CN116997371A - 基于聚合物的可植入或可注射产品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于交联聚合物的产品的制备方法，包括在含有至少两种环氧官能团的交联剂的存在下，使所述聚合物或其生理上可接受的盐类之一交联的步骤，所述交联在0℃以上10℃以下的温度下进行，以及由此获得的可植入或可注射产品，较佳地是基于透明质酸的产品。

Description

基于聚合物的可植入或可注射产品及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种交联聚合物如透明质酸的方法，从而制备可植入或可注射的产品。

本发明还涉及以这种方式获得的具有显著性能的可植入或可注射产品。其在美容领域(皱纹填充、丰胸等)、整形外科(疤痕修复)和治疗领域(例如在泌尿外科或放射疗法治疗癌症方面，用作关节增粘剂或组织间隔物)都有许多应用。

背景技术

目前，基于交联聚合物的产品已被常规应用于审美领域和医学领域，用于填充皱纹和治疗骨关节炎等多种应用。

基于透明质酸的皱纹填充剂是基于交联聚合物的产品通常会遇到的技术问题。

透明质酸(HA)是一种糖胺聚糖(或GAG)，主要存在于被称为软组织的结缔组织的细胞外基质中，如皮肤(相对于被称为硬组织的其他组织，例如软骨)。在皮肤中，透明质酸基本上是由真皮成纤维细胞和表皮角质细胞合成的，但会被透明质酸酶生理性降解。随着年龄的增长，合成的透明质酸的数量及其聚合程度降低，导致明显的皮肤衰老迹象。

透明质酸是一种由重复的二糖单元组成的聚合物，天然存在于人体结缔组织中(因此被认定为生物聚合物)，其也是可吸收的，即能够在体内降解。此外，它还具有捕获和保留水分子的特性。当其被水合时，会自然形成一种凝胶状的粘性组合物。

由于这些特性，透明质酸是一种聚合物，特别适合生产皱纹填充产品，也被称为“填充物”，其主要用于注射。然而，为了改善机械性能及其体内寿命，这些产品中所含的透明质酸的至少一部分通常是交联的，例如在交联剂的帮助下进行化学交联。

交联反应具有的效果是，产生由透明质酸分子通过交联剂分子连接在一起的网络。所形成的聚合物网络产生水凝胶。聚合物的交联程度越高，得到的凝胶就越粘稠，也就越硬，在体内的抗降解力就越强。然而，在过度交联的情况下，凝胶在植入或注射后可能会变脆、碎裂，或产生炎症，导致其被酶降解。

此外，由于这种类型的产品主要用于注射，因此凝胶必须具有足够的流动性，以便能够在注射装置中流动并防止其堵塞。

因此，为了获得满足这些不同要求的产品，已经研究了技术解决方案。

在实践中，可以通过改变交联反应中的某些参数来调节聚合物的交联度。交联度对应于聚合物中有效交联的二糖的摩尔数与聚合物中二糖总摩尔数之比。

此外，在包含交联聚合物的水性凝胶形式的产品中，有时会添加游离聚合物，即未交联的聚合物。添加游离聚合物可被用来降低产品的粘度，并且通常在注射器的帮助下方便注射应用。

特别是在审美应用方面中，提供具有足够硬度和抗压性能的产品是有益的。硬度与固体或凝胶抵抗弹性变形应力的能力密切相关，通常用模量G’测量。抗线性压缩强度可用于描述固体或凝胶体在受到线性压缩应力(如单轴应力)时的行为。通常认为，抗线性压力强度高的材料具有良好的内聚力或内聚性，即其组成分子通过巨大的力连接在一起，这意味着在单轴施加压力的作用下，它们可以避免产品的分解或扩散。

因此，一旦注射，产品就能够抵抗施加在其上的各种力，而不会从待填充的区域破裂或扩散。这种类型的性质通常是通过增加注射产品中存在的透明质酸的交联度来获得的，但可能存在上述缺点。

此外，除了上述连接外，交联反应还可能产生化学修饰，这些化学修饰并不参与透明质酸分子的真正交联，而是改变其结构。例如，交联剂分子和透明质酸单分子之间形成共价键就是这种情况(称为“接枝”)。如本文所用，由交联剂诱导的改性通常用术语“改性”来表示，而不管改性是否参与真正的交联或其他改性，例如接枝。交联反应引起的这种改性程度可以用改性度(“MoD”)来估算。通常，包含交联二糖的可注射产品的MoD对应于，以任何方式结合的交联剂的摩尔数与构成聚合物的二糖单元的摩尔数的百分比。一方面，该参数考虑了实际参与交联的交联剂分子，即结合在两个二糖分子之间的交联剂。另一方面，它也考虑到了与单个聚合物分子相连的交联剂分子，例如接枝，以及不参与聚合物的交联的交联剂分子。

然而，有人认为，改性度过高可能会影响交联透明质酸的生物相容性(A.Tezel,G.H.Fredrickson,Journal of Cosmetic and Laser Therapy，,10(1):35–42,2008)。因此，现在怀疑改性度高的透明质酸是一定数量的二次反应(过敏反应、炎症反应，甚至排斥反应)的来源。因此，这是观察到的高度交联产物品碎裂缺点之外的另一个缺点。

高度交联的碎裂产品的另一个缺点是它们不能用作增粘剂，例如在治疗骨关节炎中：对于所述应用，填料必须是亲水性的，以便能够在关节中均匀膨胀并适当地充当润滑剂。

因此，有必要开发具有相关特性(特别是流变特性)的可注射产品，但这些产品又不具有目前可用的高度改性透明质酸凝胶的缺点。

具体实施方式

为了满足所有这些需求，申请人开发了一种新的交联方法，该方法可与含有交联聚合物的可植入或可注射产品的制备方法相结合。

根据本发明，所述聚合物的交联在低温下借助交联剂进行。

众所周知，高温有利于交联步骤。然而，令人惊讶且出乎意料的是，申请人发现，，当在低温下进行交联时，可以实现有效的交联，从而生产出有效地具有水性凝胶性质的产品，特别是在流变性方面。此外，出乎意料的是，该方法可用于生产具有优异机械性能的产品，特别是即使在低改性度下也具有高抗线性压缩能力。此外，已经证明在低温下进行的交联步骤可以防止聚合物链的降解，从而产生可溶性聚合物数量更少以及特别是抗热应力性更好的最终产品。

因此，这些凝胶具有足够的耐压性，可以在通常需要高度交联聚合物的水凝胶的情况下使用，而不会受到其缺点的影响。

本发明的可注射产品也具有良好的温度稳定性。事实上，已经表明，即使在高温下几天后，它们的流变特性也相对较好地保存下来。

最后，根据本文所述方法制备的可注射产品具有另外的特征，即其中包含的绝大多数交联透明质酸以大尺寸交联聚合物网络的形式存在。因此，本发明的产品含有较少的小尺寸的透明质酸网络，从而保证了良好的填充或润滑效果，并且不易在体内降解，从而确保它们在长时间内性能良好。

因此，本申请报道了一种制备包括交联聚合物的产品的方法，通过所述方法获得的产品，以及具有所述产品特征的更普遍的可植入或可注射产品。

然后，本发明涉及一种制备基于交联聚合物产品的方法，该方法至少一个步骤包括在交联剂存在下，交联所述聚合物或其生理上可接受的盐之一，所述交联在低温下进行，例如在约0℃至约10℃的范围内。

根据第一方面，本发明涉及一种制备含有交联聚合物的产品的方法，其中交联步骤包括或包含在反应混合物中，将聚合物或其生理上可接受的盐之一，与优选地具有至少两种环氧官能团的交联剂在低温下温育反应，优选地温度大于0℃且小于10℃，更优选地温度在1℃与9℃之间。

因此，本发明的方法是在所设想的应用范围内在相关的聚合物上实施的，特别是在医疗设备中常规使用的应用上。聚合物是指一系列单体单元聚合在一起，形成简单的链。适当地，聚合物具有能够与交联剂反应的自由官能团，优选为醇或胺官能团。

根据一个方面，本发明方法中使用或实施的聚合物是其天然形式，在本发明的上下文中也称为“非交联聚合物”或“游离聚合物”，即未交联或未改性的聚合物，即其中链未桥接在一起或与交联剂分子接枝。

或者，本发明的方法可以在已经与交联剂部分反应的聚合物上进行。

优选地，所使用的聚合物是生物相容性聚合物，也称为“生物聚合物”，天然存在于拟注射的生物体中。

根据另一个特定方面，所述聚合物具有在体内可吸收的优点，即它能够被拟植入或拟注射的生物体自然降解。以已知的方式，这种性质可以在能够降解它的酶(例如在透明质酸酶存在下)存在下进行体外测试，也可以通过测量其体积缩小甚至消失所需的时间进行体内(在动物模型或人类中)测试。适当地，在本发明范围内获得的产品具有数周至数月的吸收时间。

根据优选实施方式，所实施的聚合物选自下组：多糖、胶原和弹性蛋白。

优选地，用于本发明的多糖包括：糖胺聚糖(GAG)、藻酸盐、葡聚糖、壳聚糖和纤维素。

优选地，所实施的聚合物属于糖胺聚糖家族(GAG)。在本发明的含义中，术语“糖胺聚糖”指的是由重复的二糖组成的直链多糖聚合物，总是含有一个己糖胺(葡糖胺(GlcN)或半乳糖胺(GalN))和另一种糖(葡糖醛酸(GlcA)、伊多糖酸(IdoA)、半乳糖(Gal))。葡糖胺是N-硫酸化的(GlcNS)或N-乙酰化的(GlcNac)。氨基半乳糖通常是N-乙酰化的(GalNac)。较佳地，作为糖胺聚糖的聚合物选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮质素、硫酸角质素、肝素或硫酸肝素。

本发明中特别适用的聚合物是透明质酸。在本发明的含义中，术语“透明质酸”指的是透明质酸分子的聚合物，又称β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-2-N-乙酰氨基葡萄糖酸(CAS编号：499-15-0)，通过β-1,4糖苷键结合在一起。透明质酸包括一分子D-葡萄糖醛酸和一分子D-N-乙酰葡糖胺，通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键结合在一起。

在本发明的含义中，“生理上可接受的盐”可以不限于：钠盐、钾盐、锌盐或银盐。因此，在某些实施方式中，术语“生理上可接受的透明质酸盐”指透明质酸钠、透明质酸钾、透明质锌、透明质银及其混合物，优选透明质酸钠盐。

本发明的方法可以使用任何分子量的聚合物，特别是任意分子量的透明质酸。然而，优选地，就透明质酸而言，其平均分子量小于或等于1x10⁷道尔顿(Da)。优选地，本发明方法中使用的透明质酸的平均分子量为5.0×10⁴Da至1×10⁷Da，优选地为1×10⁵Da至5.0×10⁶Da。

用于本发明的聚合物可以使用本领域技术人员熟知的方法在工业上方便地获得。因此，例如，透明质酸可以通过从动物组织(如公鸡梳)中提取或通过细菌发酵获得。

根据进一步的特征，本发明的方法采用能够在聚合物的不同链之间诱导交联(即桥接)的交联剂或交联剂。

根据一个特定的实施方式，这样的化合物包括环氧官能团。这些官能团能够与存在的聚合物反应，优选地与其醇或胺官能团反应。根据一个特定的实施方式，这种化合物包括至少两个环氧官能团，优选地是两个环氧官能团(“双环氧化物”)，更优选地位于每个链的端部，即在化合物的每个链端有一个环氧官能。根据特定实施方式，所述交联剂选自聚(乙二醇)二缩水甘油醚，也称为PEG二缩水甘油醚。所述交联剂优选选自以下组：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE，CAS编号：2425-79-8)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE，CAS编号：2224-15-9)、二甘醇二缩水甘油醚(CAS编号：4206-61-5)和四乙二醇二缩水甘油醚。根据特定实施方式，所述交联剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

根据另一个具体实施方式，该方法中使用的交联剂优选地选自PEG二缩水甘油醚，其中聚(乙二醇)链不包含多于3个或甚至2个氧原子。所述交联剂优选地选自下组：1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚和二乙二醇二缩水甘油醚，优选地选自1，4-丁二醇二缩水甘油醚和乙二醇二甘油基，更优选地为1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

例如，所述交联反应可包括在约0℃至约10℃或约1℃至约9℃的温度范围内混合或孵育聚合物和交联剂。

在该反应过程中，所述聚合物将被交联剂改性。在本发明的上下文中，所述“改性聚合物”指的是包含从交联步骤获得的结构改性的聚合物，包括通过交联剂分子在两个聚合物分子之间的交联键(以下称为“交联键”)，以及任何其他类型的连接，例如，单个聚合物分子和交联剂分子之间的连接。虽然后者不参与聚合物的交联，但它们是结构改性。因此，在本发明的含义内，从交联步骤获得的结构改性既包括交联键，也包括易受交联反应诱导的其他类型的改性，例如交联剂分子接枝到聚合物上。因此，在本发明的含义内，改性聚合物的浓度或比例(如果合适的话)，对应于从交联步骤获得的包括结构改性的聚合物的浓度和比例。

根据一个实施方式，进行交联步骤的聚合物为固体形式，例如纤维形式或粉末形式。优选地，对于交联反应，将聚合物与液相混合，该步骤可以在交联反应之前或与之同时进行。该步骤通过将聚合物与液相(例如水溶液)混合而轻松进行。在本发明的上下文中，水溶液可以由水构成，或者包括水和一种或多种其他溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。

因此，将非交联形式的聚合物或其生理上可接受的盐之一在水性介质中水合，然后与交联剂混合。或者，将非交联形式的聚合物或其生理上可接受的盐之一与交联剂的水溶液混合。

根据特定的实施方式，所述交联反应在碱性介质中进行，优选地在pH大于7，或甚至大于或等于8、9或甚至10下进行。碱性pH值促进交联反应。碱性pH可以通过使用在该领域中常规使用的碱性溶液来获得，例如氢氧化钠。

在本发明方法的交联步骤期间，因此反应混合物对应于包含聚合物和交联剂的碱性制剂。

反应混合物中的聚合物浓度由本领域技术人员调节。聚合物浓度的增加促进了交联反应，并且可以用于减少交联剂的量。然而，它应该与聚合物的良好水合作用和反应介质的良好均化兼容。关于透明质酸，例如，其在反应混合物中的浓度范围为每克反应混合物50-500mg，例如在每克的反应混合物100-200mg。

此外，特别地本领域技术人员可以在反应混合物中改变交联剂和聚合物各自的用量。因此，适当地，交联剂和聚合物的二糖单元之间的摩尔比大于或等于约0.5％。低于该比例，最终产品对于所设想的应用来说可能过于液态。根据另一个实施方式，该比率不超过约10％。在一个实施方式中，所述摩尔比在0.5％至10％的范围内。超过这个比例，从所要求保护的方法获得的最终产品可能会太脆。在本发明的含义内，使用的术语“聚合物的二糖单元”应理解为形成如上定义的聚合物的重复的二糖单元。例如，如前所述，透明质酸由透明双糖醛酸的重复单元形成，透明双糖醛酸是一种二糖，其本身由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰葡糖胺形成。

为了促进均匀的反应，可以优选地将混合物均化，例如可以借助于本领域技术人员已知的合适的任何方法机械地均化。

典型地，根据本发明，所述交联步骤在低温下进行。该温度优选地为大于0℃，或者甚至大于1、2、3、4或5℃。优选地，温度低于10℃，或者甚至低于9、8、7或6℃。在某些实施方式中，所述温度的范围为大于约0℃至小于约10℃，例如大于约0℃至小于约9℃、大于约0至小于约8℃、大于约0℃至小于约7℃、大于约0℃至小于约6℃、大于约0℃至小于约5℃、大于约1℃至小于约10℃、大于约1℃至小于约9℃、大于约1℃至小于约8℃、大于约1℃至小于约7℃、大于约1℃至小于约6℃、大于约1℃至小于约5℃、大于约2℃至小于大约10℃、大于约2℃至小于大约9℃、大于约2℃至小于约8℃、大于约2℃至小于约7℃、大于约2℃至小于约6℃、大于约2℃至小于约5℃、大于约3℃至小于大约10℃、大于约3℃至小于约9℃、大于约3℃至小于约8℃、大于约3℃至小于约7℃、大于约3℃至小于约6℃、大于约3℃至小于约5℃。在一个实施方式中，所述温度为约0℃、约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、或约10℃。实际上，优选地，将反应混合物置于所需温度的容器中，从而在整个交联反应过程中保持该温度。

优选地，所述交联步骤进行至少或大于24或48小时的时间，优选地进行大于或等于7、8、9、10、11、12、13或甚至14天，可能长达一周或多周。优选地，所需的温度在交联反应的整个持续时间内保持基本恒定。

在交联反应结束时，如此获得的产品优选为改性聚合物的凝胶形式。实际上，正确地执行交联步骤会导致反应混合物的粘度增加。

在该交联步骤结束时，反应混合物可以经历一定数量的后续处理，这些处理可以按指示的顺序或以不同的顺序，依次或同时进行：

根据本发明的一种方法可任选地包括一个中和的步骤，该步骤可将pH值降低至约8以下，优选地使其达到中性的pH值，通常大于或等于6.5，或甚至6.6、6.7、6.8或6.9，并且小于或等于7.5，或甚至7.4、7.3、7.2、7.1或7。pH值的下降可以用来停止交联反应，从而确保存在的聚合物具有更好的稳定性，或者使产品的pH值与设想的应用相适应，特别是与体液或皮肤的pH值相适应。例如，该步骤可以通过将从交联步骤获得的产品与具有酸性pH的组合物(例如盐酸(HCl)溶液)混合来进行。事实上，在进行这一中和步骤的同时，还可以稀释从交联反应中得到的混合物。

根据本发明的制备方法，还可以包括对交联反应得到的产品进行稀释或水合的步骤。例如，这可以通过向制剂中加入具有合适pH的缓冲溶液来进行，优选地，pH在6.5至7.5范围内的中性溶液，例如磷酸盐缓冲溶液(PBS，即“磷酸盐缓冲盐水”)。稀释因子通常可以在大约2和10之间变化，例如在大约4和8之间或大约4和大约5。

应该注意的是，中和和稀释的步骤可以任选地同时进行，使用合适的溶液，该溶液可以用于获得所需的pH和浓度，特别是交联透明质酸。

根据另一个方面，本发明的制备方法还可以包括对交联步骤结束后得到的产品进行提纯的步骤，尤其是为了确保在交联步骤中没有与聚合物发生反应的交联剂以及可能存在的其他杂质被清除。优选地，该处理在中和和/或稀释之后进行。该步骤可以由本领域技术人员使用任何适当的已知方法来轻松地进行，以消除不需要的残留物，例如残余交联剂。例如，它可以通过连续洗涤的方式进行。

根据特定实施方式，除了交联步骤之外，根据本发明的方法可以包括：

-中和步骤，优选地在酸性溶液的条件下进行，和/或

-稀释步骤，优选地在中性溶液的条件下进行；和/或

-纯化步骤，例如通过洗涤。

根据一个特定实施方式，该方法包括按此顺序执行所有这些步骤。然而，举例来说，中和和稀释的步骤可以同时进行。

此外，在根据本发明的方法结束时获得的产品的组成可以被改性：

可以将游离的(未改性的)聚合物，或其生理上可接受的盐之一添加到以这种方式获得的产品中。该步骤具有降低产品粘度的效果，表明可用于注射制剂中。优选地，可以加入与用于交联步骤的聚合物相同的聚合物，优选地具有基本相同的分子量。

因此，例如当使用透明质酸时，可以加入包含透明质酸的磷酸盐缓冲溶液，优选地是透明质酸钠。该溶液的浓度和体积可以调整，以便在最终产品中获得所需的游离聚合物浓度，就透明质酸而言，每克最终产品中的游离聚合物浓度优选在0.5至5mg之间。

鉴于所设想的应用，添加麻醉化合物也可能是有利的，例如利多卡因、布比卡因、甲哌卡因等，其具有减轻与注射相关的疼痛的作用。通常使用的麻醉剂的最终浓度为约1至约5mg每克最终产品，例如约2至约4mg每克最终产品或约3mg每克最终产品。根据一个优选实施方式，麻醉化合物，例如利多卡因的添加在其引入组合物之前不需要进行pH调节。

或者，还可以在根据本发明的方法最后得到的产品中添加其他活性成分。例如，它可以是减少与注射相关的副作用的血管收缩剂，或者在设想的应用中相关的任何活性成分，例如抗氧化剂，特别是甘露醇，或者抗炎剂。在本领域技术人员的知识范围内，以合适浓度添加这种类型的活性成分。

例如，在根据本发明方法的各个步骤结束时获得的产物也可以被配制为：

-通过添加非交联形式的聚合物或其生理上可接受的盐之一，和/或

-通过添加麻醉剂，例如利多卡因，以及更普遍的任何相关的活性成分。

对于每一种添加，建议调整体积，以保持所需的聚合物浓度。这些不同的添加可以同时进行，也可以先后进行。优选地，所述混合物可以在每次添加后均化。

此外优选地，对本发明方法的各个步骤结束时得到的产品进行灭菌。灭菌可以使用任何通常合适的方法进行，例如，在高压釜中通过热处理进行灭菌。灭菌温度优选地在100℃至150℃的范围内，优选大于121℃。

如此获得的产品能有利地植入体内，优选地植入人体。在相关的植入部位植入这种类型的产品的适当方式包括将其注射到体内，优选地借助于注射器等注射装置。因此，根据另一个方面，借助本发明的方法获得的产品被包装到一个或多个注射器中，该注射器的容积与所设想的应用相适应。灭菌可以在包装之前或之后进行。

本发明还涉及通过本文所述方法获得的可植入或可注射产品。在一个特定的实施方式中，本发明涉及以透明质酸或其盐作为聚合物时实施本发明所述的方法时获得的可植入或可注射产品。

因此，根据一个优选方面，本发明涉及可通过上述方法获得的可植入或可注射产品，尤其涉及透明质酸或其盐之一，特别是透明质酸钠，作为一种特别优选的聚合物。然而，本发明的教导也适用于任何聚合物，特别是那些含有二糖单元的聚合物。

因此，根据本文所述方法制备的产品可包含借助于交联剂改性的透明质酸，所述交联剂具有至少两个环氧官能团，优选地在其每个末端均包含环氧官能团，更优选地，所述交联剂选自1，4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚，或四乙二醇二缩水甘油醚。

因此，根据本发明的改性透明质酸可以包括以下不同的结构：

-通过交联剂桥接在一起的透明质酸链；

-通过交联剂接枝的透明质酸链；

-桥接且接枝的透明质酸链。

当交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚或四乙二醇二缩水甘油醚时，本发明产品中的改性透明质酸具有借助上述交联剂接枝和/或桥接的链，如下图所示：

优选地，就所设想的应用而言，所述改性或交联的透明质酸代表约1至约40mg/g本发明的产品，优选地代表约5至约40mmg/g本发明的产品，更优选地代表约10至约25mg/g本发明的产品。

所述产品还可以包括：

-未改性(非交联或游离)透明质酸，优选地为约0.5至约5mg/g产品的用量，优选地约1至约3mg/g产品的用量；和/或

-麻醉剂，优选是利多卡因；用量优选为1mg到5mg/g产品之间，优选约3mg/g产品；和/或

-任何其它合适的活性成分，例如抗氧化剂如甘露醇或抗炎剂。

根据一个特定的实施方式，所述产品不包含任何“游离”交联剂，即未接枝或未桥接到聚合物的交联剂。

适当地，本发明的产品具有中性或生理pH值，优选在约6至约8之间，更优选地在6.5至7.5之间。根据特定实施方式，根据本发明的产品的pH大于或等于6.5，或甚至6.6、6.7、6.8或6.9，并且小于或等于7.5，或甚至7.4、7.3、7.2、7.1或7，例如在6.8至7.2的范围内。

特征性地，根据本发明，该产品为凝胶形式。

根据另一个特征，所述凝胶是水凝胶，即包含水。根据一个优选实施方式，所述凝胶是可注射的，其粘度适合应用领域常规使用的注射系统，特别是注射器。

凝胶通常被定义为粘性组合物，然而，表现得像固体。凝胶的物理特性通过弹性模量G'和粘性模量G”来测量和表示。

衡量凝胶固体特性的一个合适指标是其的抗变形性，这与液体不同。事实上，当变形施加到固体上时，固体通常会发生应变，应变与施加的变形成正比，该应变可以借助于弹性模量G’来测量。

所述弹性模量G’是应力超过变形或应变的结果(G’＝应力/变形)，因此描述固体吸收的能量。G'越高，材料就越硬。弹性模量G’通常用于描述凝胶的固体成分。例如，就数量级而言，通常认为乳液的弹性模量G’为帕斯卡级，而硬固体的弹性模量G'为千兆帕斯卡级。

因此，在本发明中使用的“凝胶”优选地是指弹性模量G’大于10Pa的组合物。优选地，本发明产品的弹性模量G'在约20至约1000Pa之间。根据优选实施方式，本发明的产品显示出大于约20、30、40或甚至50Pa的弹性模量。根据另一个优选实施方案，本发明的产品显示出小于约1000、900、800、700、600或甚至500Pa的弹性模量。优选地，本发明产品的G'值范围在约50至约500Pa之间。在本发明的上下文中，G’值与聚合物的交联度相关，从而获得所设想的产品的固体组分。

本发明产品的模量G′是使用本领域技术人员所熟知的方法确定的。在本发明的方案中，模量G’优选地在环境温度下(通常在等于25℃的温度下)借助Kinexus Pro型流变仪进行测定，流变仪的板/板几何尺寸为40mm，间隙为250μm。通常，先对样品进行预剪切和静止期处理，以消除其流变记忆，然后通过振幅扫描(例如，以1Hz的固定频率扫描)确定线性粘弹性域。然后，模量G’可以由在线性粘弹性区域中获得的曲线确定，其中应力和位移呈线性关系。

特别地，通过本发明的方法获得的可植入或可注射产品，具有不同于已知产品的机械和结构特性。特别地，抗变形试验的结果表明，尽管它们的改性程度很低，但它们具有良好的内聚性，抗线性压缩的强度很高。因此，本发明的可植入或可注射产品尤其以这些参数为特征。

在本发明的上下文中，当产品借助于流变仪(例如Kinexus Pro型)以0.1mm/s的速度被压缩时，与上述模量G'的测量方法相同，测量抗线性压缩强度(F或单轴压缩强度)，板/板的几何尺寸为20mm，间隙从2.5mm到0.9mm不等。这种测量优选地在环境温度下进行，通常在25℃的温度下进行。因此，在本发明的上下文中，术语“抗线性压缩强度”表示在上述测试条件下获得的以牛顿表示的力。

优选地，本发明的产品具有至少约0.15牛顿(N)的抗线性压缩强度(F)，优选地具有至少约0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65或0.7N的抗线性压缩强度(F)。根据另一个实施方式，所述抗线性压缩力(F)不超过约1.6、1.55、1.5、1.45、1.4、1.35、1.3、1.25、1.2、1.15、1.1、1.05或1N。根据一个具体实施方式，本发明的产品的抗线性压缩强度的范围在约0.2N至约1.2N，或者甚至在约0.35N至约1N。

本发明的产品还可以其改性程度或“MoD”来表征，其与交联剂诱导的透明质酸的改性相关。

如上所述，改性程度或“MoD”说明了产品的生物相容性。产品的改性越多，它与游离或未改性的聚合物的区别就越大，生物相容性就越差。

改性程度的技术定义以及测量这种改性程度的标准化方法在Kenne等人的文献中有详细说明，(Carbohydrate Polymers；91(1):410-4182,2013)，通过引用并入本文，技术人员可以参考该文献。

在本发明的框架中，术语“改性程度”表示固定在聚合物上的交联剂的摩尔数与聚合物的二糖的摩尔数之间的比率，如Kenne等人的方法所确定的。当透明质酸是所使用的聚合物时，该比率为固定在透明质酸上的交联剂的摩尔数与透明质酸中包含的二糖的摩尔数之比，即如上所定义的透明质酸的摩尔数。该比率通常以百分比的形式表示。

简言之，产品在氯化钠溶液中洗涤，然后使用0.22μm过滤器在真空下过滤，然后用软骨素酶AC在37℃下消化过夜。使用核磁共振(必要时，特别是¹H或²D)测定固定在透明质酸分子上的交联剂的摩尔数和有效交联的透明质酸的摩尔数，方法是在校正每个信号的质子数后，将对应于交联剂残基的信号和透明质酸N-乙酰基的信号进行积分。

因此，根据本发明，产品优选地具有的改性程度(MoD)小于约15％，或甚至等于或小于约10％、9％、8％、7％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％。根据具体实施方式，本发明的产品具有的改性程度(MoD)小于约10％，优选地在约0.5％和约6％之间。

值得注意的是，对于给定的F值，所获得的产品具有特别低的改性程度。因此，本发明的产品可以通过F/MoD值来表征，该值对应于如上测量的抗线性压缩强度(F)与以百分比表示的改性程度(MoD)之比的绝对值。

优选地，该比率大于约0.15，等于或大于约0.16、0.17、0.18、0.19或0.2，甚至等于或大于大约0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8。此外，它可以达到大约0.9，或者甚至大约1。换言之，对于约1％的改性程度(MoD)，抗线性压缩的强度(如上所测)将大于约0.2N。

此外，在至少一些实施方式中，本发明的可注射产品特别耐温，这可能是由于在低温下进行的交联步骤期间保存了聚合物链。事实上，正如实验部分所证明的那样，当它们在80℃的温度下经受几天时，它们仍然会保持良好的流变性能。因此，本发明的可注射产品可以用这个参数来表征，为了更清楚，这个参数将用模量G’的百分比守恒来表示。

在本发明的上下文中，“模量G'的守恒百分比”是指产品在80℃下储存96小时后测量的模量G'(以Pa为单位)与在时间t0时(即在温度升高之前，优选在环境温度下，例如25℃)测量的模量G’(以Pa为单位)之比乘以100。

优选地，本发明的可注射产品具有的模量G’的守恒百分比大于约25％、26％或甚至27％，优选地大于或等于约28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至60％。

换言之，本发明涉及可植入或可注射的产品，优选地是基于透明质酸的产品，在80℃下储存96小时后测量其模量G’的值大于其初始值G’的27％，或甚至大于或等于其初始值G’的28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％或60％，优选地初始值在环境温度(例如25℃)下测量。

根据另一个实施方式，对于给定的初始G'值，本发明产品的耐高温性能优于未使用本发明方法制备的现有产品。换句话说，对于给定的G’值，本发明产品的守恒百分比将大于根据现有技术制备的产品的守恒百分数。

该测试被称为“强制热降解”测试，可用于：

-推断本发明产品在较低温度和较长时间下的物理化学特性。由于时间/温度的等效性，可以进行加速老化。因此，可以比较产品在37℃在人体内几

个月的耐用性；

-评估根据本发明的产品对可能与制备方法有关的热降解的耐受性，特别是对通过热处理灭菌的耐受性。

本发明的另一个方面涉及在本发明的框架中获得的产品中存在的聚合物网络的尺寸，特别是交联透明质酸的网络的尺寸。

如前所述，所述交联反应能够形成聚合透明质酸网络。聚合物的支链越长和/或越多，网络的尺寸就越大。以这种方式获得的交联聚合物网络的尺寸是至关重要的，特别是考虑到所设想的应用。事实上，假定透明质酸碎片的大小低于某一特定尺寸(估计为100μm)，就不会产生填充效果。此外，如前所述，透明质酸碎片不适合用作增粘剂。此外，小尺寸的聚合物网络(对应于"可溶性HA")溶解得更快，因此会在生物体内降解。因此，包含大量大尺寸聚合物网络的填充或润滑产品性能更好，使用寿命更长。

对这一参数的评估尤其可以通过以下试验进行：用水提取样品(凝胶)，然后将凝胶悬浮液在水中通过平均孔径约为100μm的膜(过滤器、筛子)。下文“实施例”部分详细介绍了可实施的实验方式。

这样，以小尺寸聚合物网络(小于约100μm)形式存在的透明质酸就会穿过膜，与游离HA和/或添加到产品中的利多卡因一样，处在液态水相中。通过测量该相中存在的有机碳(TOC)总量来评估这些不同数量的物质(提取的HA(相当于以小尺寸聚合物网络形式交联的HA)、游离透明质酸和/或利多卡因)。由此，可通过以下公式推算出提取的HA数量：

其中：

-[TOC]_总量：提取化验的总TOC含量(mg/l)

-401.3：HA的分子量(g/mol)

-168.2：HA中碳的分子量(g/mol)

-Q_总量：提取总量(g)＝样品+水

-PE：样品量＝凝胶(g)

-[TOC]_利多卡因：提取化验中利多卡因的TOC含量(不添加利多卡因时＝0)，按下式计算：

其中：

-168.2：盐酸利多卡因中碳的分子量(g/mol)

-270.5：盐酸利多卡因的分子量(g/mol)

-[利多卡因]_提取物：高效液相色谱法测定的提取物中盐酸利多卡因的浓度(mg/ml)。

由此，可以用下式推算出以尺寸小于约100μm的交联聚合物网络形式存在的透明质酸(“可溶透明质酸”)占测试产品中交联透明质酸总量的比例：

其中：

-HA提取物：按照前项计算

-[HA]_总量：凝胶中HA的总含量(mg/g)，用重量法测定。

因此，正如实验部分的结果所支持的那样，本发明产品的特征在于，它们所含的交联透明质酸中的绝大多数以尺寸大于约100μm的聚合物网络的形式存在。事实上，为了更清楚地说明这一特性，可以用尺寸小于约100μm的聚合物网络中的透明质酸与产品中存在的交联透明质酸总量的比例来说明。本领域的技术人员可以根据常识、上述计算公式以及基于例如实验部分所述的测试等，轻松地测量出这一比率。

本发明框架中使用的术语"存在于尺寸小于约100μm的聚合物网络中的透明质酸"仅指以聚合物网络形式存在的透明质酸，因此不包括游离透明质酸，即添加到可注射产品中的非交联透明质酸链。

优选地，本发明产品中以尺寸小于约100μm的聚合物网络形式存在的透明质酸的数量，相对于交联透明质酸的总量小于约20％，优选地为小于或等于约19％、18％、17％、16％、15％、10％，甚至小于或等于约5％。

因此，优选地，本发明的可植入或可注射产品中以尺寸小于约100μm的聚合物网络形式存在的交联透明质酸比例小于或等于约16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％，甚至小于或等于约9％、8％、7％、6％，甚至小于或等于约5％。

换句话说，对于给定的G'值，以尺寸小于约100μm的聚合物网络形式存在的交联透明质酸的比例将低于根据现有技术制备的产品的比例。

根据本发明的产品可以优选地以无菌形式引入适于皮内注射的装置(比如注射器)中。因此，本发明还涉及包含根据本发明的至少一种产品和可能适合于皮内注射的装置的试剂盒。

根据另一方面，本发明涉及这些产品的用途，特别是其在审美和治疗方面的应用。

因此，根据第一个方面，本发明涉及使用本发明的产品预防和/或治疗优选地皮肤缺陷的填充，特别是皱纹和细纹或疤痕。这些缺陷可能涉及面部，也可能涉及身体的任何其他部位。

这些应用既涉及美容外科领域，也涉及整形外科领域。

在这些应用中，本发明的产品可以以不同的方式，通过不同的途径给药，特别是皮内、皮下注射、皮下或嘴唇粘膜给药。

这些可推荐用于各种类型的适应症，在此以非限制性的方式列出：

-体积修正；

-面部修正(伤痕等)；

-表面细纹修正；

-修正中度至深度皱纹；

-修正眼部轮廓(黑眼圈、皱纹等)；

-丰唇；

-修正口周皱纹；

-作为替代假体丰胸；

-臀部塑形。

给药产品的特性，尤其是在抗线性压缩的强度方面，以及给药途径，可由专业技术人员确定，特别是根据所设想的适应症来确定。

此外，例如根据本发明的产品还可应用于治疗领域等。

根据另一方面，本发明涉及使用这种产品预防和/或治疗关节问题，特别是骨关节炎。在这种情况下，该产品补充了内源性透明质酸的润滑作用，被称为增粘剂。

本发明的产品可以具有其他需要填充空腔或产生体积的应用，例如为了施加压力或使组织分开。还可以涉及耳鼻喉科领域，特别是声带修复，或泌尿科或眼科。另一种应用是使用这类产品来分离器官，特别是在使用放射线治疗癌症的情况下，例如放疗。因此，在治疗结直肠癌时，可以将本发明的产品植入或注射到前列腺和直肠之间。在所有这些应用中，根据本发明的产品都被用作组织间隔物。

就本发明而言，应注意的是，为了提供更简洁的描述，本文中给出的一些定量表达没有用术语“约”来限定。但是，无论是否明确使用“约”一词，所有数字都应理解为由“约”一词限定，无论是否明确说明。同样，“约1％至10％”的范围是指“约”限定了了1％和10％的端点。

除非另有明确说明，步骤可按任何顺序执行，不受限制。

实施例

本发明以及由此产生的优点将从以下示例性实施例中变得更加清楚，这些实施例与透明质酸(HA)有关，但在范围上没有任何限制。

I-创造性方法和产品

实施例1：产品制备

可注射产品由下表1所示的反应混合物制备:

表1

制备方法如下：

称出获得表1所示浓度所需量的平均分子量为1.5MDa(1.5x10⁶Da)的透明质酸钠(NaHA)纤维并放入容器中。

将由蒸馏水、氢氧化钠和1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE,CAS编号：2425-79-8)组成的交联剂溶液以获得表1中所示的比例所需的浓度加入到NaHA纤维素中。

将混合物均质化。

待反应介质混合后，将容器放置在温度为0℃至10℃的冷藏容器中数天。

在这一步的最后，得到凝胶。

将得到的凝胶水化，以便在生理pH值(在6到8的范围内)下获得所需的透明质酸浓度。水化液由磷酸盐缓冲液和1N盐酸组成。根据交联过程中的HA浓度和将要获得的浓度调整比例。将凝胶切成小块，然后放入水合浴中。

然后用磷酸盐缓冲液对水合凝胶进行清洗，以去除残留的交联剂。

将平均分子量为1.5MDa的游离透明质酸钠(即未交联)添加到纯化的凝胶中，作为所需的游离透明质酸最终浓度的函数(见下表2)。

在注射产品中加入10％(w/w)的利多卡因溶液，以获得凝胶中利多卡因的最终浓度为3mg/g。

通过添加磷酸盐缓冲液调整交联HA的浓度(见下表2)。

对混合物进行脱气处理。

脱气完成后，注入注射器，然后进行消毒。

获得的注射产品见下表2：

表2

实施例2：所获产品的机械和流变特性

测量了实施例1中制备的产品的模量G'、抗线性压缩强度(F)和改性度(MoD)。

在环境温度(25℃)下，模量G'是通过Kinexus Pro流变仪，使用40mm的板/板几何形状和250μm的间隙测定的。先对样品进行预剪切和静止期处理，以消除其流变记忆，然后通过振幅扫描以1Hz的固定频率扫描确定线性粘弹性域。模量G'是根据线性粘弹性域中的曲线确定的，在线性粘弹性域中，其中应力和位移呈线性关系。

在环境温度(25℃)下，使用流变仪测定抗线性压缩强度(F)，流变仪的板/板几何尺寸为20mm，间隙从2.5mm到0.9mm不等，速度为0.1毫米/秒。

改性度(MoD)采用Kenne等人的方法测定(Carbohydrate Polymers；；91(1)：410-4182,2013)。简而言之，待分析的产品先在氯化钠溶液中洗涤，然后用0.22μm过滤器进行真空过滤，再用软骨素酶AC在37℃下消化过夜。使用²D核磁共振测定了与透明质酸分子结合的交联剂摩尔数和有效交联的透明质酸摩尔数，方法是在校正每个信号的质子数后，将对应于交联剂残基的信号和对应于透明质酸N-乙酰基的信号进行积分。

得出的结果如下表3所示：

表3

实施例3：所获产品的热稳定性

为了评估所获得的可注射产品的热稳定性，将上述凝胶A和B短时间置于高温下。

简言之，将待分析的产品样品在80℃下放置数天，例如1、2、3或4天。之后，取出样品并放置在环境温度下，直至冷却至此温度。在环境温度下，按照实施例2中所述的方法测量弹性模量G'。

得出的结果如下表4所示：

表4

实施例4：评估所获产品的体内性能

在样品从水中提取并用100μm筛网过滤后，对所获得的HA凝胶交联部分中可溶性透明质酸钠(HA可溶物)的百分比进行了估算。事实上，在此尺寸以下，假定HA(无论是否交联)没有填充效果，并且会在生物体内迅速降解。

测定总有机碳(TOC)后，通过计算确定HA可溶性。

如果所获得的产品含有利多卡因，则通过分析测试样品中存在的利多卡因来考虑利多卡因提供的TOC。

如果在产品中加入游离HA是为了方便注射，而不是为了填充，则从提取的HA中扣除添加到产品中的游离HA的数量。

提取过程：

简言之，将1g待分析产品(样品)与100g纯净水混合。所得的混合物在环境下搅拌数小时。

过滤过程：

然后将混合物经平均孔径为100μm的织物过滤。

计算从产品中提取的HA：

a-利多卡因的TOC含量：

其中：

-168.2：盐酸利多卡因中碳的分子量(g/mol)

-270.5：盐酸利多卡因的分子量(g/mol)

-[利多卡因]_提取物：通过高效液相色谱法测定样品中盐酸利多卡因的浓度(mg/ml)

b-提取的HA，以mg/g产品计

测量所得液相(以下简称“HA提取物”)中的总有机碳(TOC)含量：

其中：

-[COT]_总量：测试样品中的总TOC(mg/l)

-[COT]_利多卡因：化验样品中利多卡因的TOC含量(见上文a.)

-401.3:HA的分子量(g/mol)

-168.2：HA中碳的分子量(g/mol)

-Q_总量：提取总量(样品+水)

-PE：样品量(g)

c.可溶性HA占所获产品中HA的百分比

其中：

-HA提取物：见上文b.

-[HA]_总量:样品中HA总含量(mg/g)，用重量法测定。

获得的结果如下表5所示：

表5

可以看出，在所获得的产品中，可溶解的HA(以尺寸小于100μm的聚合物网络形式存在)的数量很少。因此，在本发明的产品中，大部分交联透明质酸链是大尺寸聚合物网络的形式，从而获得了有效的填充和持久的性能。

II-本发明产品与商业产品的比较

将通过本发明方法获得的产品的特性与已知在高温(50℃)下与BDDE交联的商用产品进行比较。数据见下表6：

III-本发明产品作为填充剂的功效

一项前瞻性多中心临床研究已经启动，以便评估本发明产品在治疗病理性面部脂肪萎缩方面的安全性和有效性。

将实施例第一部分中公开的A和B两种产品(其中大部分为B)，每次间隔14天(B的总容量为7ml，A的总容量为2ml)分两次注入患者体内，通过中面部隆起来矫正面部脂肪萎缩。对患者进行了长达12个月的随访。结果采用全球审美改善量表(GAIS)进行评估。

研究结果表明，即使在12个月后，100％的患者对治疗仍有反应。

Claims (19)

1.一种制备含有交联聚合物的产品的方法，其中，所述交联步骤包括在反应混合物中将聚合物，或其生理上可接受的盐之一，与具有至少两种环氧官能团的交联剂在0℃以上10℃以下，优选在1℃至9℃之间的温度下反应。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物选自糖胺聚糖类，优选为透明质酸或透明质酸钠。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚、二乙二醇二缩水甘油醚或四乙二醇二缩水甘油醚，优选为BDDE。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联步骤至少持续48小时，优选地至少持续7天。

5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联剂与聚合物的二糖单元之间的摩尔比小于或等于10％，优选为大于或等于0.5％。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在交联步骤结束时，反应混合物至少要经过以下一种处理：中和、稀释、纯化、灭菌。

7.通过如权利要求1至6中任一项所述方法获得的可植入或可注射产品，优选为基于透明质酸的产品。

8.如权利要求7所述的产品，其特征在于，具有：

-改良度(MoD)小于10％，优选为在0.5％至6％之间；以及

-在25℃下，使用流变仪以0.1毫米/秒的速度对其进行压缩时，抗线性压缩强度(F)在0.2N到1.2N之间，甚至在0.35N到1N之间，流变仪的板/板几何尺寸为20mm，间隙在2.5mm到0.9mm之间。

9.一种可植入或可注射产品或如权利要求8所述的产品，其特征在于，其F/MoD比率大于0.15。

10.一种可植入或可注射的产品或如权利要求7至9中任一项所述的产品，其特征在于，其在80℃下储存96小时后测得的模量G'值大于其初始G'值的27％，甚至大于或等于其初始G'值的30％、40％、50％或60％。

11.一种可植入或可注射的产品或如权利要求7至10中任一项所述的产品，其特征在于，以尺寸小于100μm的网状形式存在的交联透明质酸的比例小于20％、15％、10％或甚至小于5％。

12.如权利要求7至11中任一项所述的产品，其特征在于，含有交联透明质酸的含量为1至40mg/g产品，优选为10至25mg/g产品。

13.如权利要求7至12中任一项所述的产品，其特征在于，其含有未改性的透明质酸，较佳地占比为0.5至5mg/g产品，更佳地占比为1至3mg/g产品。

14.如权利要求7至13中任一项所述的产品，其特征在于，还包括麻醉剂，优选为利多卡因。

15.包含如权利要求7至14中任一项所述产品的试剂盒或注射器。

16.一种预防或治疗皮肤缺陷(如细纹、皱纹和疤痕)的方法，包括使用如权利要求7至14中任一项所述的产品。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述产品经皮内、皮下注射或皮下给药。

18.一种预防或治疗关节问题(较佳地是骨关节炎)的方法，包括施用如权利要求7至14中任一项所述的产品。

19.如权利要求7至14中任一项所述的产品作为组织间隔物的用途。