TWI789338B - 原位可交聯的多醣組合物之用途、關聯於其之多筒注射系統、用於形成原位可交聯的多醣組合物之衍生物之組合及用於形成原位可交聯的多醣組合物之套組 - Google Patents

原位可交聯的多醣組合物之用途、關聯於其之多筒注射系統、用於形成原位可交聯的多醣組合物之衍生物之組合及用於形成原位可交聯的多醣組合物之套組 Download PDF

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Abstract

本發明係有關於一種滅菌之原位可交聯的多醣組合物，於各種美容和醫療應用中用以擴大、填充或取代軟組織。組合物係包括一第一多醣衍生物係以一親核性基團官能化，和一第二多醣衍生物係以一親電性基團官能化。將其共同注射(co-injection)至一患者的身體後，親核性官能基團和親電性官能基團可自發性的原位形成共價鍵結，而於共同注射位置形成一交聯之水凝膠。

Description

原位可交聯的多醣組合物之用途、關聯於其之 多筒注射系統、用於形成原位可交聯的多醣組合物之衍生物之組合及用於形成原位可交聯的多醣組合物之套組
本發明是有關於一種使用於各種美容和醫療應用中之一種滅菌的可交聯的多醣組合物，以擴大、填充或取代軟組織。組合物係包括一第一多醣衍生物(first polysaccharide derivative)係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，和一第二多醣衍生物(second polysaccharide derivative)係以一親電性基團(electrophilic group)官能化。其中將其共同注射(co-injection)至一患者的身體後，親核性官能基團和親電性官能基團可自發性的形成原位共價鍵結(in situ covalent linkages)，以於共同注射位置形成一交聯之水凝膠(cross-linked hydrogel)。
可注射填充物目前用於許多醫療和化妝品應用中以 增加軟組織的體積。在美容醫學中，皮膚填充物越來越多地用於臉部和身體選定區域的修復。它們允許加強臉部特徵(例如，臉頰和嘴唇)，減少皺紋(例如鼻唇褶皺)和折痕，並且可以恢復隨著老化而發生的皮膚和下層組織的一些損失體積和彈性。這使得皮膚看起來更光滑和更豐滿，因而提供更年輕的外觀。
有許多種已知的材料可做為軟組織填充物。大部分的這些材料由於會在體內被吸收(例如膠原、透明質酸(HA)、羥基磷灰石鈣(CaHA)和聚L-乳酸(PLLA))，因而只具有暫時性的效果(約三個月至十八個月)。還有少數幾種永久性的(即不可吸收)填充劑，例如基於聚甲基丙烯酸甲酯珠(PMMA微球)的FDA許可之填充材料。一些軟組織填充劑還含有利多卡因(局部麻醉劑)，其目的在於減少與注射相關的疼痛或不適。
時至今日，世界上軟組織填充劑中最常用的材料是透明質酸(HA)，這是由於其創造體積和有利的安全性能的優異能力所致。HA是一種天然存在的糖胺聚醣(naturally occurring glycosaminogly)，可存在於例如真皮的細胞外基質中，並且由β-D-(1→3)葡萄醣醛酸(GlcUA)和β-D-(1→4)-N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)組成。在凝膠形式時，HA能夠與水結合並膨脹，造成平滑/填充效果。在大多數情況下，用於皮膚充填物的HA是交聯的，以使其在體內可持續維持更長時間(約六個月至十八個月)。
Figure 105133103-A0305-02-0005-1
用來將多醣(例如HA)分子的聚合物鏈共價結合在一起以形成具有分子間和分子內交聯的一填充材料基質(a filler material matrix)的各種交聯方法是本領域已知的。廣泛使用的一種方法是用化學試劑進行化學交聯(chemical crosslinking)。這些試劑通常會與多醣的羥基和/或羧基官能基反應。常用的交聯劑包括，但不限制於，二乙烯基碸(DVS，divinylsulfone)、二官能或多官能環氧化物(例如1,4-丁二醇二縮水甘油醚，1,4-butanediol diglycidyl ether(BDDE))、1,2-雙(2,3-環氧丙氧基)乙烯(EGDGE)和1,2,7,8二環氧辛烷(DEO))、PEG基質之交聯劑(例如季戊四醇四縮水甘油醚(PETGE))，雙碳二亞胺(BCDI)(例如亞苯基雙-(乙基)-碳二亞胺，和1,6-六亞甲基雙(乙基碳二亞胺))、二胺或多胺交聯劑(例如六亞甲基二胺(HMDA)和3-[3-(3-氨基丙氧基)-2,2-雙(3-氨基-丙氧基甲基)-丙氧基]-丙胺(4 AA))、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS)、1-(2,3-環氧丙基)-2,3-環氧環己烷、環氧氯丙烷、醛(例如甲醛和戊二醛)、醯肼(雙-、三-和多價醯肼化合物，例如己二酸二醯肼(ADH))。
已經應用於使可注射多醣水凝膠產生交聯的其他方法還包括有甲基丙烯酸化聚合物的光化學交聯(Möller等人，Int.J.Artif.Organs 2011,34：93-102)，邁克爾加成交聯(Michael addition cross-linking)(Shu等人，Biomacromolecules 2002,3：1304-1311)，席夫鹼反應交聯(Schiff-base reaction cross-linking)(Tan等人，Biomaterials 2009,30：2499-2506)，使用例如硫醇烯的反應(thiol-ene reaction)或是疊氮化物-炔類的環化加成反應(azide-alkyne cycloaddition)(Hoyle等人，Chem.Soc.Rev.2010,39：1355-1387；van Dijk等人，Bioconjug.Chem.2009,20：2001-2016)之"點擊"化學方法("click" chemistry approaches)。用來增加擴大軟組織的多醣基質之光交聯填充物也是本領域已知的(請參見例如專利US 2011/069475)。此外，酸多醣的羧基官能團與相同或不同多醣分子之羥基的酯化，因而形成“內”分子間和/或分子內酯基交聯(稱為"自交聯聚合物"或"ACP")也已經被此領域者所研究。此外，專利US 2006/0084759描述了酪胺修飾的和交聯的HA水凝膠材料，其中通過可在活體內(in vivo)進行的過氧化物酶介導的二酪胺鍵可達成交聯。
然而，傳統的預先形成水凝膠通常具有以下缺點：它們太粘稠而無法通過細針頭注射。因此，研究者已投注許多努力來發展出適合於不同應用的原位膠凝之水凝膠組合物。這些組合物以一液體形式而不是以預先形成的一凝膠形式注射到組織中。例如，專利WO 95/15168描述了通過使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)偶聯化學來合成HA醯肼衍生物。醯肼-HA可以與同型或異型雙官能或Traut交聯劑(Traut’s cross-linking agents)交聯以形成用於藥物遞送的水凝膠。專利WO 00/016818揭露了通過將HA(例如己二酸二醯肼-HA)的醛官能化或胺官能化的衍生物與均-或異雙官能(homo-or heterobifunctional)交聯劑(例如，雙官能N-羥基琥珀醯亞胺酯交聯劑如(SPA)1-PEG))交聯而原位形成水凝膠。
此外，專利WO 01/40314揭露了一種水凝膠組合物，其包含氧化多醣，例如具有醛基的藻酸鹽聚合物(PAG)和至少一種在水凝膠系統中具有兩個或更多個官能基能夠可逆交聯多醣的交聯劑，例如己二酸二醯肼(ADH)交聯劑。再者，專利WO 2011/100469揭露了用作玻璃體替代生物材料(vitreous substitute biomaterial)的一種交聯HA水凝膠，其通過使具有氧化的HA醛官能基(oxi-HA)與二醯肼交聯劑(例如己二酸二醯肼(ADH))反應進行製備。
此外，專利WO 2009/108100揭露了一種HA基質之水凝膠以混合醛基修飾之HA和醯肼基修飾之聚乙烯醇(PVAH)交聯劑而原位製備，以形成一交聯結構其具有許多羥基。專利WO 2011/069475揭露了一種使用TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶氧基)/共同氧化劑系統氧化葡糖胺重複單元的C6上的伯羥基來製備含有醛基的醛-HA衍生物的方法，藉由與二胺化合物(例如己二胺)或胺-HA(例如己二胺取代的HA)反應，前述醛-HA衍生物係用於製備交聯的HA水凝膠。
Dahlmann等人(Biomaterials 2013,34：940-951)揭露了完全定義的原位可交聯藻酸鹽和HA水凝膠的心肌組織工程(myocardial tissue engineering)。水凝膠的製備是藉由使醛和醯肼官能化的藻酸鹽和HA在人類I型膠原和新生大鼠心臟細胞(neonatal rat heart cells，NRHC)的存在下反應，以產生一腙交聯的基於水凝膠的生物人工心臟組織(hydrazone cross-linked hydrogel-based bioartificial cardiac tissue)。
Ossipov等人(Biomacromolecules 2010,11：2247-2254)揭露了醯肼官能化HA的合成，其使用具有中心二價保護基團的特定對稱雙官能試劑，且中心二價保護基團可與HA在水溶液中的羧酸酯殘基進行醯胺型反應，以合成醯肼官能化HA。將醯肼官能化的HA與醛HA衍生物混合，可用以原位形成一腙HA水凝膠。所形成之水凝膠係適合用來作為組織工程應用的一生長因子輸送載體(a growth factor delivery vehicle)。
Varghese等人(J.Am.Chem.Soc.2009,131：8781-8783)報導了用醯肼基團和能夠共價結合二磷酸鹽(bisphosphonate，BP；抗破骨和抗腫瘤小分子藥物)的氨基亞甲基雙磷酸鹽基團雙重官能化的HA衍生物。所述雙官能化HA與醛官能化HA的混合可導致原位形成之一可注射HA水凝膠，用以控制BP藥物在植入位置的釋放。
Oommen等人(Adv.Funct.Mater 2013,323：1273-1280)揭露了一種HA水凝膠，其製備方式是藉由混合一HA-醛衍生物與碳二醯肼(carbodihydrazide，CDH)官能化的HA衍生物以獲得具有腙鍵的HA水凝膠。並且進一步描述了在一治療性蛋白質(例如，重組人類生長因子BMP-2)存在下的原位HA水凝膠之形成，提供了能夠輸送用於骨頭組織再生的生長因子的活體內應用的水凝膠。
對於許多臨床應用，原位可交聯之多醣水凝膠是值得擁有的，因為它們甚至可以通過細針容易地注射，此有助於更佳地控制注射速率並改善注射器的操作。此外，原位可交聯之多 醣水凝膠可以形成任何複雜的形狀，然後隨即交聯，且容易與生物活性劑和/或細胞混合，並在凝膠形成期間附著在給定的組織上。
然而，現有的原位可交聯之水凝膠組合物並不令人滿意，因為它們沒有表現出預期目的所需或所要求的一或多種性質。通常，一原位可交聯之水凝膠組合物應該是生物相容的(biocompatible)，非免疫原性的(non-immunogenic)，非發炎性的(non-inflammatory)和安全的。它不應該與周圍組織的生物成分發生反應，也不應該產生有害的副產物，並且在投藥後可有效地交聯。此外，它應該是生物可降解的(bio-degradable)但同時又能提供足夠長時間的體內持久性。此外，並且重要的是，原位可交聯之水凝膠應能通過一細針注射，此需要注射的原位可交聯之水凝膠組合物具有足夠低的粘度。
發明目的
鑑於上述，本發明的目的是提供一種原位可交聯之組合物，其可以容易地通過細針頭擠出，並且在施打後原位形成具有所需性質的一交聯水凝膠(例如，機械、化學、流變、生物和免疫性質)，以在各種化妝品和醫療應用中擴大，填充或取代軟組織。
上述目的可藉由提供兩種官能化多醣衍生物而達成，將其注射至一患者的身體後(i.e.體內(in vivo)注射之情況)係自發性的形成共價交聯。因此形成的原位交聯之多醣網體係以水凝膠形式以作為一軟組織填充物(soft tissue filler)，例如一皮膚填充物 (dermal filler)。本揭露之原位可交聯的多醣組合物的優點在於此兩種官能化多醣衍生物可用液態型式共同注射，因而使共同注射時具低擠出力(extrusion forces)即使是通過細的針頭亦是如此。而且如期待的，此形成之原位水凝膠並沒有產生任何有害支副產物。水是僅有的副產物且很容易就被形成的水凝膠或周圍組織所吸收。再者，此原位形成之水凝膠在組織整合(tissue integration)、皮膚改善、組織塑型能力(tissue shaping capacity)和豐盈能力(volumizing ability)方面具有符合需求之性質。
根據第一方面，本揭露係關於一種使用第一多醣衍生物和一第二多醣衍生物以原位形成一交聯之水凝膠於美容應用之用途，其中第一多醣衍生物係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，第二多醣衍生物係以一親電性基團(electrophilic group)官能化，且第一多醣衍生物和第二多醣衍生物都是滅菌的，其中將第一多醣衍生物和第二多醣衍生物共同注射至一患者身體的一目標位置後，親核性基團和親電性基團可原位形成一共價鍵，造成於目標位置形成交聯之水凝膠。
根據另一方面，本揭露提出一第一多醣衍生物較佳地存在於一第一前驅溶液，一第二多醣衍生物較佳地存在於一第二前驅溶液，如文中定義係用以原位形成一交聯之水凝膠以使用於醫療應用(therapeutic applications)中。醫療上的應用或適應症係包括，但不限制於，壓力性尿失禁(stress urinary incontinence)、陰道乾澀(vaginal dryness)、膀胱輸尿管逆流(vesico-ureteral reflux)、聲帶褶不足(vocal fold insufficiency)和聲帶褶內移(vocal fold medialization)之處理。
根據又一方面，本揭露提出一種包括如文中所述之第一透明質酸衍生物(first hyaluronic acid(HA)derivative)和第二透明質酸衍生物(second hyaluronic acid(HA)derivative)之組合，其形式較佳地是包括第一透明質酸衍生物的第一前驅溶液(first precursor solution)，和包括第二透明質酸衍生物的第二前驅溶液(second precursor solution)。
根據再一方面，本揭露提出一種多筒注射系統(a multi-barrel syringe system)，其預先填充至少(a)包括如文中所述之第一多醣衍生物的一第一前驅溶液於一注射筒中，以及(b)包括如文中所述之第二多醣衍生物的第二前驅溶液於另一注射筒中。
又另一方面，本揭露提出一套組(kit)用於原位形成一交聯之多醣水凝膠，包括(i)一第一容器包括如上述之第一前驅溶液，和(ii)一第二容器包括如上述之該第二前驅溶液；以及選擇性地包括(iii)使用說明(instructions for use)。
再另一方面，本揭露提出一種於美容或醫療應用中原位形成一交聯之水凝膠之方法，包括步驟：分開提供具一第一多醣衍生物之一第一前驅溶液以及具一第二多醣衍生物之一第二前驅溶液，其中第一多醣衍生物係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，第二多醣衍生物係以一親電性基團(electrophilic group)官能化，且第一前驅溶液和第二前驅溶液都經過滅菌；混合第一前驅溶液和第二前驅溶液而產生一原位可交聯之混合溶液(in situ cross-linkable mixed solution)；和 注射原位可交聯之混合溶液至一患者之身體的一目標位置，其中第一多醣衍生物之親核性基團和第二多醣衍生物之親電性基團可原位形成一共價鍵，造成於目標位置形成交聯之水凝膠。
於文中係配合所請申請專利範圍提出本發明之特別實施例。
為了對本發明之上述及其他方面有更佳的瞭解，下文特舉實施例以配合所請申請專利範圍，作詳細說明如下：第1圖係顯示填充於1號測試兔子(test rabbit 1)皮膚的梯形塊體，其以皮內注射200μL而形成一個隧道(位置D；左上方)、兩個隧道(位置I；右上方)以及四個推注(位置J；右下方)，而於活體內最初(t=0h)形成凝膠狀的測試物品1(test article1)之一照片。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)對照組(200μL)注射於位置E(左下方)；以及第2圖是一顯微照片，顯示在皮下注射1000μL於2號測試兔子(test rabbit 2)的4小時後(t=4h)，打開皮膚後看到因測試物品2(test article 2)所形成的凸起(bulge)。
本揭露提出一種滅菌的原位可交聯的多醣組合物(in situ cross-linkable polysaccharide composition)是以低注射力即可容易通過細的針頭而進行注射的，且可提供皮膚改善、皮膚塑 型(skin shaping)或豐盈效果(volumizing effect)。特別是，此原位可交聯的多醣組合物藉由注射低黏度液態混合物的方式而可便利地應用於目標組織，此通常伴隨著簡單的物理性混合兩種滅菌的前驅溶液之注射，各前驅溶液包含了不同的官能化多醣衍生物。本揭露的這些優點允許使用細針頭注射，此可提高病患的舒適程度(減少注射部位的疼痛，降低反向壓力)而進一步使施打者可準確和安全的(no vessel clogging)將水凝膠注射至預定之目標位置，例如皮膚的各個層。
再者，注射前驅溶液之混合溶液可迅速地和有效地原位交聯而形成一共價交聯之水凝膠(covalently cross-linked hydrogel)於身體之目標位置處。無須添加劑、無須催化劑、沒有pH值轉換、無須紫外光照射也無須任何其他外來的刺激物(或誘始劑)來誘發交聯反應。特別是，無須使用交聯劑。交聯反應唯一產生的副產物是水，水很容易就被形成的水凝膠和/或周圍組織所吸收。再者，本揭露之官能化多醣衍生物可以相當簡單的方法合成而得，通常是以一單一步驟反應進行合成，且有利地是，可藉由濕熱滅菌法(moist heat sterilization)(e.g.，蒸汽滅菌法，較佳地是在高壓下進行)而便利地進行滅菌。
再者，原位形成的交聯水凝膠呈現許多優異的機械、化學和流變學性質，以作為一軟組織填充物(soft tissue filler)材料。特別是，它具有增加體積的高度能力。再者，本揭露之原位交聯之水凝膠具有在活體(in vivo)內的滯留時間延長(prolonged in vivo residence time)但仍然是生物可分解的性質。另外，本揭露之原位交聯之水凝膠亦可包括麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))或 其他許多成分(例如：細胞，包括幹細胞和脂肪細胞；脂肪、脂類、生長因子和維他命)。因此，本揭露之原位可交聯的多醣組合物特別適合用於美容(外觀的)目的以做為一皮膚填充物之使用。
根據第一方面，本揭露係關於一種使用第一多醣衍生物(first polysaccharide derivative)和一第二多醣衍生物(second polysaccharide derivative)以原位形成一交聯之水凝膠於美容應用之用途。第一多醣衍生物係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，第二多醣衍生物係以一親電性基團(electrophilic group)官能化。再者，第一多醣衍生物和第二多醣衍生物兩者都是滅菌的。其中將第一多醣衍生物和第二多醣衍生物共同注射至一患者身體的一目標位置後，親核性基團和親電性基團可原位形成一共價連結，造成於目標位置形成一交聯之水凝膠。
文中所使用的詞語"原位"(in situ)係指在施打位置處。因此，為了在施打位置處形成一水凝膠，一般是將第一多醣衍生物和第二多醣衍生物共同注射或以其他同時應用的方式施行於一患者身體的特殊位置(目標位置)處，例如因外觀理由而需要組織增大的一位置，並且可在共同注射的位置處共價地交聯。在本揭露中，"原位"和"活體"之詞語可能會互相交替著使用。而本揭露所指之一"患者"可能是在一特殊情況、狀態或疾病下例如為了美容(外觀)或醫療目的，而需要處理的任何個體或對象，例如一哺乳動物，較佳地為一人類。
本揭露文中所使用的詞語"共同注射"(co-injection)一般係指將第一多醣衍生物和第二多醣衍生物一起如同單一液態組合物(single liquid composition)例如溶液，而進行注射至一患 者身體的一目標位置。文中所使用的詞語"可注射的"(injectable)或"注射"(injection)係指原位形成水凝膠的組合物可透過一注射筒或一注射筒系統而分佈。特別是，詞語"共同注射"較佳地係指第一多醣衍生物和第二多醣衍生物被混合，特別是在離開注射針之尖端而進入患者身體的一目標位置之前即均勻地混合(homogenously mixed)，之後再以注射一混合物般將其注入至患者身體的目標位置。在本揭露中，詞語"注射"(injection)或"共同注射可能係指皮內注射或皮下注射(subdermal injection or subcutaneous injection)。再者，文中所使用的詞語"注射針"(needle)係包括或同義於"套管"(cannula)或其他任何適合注射的針狀物件。
文中所使用的詞語"水凝膠"(hydrogel)，係指一種水膨脹的三維網絡結構(a water-swollen three-dimensional network)由共價交聯的高分子鏈組成。較佳地，原位交聯(或"膠凝"(gelled))之水凝膠是內聚的(cohesive)。本揭露中詞語"內聚"或"內聚性"(cohesivity)在此係定義為一種材料(例如一水凝膠)之由於其分子之間的親和力(affinity)而不會分離(dissociate)的能力。內聚性是膠狀植體(gel implants)(例如，文中所述之原位膠凝的水凝膠)的一關鍵特性，且被視為一膠體在固相與液相維持完好無缺因而具膠體完整性(gel integrity)的必要特性。於本揭露之文中敘述，一多醣水凝膠之內聚性，特別是一透明質酸基底(HA-based)之水凝膠的內聚性，可使用Gavard-Sundaram內聚性標準而得(Gavard-Sundaram Cohesivity Scale，Sundaram et al.,Plast.Reconstr.Surg.136：678-686,2015)。
文中所使用的詞語"自發的"(spontaneous)或"自發性地"(spontaneously)，係指第一多醣衍生物之親核性基團與第二多醣衍生物之親電性基團在活體內情況下形成一共價連結的現象；即，在共同注射(co-injection)至一患者之身體的一目標位置後，之後形成，且沒有任何外來的刺激物(或稱為"誘始劑")例如熱或紫外光，即可於目標位置原位形成一交聯之多醣水凝膠。
本揭露中，一原位(或活體內)形成之水凝膠通常適合用於、應用於、和/或作用如同一軟組織填充物(soft tissue filler)。文中所使用的詞語"軟組織填充物"一般係指一種設計用來使有缺陷的軟組織增加體積的材料。包括例如擴大、填充或取代軟組織。在此，詞語"軟組織"一般係指關於連接、支持或包圍身體其他結構和器官之組織。軟組織例如是包括肌肉、肌腱(將肌肉連接到骨骼的纖維帶)、纖維組織、脂肪、血管、神經和滑膜組織(synovial tissues)(關節周圍的組織)。於本揭露之敘述中，軟組織填充物係較佳地為一皮膚填充物。
文中所使用的"衍生物"一詞較佳地係指被一親核性基團或一親電性基團所官能化之多醣，且可適用於能在一患者身體的施打位置原位(或在活體中)形成一交聯的多醣水凝膠之目的。較佳地，本揭露之官能化多醣衍生物不包括一親核性基團或一親電性基團以外的其他化學改質修飾。
第一多醣衍生物和該第二多醣衍生物兩者都是滅菌的。文中所使用的"滅菌的"(sterilized)或"滅菌"(sterile)一詞係意指加熱滅菌法(heat sterilization)，特別是濕熱滅菌法(moist heat sterilization)(例如蒸汽滅菌法)，較佳地係指在高壓蒸汽滅菌 (Autoclaving)。高壓蒸汽滅菌可能是在溫度120℃至132℃下進行0.3分鐘至20分鐘，或是在溫度121℃至130℃下進行0.5分鐘至10分鐘，例如在溫度121℃下進行0.5分鐘至2分鐘。
較佳地，第一多醣衍生物係存在於一第一滅菌前驅溶液(first sterile precursor solution)，第二多醣衍生物係存在於一第二滅菌前驅溶液(second sterile precursor solution)。
以頻率1Hz和溫度25℃下以振盪流變量測(oscillatory rheological measurement)，第一滅菌前驅溶液和第二滅菌前驅溶液一般各具有0.001Pa．s至5.0Pa．s之一低的複數黏度(complex viscosity)，特別是0.005Pa．s至3.0Pa．s，較佳地為0.001Pa．s至1.0Pa．s，更較佳地為0.001Pa．s至0.1Pa．s。再者，第一滅菌前驅溶液和第二滅菌前驅溶液可能兩者皆具有0.01牛頓(N)至15牛頓(N)範圍之間的低擠出力(low extrusion force)，較佳地為0.1牛頓(N)至10牛頓(N)，更較佳地為0.5牛頓(N)至7.5牛頓(N)，更較佳地為0.01牛頓(N)至50牛頓(N)或1.0N至5.0N，其係使用一標準1.0ml玻璃注射器(glass syringe)(BD Hypak SCF，1ml long RF-PRTC，ISO 11040，內徑6.35mm)在一擠壓速率(extrusion rate)0.21mm/sec下通過一30G針頭(TSK Laboratory)量測。
根據本揭露，第一多醣衍生物和第二多醣衍生物係在共同注射時混合而形成一液態原位可交聯之組合物(a liquid in situ cross-linkable composition)，其為包括第一和第二多醣衍生物之一混合物。通常，第一多醣衍生物和第二多醣衍生物係分別存在於第一滅菌前驅溶液和第二滅菌前驅溶液。在注射(或共同注射) 期間此兩種前驅溶液混合，最終地混合後所產生的液態原位可交聯之組合物離開針頭並植入身體內。
此液態原位可交聯之組合物較佳地具有0.1Pa．s至100Pa.s之複數黏度，或0.1Pa．s至75Pa．s或1.0Pa．s至75Pa．s之複數黏度；較佳地，具有1Pa．s至50Pa．s或5Pa．s至50Pa．s之複數黏度，其量測方式如上所述。再者，組合物之注射力(injection force)較佳地為0.01N至20N或0.01至10N，更較佳地為0.1N至10N，更較佳地為1.0N至5.0N，其其量測方式如上述。
而混合和注射(或共同注射)可透過如下述之雙筒注射器(a double-barrel syringe)或任何其他適合的注射系統而達成，其中在同時擠出和伴隨混合與通過針頭或套管(cannula)共同注射第一和第二多醣衍生物之混合物至患者之身體內之前，第一多醣衍生物和第二多醣衍生物是物理性地分隔開來的。因此，應該快速進行共同注射以避免沈積第一多醣衍生物和第二多醣衍生物於身體內之目標位置之前就預先交聯。另一方面，凝膠時間應該短以避免此共同注射之材料擴散進入周圍組織。
於第一(滅菌)前驅溶液中第一多醣衍生物的濃度係為0.1wt.%至5.0wt.%，較佳地為0.5wt.%至4.0wt.%，更較佳地為1.0wt.%至3.0wt.%，更較佳地為1.5wt.%至2.5wt.%。於第二(滅菌)前驅溶液中第二多醣衍生物的濃度係為0.1wt.%至5.0wt.%，較佳地為0.5wt.%至4.0wt.%，更較佳地為1.0wt.%至3.0wt.%，更較佳地為1.5wt.%至2.5wt.%。再者，共同注射第一多醣衍生物相對於第二多醣衍生物之重量比係較佳地為15：85 至85：15，更較佳地為30：70至70：30，且更較佳地為40：60至60：40或50：50(第一多醣衍生物對第二多醣衍生物)。
再者，第一和/或第二滅菌前驅溶液可能包括其他添加成分例如細胞包括幹細胞和脂肪細胞(adipocytes)、脂肪、脂類、生長因子、細胞激素、藥和生物活性劑。特別是，第一和/或第二滅菌前驅溶液可能包括局部麻醉劑、多元醇、維他命、鹼金屬和鹼土金屬鹽，金屬，抗氧化劑，氨基酸和陶瓷顆粒。
在本揭露之敘述中，所添加的一局部麻醉劑係特別著重於其可減輕注射時之疼痛的能力。添加局部麻醉劑之示例包括，但不限制是，氨布卡因(ambucaine)，阿莫拉酮amolanone，阿米卡因amylocaine，奧布卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、貝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、甲氯卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡鐵卡因(carticaine)、氣普魯卡因(chloroprocaine)、己基苯酸愛康因(cocaethylene)、可卡因(cocaine)、環美卡因(eyelomethycaine)^二丁卡因(dibucaine)、二甲異喹(dimethysoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、地呱冬(diperodon)、雙環胺(dicyclomine)、去水芽子鹼(ecgonidine)、芽子鹼(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、優卡因(beta-eucaine)、尤普羅辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、海克卡因(hexylcaine)、輕丁卡因(hydroxytetracaine)、對氨基苯甲酸異丁酯(isobutyl p-aminobenzoate)、甲橫酸亮氨卡因(leucinocaine mesylate)、左沙 屈爾(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲脈卡因(mepivacaine)、美普卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氣甲烷(methyl chloride)、麥替卡因(myrtecaine)、納依卡因(naepaine)、奧他卡因(octacaine)、奧索卡因(orthocaine)、輕乙卡因(oxethazaine)、對乙氧卡因(parethoxycaine)、非那卡因(phenacaine)、酚(phenol)、脈羅卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、丙嗎卡因(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普魯卡因(procaine)、丙洋卡因(propanocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙脈卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假可卡因(psuedococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、羅脈卡因(ropivacaine)、水楊醇(salicyl alcohol)、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、左拉敏(zolamine)、及其鹽類。
較佳地，麻醉劑係為利多卡因(lidocaine)，例如是鹽酸利多卡因(lidocaine HCl)。第一滅菌前驅溶液和第二滅菌前驅溶液可具有一利多卡因濃度，例如是，0.05wt.%至8.0wt.%、0.1wt.%至4.0wt.%、0.2wt.%至3.0wt.%、0.3wt.%至2.0wt.%、或0.4wt.%至1.0wt.%。
於文中適合應用的多元醇(polyols)包括，但不限制是，甘油(glycerol)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)、丙二醇(propylene)、乙二醇(glycol)、赤蘚糖醇(erythritol)、木糖醇(xylitol)、麥芽糖醇(maltitol)和乳糖醇(lactitol)。特別適合應用的是甘露醇和甘油。再者，多元醇係較佳地為乙二醇，可任意地與上述之一或多個多元醇成分結合。適合應用的維他命包括維他命C、維他 命E和維他命B群，即維他命B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9和B12之一或多者。維他命的存在可刺激和維持細胞代謝，因而促進膠原蛋白的生成。特別是應用維他命C、維他命E和維他命B6。使用於軟組織填充物組成的一較佳鹽類係為鋅鹽(zinc salt)。而陶瓷粒子較佳地係為羥基磷灰石(hydroxyapatite)粒子，例如羥基磷灰石鈣(calcium hydroxyl apatite(CaHA))粒子。
本揭露中，親電性基團係較佳地為一醛基團(aldehyde moiety)，親核性基團可選自一氨基團、氨氧基團或醯肼基團(hydrazide moiety)，且較佳地為一醯肼基團。如文中所述"醛基團"一詞，係包括一醛官能基(i.e.-CHO是甲醯基(formyl))或任何具有-CHO側基官能團之一基團或殘基(residue)，特別是一醛(i.e.-CHO)基團在末端(e.g.，一直鏈或支鏈的C1-C6烷基或烯基具有一CHO基團於末端)。
可使用於本揭露之醛基團官能化之多醣衍生物(aldehyde functionalized polysaccharide derivative)係較佳地為完整的多醣環。這表示醛基團官能化之多醣衍生物中多醣的醣類單元並沒有任何氧化開環(oxidized open rings)(亦稱為"直線型的(linearized)"醣類單元)。因此，根據此實施例，任何可製備一醛基團官能化之多醣衍生物且不會使多醣的環狀醣類單元開環的方法，都可適用於此。據此，習知之藉由使用高碘酸鹽(periodate)(e.g.，高碘酸鈉(NaIO4))以氧化多醣單體單元(monomeric saccharide units)中的鄰二醇(vicinal diols)而將醛基團導入多醣的方法，係較佳地不在此處應用，且較佳地排除於本揭露之外。
文中所述之"醯肼基團"一詞，包括，一includes a醯肼基官能基(hydrazide functional group)和醯肼基末端基團或殘基(hydrazide-terminated groups or residues)，通常具有碳原子總數不超過15、10、5、4、3或2。醯肼基團係較佳地為醯肼(hydrazide)(例如：[多醣]-C(O)-NH-NH2)或一二醯肼基團(dihydrazide moiety)，特別是一二肼基團之通式：[多醣]-C(=O)-NH-NH-R1-C(=O)-NH-NH2，其中R1係為一共價鍵、C(=O)、C(=O)-O-R2、(C=O)-R2，其中R2係為直鏈或分支之C1,C2,C3,C4,C5或C6之烷基或烯。特別是較佳的使用碳醯肼(carbodihydrazide(CDH))。若CDH用以做為醯肼基團且與多醣的羧基(carboxyl group)偶合，則造成的改質(/修飾)多醣具有如下的末端醯肼之側基官能團：多醣-C(=O)-R，其中R為NH-NH-C(=O)-NH-NH2。
第一和第二多醣衍生物的多醣係可選自於天然多醣和半合成多醣。一些適合的羧基多醣(carboxylic polysaccharides)之例子例如包括羧基化纖維素(carboxylated cellulose)及羧基化纖維素衍生物(e.g.，羧甲基纖維素、羧乙基纖維素、羧甲基乙基醚纖維素、carboxymethylethylcellulose))、羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran)、羧甲基澱粉(carboxymethylstarch)、透明質酸(hyaluronic acid)、果膠(pectin)、幾丁質(chitin)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙醯肝素(heparin sulfate)、肝素前體(heparosan)及其類似物。
較佳地，第一多醣衍生物是以透明質酸、海藻酸鹽、 肝素前體、肝素或硫酸乙醯肝素為基礎。而第二多醣衍生物是以透明質酸、纖維素、幾丁聚醣、幾丁質或肝素前體為基礎。特別是，第一多醣衍生物和第二多醣衍生物皆以透明質酸為基礎，或者以肝素前體為基礎。或是，第一多醣衍生物以肝素前體為基礎，第二多醣衍生物以透明質酸為基礎。或是，第一多醣衍生物以透明質酸為基礎，第二多醣衍生物以肝素前體為基礎。
根據本揭露之一方面，第一多醣衍生物係為一(第一)醯肼基官能化之第一透明質酸衍生物(a hydrazide functionalized first hyaluronic acid(HA)derivative)，第二多醣衍生物係為一(第二)醛基官能化之第二透明質酸衍生物(an aldehyde functionalized second hyaluronic acid(HA)derivative)。於原位交聯時，醯肼基官能化之透明質酸衍生物和醛基官能化之透明質酸衍生物係形成一腙交聯的透明質酸水凝膠(hydrazone crosslinked hyaluronic acid(HA)hydrogel)。
以上所提出關於第一和第二"多醣"衍生物的所有定義、解釋和敘述，除非另有說明，也適用於第一和第二透明質酸(HA)衍生物。此外，提及透明質酸或HA還可能可包括肝素前體。換句話說，在本揭露中，詞語"透明質酸"或"HA"可能包括"肝素前體"或可能以"肝素前體"取代。
醯肼基官能化之透明質酸衍生物的醯肼基團和醛基官能化之透明質酸衍生物的醛基團係較佳地如上述定義。因此，醯肼基團係較佳地為醯肼或二醯肼基團或殘基(dihydrazide group or residue)，特別是如上述之一碳醯肼(carbodihydrazide(CDH))。較佳地，第一HA衍生物係於一醣類單元之一羧基(carboxyl group) 處以一醯肼基團官能化。
羧基之改質係可以使用一水溶性偶合劑和利用任何技藝者已知之方法進行。舉例來說，一適當方法係與使用標準碳二亞胺化學(standard carbodiimide chemistry)相關，例如使用EDC(1-乙基-3-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺；1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)做為偶合劑，以使末端醯肼基團與羧基偶合而形成相應之透明質酸醯基醯肼(HA acyl hydrazides)(請參照如專利WO 95/15168)。其他可使用之偶合劑為三嗪化合物(triazine compounds)例如DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物；4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride；請參照如專利WO 2016/097211)，活性酯例如N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(N,N'-disuccinimidyl carbonate)和四甲基銨鹽(tetramethyl aminium salts)(例如2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU))。
第二透明質酸衍生物係較佳地以一醛基團(aldehyde moiety)官能化而沒有打斷醣類環(cyclic saccharide rings)，例如，不使透明質酸骨架線性化。若有線性化的醣類單元生成，例如藉由經典的高碘酸鹽氧化反應(classical periodate oxidation)產生，會導致醛基被導入HA之醣類單元的環狀結構中，因而同時導致HA骨架的斷裂和"線性化"(linearization)。對於進一步的細節，請參考如上述的相應解釋，其在這裡同樣適用。
較佳地，第二透明質酸衍生物之製作係將一-CH2OH基轉換成一甲醯基(-CHO基)，且特別是，醛基官能化之 透明質酸衍生物的較佳改質，例如是對透明質酸(HA)之單元(N-acetylglucosamine unit)的C6之羥基進行氧化而產生甲醯基(-CHO基)官能基。如後者改質之一適合方法係敘述於如專利WO 2011/069475中，其使用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物(TEMPO；2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy)做為一氧化劑以將一級醇基轉換為醛。
液態原位可交聯之透明質酸組合物進入一患者之身體內，亦即兩種前驅溶液之混合物，較佳地包括醯肼基官能化透明質酸衍生物(hydrazide functionalized HA derivative)和醛基官能化透明質酸衍生物(aldehyde functionalized HA derivative)的總量為0.1wt.%至5.0wt.%，和/或醯肼基官能化透明質酸衍生物相對於醛基官能化透明質酸衍生物之重量比例係為15：85至85：15。此處所提出之總量與重量比例之較佳範圍，請參考如上述關於多醣的相應內容，其在這裡同樣適用於做為一較佳多醣的透明質酸。
根據本揭露，醯肼基官能化透明質酸衍生物和醛基官能化透明質酸衍生物於液態組合物中的總量係較佳地為0.1wt.%至5.0wt.%，特別是0.5wt.%至4.0wt.%，更特別是1.0wt.%至3.0wt.%，以及更佳地為1.5wt.%至2.5wt.%。而醯肼基官能化透明質酸衍生物相對於醛基官能化透明質酸衍生物之重量比例係較佳地為15：85至75：25，更較佳地為25：75至60：40，特別較佳地為40：60至60：40，以及最佳地為50：50。
醯肼基官能化透明質酸衍生物和醛基官能化透明質酸衍生物係獨立於彼此，且以一透明質酸起始材料為依據而得， 其中透明質酸起始材料具有一平均分子量(average molecular weight)在3.0 x 104道爾頓(Da)至5.0 x 106Da範圍之間，較佳地在0.1 x 106Da至4.0 x 106Da範圍之間，更較佳地在0.3 x 106Da至3.0 x 106Da或在0.5 x 106Da至2.0 x 106Da範圍之間。如文中所述之詞語"透明質酸"或"HA"包括了透明質酸、透明質酸鹽(hyaluronate)和任何透明質酸鹽類(hyaluronate salt)例如透明質酸鈉(sodium hyaluronate)。
第一和/或第二滅菌前驅溶液可能包括未交聯的透明質酸，未交聯的透明質酸係選擇性地具有一分子量(molecular weight)在5.0 x 105Da至4.0 x 106Da範圍之間，且較佳地在1.0 x 106Da至3.0 x 106Da範圍之間。而交聯的透明質酸相對於未交聯的透明質酸之重量比例係較佳地為1：1至1：0.001，且特別是在1：0.5至1：0.005或1：0.1至1：0.01。
醯肼基官能化透明質酸衍生物和醛基官能化透明質酸衍生物的改質程度(degree of modification)，以醯肼基團或醛基團之總量相對於HA雙糖單元(disaccharide units)之總量的比例來表達，且兩者係相互獨立地，其可能是在0.1%至50%範圍之間，較佳地在0.5%至25%範圍之間，在0.5%至15%範圍之間或在0.5%至5.0%範圍之間。其改質程度可由光譜儀(spectrometry)和/或光譜分析方式測定，例如核磁共振光譜法(NMR)、紫外-可見光(UV-VIS)光譜和紅外(IR)光譜法、滴定法(titration)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、尺寸排阻色譜法(Size exclusion chromatography，SEC)、粘度法(viscosity)等其中方式量測。方便地，改質程度可以通過1H-NMR測定。
文中所敘述的多醣(e.g.HA)之"分子量"(molecular weight)、"分子質量"(molecular mass)、"平均分子量"(mean molecular weight)或"平均分子質量"(mean molecular mass)其所有數值如技藝者所知是用以指示質量平均莫耳質量(mass-average molar mass)(或質量平均分子質量(mass-average molecular mass))或單位道爾頓(Da)之Mw(w係表示重量；亦可為重量平均分子重量(weight-average molecular weight，WAMW))。質量平均莫耳質量(Mw)係如下式定義：Mw=ΣiNiMi2/ΣiNiMi，其中Ni係為分子質量Mi的分子數目。
本文中可應用各種方法來測定透明質酸(HA)的分子量，例如特性粘度測量(intrinsic viscosity measurements)(例如，歐洲藥典7.0-透明質酸專論第1472號，01/2011)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)(例如，根據Kinoshita等人，Biomed.Chromatogr.,2002,16：141-45)、凝膠滲透層析儀(gel permeation chromatography，GPC)(例如根據Kim等人，Food Chem.,2008,109：63-770)和多角度雷射光散射結合尺寸排阻色譜法(SEC-MALLS)(例如，根據Hokputsa等人，Eur.Biophys.J.Biophys.Lett.,2003,32：450-456)。
根據本發明，透明質酸(HA)聚合物的質量平均莫耳質量(Mw)係優選地由凝膠滲透層析儀(GPC)或通過馬克-霍溫克(Mark-Houwink)方程式的粘度測定法進行測定。凝膠滲透層析儀技術包括在高達幾百巴(bar)的壓力下迫使聚合物溶液通過交聯的聚合物顆粒的基質(a matrix of crosslinked polymer particles)。如本領域技術人員所熟知的，使用低分散度標準允許保留時間 (retention time)與分子量有相關聯。
以Mark-Houwink方程式測定的質量平均莫耳質量(Mw)也可以稱為粘度平均莫耳質量(viscosity average molar mass)或Mv。Mark-Houwink方程式定出了特性粘度(η)(intrinsic viscosity)和分子量M之間的關係，並且允許根據特性粘度數據確定一聚合物的分子量，反之亦然。在本發明文中，特性粘度係較佳地根據歐洲藥典7.0(透明質酸專論1472,01/2011)中定義的方法進行量測。為了由特性粘度數據計算HA的分子量，係使用Mark-Houwink方程式如下：[η]=K x Ma，其中[η]=特性粘度m3/kg，M=分子量，K=2.26 x 10-5以及a=0.796。
根據本揭露，美容應用可能包括，但不限制於，皮膚之皺紋和細紋、皺眉紋(glabellar lines)、法令紋(nasolabial folds)、下頷紋(chin folds)、木偶紋(marionette lines)、下頷輪廓(jawlines)、頰部連合(buccal commissures)、口周紋(perioral wrinkles)、魚尾紋(crow’s feet)、皮膚凹陷(cutaneous depressions)、疤痕(scars)、太陽穴(temples)、眉毛的皮下支撐(subdermal support of the brows)、(malar and buccal fat pads)、淚溝(tear troughs)、鼻子(nose)、嘴唇(lips)、臉頰(cheeks)、下巴(chin)、口周區域(perioral region)、眶下區域(infraorbital region)和臉部不對稱(facial asymmetries)之處理。
本揭露之醫療應用目標可能包括，但不限制於，處理壓力性尿失禁(stress urinary incontinence)、陰道乾澀(vaginal dryness)、膀胱輸尿管逆流(vesico-ureteral reflux)、聲帶褶不足(vocal fold insufficiency)和聲帶褶內移(vocal fold medialization)。
於另一方面，如文中所述本揭露係關於一種組合包括第一透明質酸衍生物(first hyaluronic acid(HA)derivative)和第二透明質酸衍生物(second hyaluronic acid(HA)derivative)，其中第一透明質酸衍生物係以醯肼基團官能化，第二透明質酸衍生物係以醛基團官能化，其中醯肼基團和醛基團係可原位形成一共價鍵，例如是在活體內之情況(under in vivo conditions)下形成。
較佳地，第一透明質酸衍生物是第一滅菌前驅溶液之形式，第二透明質酸衍生物是第二滅菌前驅溶液之形式。
醯肼基官能化之透明質酸衍生物、醛基官能化之透明質酸衍生物、第一滅菌前驅溶液、第二滅菌前驅溶液和原位形成之一腙交聯之透明質酸水凝膠(a hydrazone cross-linked hyaluronic acid(HA)hydrogel)可進一步定義如下。
在進一步方面，本揭露係關於一多筒注射系統(a multi-barrel syringe system)用以原位形成之一交聯之多醣水凝膠，其中多筒注射系統中係預先填充至少(a)具有如上述之以一親核性基團官能化的一第一多醣衍生物之一第一前驅溶液於一注射筒中，和(b)具有如上述之以一親電性基團官能化的第二多醣衍生物之一第二前驅溶液於另一(i.e.分開的)注射筒中。且上述之第一前驅溶液和第二前驅溶液都經過滅菌。
特別是，本揭露係關於一多筒注射系統，較佳地係為一雙筒注射系統或一三筒注射系統(a double-barrel or triple-barrel system)，其預先填充至少(a)具有如上述之以一親核性基團官能化的一第一多醣衍生物之一第一(滅菌)前驅溶液於一注射筒中，和(b)具有如上述之以一親電性基團官能化的第二多醣衍生物之一第二(滅菌)前驅溶液於另一(i.e.分開的)注射筒中，和選擇性地，一具其他成分之溶液(例如：脂肪、脂肪酸、幹細胞、維生素、多元醇、礦物鹽、麻醉劑如利多卡因、抗氧化劑、氨基酸、鹼金屬和鹼土金屬鹽)填充於一第三注射筒中。較佳地，注射系統係為一雙筒注射系統預先填充(a)如文中定義的第一前驅溶液於一注射筒中，和(b)如文中定義的第二前驅溶液於其他注射筒中。
第一和第二多醣衍生物、親核性基團和親電性基團、第一和第二滅菌前驅溶液，以及原位形成之一交聯之多醣水凝膠(in situ formed cross-linked polysaccharide hydrogel)可進一步如上述內容所定義。再者，多筒注射系統包括雙筒注射系統係適用於美容或醫療應用中，特別是，如文中所述，因為美容或醫療目的而應用來取代或填充一生物組織或增加一生物組織之體積，或者特別較佳地，用以做為一皮膚填充物(dermal filler)於外觀使用。
文中使用之"多筒注射系統"(multi-barrel syringe system)一詞，係意指各種系統或元件，通常是一種注射器，其包括至少兩個分開的注射筒(barrels)和可能有二或多個柱塞(plungers)。文中使用之"雙筒注射系統"(double-barrel syringe system)一詞，通常是一種注射器，其包括兩個分開的注射筒(barrels)和可能有二或多個柱塞(plungers)。再者，多筒例如雙筒注射系統通常包括一尖端蓋(tip cap)或是具有或不具有針護罩 (needle shield)的針或套管(cannula)，以便密封注射系統的端部。注射筒通常具有可容納足夠的第一和第二前驅溶液之儲存空間。注射筒可以由玻璃、塑膠或任何其它適合材料製成，並且可以具有不同的幾何形狀、內徑、材料組成，澄清度等。此外，多筒注射系統可以是一雙筒注射系統其具有兩個一體連接的注射器(亦即兩個一體連接的注射筒)的注射器形式，以及用於分配注射筒內容物的單柱塞或雙柱塞組件。再者，注射系統可以包括兩個可拆式連接的注射筒(detachably connected barrels)和兩個或一個可拆式連接的柱塞。
再者，注射系統還可以包括裝置(例如，施加器尖端)其用於在通過施加器尖端分配之前先徹底混合包含在注射筒中的成分。因此，注射筒通常是連接的，並且柱塞組件通常是被配置為同時分配注射筒的內容物，以保持兩前驅溶液的適當混合比。
較佳地，多筒注射系統，包括雙筒注射系統，用於原位形成腙交聯之透明質酸(HA)水凝膠，其中雙筒注射器系統係預先填充(a)醯肼基官能化透明質酸衍生物的一第一前驅溶液於一個注射筒中，和(b)醛基官能化透明質酸衍生物的一第二前驅溶液於另一個注射筒中。醯肼基官能化透明質酸衍生物、醛基官能化透明質酸衍生物、第一和第二滅菌前驅溶液、以及原位形成的腙交聯之透明質酸水凝膠係較佳地如上述所定義。
在另一方面，本揭露係關於一套組(kit)用於原位形成交聯之多醣水凝膠，包括(i)一第一容器，包括如文中所述之以一親核性基團官能化之第一多醣衍生物的第一滅菌前驅溶液，和 (ii)一第二容器，包括如文中所述之以一親電性基團官能化之第二多醣衍生物的第二滅菌前驅溶液；以及選擇性地包括(iii)使用說明(instructions for use)。
第一和第二多醣衍生物、親核性基團和親電性基團、第一和第二滅菌前驅溶液、以及原位形成交聯之多醣水凝膠可如上述內容而進一步定義。文中使用"容器"(container)一詞並沒有特別限制，可包括例如玻璃或塑料瓶、小瓶(vials)、卡普耳(安瓶)(carpules)或其他密封之容器。
"使用說明"(instructions for use)較佳地是美容或醫療應用的使用說明，特別是如文中所述因為美容或醫療應用之目的而用來取代或填充一生物組織或增加一生物組織之體積的使用說明，或者特別較佳地，用以於外觀應用中做為一皮膚填充物(dermal filler)的使用說明。
較佳地，用於原位形成一腙交聯之透明質酸水凝膠的套組係包括(i)一第一容器，包括一醯肼基官能化之透明質酸衍生物的第一滅菌前驅溶液，和(ii)一第二容器，包括一醛基官能化之透明質酸衍生物的第二滅菌前驅溶液；以及選擇性地包括(iii)使用說明(instructions for use)。醯肼基官能化之透明質酸衍生物、醛基官能化之透明質酸衍生物、第一和第二滅菌前驅溶液以及原位形成一腙交聯之透明質酸水凝膠可進一步如上述內容定義，特別是以關於本揭露第一方面來定義。選擇性地，套組可能包括第三滅菌前驅溶液其包含額外成分例如關於多筒注射系統內容中所提及之額外成分。
在另一方面，本揭露提出一種於美容或醫療應用中 原位形成一交聯之水凝膠之方法，包括步驟：(a)分開提供具一第一多醣衍生物(first polysaccharide derivative)之一第一前驅溶液(first precursor solution)以及具一第二多醣衍生物(second polysaccharide derivative)之一第二前驅溶液(second precursor solution)，其中第一多醣衍生物係以一親核性基團官能化，第二多醣衍生物係以一親電性基團官能化，且第一前驅溶液和第二前驅溶液都經過滅菌；(b)混合第一前驅溶液和第二前驅溶液而產生一原位可交聯之混合溶液(in situ cross-linkable mixed solution)；和注射該原位可交聯之混合溶液至一患者之身體的一目標位置，其中第一多醣衍生物之親核性基團和第二多醣衍生物之親電性基團可原位形成一共價鍵，造成於目標位置形成一交聯之水凝膠。
混合和注射可以使用本文定義的注射系統進行，通常係使從針(套管)分配之前就能夠使兩種成份(即第一和第二前驅組成物)進行均勻的(homogeneous)物理混合。文中所使用之詞語“均勻的”係指於整個混合物，分散體或溶液中有均勻的混合、分散或稀釋，或者是指整體具有均勻結構和/或組成之材料。
以下係以一些示例進一步敘述本揭露，但該些示例並不限制本揭露。
示例(EXAMPLES)
下面提供的示例說明了原位可交聯之透明質酸(HA)水凝膠的製備，並且在動物試驗中顯示此水凝膠在各種化妝品和 醫療應用中是前景看好的填充材料。另外，示例也證明原位可交聯的透明質酸組合物可以通過細針頭容易地注射而不需施加過大的力，同時仍然提供期望的機械和流變性質(即複數粘度(η*)，儲存模數(storage modulus，G')，損失模數(loss modulus，G")和損耗角正切(loss tangent，tanδ))以增大生物組織。
擠出力的量測(Measurement of extrusion force)
使用配備有1.0ml玻璃注射器(BD Hypak SCF,1ml long RF-PRTC,ISO 11040，內徑6.35mm)和一30G針頭(TSK Laboratory)的一質地分析儀(物性測試儀，TA.XTPlus，質地科技公司(Texture Technologies,Corp.))來量測擠出力(注射力)。並在測試速度0.21mm/sec下通過25mm之距離(目標模式：距離；力：100.0g)來進行擠出力量測。預測試(Pre-test)和後測試(post-test)速度分別為0.21mm/sec和10.0mm/sec。觸發力為2.0g(觸發類型：自動(力))，應變(形變量strain)為10.0%。將達到平穩狀態之後的平均力作為擠出力。
複數黏度(η*)和儲存與損失模數(G' and G")的量測
使用配有錐板幾何形狀(直徑50mm，角度0.1°，CP50-1，測量間隙(gap size)0.1mm)的流變儀(Anton Paar Physica MCR 302 Rheometer,Anton Paar GmbH)在25℃下量測複數黏度(η*)和儲存與損失模數(G' and G")。樣品在1Pa的應力下振盪，振盪頻率從0.1Hz變化至10Hz。
在下面示例之文中，"相當於"(equivalent)或"例如"(eq.)一詞如果沒有另外指明，是指透明質酸二糖重複單元(hyaluronic acid disaccharide repeat units)。如果沒有另外指明， 百分比是指重量百分比。
示例1
透明質酸-醛(HA-Ald)衍生物之合成
根據專利WO 2011/069475內容所提出之方法(請參見例如示例1)，通過選擇性氧化透明質酸(HA)的N-乙醯基葡萄糖胺(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)單元的伯C6羥基(primary C6 hydroxyl group)來製備醛基官能化之透明質酸衍生物。簡單而言，使用TEMPO/共同氧化劑系統(TEMPO，2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基(2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy))氧化透明質酸(Mw=1.0×106Da)。透析後，將溶液冷凍乾燥，得到醛基官能化的透明質酸(以下稱為"HA-Ald")。
示例2
透明質酸-醯肼(HA-Hyd)衍生物之合成
於室溫下將透明質酸(6000.0mg，14.9mmol的二糖重複單元)溶解至700.0mL的去離子水約12小時。添加HOBt(2289.3mg，14.9mmol)，之後再添加固體的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)(1428.9mg，7.84mmol)。pH值調整至5.5到6.5，且攪拌溶液1小時。接著，加入碳醯肼(carbohydrazide，CDH；4043.5mg，44.88mmol)，繼續在室溫下攪拌溶液10小時。
然後將溶液在5.0L異丙醇中沉澱，收集沉澱物，溶解於鹽水中，並裝載到透析袋(Spectra Por-6，MWCO 3500)中。將沉澱物對含有0.1M氯化鈉(NaCl，2×2L，48小時)的蒸餾水透析，然後用鹽水(2×2L，2.4小時)透析。最後，將溶液冷凍乾燥， 得到5000mg至5500mg的透明質酸-醯肼衍生物(以下稱為"HA-Hyd")。
示例3
透明質酸水凝膠的形成與特性
透明質酸水凝膠的製備是在室溫(約25℃)下通過混合等量之蒸汽滅菌的示例1("HA-Ald")透明質酸-醛衍生物和(131℃，131℃，0.7分鐘)示例2透明質酸-醯肼衍生物("HA-Hyd")。將HA-Ald衍生物和HA-Hyd衍生物分別溶於滅菌的pH值6.5至7.5的磷酸鹽緩衝鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)中，各溶液分別有15mg/ml和24.5mg/ml的濃度。然後，將1.0ml的HA-Ald和HA-Hyd前驅溶液(分別對於每種溶液的15mg/ml和24.5mg/ml濃度)裝入1ml體積比為1的Luer-lock注射器中。使用的兩個注射器各自在每個尖端(tip)處連接到Y-連接器(Y-connector)，使得在通過針頭擠出的同時能有效地混合兩種前驅溶液。
量測到的滅菌前驅溶液和滅菌前驅溶液混合物的平均擠出力與流變性質(η*、G'、G"和tan(δ))，係列於表1。
Figure 105133103-A0305-02-0036-2
Figure 105133103-A0305-02-0037-3
Figure 105133103-A0305-02-0038-4
從表1可看出，HA-Hyd前驅溶液和HA-Ald前驅溶液的擠出力和複數粘度都非常低，這表示出前驅溶液的液體狀態(非凝膠狀態)。再者，量測結果發現兩種前驅溶液的混合物具有僅約5N的擠出力，其大約是在從單獨的注射器通過30G細針擠出後的每種前驅溶液(15mg/ml)之總和。因此，與預先形成的水凝膠形式的皮膚填充物組合物相比，混合的前驅溶液更加容易注射。
原位交聯之HA水凝膠係分別由15mg/ml和24.5mg/ml前體溶液在培養皿上而製備，如表1中所示。為了能適當且充足持續交聯以獲得最終凝膠狀態，根據流變學係持續約30分鐘的時間以充分交聯。因此，混合兩種前體溶液後係使用上述的Anton Paar流變儀進行30分鐘量測，以測量水凝膠之流變性質(η*,G',G" and tan(δ))，其結果列於表2。
Figure 105133103-A0305-02-0038-5
Figure 105133103-A0305-02-0039-6
如表2所示，原位可交聯水凝膠呈現出與預先形成並隨後注射到患者中的其它市售填料可相比之流變性質。此外，測試的原位可交聯水凝膠都是內聚性的(cohesive)，如在Gavard-Sundaram內聚性量表(Gavard-Sundaram Cohesivity Scale)等於或高於3的結果所示。
示例4
動物測試以建立概念性驗證(proof-of-concept)
初步動物試驗研究(Preliminary Animal Study)
表2所提出之兩種製劑係用於兔子活體內形成水凝膠。將(1：1v/v)HA-Hyd前驅溶液(15mg/ml)和HA-Ald前驅溶液(15mg/ml)共同注射到兔子皮膚中以產生第一水凝膠("測試物品1")。將(1：1v/v)HA-Hyd前驅溶液(24.5mg/ml)和HA-Ald前驅溶液(24.5mg/ml)共同注射到兔子皮膚中以產生第二水凝膠("測試物品2")。
根據注射深度，通過皮內(intradermal，ID)和皮下(subdermal，SD)注射將100μL至1000μL的體積注射到兔子的不同皮膚層中，並與兩種市售的皮膚填充物(對照物品1：Belotero Balance；對照物品2：Belotero Volume)進行比較。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)用作陰性對照組。其結果顯示於第1圖和第2圖中。
從第1圖可看出，在皮內注射後，測試物品1在真皮中呈現為大致梯形塊體，如典型注射HA基底填充物會發生的狀態，如第1圖所示。再者，從第1圖還可看出，注射型態(例如是，推注(bolus)、一個隧道和兩個隧道注射(tunnels injections))並沒有導致任何在形態學上的差異。對於測試物品2，發現了基本上相同的結果。此外，其他測試結果顯示，皮內注射不同體積的測試物品1和2並不會導致測試物品分佈的相關差異(結果未示出)。
第2圖是在時間4小時後(t=4h)因體內交聯的測試物品2形成的"凸起"(bulge)或"水泡"(bleb)之顯微照片。可以看出，測試物品2在注射後數小時後提供了提升效果(lifting effect)。相較之下，鹽水溶液在該時間內完全消失。在測試物品1中觀察到相同的情況。體內交聯後獲得的水泡係類似於注入具有流變特性 近似於預先形成之市售填充物的填充劑後所獲得的水泡(例如Belotero®填料範圍(莫氏醫美公司)。
總結來說，變化量的測試物品1和2之皮內和皮下注射係提供了所需的提升效果，並且與兔子皮膚中的任何不利的組織病理學效應無關。
接續12週的動物試驗研究(Follow-up 12-weeks animal study)
對兔子進行12週的研究以確定上述測試物品1的皮內注射(ID)和上述測試物品2的皮下注射(SC)後的皮膚反應嚴重性(severity of skin reactions)。將反應結果與ID注射對照物品1(Belotero Balance)和SC注射對照物品2(Belotero Volume Lidocaine)做比對。注射後4週，仔細觀察注射部位並進行組織病理學分析以評估每個物品引起的皮膚反應。注射後仔細觀察所有注射位置，然後於5天期間每天觀察，且每週持續觀察直到12週結束為止。
令人驚訝的，結果發現兩種測試物品(活體內HA填料)形成非常小的顆粒(granules)和針狀物，其浸潤在真皮膠原纖維之間。對照物品(Belotero Balance和Belotero Balance Lidocaine)則形成較大的顆粒和湖泊(lakes)，其填充真皮中的大空間，並且不浸潤真皮膠原。換句話說，活體內HA填充劑達成了組織基本上更好的浸潤行為，如Belotero Balance(完全組織整合相對於局部填充)，儘管Belotero Balance以其優異的組織整合能力而聞名(Flynn等人，單相和雙相透明質酸填料之皮內植入的比較組織學(Comparative histology of intradermal implantation of mono and biphasic hyaluronic acid fillers)，Dermatol Surg.2011,37：637-643； 以及Micheels等人，淺表皮膚注射透明質酸軟組織填充劑：比較超聲研究(Superficial dermal injection of hyaluronic acid soft tissue fillers：comparative ultrasound study)，Dermatol Surg.2012,38：1162-1169)。.
綜合而言，12週的兔子試驗研究顯示本揭露之活體內HA填充物與市售皮膚填充物的可比性(comparability)。試驗結果更顯示活體內HA填充物提供了獨特的性質例如改善的組織浸潤(improved tissue infiltration)，此導致完全的組織整合，這與局部填充(local filling)相反。這些結果強烈建議和表達了本揭露之活體內HA填充物在各種化妝品和醫療應用中用於擴大，填充或取代軟組織的潛力
綜上所述，雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。因此，本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (13)

  1. 一種使用一第一多醣衍生物(first polysaccharide derivative)和一第二多醣衍生物(second polysaccharide derivative)以原位形成一交聯之水凝膠(cross-linked hydrogel)之用途，其係用於製備於美容應用之藥物，其中該第一多醣衍生物係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，該第二多醣衍生物係以一親電性基團(electrophilic group)官能化，且該第一多醣衍生物和該第二多醣衍生物都是滅菌的，其中將該第一多醣衍生物和該第二多醣衍生物共同注射(co-injection)至一患者之身體的一目標位置後，該親核性基團和該親電性基團可原位形成一共價鍵，造成於該目標位置形成該交聯之水凝膠；其中該第一多醣衍生物係為一醯肼基官能化之第一透明質酸衍生物(a hydrazide functionalized first hyaluronic acid(HA)derivative)，該第二多醣衍生物係為一醛基官能化之第二透明質酸衍生物(an aldehyde functionalized second hyaluronic acid(HA)derivative)，其中該第一透明質酸衍生物在透明質酸之一醣類單元的一羧基(carboxyl group)以一醯肼基團官能化，其中該醯肼基團是醯肼或碳醯肼，且其中將一-CH2OH基轉換成一甲醯基(-CHO基)而造成該第二透明質酸衍生物之一醛基團官能化。
  2. 如請求項1所述之用途，其中所述原位形成之該共價鍵係於共同注射時自發性地產生，和/或其中所述原位形成之該共價鍵係造成除了水以外沒有其他副產物產生。
  3. 如請求項1或2所述之用途，其中該第一多醣衍生物係存在於一第一滅菌前驅溶液(first sterile precursor solution)，該第二多醣衍生物係存在於一第二滅菌前驅溶液(second sterile precursor solution)。
  4. 如請求項3所述之用途，其中以頻率1Hz和溫度25℃下以振盪流變量測(oscillatory rheological measurement)，該第一滅菌前驅溶液和該第二滅菌前驅溶液各具有一0.001Pa．s至5.0Pa．s之複數黏度，或是使用1.0ml玻璃注射器(glass syringe)在一擠壓速率0.21mm/sec下通過一30G針頭量測而各具有一0.01牛頓(N)至15牛頓(N)的注射力(injection force)，或兩者皆是。
  5. 如請求項3所述之用途，其中在進入該身體前該第一滅菌前驅溶液和該第二滅菌前驅溶液在共同注射時係混合，以形成一液態原位可交聯之組合物(a liquid in situ cross-linkable composition)，其中以頻率1Hz和溫度25℃下以振盪流變量測，該液態原位可交聯之組合物具有0.1Pa．s到100Pa．s之一複數黏度，或是使用1.0ml玻璃注射器(glass syringe)在一擠壓速率0.21mm/sec下通過一30G針頭進行量測係具有一0.01牛頓(N)至20牛頓(N)的注射力，或兩者皆是。
  6. 如請求項3所述之用途，其中於該第一滅菌前驅溶液中該第一多醣衍生物的濃度係為0.1wt.%至5.0wt.%，於該第二滅菌前驅溶液中該第二多醣衍生物的濃度係為0.1wt.%至5.0wt.%，和/或其中注射至該患者之身體之該目標位置的該液態原位可交聯之組合物所包括之該第一多醣衍生物相對於該第二多醣衍生物之重量比係為15：85至85：15。
  7. 如請求項1-2任一項所述之用途，其中原位形成之該交聯之水凝膠係用於皮膚之皺紋和細紋、皺眉紋(glabellar lines)、法令紋(nasolabial folds)、下頷紋(chin folds)、木偶紋(marionette lines)、下頷輪廓(jawlines)、頰部連合(buccal commissures)、口周紋(perioral wrinkles)、魚尾紋(crow’s feet)、皮膚凹陷(cutaneous depressions)、疤痕(scars)、太陽穴(temples)、眉毛的皮下支撐(subdermal support of the brows)、(malar and buccal fat pads)、淚溝(tear troughs)、鼻子(nose)、嘴唇(lips)、臉頰(cheeks)、下巴(chin)、口周區域(perioral region)、眶下區域(infraorbital region)和臉部不對稱(facial asymmetries)之處理。
  8. 一種如請求項1-6任一項所述之該第一多醣衍生物和該第二多醣衍生物而原位形成該交聯之水凝膠之用途，其係用於製備於醫療應用之藥物。
  9. 如請求項8所述之用途，該交聯之水凝膠用於處理壓力性尿失禁(stress urinary incontinence)、陰道乾澀(vaginal dryness)、膀胱輸尿管逆流(vesico-ureteral reflux)、聲帶褶不足(vocal fold insufficiency)和聲帶褶內移(vocal fold medialization)。
  10. 一種用於形成原位可交聯的水凝膠之衍生物之組合，包括如請求項1所定義之該醯肼基官能化之第一透明質酸衍生物(first hyaluronic acid(HA)derivative)和該醛基官能化之第二透明質酸衍生物(second hyaluronic acid(HA)derivative)。
  11. 一種多筒注射系統(a multi-barrel syringe system)，其預先填充至少(a)如請求項1-6任一項所述之該第一滅 菌前驅溶液於一注射筒中；和(b)如請求項1-6任一項所述之該第二滅菌前驅溶液於另一注射筒中。
  12. 一種用於原位形成交聯之多醣水凝膠的套組(kit)，包括(i)一第一容器包括如請求項1-6任一項所述之該第一滅菌前驅溶液，和(ii)一第二容器包括如請求項1-6之任一項所述之該第二滅菌前驅溶液；以及選擇性地包括(iii)使用說明(instructions for use)。
  13. 一種原位形成一交聯之水凝膠的用途，其係用於製備於美容或醫療應用之藥物，其中原位形成該交聯之水凝膠之方法包括下列步驟：(a)分開提供具一第一多醣衍生物(first polysaccharide derivative)之一第一滅菌前驅溶液(first precursor solution)以及具一第二多醣衍生物(second polysaccharide derivative)之一第二滅菌前驅溶液(second precursor solution)，其中該第一多醣衍生物係以一親核性基團(nucleophilic group)官能化，該第二多醣衍生物係以一親電性基團(electrophilic group)官能化，其中該第一多醣衍生物係為一醯肼基官能化之第一透明質酸衍生物(a hydrazide functionalized first hyaluronic acid(HA)derivative)，該第二多醣衍生物係為一醛基官能化之第二透明質酸衍生物(an aldehyde functionalized second hyaluronic acid(HA)derivative)，其中該第一透明質酸衍生物在透明質酸之一醣類單元的一羧基(carboxyl group)以一醯肼基團官能化，其中該醯肼基團是醯肼或碳醯肼，且其中將一-CH2OH基轉換成一甲醯基(-CHO基)而造成該第二 透明質酸衍生物之一醛基團官能化，且該第一滅菌前驅溶液和該第二滅菌前驅溶液都經過滅菌；(b)混合該第一滅菌前驅溶液和該第二滅菌前驅溶液而產生一原位可交聯之混合溶液(in situ cross-linkable mixed solution)；和(c)注射該原位可交聯之混合溶液至一患者之身體的一目標位置，其中該第一多醣衍生物之該親核性基團和該第二多醣衍生物之該親電性基團可原位形成一共價鍵，造成於該目標位置形成該交聯之水凝膠。
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