是2至12.5％w/w，所述重量比表示为PPE与干多糖的重量比。术语“重量比”是指本发明的交联多糖在应用后为提高稳定性和提高生物利用度所需要的两种成分的重量关系。特别地，本发明的多糖与超支化PPE的关系需要降低酶促/氧化降解速率并降低交联度。

在一个实施方案中，在步骤e4)或步骤f4)中获得的碱性溶液包含1至50mg/mL的多糖。

分离步骤g)可以根据本领域技术人员众所周知的用于分离化合物的现有技术中公开的方法进行。在一个实施方案中，分离步骤可以包括通过以下操作中的一种或多种除去它们：蒸发、冻干、过滤、倾析和离心，或本领域技术人员已知的其他合适的技术。在一个实施方案中，分离步骤g)包括将步骤e3)或f3)中获得的碱性溶液的pH调节至6.5至7.4。可以通过添加酸例如HCl、H₃PO₃或它们的混合物来调节pH。pH的测定可以通过现有技术中已知的任何方法进行。在本申请的情况下，通过使用其电极浸入水凝胶中的pH计直接读取pH值来确定pH。

本发明的另一方面涉及组合物，其包含：

一种或多种本发明的交联多糖，和

一种或多种合适的赋形剂或载体。合适的交联多糖以及合适的赋形剂和/或载体，以及它们的量，可以由本领域技术人员根据本领域和所制备的制剂类型容易地确定。

在一个实施方案中，组合物是药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种药学上可接受的交联多糖，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。

术语“药物组合物”是指适用于具有医疗用途的制药技术的组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的交联多糖的治疗有效量”是指本发明的交联多糖的量，当施用时，足以防止一种或多种的发展或在一定程度上减轻一种或多种解决的疾病的症状。根据本发明给药的药学上可接受的交联多糖的剂量当然将由围绕病例的具体情况确定，包括施用的化合物、施用途径、所治疗的具体病症以及类似的考虑。就本发明而言，术语“药学上可接受的交联多糖”是指组合物中的活性或中心成分，其对疾病或病症的诊断、预防、治疗、治愈或缓解产生直接(治疗)作用。

本发明的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。术语“药学上可接受的赋形剂或载体”是指适用于制备具有医疗用途的组合物的制药技术的赋形剂或载体。在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体，所述赋形剂和/或载体选自稀释剂、粘合剂、助流剂、崩解剂、润滑剂及其混合物。此外，本发明的药物组合物可以包含其他成分，例如香料、着色剂和本领域已知的其他组分。

在一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的交联多糖，其选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶。

在一个实施方案中，组合物是化妆品组合物，其包含美容有效量的一种或多种美容上可接受的交联多糖，以及一种或多种美容上可接受的赋形剂或载体。

本发明的化妆品组合物设计用于将适量(“美容有效量”)施加于身体以改善其外观或美化、保存、调理、清洁、着色或保护皮肤、指甲或头发(参见Academic pressDictionary of Science and Technology,1992,pp.531；A terminological Dictionaryof the Pharmaceutical Sciences.2007,pp.190)。因此，上述化妆品组合物被用于形容非医疗应用。

本文可互换使用的术语“化妆品可接受的”或“皮肤病学上可接受的”是指适用于与人体皮肤接触而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的赋形剂或载体。

在一个实施方案中，本发明的药物或化妆品组合物是局部组合物，其可以配制成多种形式，包括但不限于溶液、气溶胶和非气溶胶喷雾剂、剃须膏、粉剂、摩丝、乳液、凝胶、棒、软膏、糊剂、面霜、洗发水、沐浴露、沐浴乳或洗面奶。

在一个实施方案中，药物或化妆品组合物是口服组合物。例如，固体组合物是片剂、颗粒剂和胶囊剂。

在一个实施方案中，药物或化妆品组合物是可注射组合物。在一个实施方案中，药物或化妆品组合物是选自肌肉内、皮下或静脉内应用的可注射组合物。在一个实施方案中，本发明的药物或化妆品组合物是适于将它们注射、输注或植入体内的肠胃外组合物的形式。上文定义的肠胃外组合物应该是无菌的、无热原的，并且它们可以是液体形式，例如溶液、乳液或悬浮液，或者是包装在使用前适当稀释的单剂量或多剂量容器中的固体形式。肠胃外组合物可以包含用于肠胃外施用的合适的赋形剂或载体，其可以是药物或化妆品赋形剂，包括但不限于溶剂、悬浮剂、缓冲剂、使制剂与血液等渗的物质、稳定剂或抗微生物防腐剂。辅料的添加应保持在最低限度。当使用赋形剂时，它们不应对聚合物和/或活性剂的稳定性、生物利用度、安全性或功效产生不利影响，或引起毒性或过度的局部刺激。剂型的任何成分之间不应存在任何不相容性。

以上定义的局部组合物包含用于局部施用的合适的赋形剂或载体，其可以是药物或化妆品赋形剂，包括但不限于修复皮肤屏障功能剂、水合剂、润肤剂、乳化剂、增稠剂、保湿剂、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、载体或它们的混合物。所使用的赋形剂或载体对皮肤具有亲和力，耐受性好、稳定，并且用量足以提供所需的稠度并易于应用。此外，本发明的组合物可以包含其他成分，例如香料、着色剂和本领域已知的用于局部制剂的其他组分。本发明的局部组合物可以配制成多种形式，包括但不限于溶液、气溶胶和非气溶胶喷雾剂、乳膏、粉剂、摩丝、乳液、凝胶、棒、软膏、糊剂和乳剂。

在一个实施方案中，化妆品组合物包含一种或多种药学上可接受的交联多糖，其选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶。

在一个实施方案中，所述组合物是可食用组合物，其包含一种或多种可食用的交联多糖和一种或多种可食用的赋形剂或载体。

术语“可食用的”是指可以被人类或动物食用而不会产生显著有害健康后果的组合物、交联多糖、赋形剂和载体。

术语“可食用的可接受的赋形剂或载体”是指从风味的角度来看基本上是中性的赋形剂或载体，只要它不显著改变感官特性。此外，它们适用于制备可供人类食用的组合物，而不会产生明显的有害健康后果。

在一个实施方案中，可食用组合物包含一种或多种可食用的交联多糖，其选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖和角叉菜胶。

本发明的可食用组合物可以配制成多种形式，包括但不限于固体或液体形式。此外，本发明的可食用组合物可包含其他成分，例如着色剂和耐光剂，以及现有技术中已知的用于可食用组合物的其他组分。

在一个实施方案中，可食用组合物是人类食物或动物食物(饲料)。

在一个实施方案中，组合物是农业组合物，其包含生物学有效量的一种或多种农业上可接受的交联多糖，以及一种或多种农业上可接受的赋形剂或载体。

术语“农业上”是指这样的组合物、交联多糖、赋形剂和载体，它们可以应用于植物的基部和/或叶部以对其进行处理而不会对健康造成显著的有害后果。

在一个实施方案中，农业组合物选自肥料、常量营养素、微量营养素、杀虫剂、植物生长调节剂、植物激素和Nod因子。

如本文所用，术语“生物学有效量”是指对植物、昆虫或植物害虫产生所需效果所需的本发明的交联多糖的量。该物质的有效量取决于几个因素，包括处理方法、植物种类、害虫种类、繁殖材料类型和环境条件。例如，杀虫剂的生物学有效量是保护植物免受损害的杀虫剂的量。这并不意味着受保护的植物不会受到害虫的损害，而是损害程度足以使植物产生可接受的作物产量。

农业组合物可配制成选自可湿性粉剂、撒粉剂、水分散粒剂、悬浮浓缩物、乳油、片剂、丸剂、液体和油悬浮剂的形式。

在一个实施方案中，农业组合物包含一种或多种农业上可接受的交联多糖，其选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶。

本发明的交联多糖的用途也是本发明的一部分。合适的交联多糖以及合适的赋形剂和/或载体，以及它们的量，可以由本领域技术人员根据本领域和所制备的制剂类型容易地确定。

本发明的药物交联多糖和含有它们的药物组合物可用于制药领域。因此，本发明的药物交联多糖或本发明的包含它们的药物组合物用于治疗也是本发明的一部分。在一个实施方案中，本发明的交联HA或包含它的组合物用于治疗。

该方面也可以被制定为药物交联多糖在制备药物中的用途。它还涉及治疗患有疾病的哺乳动物的方法，其中该方法包括向所述哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的如上定义的本发明的药物交联多糖。在一个实施方案中，如上定义的本发明的药物组合物是其中药物交联多糖是用于治疗软组织增大的交联多糖。该方面还可以被配制成包含如上定义的交联HA的本发明药物组合物在制备用于治疗伤口的药物中的用途。它还涉及治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法。其中该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的药物组合物，该药物组合物包含如上定义的交联HA。

如上定义的本发明的药物交联多糖和药物组合物的所有实施方案也适用于它们在治疗中的用途。

本发明的化妆品交联多糖和含有它们的化妆品组合物可用于化妆品领域。因此，本发明的化妆品交联多糖和化妆品组合物作为护肤剂的用途也是本发明的一部分，其中所述护肤包括改善以下症状中的至少一种：粗糙、片状、脱水、紧绷、皲裂和缺乏弹性。

在一个实施方案中，本发明的化妆品交联多糖和包含它们的化妆品组合物是保湿剂。在一个实施方案中，本发明的化妆品交联多糖和包含它们的化妆品组合物是护肤剂。在一个实施方案中，本发明的化妆品交联多糖和包含它们的化妆品组合物是舒缓剂。舒缓剂适用于舒缓、镇静(calming、composing、lulling、quieting、settling、stilling或tranquilizing)皮肤。在一个实施方案中，本发明的化妆品交联多糖和含有它们的化妆品组合物是皮肤屏障恢复剂。

在一个实施方案中，本发明的化妆品交联多糖和包含它们的化妆品组合物是真皮填充剂，特别是其中多糖是HA。

本发明的食用交联多糖和含有它们的食用组合物可用于食品领域。在一个实施方案中，本发明的可食用交联多糖和包含它们的可食用组合物是食品添加剂。在一个实施方案中，本发明的可食用交联多糖和含有它们的可食用组合物是质地改性剂，例如树胶、增稠剂、增量剂、乳剂稳定剂和粘合剂。

在一个实施方案中，本发明的可食用交联多糖和含有它们的可食用组合物作为食品添加剂的用途；特别是质地改性剂，其中多糖是HA、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖和角叉菜胶。

本发明的交联多糖作为载体的用途也是本发明的一部分，其作为药物活性成分、诊断剂、化妆品化合物、肽、蛋白质、抗体、疫苗和基因的递送系统。

在整个说明书和权利要求书中，“包含/包括”一词和该词的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，“包含/包括”一词包括“由......组成”的情况。本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员来说将在检查说明书后变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来了解。以下实施例和附图以示例的方式提供，它们不旨在限制本发明。权利要求中与附图相关并置于括号中的参考符号仅用于试图增加权利要求的可理解性，不应解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文描述的实施方案的所有可能组合。

实施例

缩略语表

HA:透明质酸

GAG:糖胺聚糖

C.D.:交联度

NaCMC:羧甲基纤维素钠

HES:羟乙基淀粉

GlcA:D-葡萄糖醛酸

GlcNAc:N-乙酰-D-氨基葡萄糖

ECM:细胞外基质

ROS:活性氧

HYAL:透明质酸酶

IA:炎症性关节炎

EDC:碳二亚胺

DVS:二乙烯基砜

BDDE:1,4-丁二醇二缩水甘油醚

PEGDE:聚(乙二醇)二缩水甘油醚

GDE:1,3-甘油二缩水甘油醚

PPE:聚甘油二缩水甘油醚

FDA:美国食品和药物管理局

EEW:环氧当量

GPC:凝胶渗透色谱

SEC:尺寸排阻色谱

SANS:小角中子散射

1H NMR:质子核磁共振

PBS:磷酸盐缓冲溶液

IPN:互穿网络

MMPs:金属蛋白酶

Mw:重均分子量

Mn:数均分子量

材料

Shyalt超纯透明质酸钠(透明质酸)来自Altergon Italy。

高直链淀粉来自Merck。

高支链淀粉来自Merck。

羧甲基纤维素钠0.7MDa,0.8-0.9D.S.AQUALON^TM,BLANOSE^TM和BONDWELL^TM。

丁二醇二缩水甘油醚(BDDE),MW＝202Da来自Merck。

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDE),MW＝526Da来自Merck。

1,3-双(2-环氧乙烷基甲氧基)-2-丙醇，也有以下名称、商品名、同义词和缩写：1,3-双(环氧乙烷基-2-基甲氧基)丙-2-醇；2-丙醇，1,3-双(环氧乙烷基甲氧基)；甘油1,3-二缩水甘油醚；Denacol EX-313,MW＝204Da,EEW＝141g/eq来自Nagase Chemtex；1,3-甘油二缩水甘油醚,MW＝204Da来自Merck；并且1,3-GDE具有以下结构：

2,3-双(2-环氧乙烷基甲氧基)-1-丙醇，也有以下名称、商品名、同义词和缩写：2,3-双(环氧乙烷-2-基甲氧基)丙-1-醇、1-丙醇,1,2-双(环氧乙烷基甲氧基)；甘油1,2-二缩水甘油醚；1,2-甘油二缩水甘油醚,MW＝204Da来自Merck；并且1,2-GDE具有以下结构：

1,3-GDE和1,2-GDE的混合物也可以以下列商标名购得：Denacol EX-314，MW＝260Da，EEW＝144g/eq来自Nagase Chemtex；

氢氧化钠颗粒(NaOH)来自Merck；

盐酸37％(HCl)来自Merck；

氯化钠粉末(NaCl)来自Merck；

氯化钾粉末(KCl)来自Merck；

磷酸85％(H₃PO₄)来自Merck；

磷酸盐缓冲盐水(PBS)颗粒来自Merck；

蒸馏水(H₂O)来自Merck；

方法

使用配备有光散射检测器的色谱仪通过GPC/SEC分析评估平均Mw、Mn和Mw/Mn的测量方法。

通过超声辅助滴定评估EEW的测量方法。

测量pH的方法是通过直接读取配备有直接浸入水凝胶中的电极的pH计来计算的。

1.超支化聚甘油多缩水甘油醚

1.1.使用1,3-GDE作为起始材料

下述制备过程也可以通过使用可从Nagase商购的EX-313作为1,3-GDE的来源进行。然而，这些过程也可以通过使用可从Merck商购的1,3-甘油二缩水甘油醚或使用商标/>EX-314而不是/>EX-313进行，/>EX-314是一种包含1,3-DGE的混合物。

1.1.1.方法1

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。

在室温下将1,3-GDE(EX-313)溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至50％的1,3-GDE的碱性溶液(溶液C1)。

然后将溶液C1在50至80℃范围内的受控温度下反应包括1至500分钟的时间段，在此期间1,3-GDE发生自聚合，得到本发明的聚甘油多缩水甘油醚(表1中公开的溶液C3)(实施例1-13)。

1.1.2方法2

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。

在室温下将1,3-GDE(EX-313)溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至50％的1,3-GDE的碱性溶液(溶液C1)。

然后将溶液C1在10至40℃范围内的受控温度下反应包括1至30天的时间段，在此期间1,3-GDE发生自聚合，得到本发明的聚甘油多缩水甘油醚(表1中公开的溶液C2)(实施例14-31)。

1.1.3本发明的PPE的表征

分别使用如前所述的配备有光散射检测器的GPC仪器和HCl定量滴定随时间分析监测按照方法1和2获得的PPE的分子量和环氧含量，以环氧当量表示，表示为起始GDE的EEW百分比。每次分析前，通过加入1M盐酸溶液和PBS中和碱性催化剂，使聚甘油多缩水甘油醚溶液的pH恢复至7.0，停止GDE的自聚合反应。

得到的本发明的聚甘油多缩水甘油醚(PPE)的平均分子量(MW)和EEW值在每种温度和时间组合下报告在表1中。

表1

2.交联多糖

2.1交联透明质酸

2.1.1本发明的PPE交联透明质酸

2.2.1.1.制备方法

实施例1-13的PPE交联透明质酸(参见表2)按照如下定义的方法制备。实施例14-16的PPE交联透明质酸(见表2)是按照与实施例1-13相同的方法制备的，但使用的交联剂浓度是实施例1-13的约2.5倍，其浓度为1.00。

方法1

A.根据上文第1.1.2节所公开的方法制备实施例1-13的聚甘油多缩水甘油醚

B.制备交联多糖

备选B1

将透明质酸(HA)干粉在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中(或直接添加到溶液C3中)，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合HA的碱性溶液(溶液B)。

然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度在0.25和0.75M范围内并且HA和PPE的比例从2到12.5％w/w(表示为PPE与干多糖的重量比)。

备选B2

然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度范围为0.25至0.75M，HA在最终溶液中的浓度相对于总重量在8至10重量％的范围内，并且PPE在最终溶液中的浓度相对于总重量在0.2至1重量％的范围内。以PPE与干多糖的重量比表示的比例为2至40％w/w(表示为PPE与干多糖的重量比)。

C.交联多糖的反应和分离

然后在室温下将所得的由HA、PPE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。

然后将PPE交联透明质酸(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的材料和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复PPE交联透明质酸(水凝胶)的pH值到6.5-7.4，并达到PPE交联透明质酸水凝胶中如表2所示的从1到50mg/mL的所需HA最终浓度。

将PPE交联透明质酸(水凝胶)填充到注射器中，并按照EN ISO 17665-1保健产品的灭菌——湿热第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、验证和常规控制的要求中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。

PPE交联透明质酸(水凝胶)可任选在30℃真空下脱水或冻干(冷冻干燥)并储存以供后续使用或分析。

方法2

A.根据上文第1.1.3节所公开的方法制备实施例14-31的聚甘油多缩水甘油醚

B.制备交联多糖

备选B1

将透明质酸(HA)在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中(或直接添加到溶液C3中)，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合HA的碱性溶液(溶液B)。然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度在0.25和0.75M范围内并且HA和PPE的比例从2到12.5％w/w(表示为PPE与干多糖的重量比)。

备选B2

然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度范围为0.25至0.75M，HA在最终溶液中的浓度相对于总重量在8至10重量％的范围内，并且PPE在最终溶液中的浓度相对于总重量在0.2至1重量％的范围内。以PPE与干多糖的重量比表示的比例为2至40％w/w(表示为PPE与干多糖的重量比)。

C.交联多糖的反应和分离

然后在室温下将所得的由HA、PPE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。

然后将PPE交联透明质酸(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的材料和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复PPE交联透明质酸(水凝胶)的pH值到6.5-7.4，并达到PPE交联透明质酸(水凝胶)中如表2所示的从1到50mg/mL的HA最终浓度。

将PPE交联透明质酸(水凝胶)填充到注射器中，并按照EN ISO 17665-1保健产品的灭菌——湿热第1部分：医疗器械灭菌过程的开发、验证和常规控制的要求中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。PPE交联透明质酸(水凝胶)可任选在30℃真空下脱水或冻干(冷冻干燥)并储存以供后续使用或分析。

2.1.1.2.本发明的PPE交联透明质酸(PPE交联透明质酸实施例1-16)的表征

由本发明的PPE得到的本发明的PPE交联透明质酸的机械性能如表2所示。表2中实施例1-13所公开的PPE交联透明质酸的浓度为22.0mg/mL透明质酸，同时实施例14-16的交联剂浓度是实施例1-13的约2.5倍。

表2

(a)PPE交联HA中HA的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)本发明的PPE在PPE交联HA中的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.1.2.比较交联透明质酸

2.1.2.1.比较1,3-GDE交联透明质酸(比较GDE-HA)

通过使用可从Nagase商购的EX-313作为1,3-GDE的来源制备下述比较GDE-HA。然而，这些方法也可以通过使用可从Merck商购的1,3-甘油二缩水甘油醚或使用商标/>EX-314而不是/>EX-313进行，/>EX-314是一种包含1,3-DGE的混合物。

比较实施例1-5的比较GDE交联透明质酸(参见表4)按照如下定义的方法制备。比较实施例6的比较GDE交联透明质酸(参见表4)按照与实施例1-5相同的方法制备，但使用1.00的交联剂浓度并具有0.4037％的C.D.。

制备方法

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。将HA在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合HA的碱性溶液(溶液B)。

在室温下将GDE溶解在蒸馏水中，以形成含有基于溶液总重量的1至10％的GDE的中性溶液(溶液C1)。任选地，在室温下将GDE溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的0.2至2％的GDE的碱性溶液(溶液C2)。然后将溶液C(C1/C2)添加到溶液B中以提供在最终溶液中的氢氧化物浓度在0.25和0.75M范围内并且具有所需HA和GDE比例的碱性溶液。然后在室温下将所得的由HA、GDE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。

然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。然后将比较GDE交联透明质酸(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的物质和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复水凝胶的pH值到6.5-7.4，并达到水凝胶中如下表4所示的从1到50mg/mL的HA浓度(比较GDE实施例1-5)。

将水凝胶填充到注射器中并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。比较GDE交联透明质酸(水凝胶)可任选在30℃真空下脱水或冻干(冷冻干燥)并储存以供后续使用或分析。

比较GDE交联透明质酸的表征(比较GDE-HA.1-6)

从商业1,3-GDE获得的落在本发明范围之外的比较GDE交联透明质酸的机械性能公开于表4中，透明质酸的浓度为22.0mg/mL。

表4

(a)GDE交联HA中HA的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)本发明的GDE在GDE交联HA中的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.1.2.2比较BDDE交联透明质酸(比较BDDE-HA)

制备方法

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。将透明质酸在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合HA的碱性溶液(溶液B)。

在室温下将BDDE溶解在蒸馏水中，以形成含有基于溶液总重量的0.2至2％的BDDE的中性溶液(溶液C1)。任选地，在室温下将BDDE溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至10％的BDDE的碱性溶液(溶液C2)。然后将溶液C(C1中性或C2碱性)添加到溶液B中以提供在最终溶液中的氢氧化物浓度在0.25和0.75M范围内并且具有所需HA和BDDE比例的碱性溶液。然后在室温下将所得的由HA、BDDE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括30分钟至48小时的时间段。

然后将比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的物质和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复水凝胶的pH值到6.5-7.4，并达到比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)中如下表所示的从1到50mg/mL的HA浓度(比较BDDE-HA实施例1-5)。

将比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)填充到注射器中并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)可任选在30℃真空下脱水并储存以供后续使用或分析。

比较BDDE交联透明质酸的表征

从商业BDDE获得的落在本发明范围之外的比较BDDE交联透明质酸的机械性能公开于表5中，透明质酸的浓度为22.0mg/mL。

表5

(a)GDE交联HA中HA的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)本发明的BDDE在BDDE交联HA中的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.1.2.3比较PEGDE交联透明质酸(比较PEGDE-HA)

制备方法

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。将HA在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合HA的碱性溶液(溶液B)。在室温下将PEGDE溶解在蒸馏水中，以形成含有基于溶液总重量的0.4至4％的PEGDE的中性溶液(溶液C1)。任选地，在室温下将PEGDE溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至10％的GDE的碱性溶液(溶液C2)。然后将溶液C(C1/C2)添加到溶液B中以提供在最终溶液中的氢氧化物浓度在0.25和0.75M范围内并且具有所需HA和PEGDE比例的碱性溶液。然后在室温下将所得的由HA、PEGDE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。然后将比较PEGDE交联透明质酸(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的物质和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复PEGDE交联透明质酸(水凝胶)的pH值到6.5-7.4，并达到PEGDE交联透明质酸(水凝胶)中如下表所示的从1到50mg/mL的HA浓度(比较PEGDE-HA实施例1-5)。

将PEGDE交联透明质酸(水凝胶)填充到注射器中并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。水凝胶可任选在30℃真空下脱水并储存以供后续使用或分析。

比较PEGDE交联透明质酸的表征

从商业PEGDE获得的落在本发明范围之外的比较PEGDE交联透明质酸的机械性能公开于表6中，透明质酸的浓度为22.0mg/mL。

表6

(a)GDE交联HA中HA的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)本发明的PEGDE在PEGDE交联HA中的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.1.3.测定

2.1.3.1.活力测定

MTT测定用于评估生长的3T3小鼠成纤维细胞的活力。

采用以下进行MTT测定：

比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)(比较BDDE-HA实施例3)，

比较PEGDE交联透明质酸(水凝胶)(比较PEGDE-HA实施例3)，

本发明的PPE交联透明质酸(水凝胶)(PPE-HA实施例3)，

BDDE，

PEGDE，和

PPE(本发明的PPE实施例22)。

a)对与测试水凝胶直接接触生长的细胞进行MTT测定。

MTT测定是在与100mg每个测试样品直接接触生长的细胞上进行的。该MTT测定显示所有三种测试水凝胶相对于对照(以培养基为代表)的细胞活力存在差异，这归因于细胞增殖的抑制，主要是由于水凝胶的存在导致可用空间不足，而不是有毒或低生物相容性组织。具体而言，在本发明的PPE交联透明质酸存在下的细胞活力与对照和与具有BDDE和PEDGE的对比交联透明质酸相比显著更高。

b)对在水凝胶提取物中生长的细胞进行MTT测定。

MTT测定是对在存在测试水凝胶提取物的情况下生长的细胞进行的，该提取物是通过将测试的交联水凝胶浸入培养基中24小时获得的。

在测试水凝胶提取物存在下生长的细胞上进行的MTT测定显示水凝胶和对照之间的细胞活力没有差异，这意味着当这些水凝胶在培养基中浸泡24小时时，所有三种测试的水凝胶都没有在培养基中释放有毒物质。这归功于良好且受控的制造过程，其中所有未反应的原材料和副产物在交联制造过程中被有效去除。

c)对与交联剂直接接触生长的细胞进行MTT测定

对与含有交联剂溶液的溶液直接接触生长的细胞进行MTT测定。该溶液含有相同的环氧当量，遵循水凝胶制造过程的相同步骤——例如化学反应、洗涤和灭菌，但不添加多糖。

MTT测定表明，与PPE直接接触生长的细胞的活力与对照(NaCl 0.9％中的培养基)相比没有显著差异。显微图像证实，与直接接触BDDE和PEGDE的细胞相比，直接接触PPE的细胞具有良好的形状和活力，而直接接触BDDE和PEGDE的细胞反而显示出细胞活力的显著下降和受损迹象。

2.1.3.2.酶促降解测定

采用以下进行酶促降解率的评估：

比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)比较BDDE-HA实施例3，

比较PEGDE交联透明质酸(水凝胶)比较PEGDE-HA实施例3，

比较GDE交联透明质酸(水凝胶)比较GDE-HA实施例3，和

本发明的PPE交联透明质酸(水凝胶)PPE-HA实施例4、PPE-HA实施例5和PPE-HA实施例6。

用来自牛测试的10μL 0.1mg/mL透明质酸酶(IV-S型；1040单位/mg固体)处理0.2mL每种测试的交联透明质酸(水凝胶)。将测试的水凝胶在PBS中在37℃下孵育16小时，用咔唑测定评估来自降解的透明质酸的糖醛酸。测试的22mg/mL交联透明质酸水凝胶显示响应于透明质酸酶的降解率从74.4％(BDDE交联作为对照)到26.3％的酶促降解的游离糖醛酸。

比较BDDE水凝胶(比较BDDE-HA实施例3)、比较PEGDE水凝胶(比较PEGDE-HA实施例3)和比较GDE水凝胶(比较GDE-HA实施例3)交联透明质酸显示相似的交联度，因此酶降解后游离糖醛酸的可比量分别为74.4、70.8和69.5％。

本发明的PPE水凝胶(PPE-HA实施例4和实施例5)显示出交联度的降低，因此应当预期的是酶促降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，酶促降解后游离糖醛酸的量分别下降到56.7％和26.3％，这表明酶促降解抗性发生了有统计学意义的增加。

PPE交联HA PPE-HA实施例6在酶促降解后显示出58.0％的游离糖醛酸量，与源自PPE-HA实施例4的PPE交联HA的游离糖醛酸相当，这表明，即使两种水凝胶具有两种不同的交联度、特别是来自PPE-HA实施例6的C.D.明显低于PPE-HA实施例4的C.D.(分别为0.2688和0.1528％)，它们的酶促降解抗性仍然是相当的(分别为56.7和58.0％)。

因此，本发明的PPE对酶促降解的保护作用显著高于比较GDE、BDDE和PEGDE。具体而言，高分子量(即3000-15000Da)的PPE的保护作用高于低分子量PPE(即750至低于3000Da)对酶促降解的保护作用，即使低分子量PPE具有更好的机械性能。来自实验51水凝胶的22mg/mL HA对透明质酸酶的体外酶促降解表现出比其他的HA更强的抗性。

与BDDE、PEGDE、GDE交联的比较透明质酸和与本发明的PPE交联的透明质酸的酶促降解测定结果总结于下表：

表7

(a)C.D.＝0.2745；G’＝274.17±9.54并且D_N＝27.62±0.23

(b)C.D.＝0.1358；G’＝85.56±2.94并且D_N＝34.92±0.19

(c)C.D.＝0.1127；G’＝54.09±4.07并且D_N＝37.17±0.33

因此，如上述结果所示，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。具体而言，证明了本发明的交联多糖(通过使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)与落入本发明保护范围之外的比较交联多糖(使用商业GDE、BDDE和PEGDE作为交联剂获得)相比具有相当的物理性质(用G'值表示，因此用DN值表示和CD)，但具有更大的酶促抗性(即更低的酶促降解率)。

此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，酶促降解率较高，数值上表示为具有与比较交联多糖的降解速率相同，但G'、DN和CD的值较低。这是有利的，因为由于使用的交联剂量越低，则多糖的化学改性越低，从而提高了其注射到皮肤后的生物相容性和安全性。

2.1.3.3.氧化降解测定

样品：

采用以下进行氧化降解率的评估：

比较BDDE交联透明质酸比较BDDE-HA实施例3，

比较PEGDE交联透明质酸比较PEGDE-HA实施例3，

比较GDE交联透明质酸比较GDE-HA实施例3，和

本发明的PPE交联透明质酸PPE-HA实施例4、PPE-HA实施例5和PPE-HA实施例6。

方法：

按照本领域公开的方法评估对氧化降解的抗性(参见Bitter,T.and H.M.Muir,“Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry”,1962,vol.4(4),pp.330-334)：

用芬顿试剂(5mL的PBS中10μL的0.1M Fe⁺²/H₂O₂和25μL 0.1M的抗坏血酸)处理0.2mL每种测试的交联透明质酸，在37℃下孵育24小时。用咔唑测定评估来自降解的透明质酸的糖醛酸。测试的22mg/mL交联透明质酸水凝胶显示响应于氧化的降解率从88.0％(PEGDE交联)到61.6％的来自氧化降解的游离糖醛酸。

比较BDDE交联水凝胶(比较BDDE-HA实施例3)、比较PEGDE交联水凝胶(比较PEGDE-HA实施例3)和比较GDE交联水凝胶(比较GDE-HA实施例3)交联透明质酸显示相当的交联度，因此氧化降解后游离糖醛酸的可比量分别为81.2、88.0和80.2，其中PEGDE交联水凝胶对氧化降解最敏感。

本发明的PPE交联水凝胶(PPE-HA实施例4和实施例5)显示出交联度的降低，因此应当预期的是氧化降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，氧化降解后游离糖醛酸的量分别下降到65.9和61.6，这表明氧化降解抗性发生了有统计学意义的增加。来自PPE-HA实施例6本发明的PPE交联HA在氧化降解后显示出69.6％的游离糖醛酸量，略高于源自来自PPE-HA实施例4和PPE-HA实施例6的PPE交联HA的游离糖醛酸，但统计学上显著低于实验3、8和13，这表明本发明的PPE交联透明质酸的氧化降解抗性高于不在本发明的范围的比较BDDE、PEGDE和GDE交联多糖。

结果：

与BDDE、PEGDE、GDE交联的比较透明质酸和与本发明的PPE交联的透明质酸的氧化降解测定结果总结于下表：

表8

(a)C.D.＝0.2745；G’＝274.17±9.54并且D_N＝27.62±0.23

(b)C.D.＝0.1358；G’＝85.56±2.94并且D_N＝34.92±0.19

(c)C.D.＝0.1127；G’＝54.09±4.07并且D_N＝37.17±0.33

因此，如上述结果所示以及上述酶促降解速率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的氧化降解抗性(这意味着相对氧化降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。

此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，氧化降解率较高。这是有利的，因为由于使用的交联剂量越低，则多糖的化学改性越低，从而提高了其注射到皮肤后的生物相容性和安全性。

2.2交联直链淀粉

2.2.1本发明的PPE交联直链淀粉(PPE-AS)

下文所述的PPE-AS是使用可从Nagase商购的EX-313作为1,3-GDE的来源制备的。然而，这些过程也可以通过使用可从Merck商购的1,3-甘油二缩水甘油醚或使用商标/>EX-314而不是/>EX-313进行，/>EX-314是一种包含1,3-DGE的混合物。

制备方法

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。在室温下将1,3-GDE(EX-313)溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至50％的1,3-GDE的碱性溶液(溶液C1)。然后将溶液C1在10至40 ℃范围内的受控温度下反应包括1至30天的时间段，或者在20至50℃范围内的受控温度下 反应包括1至48小时的时间段，在此期间1,3-GDE发生自聚合，得到具有表1中公开的分子量和/或具体环氧含量的聚甘油多缩水甘油醚(溶液C3)。

将高含量直链淀粉在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合高含量直链淀粉的碱性溶液(溶液B)。然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度在0.25和0.75M范围内并且高含量直链淀粉和PPE的比例。然后在室温下将所得的由高含量直链淀粉、PPE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。

然后将PPE交联高含量直链淀粉(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的材料和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复水凝胶的pH值到6.5-7.4，并达到PPE交联直链淀粉(水凝胶)中如下表所示的从1到50mg/mL的高含量直链淀粉浓度(PPE-AS实施例1-3)。

将PPE交联直链淀粉水凝胶填充到注射器中，并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。PPE交联直链淀粉水凝胶可任选通过冷冻干燥脱水并储存以供后续使用或分析。

2.2.2.比较GDE交联直链淀粉(比较GDE-AS)

比较GDE交联直链淀粉是按照上面对于比较1,3-GDE交联透明质酸的第2.1.2.1节中公开的方法制备的，但使用直链淀粉代替透明质酸。

2.2.3.交联直链淀粉的表征

如上获得的本发明的PPE交联直链淀粉(PPE-AS)和比较GDE交联直链淀粉(比较GDE-AS)的机械性能公开于下表中。

表9

(a)交联水凝胶中直链淀粉的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)交联直链淀粉中本发明的交联剂的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.2.4测定

2.2.4.1酶促降解测定

样品：

采用以下进行酶促降解率的评估：

比较GDE交联直链淀粉(水凝胶)比较GDE-AS实施例1，和

本发明的PPE交联直链淀粉(水凝胶)PPE-AS实施例1、PPE-AS实施例2和PPE-AS实施例3。

方法：

用10μL 0.1mg/mL来自地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α-淀粉酶(冻干粉，500-1,500单位/mg蛋白质)处理0.2mL每种测试的交联直链淀粉(水凝胶)。将测试的水凝胶在PBS中在37℃下孵育16小时，用咔唑测定评估来自降解的直链淀粉水凝胶的己糖单体。测试的22mg/mL交联直链淀粉水凝胶显示响应于α-淀粉酶从80.3％到41.7％的相对酶促降解率。

结果：

比较GDE交联直链淀粉(比较GDE-AS实施例1)和本发明的PPE交联直链淀粉(PPE-AS实施例1)显示相当的交联度，本发明的PPE水凝胶(PPE-AS实施例2和PPE-AS实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是酶促降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，酶促降解后游离己糖单体的量分别下降到41.7％和80.0％，这表明酶促降解抗性发生了有统计学意义的增加。

PPE交联HA PPE-AS实施例3在酶促降解后显示出与原自来自PPE-AS实施例1的PPE交联淀粉的游离己糖单体的量相当的游离己糖单体的量，这表明，即使两种水凝胶具有两种不同的交联度、特别是来自PPE-AS实施例3的C.D.明显低于PPE-AS实施例1的C.D.(分别为0.1548和0.1981％)，它们的酶促降解抗性仍然是相当的(分别为80.0％和80.3)。

因此，本发明的PPE对酶促降解的保护作用显著高于比较GDE。具体而言，高分子量(即3000-15000Da)的PPE的保护作用高于低分子量PPE(即750至低于3000Da)对酶促降解的保护作用，即使低分子量PPE具有更好的机械性能。来自PPE-AS实施例2的22mg/mL AS对透明质酸酶的体外酶降解显示出比其他的AS更强的抗性。

与GDE交联的比较直链淀粉和与本发明的PPE交联的直链淀粉的酶促降解测定结果总结于下表：

表10

因此，如上述结果所示，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。具体而言，证明了本发明的交联多糖(通过使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)具有更大的酶促抗性(即更低的酶促降解率)。此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，酶促降解率较高。

2.2.4.2氧化降解测定

样品：

采用以下进行氧化降解率的评估：

比较GDE交联直链淀粉比较GDE-AS实施例1，和

本发明的PPE交联直链淀粉PPE-AS实施例1、PPE-AS实施例2和PPE-AS实施例3。

方法：

按照本领域公开的方法评估对氧化降解的抗性(参见Bitter,T.and H.M.Muir,“Amodified uronic acid carbazole reaction.Analytical Biochemistry”,1962,vol.4(4),pp.330-334)：

用芬顿试剂(5mL的PBS中10μL的0.1M Fe⁺²/H₂O₂和25μL 0.1M的抗坏血酸)处理0.2mL每种测试的交联直链淀粉，在37℃下孵育24小时。用咔唑测定评估来自降解的直链淀粉的游离己糖单体。测试的22mg/mL交联直链淀粉显示响应于氧化从83.8％到77.4％的降解率。

结果：

比较GDE交联直链淀粉(比较GDE-AS实施例1)和本发明的PPE交联直链淀粉(PPE-AS实施例1)显示相当的交联度，本发明的PPE交联直链淀粉(PPE-AS实施例2和PPE-AS实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是氧化降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，氧化降解后PPE-AS实施例1、PPE-AS实施例2和PPE-AS实施例3的游离己糖单体的量分别下降到83.8、77.4和81.0，这表明氧化降解抗性发生了有统计学意义的增加。

因此，如上述结果所述和上文对于氧化降解率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。

与GDE交联的比较直链淀粉和与本发明的PPE交联的直链淀粉的氧化降解测定结果总结于下表：

表11

因此，如上述结果所示和上述酶促降解速率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的氧化降解抗性(即相对氧化降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，氧化降解率较高。

2.3交联支链淀粉/糖原

2.3.1.本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG)

下文所述的PPE-ASG是使用可从Nagase商购的EX-313作为1,3-GDE的来源制备的。然而，这些过程也可以通过使用可从Merck商购的1,3-甘油二缩水甘油醚或使用商标/>EX-314而不是/>EX-313进行，/>EX-314是一种包含1,3-DGE的混合物。

制备方法

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。在室温下将1,3-GDE(EX-313)溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至50％的1,3-GDE的碱性溶液(溶液C1)。然后将溶液C1在10至40 ℃范围内的受控温度下反应包括1至30天的时间段，或者在20至50℃范围内的受控温度下 反应包括1至48小时的时间段，在此期间1,3-GDE发生自聚合，得到具有表1中公开的分子量和/或具体环氧含量的聚甘油多缩水甘油醚(溶液C3)。

将高含量支链淀粉/糖原在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合高含量支链淀粉/糖原的碱性溶液(溶液B)。然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度在0.25和0.75M范围内并且高含量支链淀粉/糖原和PPE的比例。然后在室温下将所得的由高含量支链淀粉/糖原、PPE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。

然后将PPE交联高含量支链淀粉/糖原(水凝胶)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的材料和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复水凝胶的pH值到6.5-7.4，并达到如下表所示的从1到50mg/mL的与PPE交联的高含量支链淀粉/糖原(水凝胶)浓度(PPE-ASG实施例1-3)。

将与PPE交联支链淀粉/糖原(水凝胶)填充到注射器中，并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。本发明的与PPE交联的支链淀粉/糖原(水凝胶)可任选在50℃的通风烘箱中脱水并储存以供后续使用或分析。

2.3.2.比较GDE交联支链淀粉/糖原(比较GDE-ASG)

比较GDE交联支链淀粉/糖原是按照上面对于比较1,3-GDE交联透明质酸的第2.1.2.1节中公开的方法制备的，但使用支链淀粉/糖原代替透明质酸。

2.3.3.交联支链淀粉/糖原的表征

如上获得的浓度为22.0mg/mL的本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG)和比较GDE交联支链淀粉/糖原(比较GDE-ASG)的机械性能公开于下表中：

表12

(a)交联水凝胶中支链淀粉/糖原的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)交联支链淀粉/糖原中交联剂的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.3.4测定

2.3.4.1酶促降解测定

样品：

采用以下进行酶促降解率的评估：

比较GDE交联支链淀粉/糖原(水凝胶)比较GDE-ASG实施例1，和

本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(水凝胶)PPE-ASG实施例1、PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3。

方法：

按照前面第2.2.4.1节酶促降解测定中公开的方法评估对酶促降解的抗性。

结果：

本发明的PPE水凝胶(PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是酶促降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，酶促降解后游离己糖单体的量分别下降到76.0％和89.4％，这表明酶促降解抗性发生了有统计学意义的增加。

比较GDE交联支链淀粉/糖原(比较GDE-ASG实施例1)和本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG实施例1)显示相当的交联度，本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是氧化降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，PPE交联HA PPE-ASG实施例3在酶促降解后显示出与原自来自PPE-ASG实施例1的PPE交联淀粉的游离己糖单体的量相当的游离己糖单体的量，这表明，即使两种水凝胶具有两种不同的交联度、特别是来自PPE-ASG实施例3的C.D.明显低于PPE-ASG实施例1的C.D.(分别为0.1241和0.1708％)，它们的酶促降解抗性仍然是相当的(分别为89.4％和85.7)。

因此，本发明的PPE对酶促降解的保护作用显著高于比较GDE。具体而言，高分子量(即3000-15000Da)的PPE的保护作用高于低分子量PPE(即750至低于3000Da)对酶促降解的保护作用，即使低分子量PPE具有更好的机械性能。来自PPE-AS实施例2的22mg/mL AS对透明质酸酶的体外酶降解显示出比其他的AS更强的抗性。

与GDE交联的比较支链淀粉/糖原和与本发明的PPE交联的支链淀粉/糖原的酶促降解测定结果总结于下表：

表13

因此，如上述结果所示，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。具体而言，证明了本发明的交联多糖(通过使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)具有更大的酶促抗性(即更低的酶促降解率)。此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，酶促降解率较高。

2.3.4.2氧化降解测定

样品：

采用以下进行氧化降解率的评估：

比较GDE交联支链淀粉/糖原(水凝胶)比较GDE-ASG实施例1，和

本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(水凝胶)PPE-ASG实施例1、PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3。

方法：

按照前面第2.2.4.2节氧化降解测定中公开的方法评估对氧化降解的抗性。

结果：

比较GDE交联支链淀粉/糖原(比较GDE-ASG实施例1)和本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG实施例1)显示相当的交联度，本发明的PPE交联支链淀粉/糖原(PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是氧化降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，氧化降解后PPE-ASG实施例1、PPE-ASG实施例2和PPE-ASG实施例3的游离己糖单体的量分别下降到81.2、74.5和87.0，这表明氧化降解抗性发生了有统计学意义的增加。

因此，如上述结果所述和上文对于氧化降解率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。

与GDE交联的比较支链淀粉/糖原和与本发明的PPE交联的支链淀粉/糖原的氧化降解测定结果总结于下表：

表14

因此，如上述结果所示和上述酶促降解速率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的氧化降解抗性(即相对氧化降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。此外，上述结果还表明，本发明的交联多糖(使用本发明的超支化PPE作为交联剂获得)在交联剂用量较低的情况下，氧化降解率较高。

2.4交联羧甲基纤维素钠

2.4.1.本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(PPE-CMC)

下文所述的PPE-CMC是使用可从Nagase商购的EX-313作为1,3-GDE的来源制备的。然而，这些过程也可以通过使用可从Merck商购的1,3-甘油二缩水甘油醚或使用商标/>EX-314而不是/>EX-313进行，/>EX-314是一种包含1,3-DGE的混合物。

将氢氧化钠颗粒(NaOH)溶解在水中以形成含有基于溶液总重量的4％的NaOH(1M)的碱性溶液(溶液A)。在室温下将1,3-GDE(EX-313)溶解在一部分溶液A中，以形成含有基于溶液总重量的1至50％的1,3-GDE的碱性溶液(溶液C1)。然后将溶液C1在10至40 ℃范围内的受控温度下反应包括1至30天的时间段，或者在20至50℃范围内的受控温度下 反应包括1至48小时的时间段，在此期间1,3-GDE发生自聚合，得到具有表1中公开的分子量和/或具体环氧含量的聚甘油多缩水甘油醚(溶液C3)。

将羧甲基纤维素钠(NaCMC)在室温(25℃)下轻轻溶解在一部分溶液A中，以形成基于溶液总重量含有5至15重量％的水合NaCMC的碱性溶液(溶液B)。然后将溶液C3添加到溶液B中以提供碱性溶液，其中氢氧化物在最终溶液中的浓度在0.25和0.75M范围内并且NaCMC和PPE的比例。然后在室温下将所得的由NaCMC、PPE和NaOH组成的碱性溶液充分混合。然后使均质溶液在20至50℃范围内的受控温度下反应包括1至48小时的时间段。然后将PPE交联NaCMC(水凝胶)(PPE-CMC)用酸性水溶液(1M盐酸和PBS)洗涤48至120小时以去除未反应的材料和副产物，以中和碱性催化剂并通过离子交换恢复水凝胶的pH值到6.5-7.4，并达到本发明的PPE交联的NaCMC(水凝胶)中如下表所示的从1到50mg/mL的NaCMC浓度(PPE-CMC)。

将与PPE交联NaCMC(水凝胶)填充到注射器中，并按照EN ISO 17665-1中报告的药典接受程序(例如121℃下15分钟)在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。水凝胶可任选通过冷冻干燥脱水并储存以供后续使用或分析。

2.4.2.比较GDE交联羧甲基纤维素钠(比较GDE-CMC)

比较GDE交联NaCMC是按照上面对于比较1,3-GDE交联透明质酸的第2.1.2.1节中公开的方法制备的，但使用NaCMC代替透明质酸。

2.4.3.交联NaCMC的表征

如上获得的浓度为22.0mg/mL的本发明的PPE交联NaCMC(PPE-CMC实施例1-3)和比较GDE交联NaCMC(比较GDE实施例1)的机械性能公开于下表中：

表15

(a)交联水凝胶中NaCMC的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

(b)交联NaCMC中本发明的交联剂的浓度，表示为相对于总重量的重量百分比。

2.4.4测定

2.4.4.1酶促降解测定

样品：

采用以下进行酶促降解率的评估：

比较GDE交联羧甲基纤维素钠(水凝胶)比较GDE-CMC实施例1，和

本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(水凝胶)PPE-CMC实施例1、PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3。

方法：

用10μL 0.1mg/mL来自黑曲霉(Aspergillus Niger)的果胶酶处理0.2mL每种测试的交联羧甲基纤维素钠(水凝胶)。将测试的水凝胶在PBS中在37℃下孵育16小时，用咔唑测定评估来自降解的羧甲基纤维素钠水凝胶的己糖单体。

结果：

比较GDE交联羧甲基纤维素钠(比较GDE-CMC实施例1)和本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(PPE-CMC实施例1)显示相当的交联度。本发明的PPE水凝胶(PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是酶促降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，酶促降解后PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3的游离己糖单体的量分别下降到64.6％和85.4％，这表明酶促降解抗性发生了有统计学意义的增加。

因此，本发明的PPE对酶促降解的保护作用显著高于比较GDE。具体而言，高分子量(即3000-15000Da)的PPE的保护作用高于低分子量PPE(即750至低于3000Da)对酶促降解的保护作用，即使低分子量PPE具有更好的机械性能。来自PPE-AS实施例2的22mg/mL AS对透明质酸酶的体外酶降解显示出比其他的AS更强的抗性。

与GDE交联的比较羧甲基纤维素钠和与本发明的PPE交联的羧甲基纤维素钠的酶促降解测定结果总结于下表：

表16

因此，本发明的PPE对酶促降解的保护作用显著高于比较GDE。具体而言，高分子量(即3000-15000Da)的PPE的保护作用高于低分子量PPE(即750至低于3000Da)对酶促降解的保护作用，即使低分子量PPE具有更好的机械性能。

2.4.4.2氧化降解测定

样品：

采用以下进行氧化降解率的评估：

比较GDE交联羧甲基纤维素钠(水凝胶)比较GDE-CMC实施例1，和

本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(水凝胶)PPE-CMC实施例1、PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3。

方法：

按照前面第2.2.4.2节氧化降解测定中公开的方法评估对氧化降解的抗性。

结果：

比较GDE交联羧甲基纤维素钠(比较GDE-CMC实施例1)和本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(PPE-CMC实施例1)显示相当的交联度，本发明的PPE交联羧甲基纤维素钠(PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3)显示出交联度的降低，因此应当预期的是氧化降解抗性的降低，但是出乎意料和违反直觉的是，氧化降解后PPE-CMC实施例1、PPE-CMC实施例2和PPE-CMC实施例3的游离己糖单体的量分别下降到92.6、83.7和82.5，这表明氧化降解抗性发生了有统计学意义的增加。

因此，如上述结果所述和上文对于氧化降解率提到的，以本发明的超支化PPE作为交联剂制备的本发明的交联多糖比使用上述公开的比较交联剂制备的不在本发明的保护范围内的交联多糖具有更好的酶促降解抗性(即相对酶促降解率的百分比更低)，但具有相当的物理性能。

与GDE交联的比较羧甲基纤维素钠和与本发明的PPE交联的羧甲基纤维素钠的氧化降解测定结果总结于下表：

表17

3.本发明的PPE交联多糖预充式注射器通过针头注射力的测定

该测试允许测定通过针头的注射力。具体而言，峰值注射力是指化合物或组合物克服静摩擦所需的力。就交联多糖而言，这个值取决于它的均匀性、注射器的质量以及它的针筒润滑。通常这个值代表系统(化合物、注射器和针头)的整体质量。因此，较低的注射力值会在不增加注射速度的情况下呈现较低的疼痛感。

测试的样品：

比较BDDE交联透明质酸(水凝胶)比较BDDE-HA实施例5，

比较PEGDE交联透明质酸(水凝胶)比较PEGDE-HA实施例5，

比较GDE交联透明质酸(水凝胶)比较GDE-HA实施例5，和

本发明的PPE交联透明质酸(水凝胶)PPE-HA实施例10、PPE-HA实施例11和PPE-HA实施例12。

通过对注射样品进行测试来评估通过针头注射的效果。口径(Gauge)长度为27G和30G，并且通常针头的选择正确受到水凝胶的物理化学和机械性能的强烈影响。在质构分析仪(Stable Micro Systems，TA.XT Plus)上测量注射力为通过27G和30G针头使用1mL注射器以10mm/min(0.2mL/min)的速度在50mm的距离注射水凝胶所需的力(单位N)。

比较使用标准方法与BDDE、PEGDE和GDE交联的比较透明质酸(水凝胶)和与本发明PPE交联的透明质酸(水凝胶)(如下表所示所有交联剂加入多糖时具有相同的环氧当量)的27G针头的峰值注射力和平均注射力：

表18

如上述结果所示，本发明的交联多糖的峰值注射力的值低于落入本发明范围之外的对比交联多糖。这是有利的，因为在不损害(增加)注射速度的情况下，本发明的交联多糖更容易注射，减少疼痛感和皮肤创伤。此外，这也是有利的，因为本发明的交联多糖对于从业者来说的便利性增加了。

引文列表

He,Z.等,“Ultrasonication-assisted rapid determination of epoxidevalues in polymer mixtures containing epoxy resin”.Analytical Methods,2014,vol.6(12),pp.4257-4261.

为了完整起见，本发明的各个方面在以下编号的条款中列出：

条款1.式(I)的化合物，

或者，

式(II)的化合物

其中

R₁各自独立地选自R₂和R₃；

R₂是

R₃是

b是选自1至70的整数；

c是选自1至70的整数；

d是选自1至70的整数；

具有通过液相色谱法测量的750至15000Da的分子量(M_w)；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的183至7000g/eq的环氧当量。

条款2.根据条款1所述的化合物，其中：

通过液相色谱法测量的分子量(M_w)为800至7000Da；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的环氧当量为195至700g/eq。

条款3.根据条款1或2任一项所述的化合物，其中：

通过液相色谱法测量的分子量为900至4500Da；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的环氧当量为200至600g/eq。

条款4.根据条款1-3中任一项所述的化合物，其具有通过液相色谱法测量的等于或小于1.8的多分散指数(M_W/M_n)。

条款5.式(III)的交联多糖

或者

式(IV)的交联多糖

其中

R₁各自独立地选自R₂、R₃、R₄和R₅；

R₂是

R₃是

R₄是

R₅是

PS是多糖；和

所述交联多糖的交联百分比为0.077至0.269％。

条款6.根据条款5所述的交联多糖，其中：

相对酶促降解率为100％至37.9％；和

相对氧化降解率为100％至76.8％。

条款7.根据条款5-6中任一项所述的交联多糖，其中所述多糖选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸(海藻酸盐)、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶；优选透明质酸。

条款8.根据条款5-7中任一项所述的交联多糖，其中两个交联基团之间的平均距离(D_N)为27nm至42nm。

条款9.根据条款5-8中任一项所述的交联多糖，其中多糖的浓度为1至50mg/ml。

条款10.根据条款5-9中任一项所述的交联多糖，其可通过以下方法获得，所述方法包括：使多糖与选自条款1-4中任一项所定义的式(I)化合物、式(II)化合物的化合物及其混合物交联。

条款11.根据条款10所述的交联多糖，其可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(I)的化合物交联，其中式(I)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(II)的化合物交联，其中式(II)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(I)的化合物和式(II)的化合物的混合物交联，其中：

式(I)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；和

式(II)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

条款12.根据条款11所述的交联多糖，其中：

在步骤a)中，碱性溶液包含1-50重量％的1,3-甘油二缩水甘油醚；和

在步骤c)中，碱性溶液包含1-50重量％的1,2-甘油二缩水甘油醚。

条款13.制备如条款1-4中任一项所定义的化合物(I)或式(II)化合物的方法；其中：

当化合物是式(I)的化合物时，则所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

当化合物是式(II)的化合物时，则所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

条款14.组合物，其包含：

一种或多种如条款5-12中任一项所定义的交联多糖，和

一种或多种合适的赋形剂或载体。

条款15.根据条款14所述的组合物，其为药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种如条款5-12中任一项所定义的药学上可接受的交联多糖，以及一种或多种药学上可接受的用于治疗的赋形剂或载体。

条款16.根据条款14所述的组合物的用途，其为化妆品组合物，所述化妆品组合物包含美容有效量的一种或多种如条款5-12中任一项所定义的美容上可接受的交联多糖，以及一种或多种美容上可接受的赋形剂或载体作为护肤剂；特别是作为真皮填充剂。

Claims (18)

1.式(I)的化合物，

或者，

式(II)的化合物

其中R₁各自独立地选自R₂和R₃；R₂是

R₃是

b是选自1至70中的整数；

c是选自1至70中的整数；

d是选自1至70中的整数；

具有通过液相色谱法测量的750至15000Da的重均分子量；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的183至7000g/eq的环氧当量。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中：

通过液相色谱法测量的重均分子量为800至7000Da；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的环氧当量为195至700g/eq。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的化合物，其中：

通过液相色谱法测量的重均分子量为900至4500Da；和

通过HCl超声辅助快速滴定测量的环氧当量为200至600g/eq。

4.根据权利要求1所述的化合物，其具有通过液相色谱法测量的等于或小于1.8的多分散指数(M_W/M_n)。

5.式(III)的交联多糖

或者

式(IV)的交联多糖

其中R₁各自独立地选自R₂、R₃、R₄和R₅；R₂是

R₃是R₄/>

R₅是

PS是多糖；和

所述交联多糖的交联百分比为0.077至0.450％。

6.根据权利要求5所述的交联多糖，其中所述交联多糖的交联百分比为0.077至0.269％。

7.根据权利要求5和6中任一项所述的交联多糖，其中R₂的量低于式(III)和(IV)的交联多糖的总重量的2ppm。

8.根据权利要求5所述的交联多糖，其中：

所述交联多糖的相对酶促降解率为比较甘油二缩水甘油醚(GDE)交联多糖的酶促降解率的100％至37.9％；和

所述交联多糖的相对氧化降解率为比较甘油二缩水甘油醚(GDE)交联多糖的氧化降解率的100％至76.8％，其中所述酶促降解率和氧化降解率基于用咔唑测定对糖醛酸浓度的比色监测来测量。

9.根据权利要求5所述的交联多糖，其中所述多糖选自透明质酸、淀粉及其衍生物、糖原、纤维素及其衍生物、果胶、木质素、菊粉、瓜尔胶、黄原胶、海藻酸、海藻酸盐、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡糖醛酸聚合物、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和角叉菜胶。

10.根据权利要求5所述的交联多糖，其中两个交联基团之间的平均距离D_N为27nm至42nm。

11.根据权利要求5所述的交联多糖，其中多糖PS以1至50mg/ml的浓度存在于所述交联多糖中，其中多糖的浓度是通过将水凝胶在通风烘箱中105℃下脱水适当时间后获得的干残留物进行重量测量来测量的。

12.根据权利要求5所述的交联多糖，其可通过以下方法获得，所述方法包括：使多糖与选自根据权利要求1-4中任一项所定义的式(I)化合物、式(II)化合物的化合物及其混合物交联。

13.根据权利要求12所述的交联多糖，其可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(I)的化合物交联，其中式(I)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(II)的化合物交联，其中式(II)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

可通过以下方法获得，所述方法包括使所述多糖与式(I)的化合物和式(II)的化合物的混合物交联，其中：

式(I)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；和

式(II)的化合物通过以下方法获得，所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

14.根据权利要求13所述的交联多糖，其中：

在步骤a)中，所述碱性溶液包含1-50重量％的1,3-甘油二缩水甘油醚；和

在步骤c)中，所述碱性溶液包含1-50重量％的1,2-甘油二缩水甘油醚。

15.制备如权利要求1-4中任一项所定义的化合物(I)或式(II)的化合物的方法；其中：

当化合物是式(I)的化合物时，则所述方法包括：

a)提供含有1,3-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

b)将步骤a)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段；

或者

当化合物是式(II)的化合物时，则所述方法包括：

c)提供含有1,2-甘油二缩水甘油醚的碱性溶液；和

d)将步骤c)中获得的溶液在10至80℃的温度下保持1分钟至30天的时间段。

16.组合物，其包含：

一种或多种如权利要求5-14中任一项所定义的交联多糖，和

一种或多种合适的赋形剂或载体。

17.根据权利要求16所述的组合物，其为药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种如权利要求5-14中任一项所定义的药学上可接受的交联多糖，以及一种或多种药学上可接受的用于治疗的赋形剂或载体。

18.根据权利要求16所述的组合物的用途，其为化妆品组合物，所述化妆品组合物包含美容有效量的一种或多种如权利要求5-14中任一项所定义的美容上可接受的交联多糖，以及一种或多种美容上可接受的赋形剂或载体作为护肤剂。