JP2024509534A - ポリマーをベースとする植込み型又は注入型生成物及びそれらの調製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、架橋ポリマーをベースとする生成物を調製する方法であって、少なくとも2つのエポキシ官能基を含む架橋剤の存在下で、前記ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を架橋するための工程を含み、前記架橋が0℃超及び10℃未満の温度で行われる、方法、並びにそこから得られる植込み型又は注入型生成物、有利にはヒアルロン酸をベースとする植込み型又は注入型生成物に関係している。
Description
本発明は、ヒアルロン酸等のポリマーを架橋して、植込み型又は注入型生成物を製造することを可能にする方法に関する。
本発明はまた、注目すべき特性を有する、このようにして得られる植込み型又は注入型生成物にも関係している。これらは、美容分野(リンクルフィラー、豊胸等)、形成外科(瘢痕修復)、及び治療分野(関節のための関節内補充薬、又は例えば、泌尿器科若しくは放射線療法によるがんの処置における、組織スペーサー)の両方おいていくつかの用途を有する。
架橋ポリマーをベースとする生成物は、現在、美容分野と医療分野の両方で、しわの充填及び変形性関節症の処置のような多様な用途に日常的に使用されている。
ヒアルロン酸をベースとするリンクルフィラーは、架橋ポリマーをベースとする生成物で一般的に遭遇する技術的課題の良い例を構成する。
ヒアルロン酸(HA)は、(軟骨等の硬組織として知られる他の組織とは対照的に)皮膚等の軟組織として知られる結合組織の細胞外マトリックスに本質的に見られるグリコサミノグリカン(又はGAG)である。皮膚では、ヒアルロン酸は、皮膚線維芽細胞及び表皮角化細胞によって本質的に合成されるが、ヒアルロニダーゼによって生理学的に分解される。加齢とともに、合成されるヒアルロン酸の量及びその重合度が減少し、皮膚老化の目に見える徴候に寄与する。
ヒアルロン酸は、反復二糖単位によって構成されるポリマーであり、ヒト結合組織に天然に存在し(したがって、バイオポリマーとしての資格)、また再吸収性である、すなわち、インビボで分解することができる。更に、ヒアルロン酸は水の分子を捕捉し、保持する特性を有する。ヒアルロン酸は、水和すると、ゲルの外観を有する粘性組成物を自然に形成する。
これらの特徴のために、ヒアルロン酸は、本質的に注入されることを意図した「フィラー」としても知られるしわ充填製品の製造に特に適したポリマーである。しかしながら、機械的特性及びそのインビボ寿命を改善するために、これらの製品に含有されるヒアルロン酸の少なくとも一部は、通常、例えば、架橋剤を用いて化学的に架橋される。
架橋反応は、架橋剤の分子を介して一緒に連結されるヒアルロン酸の分子を含むネットワークを生成する効果を有する。形成されるポリマーネットワークは水性ゲルを生成する。ポリマーが架橋されればされるほど、得られるゲルがより粘性になり、より硬くなり、インビボ分解に対してより耐性になる。しかしながら、過剰な架橋の場合、ゲルは脆くなり、断片になる、又は植込み若しくは注入後に炎症をもたらし、その酵素分解を引き起こす可能性がある。
更に、このタイプの生成物は注入されることを主に意図しているため、ゲルが、注入デバイス内で流動し、目詰まりするのを防ぐのに十分に流動性でなければならない。
したがって、これらの様々な要件を満たす生成物を得るために、技術的解決策が調査されてきた。
実際には、架橋反応のある特定のパラメータを変化させることによって、ポリマーの架橋度を調節することが可能である。架橋度は、有効に架橋されるポリマーの二糖類のモル数のポリマーの二糖類の総モル数に対する比に対応する。
更に、水性ゲルの形態であり、架橋ポリマーを含む生成物においては、遊離ポリマー、すなわち架橋されていないポリマーが時々添加される。その場合、遊離ポリマーの添加を使用して、生成物の粘度を低下させ、一般的にシリンジを用いて行われる注入による施用を容易にすることができる。
特に美容用途の枠では、硬度及び圧縮に対する抵抗性の十分な特性を有する生成物が利用可能であることが有益である。硬度は、従来から、係数G'によって測定される、固体又はゲルが弾性変形応力に抵抗する能力に密接に関連する。線形圧縮に抵抗する強度を使用して、線形圧縮型応力、例えば、一軸応力にさらされる固体又はゲルの挙動を記述することができる。一般に、線形圧縮に抵抗する強度が高い材料は、良好な凝集力又は凝集性(cohesivity)を有する、すなわち、材料を構成する分子が、大きな力によって一緒に連結されており、これは、材料が一軸方向に印加される圧力の影響下での生成物の崩壊又は拡散を回避することができることを意味すると考えられる。
したがって、いったん注入されると、生成物は、充填されるゾーンから破裂することも拡散することもなく、及ぼされる様々な力に抵抗することができる。このタイプの特性は、典型的には、注入型生成物中に存在するヒアルロン酸の架橋度を増加させることによって得られ、上記の考えられる欠点を有する。
更に、上記の結合に加えて、架橋反応は、ヒアルロン酸の分子の真の架橋には関与しないが、その構造の修飾に関与する化学修飾を生成し得る。これは、例えば、架橋剤の分子とヒアルロン酸の単一分子との間の共有結合の形成(「グラフト」と呼ばれる)の場合に当てはまる。本明細書で使用される場合、架橋剤によって誘導される修飾は、修飾が真の架橋に関与するか又はグラフト等の他の修飾に関与するかどうかにかかわらず、「修飾」という用語によって一般に示される。架橋反応によるこのような修飾の程度は、修飾度(「MoD」)によって推定され得る。一般に、架橋二糖を含む注入型生成物のMoDは、ポリマーを形成する二糖単位のモル数に対する任意の方法で結合される架橋剤のモル数のパーセンテージに対応する。一方で、このパラメータは、架橋に実際に関与する架橋剤の分子、すなわち2つの二糖分子間で結合した架橋剤の分子を考慮に入れる。他方、これはグラフト等によりポリマーの単一分子に結合し、ポリマーの架橋には関与しない架橋剤の分子も考慮する。
しかしながら、高すぎる修飾度は、架橋ヒアルロン酸の生体適合性に影響を及ぼす可能性があることが示唆されている(A.Tezel、G.H.Fredrickson、Journal of Cosmetic and Laser Therapy、10(1):35～42、2008)。例えば、高度に修飾されたヒアルロン酸は、現在、一定数の二次反応(アレルギー反応、炎症反応、又は更には拒絶反応)の原因であることが疑われている。したがって、これは、高度に架橋された生成物について観察される断片化に対するさらなる欠点を構成する。
A.Tezel、G.H.Fredrickson、Journal of Cosmetic and Laser Therapy、10(1):35～42、2008
Kenneら、Carbohydrate Polymers;91(1):410～4182、2013
高度に架橋された断片化生成物のさらなる欠点は、例えば、変形性関節症の処置において、これらを関節内補充療法薬として使用することができないことである:前記用途のためには、フィラーは、関節内で均質に膨潤し、潤滑剤として適切に作用することができるようになるために親水性でなければならない。
したがって、興味深い特性、特にレオロジー特性を有するが、現在入手可能な高度に修飾されたヒアルロン酸ゲルの欠点に悩まされない注入型生成物の開発が必要である。
これらの要求の全てを満たすために、本出願人は、架橋ポリマーを含有する植込み型又は注入型生成物を調製する方法に組み込むことができる新規な架橋方法を開発した。
本発明によると、前記ポリマーの架橋は、架橋剤を用いて低温で行われる。
架橋工程が高温によって促進されることは一般に知られている。しかしながら、驚くべきことに、また予想外に、本出願人は、架橋が低温で行われる場合に、有効な架橋を達成し、特にレオロジーの観点から、水性ゲルの品質を有効に有する生成物の製造をもたらすことができることを発見した。更に、また予想外に、この方法を使用して、優れた機械的特性を有する、特に低い修飾度であっても線形圧縮に抵抗する強度が高い生成物を製造することができる。その上、低温で実施される架橋工程は、ポリマー鎖の分解を防止し、とりわけ、減少した量の可溶性ポリマー及びとりわけ熱応力に対する優れた抵抗性を有する最終生成物をもたらすことが示されている。
結果として、これらのゲルは、その欠点に悩まされることなく、高度に架橋されたポリマーの水性ゲルを通常必要とする状況下で使用される圧力に十分に抵抗性である。
本発明の注入型生成物はまた、良好な温度安定性を有する。実際、これらのレオロジー特性は、高温で数日後であっても比較的良好に保存されていることが示されている。
最後に、本明細書に記載される方法に従って調製された注入型生成物は、その中に含有される架橋ヒアルロン酸の大部分が、大型の架橋ポリマーのネットワークの形態であるという追加の特徴を有する。結果として、本発明の生成物は、小型のヒアルロン酸ネットワークをほとんど含有せず、それによって、良好な充填又は潤滑効果を保証し、インビボ分解を受けにくくなり、長期間にわたって良好に機能することが保証される。
したがって、本出願は、架橋ポリマーを含む生成物を調製する方法、前記方法によって得られた生成物、及びより一般的には、このような生成物の特徴を有する植込み型又は注入型生成物を報告する。
次に、本発明は、架橋ポリマーをベースとする生成物を調製する方法であって、架橋剤の存在下で、前記ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を架橋するための少なくとも1つの工程を含み、前記架橋は、低温、例えば、約0℃～約10℃の範囲の低温で行われる、方法に関係している。
第1の態様によると、本発明は、架橋ポリマーを含有する生成物を調製する方法であって、架橋工程が、低温、有利には0℃超及び10℃未満、より有利には1℃～9℃の間の低温で、ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を、有利には少なくとも2つのエポキシ官能基を有する架橋剤と共に反応混合物中でインキュベートすることを含む、又はインキュベートすることからなる、方法に関係している。
したがって、本発明の方法は、想定される用途、特に医療機器で日常的に使用される用途の文脈において対象となるポリマーで行われる。ポリマーは、一緒に重合されて単純な鎖を形成する一連のモノマー単位として定義される。適切には、ポリマーは、架橋剤と反応することができる遊離官能基、有利にはアルコール又はアミン官能基を有する。
一態様によると、本発明の方法で使用又は実行されるポリマーは、本発明の文脈では「非架橋ポリマー」又は「遊離ポリマー」とも呼ばれる、その天然形態である、すなわち、架橋も修飾もされていないポリマー、すなわち、鎖が架橋剤の分子で一緒に架橋されておらず、グラフトもされていないポリマーである。
或いは、本発明の方法は、既に架橋剤と部分的に反応したポリマーで行われ得る。
有利には、実行されるポリマーは、注入されることが意図される生物内に天然に存在する、「バイオポリマー」とも呼ばれる生体適合性ポリマーである。
別の特定の態様によると、前記ポリマーは、インビボで再吸収性であるという利点を有する、すなわち、前記ポリマーは、それが植え込まれる又は注入されることが意図される生物によって自然に分解されることが可能である。この特性は、既知の方法で、それを分解することができる酵素の存在下(例えば、ヒアルロン酸の場合はヒアルロニダーゼの存在下)、インビトロで、又はインビボで(動物モデル若しくはヒトにおいて)、その体積を減少させるのに必要な時間、又は更にはそれが消失するのに必要な時間を測定することによって、試験することができる。適切には、本発明の文脈で得られる生成物は、数週間～数か月であり得る再吸収時間を有する。
好ましい実施形態によると、実行されるポリマーは、多糖類、コラーゲン及びエラスチンを含む群から選択される。
好ましくは、本発明の文脈で使用される多糖類には、グリコサミノグリカン(GAG)、アルギネート、デキストラン、キトサン及びセルロースが含まれる。
有利には、実行されるポリマーはグリコサミノグリカンファミリー(GAG)に属する。本発明の意味において、「グリコサミノグリカン」という用語は、ヘキソサミン(グルコサミン(GlcN)又はガラクトサミン(GalN))及び別のオース(ose)(グルクロン酸(GlcA)、イズロン酸(IdoA)、ガラクトース(Gal))を常に含有する反復二糖で構成される非分岐多糖ポリマーを示す。グルコサミンは、N-硫酸化されている(GlcNS)、又はN-アセチル化されている(GlcNac)。ガラクトサミンは常にN-アセチル化されている(GalNac)。有利には、グリコサミノグリカンであるポリマーは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン又はヘパラン硫酸を含む群から選択される。
本発明の文脈において特に適したポリマーはヒアルロン酸である。本発明の意味において、「ヒアルロン酸」という用語は、β-1,4グリコシド結合によって一緒に結合された、別名β-D-グルクロピラノシル(1→3)-β-D-2-N-アセチルグルコサミン酸(CAS番号:499-15-0)として知られている、ヒアロビウロン酸の分子のポリマーを示す。ヒアロビウロン酸は、交互のβ-1,4グリコシド結合及びβ-1,3グリコシド結合を介して一緒に結合された、D-グルクロン酸の1個の分子及びD-N-アセチルグルコサミンの1個の分子を含む。
本発明の意味において、「生理学的に許容される塩」は、限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩又は銀塩から選択され得る。したがって、ある特定の実施形態では、「生理学的に許容されるヒアルロン酸塩」という用語が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸銀及びこれらの混合物、好ましくはヒアルロン酸ナトリウムを示す。
本発明の方法は、任意の分子量のポリマー、特に任意の分子量のヒアルロン酸で実行することができる。しかしながら、有利には、ヒアルロン酸の場合、これは、1×107ダルトン(Da)以下の平均分子量を有する。有利には、本発明の方法で使用されるヒアルロン酸は、5.0×104Da～1×107Da、有利には1×105Da～5.0×106Daの範囲の平均分子量を有する。
本発明の文脈で使用されるポリマーは、当業者に周知の方法を使用して工業的に容易に得ることができる。例えば、例として、ヒアルロン酸は、動物組織(例えば、雄鶏のとさか)からの抽出によって、又は細菌発酵によって得ることができる。
更なる特徴によると、本発明による方法は、異なるポリマー鎖間の架橋、すなわち橋かけを誘導することができる架橋剤(crosslinking agent)又は架橋剤(crosslinker)を使用する。
特定の実施形態によると、このような化合物はエポキシ官能基を含む。これらの官能基は、存在するポリマーと、有利には、そのアルコール又はアミン官能基と反応することができる。特定の実施形態によると、このような化合物は、少なくとも2つのエポキシ官能基、有利には2つのエポキシ官能基(「ビスエポキシド」)、なおより有利には各鎖端に位置する2つのエポキシ官能基、すなわち、化合物の各鎖端に1つのエポキシ官能基を含む。特定の実施形態によると、架橋剤は、PEGジグリシジルエーテルとしても知られる、ポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテルから選択される。架橋剤は、好ましくは、以下の群:1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE、CAS番号:2425-79-8)、エチレングリコールジグリシジルエーテル(EGDE、CAS番号:2224-15-9)、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル(CAS番号:4206-61-5)、及びテトラエチレングリコールジグリシジルエーテルから選択される。特定の実施形態によると、架橋剤は1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルである。
別の特定の実施形態によると、本方法で使用される架橋剤は、好ましくは、ポリ(エチレングリコール)鎖が3個超又は更には2個超の酸素原子を含有しないPEGジグリシジルエーテルから選択される。架橋剤は、好ましくは、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、及びジエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる群から、有利には1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル及びエチレングリコールジグリシジルエーテル、より有利には1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルからなる群から選択される。
架橋反応は、例えば、約0℃～約10℃、又は約1℃～約9℃の温度範囲でポリマー及び架橋剤を混合又はインキュベートすることからなり得る。
次いで、この反応中、ポリマーは架橋剤によって修飾される。本発明の文脈において、「修飾ポリマー」は、架橋剤の分子を介した2個のポリマー分子間の架橋結合(crosslinking bond)(以下、「架橋結合(crosslinking linkage)」と称する)、並びに例えば、ポリマーの単一分子と架橋剤の分子との間の結合等の任意の他の種類の結合を含む、架橋工程から得られる構造修飾を含むポリマーを示す。これらの後者は、ポリマーの架橋に関与しないが、構造的修飾を構成する。したがって、本発明の意味において、架橋工程から得られる構造修飾には、架橋結合と架橋反応によって誘導されやすい他の種類の修飾、例えば、架橋剤の分子のポリマーへのグラフトの両方が含まれる。したがって、本発明の意味において、修飾ポリマーの濃度、又は適切であれば割合は、架橋工程から得られる構造修飾を含むポリマーの濃度又は割合に対応する。
一実施形態によると、架橋工程を受けるポリマーは、固体形態、例えば、繊維又は粉末としての固体形態である。有利には、架橋反応のために、ポリマーが液相と混合され、この工程は、おそらく、架橋反応の前に、又はこれと同時に行われる。この工程は、ポリマーを液相、例えば水溶液と混合することによって容易に行われる。本発明の文脈において、水溶液は、水によって構成されてもよく、又は水及びジメチルスルホキシド(DMSO)等の1種若しくは複数の他の溶媒を含んでもよい。
したがって、ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種は、非架橋形態で、水性媒体中で水和され、次いで、架橋剤と混合される。或いは、ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種は、非架橋形態で、架橋剤の水溶液と混合される。
特定の実施形態によると、架橋反応は、塩基性培媒体中、好ましくは7超、又は更には8、9若しくは更には10以上のpHで行われる。塩基性pHは架橋反応を促進する。塩基性pHは、例えば、水酸化ナトリウム等の、この分野で日常的に使用されている塩基性溶液を使用することによって得ることができる。
したがって、本発明の方法の架橋工程中、反応混合物は、ポリマー及び架橋剤を含む塩基性調製物に対応する。
反応混合物中のポリマー濃度は、当業者によって調整される。ポリマー濃度の増加は、架橋反応を促進し、架橋剤の量を減少させるために使用することができる。しかしながら、これは、ポリマーの良好な水和及び反応媒体の良好な均質化と適合性であるべきである。ヒアルロン酸に関しては、例えば、反応混合物中のその濃度が、反応混合物1グラム当たり50～500mgの範囲、例えば、反応混合物1グラム当たり100～200mgの間であり得る。
更に、当業者であれば、特に、反応混合物中の架橋剤及びポリマーのそれぞれの量を変化させることができる。例えば、適切には、架橋剤とポリマーの二糖単位との間のモル比は約0.5%以上である。この比を下回ると、最終生成物が想定される用途にとって液体すぎる場合がある。別の実施形態によると、この比は約10%を超えない。一実施形態では、モル比が0.5%～10%の範囲である。この比を上回ると、請求される方法から得られる最終生成物は脆すぎる危険性があり得る。本発明の意味において使用される「ポリマーの二糖単位」という用語は、上に定義されるポリマーを形成する反復二糖単位を意味すると理解されるべきである。例として、既に述べたように、ヒアルロン酸は、それ自体がD-グルクロン酸及びD-N-アセチルグルコサミンから形成される二糖であるヒアロビウロン酸の反復単位から形成される。
均一な反応を促進するために、混合物は、有利には、例えば、当業者に適した既知の任意の方法を用いて、機械的に均質化され得る。
特徴として、本発明によると、架橋工程は低温で行われる。この温度は、有利には0℃超、又は更には1、2、3、4若しくは5℃超である。好ましくは、この温度は、10℃未満、又は更には9、8、7若しくは6℃未満である。ある特定の実施形態では、温度が、約0℃超～約10℃未満、例えば約0℃超～約9℃未満、約0℃超～約8℃未満、約0℃超～約7℃未満、約0℃超～約6℃未満、約0℃超～約5℃未満、約1℃超～約10℃未満、約1℃超～約9℃未満、約1℃超～約8℃未満、約1℃超～約7℃未満、約1℃超～約6℃未満、約1℃超～約5℃未満、約2℃超～約10℃未満、約2℃超～約9℃未満、約2℃超～約8℃未満、約2℃超～約7℃未満、約2℃超～約6℃未満、約2℃超～約5℃未満、約3℃超～約10℃未満、約3℃超～約9℃未満、約3℃超～約8℃未満、約3℃超～約7℃未満、約3℃超～約6℃未満、又は約3℃超～約5℃未満の範囲である。他の実施形態では、温度が、約0℃、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、約8℃、約9℃、又は約10℃であり得る。実際には、反応混合物を有利には、所望の温度の容器に入れて、架橋反応の持続時間を通してこの温度を維持することを可能にする。
好ましくは、架橋工程は、少なくとも24時間若しくは48時間、又は24時間若しくは48時間超、有利には7、8、9、10、11、12、13又は更には14日以上、おそらく最大1週間又は複数週間の期間にわたって行われる。好ましくは、所望の温度が、架橋反応の持続時間を通して実質的に一定に維持される。
架橋反応の最後に、このようにして得られた生成物は、有利には修飾ポリマーのゲルの形態である。実際には、架橋工程の適切な実行は、反応混合物の粘度の増加をもたらす。
この架橋工程の最後に、反応混合物は、示される順序で又は異なる順序で、順次に又は同時に行われ得る、ある特定の数の後続の処理を受け得る。
本発明による1つの方法は、場合により、pHを約8未満の値に低下させることができる、有利にはpHをほぼ中性のpH、典型的には6.5以上、又は更には6.6、6.7、6.8若しくは6.9以上及び7.5以下、又は更には7.4、7.3、7.2、7.1若しくは7以下にするための、中和のための工程を含み得る。このpHの低下を使用して架橋反応を停止し、存在するポリマーのより優れた安定性を保証する、又は生成物を、想定される用途、特に体液若しくは皮膚の用途と適合性のpHにすることができる。この工程は、例えば、架橋工程から得られた生成物を、例えば、塩酸(HCl)の溶液等の酸性pHを有する組成物と混合することによって行われ得る。実際には、中和のためのこの工程は、架橋反応から得られた混合物の希釈を伴い得る。
本発明による調製方法はまた、架橋反応から得られた生成物の希釈又は水和のための工程を含み得る。これは、例えば、適切なpH、有利には、6.5～7.5の範囲の中性pHを有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液(PBS、「リン酸緩衝生理食塩水」)を調製物に添加することによって行われ得る。希釈率(dilution factor)は、典型的には約2～10の間、例えば約4～8又は約5の間で変化し得る。
中和及び希釈のための工程は、場合により、特に架橋ヒアルロン酸の所望のpH及び濃度を得るために使用することができる適切な溶液を使用して、同時に行われ得ることに留意すべきである。
別の態様によると、本発明の調製方法はまた、特に、架橋工程中にポリマーと反応しなかった架橋剤、及び考えられる他の不純物が確実に除去されるようにするために、架橋工程の最後に得られた生成物の精製のための工程を含み得る。有利には、この処理は、中和及び/又は希釈後に行われる。この工程は、不要な残留物、例えば残留架橋剤を除去するための任意の適切な既知の方法を使用して、当業者によって容易に行われ得る。これは、例えば、連続洗浄によって行われ得る。
特定の実施形態によると、本発明による方法は、架橋工程に加えて、
- 好ましくは酸性溶液を用いて行われる、中和のための工程、及び/又は
- 好ましくは中性溶液を用いて行われる、希釈のための工程;及び/又は
- 例えば洗浄による、精製のための工程
を含み得る。
- 好ましくは酸性溶液を用いて行われる、中和のための工程、及び/又は
- 好ましくは中性溶液を用いて行われる、希釈のための工程;及び/又は
- 例えば洗浄による、精製のための工程
を含み得る。
1つの特定の実施形態によると、方法は、この順序で行われるこれらの工程の全てを含む。しかしながら、例として、中和及び希釈の工程は同時であってもよい。
更に、本発明による方法の最後で得られた生成物の組成を修飾することができる:
遊離(非修飾)ポリマー、又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を、このようにして得られた生成物に添加することができる。この工程は、注入型調製物の文脈で有用であることが証明され得る、生成物の粘度を低下させる効果を有する。有利には、好ましくは実質的に同じ分子量を有する、架橋工程に使用されるポリマーと同じポリマーを添加することができる。
遊離(非修飾)ポリマー、又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を、このようにして得られた生成物に添加することができる。この工程は、注入型調製物の文脈で有用であることが証明され得る、生成物の粘度を低下させる効果を有する。有利には、好ましくは実質的に同じ分子量を有する、架橋工程に使用されるポリマーと同じポリマーを添加することができる。
したがって、例えば、ヒアルロン酸を使用する場合、ヒアルロン酸、有利にはヒアルロン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液を添加することができる。この溶液の濃度及び体積は、最終生成物中の遊離ポリマーの所望の濃度を得るような方法で、有利には、ヒアルロン酸の場合、最終生成物1グラム当たり約0.5～5mgの範囲で調整することができる。
想定される用途を考慮して、注入に関連する疼痛を制限する効果を有する、例えば、リドカイン、ブピバカイン、メピバカイン等の麻酔化合物を添加することも有利となり得る。最終生成物1グラム当たり約1～約5mg、例えば1グラム当たり約2～約4mg又は1グラム当たり約3mgの範囲の麻酔薬の最終濃度が従来から使用されている。好ましい実施形態によると、麻酔化合物、例えばリドカインの添加は、組成物へのその導入前にいかなるpH調整も必要としない。
代替的又は追加的に、他の活性成分を、本発明による方法の最後に得られた生成物に添加することができる。これは、例えば、注入に関連する二次効果を低減する血管収縮薬、又は想定される用途の文脈において対象となる任意の活性成分、例えば、酸化防止剤、特にマンニトール、又は抗炎症薬であり得る。このタイプの活性成分を適切な濃度で添加することは、当業者の知識の範囲内である。
例として、本発明による方法の様々な工程の最後に得られた生成物はまた、
- 非架橋形態のポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を添加することによって、及び/又は
- 麻酔薬、例えばリドカイン、及びより一般的には対象となる任意の活性成分を添加することによって
製剤化され得る。
- 非架橋形態のポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を添加することによって、及び/又は
- 麻酔薬、例えばリドカイン、及びより一般的には対象となる任意の活性成分を添加することによって
製剤化され得る。
これらの添加のそれぞれで、ポリマーの所望の濃度を維持するために、体積を調整することが推奨される。これらの様々な添加は同時に又は順次に行われ得る。有利には、混合物を各添加後に均質化することができる。
更に、好ましくは、本発明の方法の様々な工程の最後に得られた生成物を滅菌する。滅菌は、例えば、オートクレーブ内での熱処理による滅菌等の通常の適切な方法のいずれかを使用して行われ得る。滅菌温度は、有利には、100℃～150℃の範囲、好ましくは121℃超である。
このようにして得られた生成物は、有利には、体内に、好ましくは人体に植え込まれることを意図している。対象となる植込み部位にこのタイプの製品を植え込む適切な方法は、有利には、シリンジ等の注入装置を用いて、これを体内に注入する工程からなる。したがって、別の態様によると、本発明の方法を用いて得られた生成物は、想定される用途に適合する体積を有する、1つ又は複数のシリンジに包装される。滅菌は包装前又は後に行われ得る。
本発明はまた、本明細書に記載される方法によって得られる植込み型又は注入型生成物に関係している。1つの特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される方法をポリマーとしてヒアルロン酸又はその塩を用いて行った場合に得られる植込み型又は注入型生成物に関係している。
したがって、好ましい態様によると、本発明は、上記の方法によって得ることができる植込み型又は注入型生成物に関係し、特に、特に好ましいポリマーとしての、ヒアルロン酸又はその塩のうちの1種、特にヒアルロン酸ナトリウムに関する。しかしながら、本発明の教示はまた、任意のポリマー、とりわけ二糖単位を含有するポリマーにも適用される。
したがって、本明細書に記載される方法に従って調製される生成物は、少なくとも2つのエポキシ官能基を有する、有利にはその末端の各々にエポキシ官能基を含む架橋剤、より有利には1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、又はテトラエチレングリコールジグリシジルエーテルから選択される架橋剤を用いて修飾されたヒアルロン酸を含み得る。
したがって、本発明による修飾ヒアルロン酸は、以下の異なる構造を含み得る:
- 架橋剤によって一緒に架橋されたヒアルロン酸の鎖;
- 架橋剤によってグラフトされたヒアルロン酸の鎖;
- 架橋されると共にグラフトもされたヒアルロン酸の鎖。
- 架橋剤によって一緒に架橋されたヒアルロン酸の鎖;
- 架橋剤によってグラフトされたヒアルロン酸の鎖;
- 架橋されると共にグラフトもされたヒアルロン酸の鎖。
架橋剤が1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、又はテトラエチレングリコールジグリシジルエーテルである場合、本発明の生成物中に存在する修飾ヒアルロン酸は、以下に図示される、前記薬剤を用いてグラフト及び/又は架橋される鎖を有する:
好ましくは、想定される用途に関して、修飾又は架橋ヒアルロン酸は、本発明による生成物のg当たり約1～約40mg、有利には約5～約40mg/g(生成物)、より有利には約10～約25mg/g(生成物)に相当する。
前記生成物は、
- 有利には約0.5～約5mg/g(生成物)の量、有利には約1～約3mg/g(生成物)の量の非修飾(非架橋又は遊離)ヒアルロン酸;及び/又は
- 好ましくは生成物1グラム当たり約1mg～約5mg、好ましくは生成物1グラム当たり約3mgの量の麻酔薬、有利にはリドカイン;及び/又は
- 任意の他の適切な活性成分、例えばマンニトール等の抗酸化剤又は抗炎症薬
を更に含み得る。
- 有利には約0.5～約5mg/g(生成物)の量、有利には約1～約3mg/g(生成物)の量の非修飾(非架橋又は遊離)ヒアルロン酸;及び/又は
- 好ましくは生成物1グラム当たり約1mg～約5mg、好ましくは生成物1グラム当たり約3mgの量の麻酔薬、有利にはリドカイン;及び/又は
- 任意の他の適切な活性成分、例えばマンニトール等の抗酸化剤又は抗炎症薬
を更に含み得る。
特定の実施形態によると、生成物は、いかなる「遊離」架橋剤も、すなわち、ポリマーにグラフトされていない、又は架橋されていない架橋剤を含有しない。
適切には、本発明の生成物は、中性又は生理学的pH、有利には、約6～約8の範囲、より有意には6.5～7.5の範囲の中性又は生理学的pHを有する。特定の実施形態によると、本発明による生成物のpHは、6.5以上又は更には6.6、6.7、6.8若しくは6.9以上及び7.5以下又は更には7.4、7.3、7.2、7.1若しくは7以下、例えば6.8～7.2の範囲である。
特徴として、本発明によると、生成物はゲルの形態である。
別の特徴によると、前記ゲルは水性ゲルである、すなわち、水を含む。好ましい実施形態によると、前記ゲルは注入可能であり、特にシリンジにおける用途の分野で日常的に使用されている注入システムに適合する粘度を有する。
ゲルは、従来から、固体のように振る舞う粘性組成物として定義される。ゲルの物理的挙動は、弾性係数G'及び粘性係数G''によって測定され、表される。
ゲルの固体挙動の適切な尺度は、液体とは異なる、変形に対する抵抗性である。実際、変形が固形体に印加されると、固形体はしばしば、課された変形に比例するひずみによって応答し、これは弾性係数G'を用いて測定することができる。
弾性係数G'は、変形又はひずみに対する応力の結果(G'=応力/変形)であり、したがって、固体によって吸収されるエネルギーを記述する。G'が高いほど、材料は硬くなる。弾性係数G'は、ゲルの固体成分を記述するために従来から使用されている。例として、桁数に関して、エマルジョンはパスカルの桁の弾性係数G'を有するが、硬質固体はギガパスカルの桁の弾性係数G'を有すると一般的に考えられる。
したがって、本発明の文脈で使用される「ゲル」は、有利には、10Pa超の弾性係数G'を有する組成物を意味する。好ましくは、本発明の生成物は、約20～約1000Paの範囲の弾性係数G'を有する。好ましい実施形態によると、本発明の生成物は、約20、30、40又は更には50Pa超の弾性係数を示す。別の好ましい実施形態によると、本発明の生成物は、約1000、900、800、700、600又は更には500Pa未満の弾性係数を示す。有利には、本発明の生成物のG'値は、約50～約500Paの範囲である。本発明の文脈において、G'値は、想定される生成物の固体成分に寄与する、ポリマーの架橋度に相関する。
本発明の生成物の係数G'は、当業者に周知の方法を使用して決定される。本発明の枠では、係数G'は、好ましくは、40mmのプレート/プレート形状及び250μmのギャップを使用して、例えばKinexus Proタイプのレオメータを用いて、室温、典型的には25℃に等しい温度で決定される。従来から、試料のレオロジー記憶を消去するために、前せん断及び休止期間が試料に適用され、その後、例えば、1Hzの固定周波数で、振幅スイープによって線形粘弾性領域が決定される。次いで、応力と変位が線形関係にある線形粘弾性領域で得られる曲線から係数G'を決定することができる。
特に、本発明の方法から得られる植込み型又は注入型生成物は、それらを既知の生成物と区別する機械的特性及び構造的特性を有する。特に、変形抵抗試験の結果は、それらの修正度が低いにもかかわらず、線形圧縮に抵抗する高い強度によって示される、それらが良好な凝集特性を有するという証拠を提供する。したがって、本発明の植込み型又は注入型生成物は、特にこれらのパラメータによって特徴付けられる。
本発明の文脈において、線形圧縮に抵抗する強度(F又は一軸圧縮強度力)は、0.1mm/秒の速度で、2.5mmから0.9mmまで変化するギャップを有する20mmプレート/プレート形状を用いて、上記の係数G'の測定のように、例えばKinexus Proタイプのレオメータを用いて生成物を圧縮する際に測定される。この測定は、有利には、室温で、典型的には25℃に等しい温度で行われる。したがって、本発明の文脈において、「線形圧縮に抵抗する強度」という用語は、上記の試験条件の下で得られるニュートンで表される力を示す。
有利には、本発明の生成物は、少なくとも約0.15ニュートン(N)、有利には少なくとも約0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65又は0.7Nの線形圧縮に抵抗する強度(F)を有する。別の実施形態によると、線形圧縮に抵抗する強度(F)は、約1.6、1.55、1.5、1.45、1.4、1.35、1.3、1.25、1.2、1.15、1.1、1.05又は1Nを超えない。具体的な実施形態によると、本発明の生成物は、約0.2N～約1.2Nの範囲、又は更には約0.35N～約1Nの範囲の線形圧縮に抵抗する強度を有する。
本発明の生成物はまた、架橋剤によって誘導されるヒアルロン酸への修飾と相関する修飾度又は「MoD」によって特徴付けられ得る。
上記のように、修飾度又は「MoD」は、生成物の生体適合性を示す。生成物が有する修飾が多いほど、遊離又は非修飾ポリマーと区別され、生体適合性が低くなる。
修飾度の技術的定義、並びにこの修飾度を測定するための正規化された方法は、当業者が参照することができる、参照により本明細書に組み込まれる文献Kenneら(Carbohydrate Polymers;91(1):410～4182、2013)に詳述される。
本発明の枠において、「修飾度」という用語は、Kenneらの方法によって決定される、ポリマーに固定された架橋剤のモル数とポリマーの二糖のモル数との間の比を示す。ヒアルロン酸が使用されるポリマーである場合、この比は、ヒアルロン酸に固定された架橋剤のモル数とヒアルロン酸に含まれる二糖のモル数、すなわち、上に定義されるヒアロビウロン酸のモル数の比である。この比は、典型的には、パーセンテージの形態で表される。
手短に言えば、生成物を塩化ナトリウムの溶液で洗浄し、次いで、0.22μmフィルタを使用して真空下で濾過した後、37℃で一晩、コンドロイチナーゼACで消化する。ヒアルロン酸分子に固定された架橋剤のモル数及び有効に架橋されたヒアルロン酸のモル数は、架橋剤の残基に対応するシグナル及び各シグナルを担うプロトンの数を補正した後のヒアルロン酸のN-アセチルに対応するシグナルを積分することによって、NMR(特に1H又は必要であれば2D)を使用して決定される。
したがって、本発明によると、生成物は、好ましくは、約15%未満、又は更には約10%、9%、8%、7%、6%、5.5%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%若しくは0.5%以下の修飾度(MoD)を有する。具体的な実施形態によると、本発明の生成物は、約10%未満、有利には約0.5%～約6%の間の修飾度(MoD)を有する。
注目すべきことに、Fの所与の値について、得られる生成物は、特に低い修飾度を有する。したがって、本発明の生成物は、上記のように測定される線形圧縮に抵抗する強度(F)とパーセンテージとして表される修飾度(MoD)との間の比の絶対値に対応する値F/MoDによって特徴付けることができる。
有利には、この比は、約0.15超、約0.16、0.17、0.18、0.19又は0.2以上、更には約0.3、0.4、0.5、0.6、0.7又は0.8以上である。更に、この比は、約0.9、又は更には約1の値に達し得る。換言すれば、約1%の修飾度(MoD)については、(上で測定される)線形圧縮に抵抗する強度が約0.2N超となるだろう。
更に、少なくとも一部の実施形態では、本発明の注入型生成物が、おそらく低温で実施される架橋工程中のポリマー鎖の保存に起因して、温度に特に耐性である。実際、実験節で実証されるように、これらは、80℃の温度で数日間にさらされた場合、良好なレオロジー特性を依然として保持する。結果として、本発明の注入型生成物は、より明確にするために、係数G'の保存率によって表されるこのパラメータによって特徴付けられ得る。
本発明の文脈において、「係数G'の保存率」は、生成物を80℃で96時間貯蔵した後に測定された係数G'(Pa)の、有利には室温(例えば、25℃)で測定された、時間t0で、すなわち温度を上昇させる前に測定された係数G'(Pa)に対する比×100に対応する。
好ましくは、本発明の注入型生成物は、約25%、26%又は更には27%超、有利には約28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%又は更には60%以上の係数G'の保存率を有する。
換言すれば、本発明は、有利には室温(例えば、25℃)で測定された、80℃で96時間貯蔵した後に測定された係数G'についての値が、その初期値G'の27%超又は更には28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%若しくは60%以上である、植込み型又は注入型生成物、有利にはヒアルロン酸をベースとする生成物に関する。
別の実施形態によると、所与の初期G'値について、本発明の生成物は、本発明の方法を使用して調製されていない利用可能な生成物よりも高温に耐える。換言すれば、G'の所与の値について、本発明の生成物の保存率は、先行技術に従って調製された生成物の保存率よりも高くなる。
「強制熱分解」試験として知られるこの試験を使用して、
- より低い温度であるがより長い期間にわたってさらされる本発明の生成物の物理化学的挙動を外挿することができる。時間/温度等価性のために加速老化が行われる。したがって、数か月にわたって、37℃の人体内の生成物の耐久性と比較することができる。
- 調製方法、特に熱処理による滅菌に関連する可能性のある熱分解に対する、本発明による生成物の耐性を評価することができる。
- より低い温度であるがより長い期間にわたってさらされる本発明の生成物の物理化学的挙動を外挿することができる。時間/温度等価性のために加速老化が行われる。したがって、数か月にわたって、37℃の人体内の生成物の耐久性と比較することができる。
- 調製方法、特に熱処理による滅菌に関連する可能性のある熱分解に対する、本発明による生成物の耐性を評価することができる。
本発明の別の態様は、本発明の枠で得られた生成物に存在するポリマーネットワーク、とりわけ架橋ヒアルロン酸のネットワークのサイズに関係している。
既に述べたように、架橋反応は、高分子ヒアルロン酸のネットワークの形成を可能にする。ポリマーが長いほど及び/又は分岐しているほど、ネットワークのサイズが大きくなる。このようにして得られた架橋ポリマーのネットワークのサイズは、特に想定される用途を考慮すると重要である。実際、100μmと評価されるある特定のサイズ未満では、ヒアルロン酸の断片は充填効果を有さないと想定される。その上、既に述べたように、ヒアルロン酸の断片は、関節内補充薬として使用するのに適していない。更に、ポリマーの小型ネットワーク(「可溶性HA」に対応する)は、生物内でより迅速に溶解され、したがって、分解される。したがって、大量の大型ポリマーネットワークを含む充填又は潤滑生成物は、より優れた性能を発揮し、より長く持続するだろう。
このパラメータの評価は、特に、水を用いて試料(ゲル)の抽出を行い、次いで、ゲルの水中懸濁液を、約100μmの平均細孔直径を有する細孔を有する膜(フィルタ、ふるい)に通すことからなる試験によって行われ得る。行われ得る実験プロトコルに関する詳細は、以下の「実施例」節に示される。
例えば、小型ポリマーネットワーク(約100μm未満)の形態のヒアルロン酸は、遊離HA及び/又は生成物に添加されたリドカインと同様に、膜を通過し、液体水性相に位置する。これらの様々な量(ポリマーの小型ネットワークの形態の架橋HAに対応する抽出されたHA、遊離HA及び/又はリドカイン)は、この相に存在する有機炭素の総量(TOC)を測定することによって評価される。このことから、次いで、抽出されたHAの量を、以下の式を使用して推定することができる:
(式中、
- [TOC]合計:抽出されたアッセイの総TOC含有量(mg/l)
- 401.3:HAの分子量(g/mol)
- 168.2:HA中の炭素の分子量(g/mol)
- Q合計:総抽出量(g)=試料+水
- PE:試料サイズ=ゲル(g)
- [TOC]リドカイン:以下の式を使用して計算される、抽出されたアッセイ中のリドカインのTOC含有量(リドカインを添加していない場合=0):
- [TOC]合計:抽出されたアッセイの総TOC含有量(mg/l)
- 401.3:HAの分子量(g/mol)
- 168.2:HA中の炭素の分子量(g/mol)
- Q合計:総抽出量(g)=試料+水
- PE:試料サイズ=ゲル(g)
- [TOC]リドカイン:以下の式を使用して計算される、抽出されたアッセイ中のリドカインのTOC含有量(リドカインを添加していない場合=0):
(式中、
- 168.2:リドカインHCl中の炭素の分子量(g/mol)
- 270.5:リドカインHClの分子量(g/mol)
- [リドカイン]抽出物:HPLCによって決定される、抽出物中のリドカインHClの濃度(mg/ml)))。
- 168.2:リドカインHCl中の炭素の分子量(g/mol)
- 270.5:リドカインHClの分子量(g/mol)
- [リドカイン]抽出物:HPLCによって決定される、抽出物中のリドカインHClの濃度(mg/ml)))。
このことから、試験生成物中に存在する総架橋ヒアルロン酸に対する約100μm未満のサイズの架橋ポリマーのネットワークの形態のヒアルロン酸(「HA可溶性」)の割合を、以下の式を使用して推定することができる:
(式中、
- HA抽出物:前の段落に従って計算される
- [HA]合計:重量測定によって決定される、ゲル中の総HA含有量(mg/g))。
- HA抽出物:前の段落に従って計算される
- [HA]合計:重量測定によって決定される、ゲル中の総HA含有量(mg/g))。
したがって、実験節の結果によって支持されるように、本発明の生成物は、それらが含有する架橋ヒアルロン酸の極めて大部分が、約100μm超のサイズのポリマーネットワークの形態であることを特徴とする。実際には、より明確にするために、この特徴は、約100μm未満のサイズのポリマーネットワークに存在するヒアルロン酸と生成物中に存在する総架橋ヒアルロン酸との間の比によって示される。当業者であれば、彼らの一般的な知識、計算のために上に示される式を考慮して、及び例えば、実験節に記載される試験に基づいて、この比を測定することに困難を感じないであろう。
本発明の枠で使用される「約100μm未満のサイズのポリマーネットワークに存在するヒアルロン酸」という用語は、ポリマーネットワークの形態で存在するヒアルロン酸のみを示し、したがって、遊離ヒアルロン酸、すなわち、注入型生成物に添加されるヒアルロン酸の非架橋鎖を含まない。
好ましくは、本発明の生成物は、約20%未満、有利には約19%、18%、17%、16%、15%、10%以下、又は更には約5%以下の、架橋ヒアルロン酸の総量に対する約100μm未満のサイズのポリマーネットワークの形態のヒアルロン酸の量を有する。
したがって、有利には、本発明の植込み型又は注入型生成物は、約100μm未満のサイズのポリマーネットワークの形態で存在する架橋ヒアルロン酸の割合が、約16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%以下又は更には約9%、8%、7%、6%以下又は更には約5%以下である。
換言すれば、G'の所与の値について、約100μm未満のサイズのポリマーネットワークの形態で存在する架橋ヒアルロン酸の割合は、先行技術に従って調製された生成物のその割合より少ないだろう。
本発明による生成物は、シリンジ等の皮内注入に適したデバイスに、有利には無菌形態で導入され得る。したがって、本発明はまた、少なくとも1つの本発明による生成物と、おそらく皮内注入に適したデバイスとを含むキットに関係している。
別の態様によると、本発明は、これらの生成物の使用、特にそれらの美容用途及び治療用途に関する使用に関係している。
したがって、第1の態様によると、本発明は、予防及び/又は処置、有利には、皮膚欠陥、特にしわ及び小じわ又は瘢痕の充填のための本発明の生成物の使用に関係している。これらの欠陥は、顔だけでなく、身体の他の部分にも関係し得る。
これらの用途は、美容外科の分野と形成外科の分野の両方に関連している。
これらの用途では、本発明の生成物は、様々な方法で、様々な経路によって、特に皮内、皮下組織(hypodermically)、皮下(subcutaneously)、又は唇の粘膜内に投与され得る。
これらは、非限定的にここに列挙される様々な種類の適応症に推奨され得る:
- ボリューム修正;
- 表面修正(瘢痕等);
- 表面の小じわの修正;
- 中程度～深いしわの修正;
- 目の輪郭線(くま、ひだ等)の修正;
- 唇のボリュームの増加;
- 口周囲のしわの修正;
- プロテーゼの代替としての豊胸;
- 尻のスカルプチャー(sculpture)。
- ボリューム修正;
- 表面修正(瘢痕等);
- 表面の小じわの修正;
- 中程度～深いしわの修正;
- 目の輪郭線(くま、ひだ等)の修正;
- 唇のボリュームの増加;
- 口周囲のしわの修正;
- プロテーゼの代替としての豊胸;
- 尻のスカルプチャー(sculpture)。
特に、その線形圧縮に抵抗する強度に関する、投与される生成物の特徴、並びに投与経路は、特に想定される適応症に照らして、当業者によって決定され得る。
更に、本発明による生成物は、例えば、治療分野における用途を有する。
別の態様によると、本発明は、関節障害、特に変形性関節症の予防及び/又は処置のためのこのような生成物の使用に関係している。この文脈では、生成物は、潤滑剤としての役割において内因性ヒアルロン酸を補充し、関節内補充薬と呼ばれる。
本発明の生成物は、例えば、圧力をかけるために、又は組織を離間させるために、空洞の充填又は体積の生成を必要とする他の用途を有し得る。耳鼻咽喉科の分野、特に声帯の修復、又は泌尿器科若しくは眼科を挙げることができる。別の用途は、特に例えば放射線療法による、放射線を使用したがん処置の場合の、臓器を隔離するためのこのタイプの生成物の使用に関係している。したがって、本発明の生成物は、結腸直腸がんの処置の場合に、前立腺と直腸との間に植え込まれ得る、又は注入され得る。これらの用途の全てにおいて、本発明による生成物は組織スペーサーとして使用される。
本発明の目的のために、より簡潔な説明を提供するために、本明細書に示される定量的表現の一部は、「約」という用語で修飾されないことに留意すべきである。しかしながら、「約」という用語が明示的に使用されるか否かにかかわらず、全ての数字は、明示的に記載されているか否かにかかわらず、「約」という用語によって修正されるものとして理解されるべきであることが理解される。同様に、「約1%～10%」の示される範囲は、1%終点と10%終点の両方を修飾する「約」という用語を有することを意図している。
特に明示的に示されない限り、工程は、限定されないが、任意の順序で実施され得る。
本発明及びそこから生じる利点は、ヒアルロン酸(HA)に関するが、いかなる方法でも範囲を限定するものではない以下の例示的な実施形態からより明確になるだろう。
I-発明の方法及び生成物
(実施例1)
生成物の調製
注入型生成物を、以下のTable 1(表1)に示される反応混合物から調製した:
生成物の調製
注入型生成物を、以下のTable 1(表1)に示される反応混合物から調製した:
調製方法は以下の通りであった:
Table 1(表1)に示される濃度を得るために必要な、平均分子量1.5MDa(1.5×106Da)のヒアルロン酸ナトリウム(NaHA)繊維の塊を秤量し、容器に入れた。
Table 1(表1)に示される濃度を得るために必要な、平均分子量1.5MDa(1.5×106Da)のヒアルロン酸ナトリウム(NaHA)繊維の塊を秤量し、容器に入れた。
Table 1(表1)に示される比を得るために必要な濃度の蒸留水、水酸化ナトリウム及び1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE、CAS番号:2425-79-8)で構成される架橋剤の溶液をNaHA繊維に添加した。
混合物を均質化した。
反応媒体を混合したら、容器を0℃～10℃の範囲の温度の冷蔵容器に数日間入れた。
この工程の最後に、ゲルが得られた。
生理学的pH(6～8の範囲)で、所望の濃度のヒアルロン酸を得るために、このようにして得られたゲルを水和させた。水和浴は、リン酸緩衝液及び1N塩酸で構成された。割合は、架橋中のHAの濃度及び得られる濃度の関数として適合させた。ゲルを細かく切断し、次いで、水和浴に導入した。
次いで、この水和ゲルを、残留架橋剤を除去するために、リン酸緩衝液で洗浄することによって精製した。
平均分子量1.5MDaの遊離ヒアルロン酸ナトリウム(すなわち、架橋されていない)を、遊離HAの所望の最終濃度の関数として、精製ゲルに添加した(以下のTable 2(表2)参照)。
ゲル中3mg/gのリドカインの最終濃度を得るために、リドカインの10%(w/w)溶液を注入型生成物に添加した。
リン酸緩衝液を添加することによって、架橋HAの濃度を調整した(以下のTable 2(表2)参照)。
混合物を脱気した。
脱気が完了したら、シリンジを充填し、次いで、滅菌した。
得られた注入型生成物は、以下のTable 2(表2)に記載される:
(実施例2)
得られた生成物の機械的特性及びレオロジー特性
実施例1で調製された生成物の係数G'、線形圧縮に抵抗する強度(F)及び修飾度(MoD)を測定した。
得られた生成物の機械的特性及びレオロジー特性
実施例1で調製された生成物の係数G'、線形圧縮に抵抗する強度(F)及び修飾度(MoD)を測定した。
室温(25℃)で、250μmのギャップを有する、40mmプレート/プレート形状を使用して、Kinexus Proレオメータを用いて、係数G'を決定した。試料のレオロジー記憶を消去するために、前せん断及び休止期間を試料に適用し、次いで、1Hzの固定周波数で、振幅スイープによって線形粘弾性領域を決定した。応力と変位が線形関係にある線形粘弾性領域で得られた曲線から係数G'を決定した。
室温(25℃)で、0.1mm/秒の速度で2.5mmから0.9mmまで変化するギャップを有する20mmプレート/プレート形状を有するレオメータを用いて、線形圧縮に抵抗する強度(F)を決定した。
Kenneらの方法(Carbohydrate Polymers;91(1):410～4182、2013)を使用して、修飾度(MoD)を決定した。手短に言えば、分析する生成物を塩化ナトリウム溶液で洗浄し、次いで、0.22μmフィルタを使用して真空下で濾過した後、37℃で一晩、コンドロイチナーゼACで消化した。各シグナルを担うプロトンの数を補正した後、架橋剤の残基に対応するシグナル及びN-アセチルヒアルロン酸に対応するシグナルを積分して、2D NMRによって、ヒアルロン酸の分子に結合した架橋剤のモル数及び有効に架橋されたヒアルロン酸のモル数を決定した。
得られた結果を以下のTable 3(表3)に示す:
(実施例3)
得られた生成物の熱安定性
得られた注入型生成物の熱安定性を推定するために、上記のゲルA及びゲルBを短期間高温にさらした。
得られた生成物の熱安定性
得られた注入型生成物の熱安定性を推定するために、上記のゲルA及びゲルBを短期間高温にさらした。
手短に言えば、分析する生成物の試料を、数日間、例えば、1、2、3又は4日間、80℃で置いた。その後、試料を取り出し、次いで、室温に冷却するまで室温で置いた。室温になったら、実施例2に記載される方法に従って、弾性係数G'を測定した。
得られた結果を以下のTable 4(表4)に示す:
(実施例4)
得られた生成物のインビボ性能の推定
水中で試料を抽出し、100μmふるいで濾過した後に、得られたHAゲルの架橋画分中の可溶性ヒアルロン酸ナトリウム(HA可溶性)の割合を推定した。実際、このサイズ未満では、架橋されているかどうかにかかわらず、HAは充填効果を有さず、生物中で急速に分解されると想定された。
得られた生成物のインビボ性能の推定
水中で試料を抽出し、100μmふるいで濾過した後に、得られたHAゲルの架橋画分中の可溶性ヒアルロン酸ナトリウム(HA可溶性)の割合を推定した。実際、このサイズ未満では、架橋されているかどうかにかかわらず、HAは充填効果を有さず、生物中で急速に分解されると想定された。
総有機炭素(TOC)をアッセイした後、計算によってHA可溶性を決定した。
得られた生成物がリドカインを含有していた場合、試験試料中に存在するリドカインをアッセイすることによって、リドカインによって提供されるTOCを考慮に入れた。
充填のためではなく、注入を容易にするために得られた生成物に遊離HAを添加した場合、生成物に添加された遊離HAの量を抽出されたHAから差し引いた。
抽出プロトコル:
手短に言えば、1グラムの分析する生成物(試料)を100gの精製水と混合した。混合物を室温で数時間攪拌した。
手短に言えば、1グラムの分析する生成物(試料)を100gの精製水と混合した。混合物を室温で数時間攪拌した。
濾過プロトコル:
次いで、混合物を、平均直径が100μmの細孔を有する布で濾過した。
次いで、混合物を、平均直径が100μmの細孔を有する布で濾過した。
生成物から抽出されたHAの計算:
a-リドカインのTOC含有量:
a-リドカインのTOC含有量:
(式中、
- 168.2:リドカインHCl中の炭素の分子量(g/mol)
- 270.5:リドカインHClの分子量(g/mol)
- [リドカイン]抽出物:HPLCによって決定される、試料中のリドカインHClの濃度(mg/ml))。
- 168.2:リドカインHCl中の炭素の分子量(g/mol)
- 270.5:リドカインHClの分子量(g/mol)
- [リドカイン]抽出物:HPLCによって決定される、試料中のリドカインHClの濃度(mg/ml))。
b-得られた生成物の抽出されたHA(mg/g)
得られた液相中に存在する総有機炭素(TOC)の量(以下、「HA抽出物」)を測定した:
得られた液相中に存在する総有機炭素(TOC)の量(以下、「HA抽出物」)を測定した:
(式中、
- [TOC]合計:試験試料中の総TOC(mg/l)
- [TOC]リドカイン:試料中のアッセイされたリドカイン中のTOC含有量(上記のa.参照)
- 401.3:HAの分子量(g/mol)
- 168.2:HA中の炭素の分子量(g/mol)
- Q合計:総抽出量(試料+水)
- PE:試料サイズ(g))。
- [TOC]合計:試験試料中の総TOC(mg/l)
- [TOC]リドカイン:試料中のアッセイされたリドカイン中のTOC含有量(上記のa.参照)
- 401.3:HAの分子量(g/mol)
- 168.2:HA中の炭素の分子量(g/mol)
- Q合計:総抽出量(試料+水)
- PE:試料サイズ(g))。
c.得られた生成物中のHAの%としての可溶性HA
(式中、
- HA抽出物:上記のb.参照
- [HA]合計:重量測定によって決定される、試料中の総HA含有量(mg/g))。
- HA抽出物:上記のb.参照
- [HA]合計:重量測定によって決定される、試料中の総HA含有量(mg/g))。
得られた結果を以下のTable 5(表5)に示す:
得られた生成物中で可溶性であるとされるHA(100μm未満のサイズのポリマーのネットワークの形態)の量が低いことが分かる。結果として、本発明の生成物では、架橋ヒアルロン酸の鎖の大部分が、ポリマーの大型ネットワークの形態であるので、結果として有効な充填及び長期持続性の性能が得られる。
II-本発明の生成物と市販品の比較
本発明の方法によって得られた生成物の特徴を、高温(50℃)でBDDEにより架橋されることが知られている市販品と比較した。データを以下のTable 6(表6)に示す:
本発明の方法によって得られた生成物の特徴を、高温(50℃)でBDDEにより架橋されることが知られている市販品と比較した。データを以下のTable 6(表6)に示す:
III-フィラーとしての本発明の生成物の有効性
前向き多施設臨床研究を開始して病理学的顔面脂肪萎縮症の処置における本発明による生成物の安全性及び有効性を評価した。
前向き多施設臨床研究を開始して病理学的顔面脂肪萎縮症の処置における本発明による生成物の安全性及び有効性を評価した。
実施例のパートIに開示される、Bが大部分である生成物Aと生成物Bの両方を、中顔面増強による顔面脂肪萎縮症の矯正のために、患者に14日間隔で2回のセッション(Bについては総量7ml、Aについては2ml)で注入した。患者を最長12か月間追跡した。グローバル審美性改善尺度(Global Aesthetic Improvement Scale)、GAISを用いて結果を評価した。
この研究は、12か月後でさえ、患者の100%が依然として処置に対するレスポンダーであることを実証することを可能にした。
Claims (19)
- 架橋ポリマーを含有する生成物を調製する方法であって、架橋工程が、0℃超及び10℃未満、有利には1℃～9℃の間の温度で、前記ポリマー又はその生理学的に許容される塩のうちの1種を、少なくとも2つのエポキシ官能基を有する架橋剤と共に反応混合物中でインキュベートすることからなる、方法。
- 前記ポリマーが、グリコサミノグリカン群、有利にはヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムから選択される、請求項1に記載の方法。
- 架橋剤が、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、又はテトラエチレングリコールジグリシジルエーテルから選択され、有利にはBDDEである、請求項1又は2に記載の方法。
- 架橋工程が、少なくとも48時間、有利には少なくとも7日間の期間行われる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋剤と前記ポリマーの二糖単位との間のモル比が10%以下、及び有利には0.5%以上である、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋工程の最後に、前記反応混合物が以下の処理:中和、希釈、精製、滅菌のうちの少なくとも1つを受ける、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の方法によって得られる植込み型又は注入型生成物、有利にはヒアルロン酸をベースとする生成物。
- - 10%未満、有利には0.5%～6%の間の修飾度(MoD);及び
- 20mmプレート/プレート形状及び0.1mm/秒の速度で2.5mmから0.9mmまで変化するギャップを有するレオメータを使用して25℃で圧縮した場合、0.2N～1.2Nの間、又は更には0.35N～1Nの間の線形圧縮に抵抗する強度(F)
を有する、請求項7に記載の生成物。 - 0.15超の比F/MoDを有する、植込み型若しくは注入型生成物又は請求項8に記載の生成物。
- 80℃で96時間の貯蔵後に測定された係数G'についての値が、初期G'値の27%超、更には30%、40%、50%又は60%以上である、植込み型若しくは注入型生成物又は請求項7から9のいずれか一項に記載の生成物。
- 100μm未満のサイズのネットワークの形態で存在する架橋ヒアルロン酸の割合が20%、15%、10%未満又は更には5%未満である、植込み型若しくは注入型生成物又は請求項7から10のいずれか一項に記載の生成物。
- 1～40mg/g(生成物)、有利には10～25mg/g(生成物)に相当する架橋ヒアルロン酸を含有する、請求項7から11のいずれか一項に記載の生成物。
- 有利には0.5～5mg/g(生成物)、より有利には1～3mg/g(生成物)に相当する非修飾ヒアルロン酸を含有する、請求項7から12のいずれか一項に記載の生成物。
- 麻酔薬、有利にはリドカインを更に含む、請求項7から13のいずれか一項に記載の生成物。
- 請求項7から14のいずれか一項に記載の生成物を含むキット又はシリンジ。
- 皮膚欠陥、例えば小じわ、しわ及び瘢痕を予防又は処置する方法であって、請求項7から14のいずれか一項に記載の生成物を投与する工程を含む、方法。
- 前記生成物が皮内、皮下組織(hypodermically)又は皮下(subcutaneously)に投与される、請求項16に記載の方法。
- 関節障害、有利には変形性関節症を予防又は処置する方法であって、請求項7から14のいずれか一項に記載の生成物を投与する工程を含む、方法。
- 組織スペーサーとしての、請求項7から14のいずれか一項に記載の生成物の使用。
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