CN112638434B - 交联的多羧酸化多糖及其使用方法 - Google Patents

交联的多羧酸化多糖及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包括通过包括与四嗪部分或其衍生物偶联的不饱和部分或其衍生物的连接体交联的第一透明质酸(HA)链和第二HA链的聚合物。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于具有0.2至4％的交联度。

Description

交联的多羧酸化多糖及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月28日提交的题为“CROSS-LINKED POLYCARBOXYLATEDPOLYSACCHARIDES AND METHODS OF USE THEREOF”的美国临时专利申请号62/691,035的优先权权益，其内容整体通过引用合并于此。
技术领域
在一些实施方式中，本发明涉及交联的透明质酸。
背景技术
皮肤填充剂中透明质酸的交联赋予了该材料的期望机械性质，具体地提升(或充盈)性质。
对使用尽可能接近内源透明质酸的材料的需要注定了要生产具有低修饰度(例如，％交联)的材料。已知透明质酸和交联透明质酸都具有高度吸湿性。因此，当注射这些材料时，其倾向于吸收组织中的水并导致溶胀和浮肿。吸水率与透明质酸和交联透明质酸的含量呈正相关。因此，由于需要降低溶胀和浮肿的风险，期望生产出透明质酸和交联透明质酸含量低的皮肤填充剂。
已知当前市场上的材料包含高交联度(4至10％)或总体透明质酸含量(等于或大于20mg/gR)，以提供足够的提升性质
发明内容
在其一些实施方式中，本发明涉及交联的透明质酸。
在本发明的一个方面，提供了聚合物，其包含经由连接体交联的第一透明质酸(HA)链和第二HA链，所述连接体包含与四嗪部分或其衍生物结合的不饱和部分或其衍生物，并且其中交联的特征在于交联度为0.2至4％。
在一些实施方式中，不饱和部分包括：不饱和环烷基、不饱和烷芳基、不饱和烷基或其组合。
在一些实施方式中，一个或多个连接体包括由下式表示的化合物：
式(A)
或式(B)：
或其组合；其中：
---表示单键或双键；
R1、R2或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z为键、芳基或杂芳基；
A选自：键、烷基和芳基；
Q1、Q2或两者表示氢或不存在；
并且其中R3选自：氢、取代或未取代的烷基、芳基和杂芳基。
在一些实施方式中，不饱和部分包含苯乙烯部分或其衍生物。
在一些实施方式中，苯乙烯部分或其衍生物由式IA-D表示：
在一些实施方式中，一个或多个连接体包括由下式表示的化合物：
式(C)
或式(D)：
或其组合；其中：
---表示单键或双键；
R1、R2或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z为键、芳基或杂芳基；
Q1、Q2或两者表示氢或不存在；
并且其中R3选自氢、取代或未取代的烷基、芳基和杂芳基。
在一些实施方式中，一个或多个连接体包括：
衍生自降冰片烯部分的第一化合物，所述降冰片烯部分选自式IIA-G：
和
b)衍生自四嗪部分的第二化合物，所述四嗪部分选自式IIIA-F：
在一些实施方式中，第一化合物和第二化合物共价结合。
在一些实施方式中，降冰片烯部分和四嗪部分通过共价键结合至第一HA链和第二HA链。
在一些实施方式中，共价键选自：酰胺、胺、酯、醚、脲、硫脲和氨基甲酸酯。
在一些实施方式中，第一HA链和第二HA链的平均分子量Mw为100,000至4,000,000道尔顿(Da)。
在一些实施方式中，聚合物具有0.1至10°的相角(δ)。
在一些实施方式中，聚合物的弹性模量(G′)为10至1,000Pa。
在一些实施方式中，聚合物包括1mg/gR至20mg/gR的HA含量。
在一些实施方式中，交联度通过1HNMR确定。
根据另一方面，提供了组合物，其包括本发明的聚合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，组合物包括来自下列的一种或多种：
1)包括由式(A)表示的连接体的聚合物；
2)包括由式(B)表示的连接体的聚合物；
3)包括由式(C)表示的连接体的聚合物；
4)包括由式(D)表示的连接体的聚合物。
在一些实施方式中，组合物还包括组合物中总HA含量的0.1-30％(w/w)的非交联HA。
在一些实施方式中，所述组合物还包括选自以下的一种或多种化合物：氨基酸、矿物质、维生素、抗氧化剂、核酸、辅酶、酶、生长因子、蛋白质、抗肿瘤药物、类固醇、非类固醇抗炎药物、抗生素、麻醉剂、抗微生物药物或其任何组合。
根据另一个方面，提供了在有需要的对象中填充或充盈组织的方法，其包括将本发明的组合物或本发明的聚合物给予组织，从而使在有需要的对象中填充或充盈组织。
在一些实施方式中，组织选自：皮肤、牙龈、软骨和眼科组织、肌肉和皮下组织。
根据另一方面，在其实施方式中提供了制备聚合物的方法，该方法包括：将第一透明质酸(HA)链或其衍生物与第二HA链或其衍生物混合，其中第一HA链包括不饱和部分或其衍生物，并且第二HA链包括四嗪部分或其衍生物；其中不饱和部分或其衍生物与四嗪部分或其衍生物存在的摩尔比为3∶1至1∶3；从而使第一HA链或其衍生物与第二HA链或其衍生物交联。
在一些实施方式中，不饱和部分包括降冰片烯部分或其衍生物。
在一些实施方式中，第一HA链或其衍生物和第二HA链或其衍生物具有100,000至4,000,000道尔顿(Da)的平均分子量Mw。
在一些实施方式中，交联包括在降冰片烯部分或其衍生物与四嗪部分或其衍生物之间形成共价键。
根据另一方面，提供了试剂盒(套组，kit)，其包括与不饱和部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物，以及与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物。
在一些实施方式中，不饱和部分包括降冰片烯部分或其衍生物。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，试剂盒还包括注射装置。
在一些实施方式中，试剂盒还包括选自以下的组分：游离HA链、氨基酸、矿物质、维生素或麻醉剂。
在一些实施方式中，试剂盒包括关于以下的说明书：
a.将偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物和偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物以3∶1至1∶3的比例混合；和
b.将通过混合偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物和与偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物混合而形成的组合物应用于填充或充盈方法。
在一些实施方式中，试剂盒还包括关于将组合物与游离HA链、氨基酸、矿物质、维生素、麻醉剂或其任何组合混合的说明书。
在一些实施方式中，混合在注射装置中进行。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试，但下文描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是示例性的，并非意图一定是限制性的。
本发明的其他实施方式和全部应用范围由下文给出的详细描述将变得显而易见。然而，应理解，详细说明和具体实例虽然指出了本发明的优选实施方式，但是仅是通过示例的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和改动基于本详细描述对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1：用四嗪修饰的透明质酸(HA-四嗪)的1HNMR波谱，显示四嗪的芳族峰和N-乙酰基葡萄糖胺残基的脂族峰。
图2：用降冰片烯修饰的透明质酸(HA-降冰片烯)的1HNMR波谱，显示降冰片烯的烯烃峰和N-乙酰基葡萄糖胺残基的脂族峰。
图3：用苯乙烯修饰的透明质酸(HA-苯乙烯)的1HNMR波谱，显示苯乙烯的烯烃峰和N-乙酰基葡萄糖胺残基的脂族峰。
图4：描绘聚合物的线性粘弹性区(LVR)中的起点(onset point)的图。
图5：描绘在体内给予商品vs.本发明聚合物后95天期间皮下凝胶物质的尺寸的图
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明涉及聚合物，其包括通过连接体交联的第一透明质酸(HA)链和第二HA链，该连接体包括与四嗪部分或其衍生物结合的不饱和部分或其衍生物。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于具有0.2至4％的交联度。
在一些实施方式中，不饱和部分包括：不饱和环烷基、不饱和烷芳基、不饱和烷基或其组合。在一些实施方式中，不饱和部分包括环状或非环状炔烃。在一些实施方式中，不饱和部分包括环状或非环状烯烃。在一些实施方式中，不饱和部分包括任选地稠合的环状烯烃。
在一些实施方式中，不饱和部分选自：取代的或未取代的苯乙烯、环己烯、环戊烯、环己二烯、环戊二烯、降冰片二烯、稠合降冰片二烯、降冰片烯和稠合降冰片烯。在示例性的实施方式中，不饱和部分是降冰片烯。
聚合物
在一些实施方式中，本发明涉及包括透明质酸(HA)链或其衍生物的聚合物。如本文所用，HA链或其衍生物包括D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-葡萄糖胺。
如本文所用，HA链的衍生物涉及化学修饰的HA。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括侧链修饰(例如羟基的乙酰化、羧基的去羧酸化、酯化或酰胺化)。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括所述侧链修饰中的一种或多种。在一些实施方式中，修饰是相同的。在一些实施方式中，修饰是不同的。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括修饰的侧链的组合。
在一些实施方式中，本发明的HA链具有如下分子量：50,000-200,000Da、100,000-200,000Da、150,000-400,000Da、150,000-1,000,000Da、250,000-1,500,000Da、350,000-5,000,000Da、750,000-4,000,000Da、50,000-5,000,000Da、1,000,000-7,500,000Da、2,000,000-10,000,000Da、400,000-5,000,000Da、650,000-8,000,000Da、4,000,000-10,000,000Da或7,500,000-15,000,000Da。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
如本文所用，术语“分子量”包括选自以下的平均重量值中的任一种：Mn(数均摩尔质量)、NAMW(数均分子量)、Mw(质量平均摩尔质量)、WAMW(重均分子量)、Mz(Z平均摩尔质量)、Mv(粘度平均摩尔质量)和MWCO(截留分子量)。除非另有说明，该术语指代Mw。
在一个实施方式中，本发明涉及聚合物，该聚合物包括分子量在上述范围内的多羧酸化多糖或其衍生物。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括一个或多个HA链。在一些实施方式中，“一个或多个”是两个。在一些实施方式中，本发明的两个HA链是交联的。在一个实施方式中，交联是相互交联的。如本文所定义，术语“相互”指代位于两个不同链中的两个部分之间成键，与位于相同链中的两个残基之间形成“内部”键相反。在一些实施方式中，两个HA链的交联是通过连接体进行的。
如本文所定义的“连接体”指代用于连接一个或多个多羧酸化多糖的不同部分或官能团的分子或大分子。在一个实施方式中，连接体还可以促进其他功能，包括但不限于保存生物活性、维持相互作用和其他。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过一个或多个连接体与第二HA链连接的第一HA链，所述连接体包括由下式表示的化合物：
式(A)
或式(B)
或其组合；其中：
表示单键或双键。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括经由一个或多个连接体交联至第二HA链的第一HA链，该连接体包括由式(A)和/或(B)表示的化合物。
在一些实施方式中，R1、R2或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z是键、芳基或杂芳基。
在一些实施方式中，A选自：键、烷基和芳基。
在一些实施方式中，Q1、Q2或两者表示氢或不存在。
在一些实施方式中，R3选自：氢、取代或未取代的烷基、芳基和杂芳基。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过一个或多个连接体连接至第二HA链的第一HA链，该连接体包括由下式表示的化合物：
式(C)
或式(D)
或其组合；
其中表示单键或双键。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括经由连接体与第二HA链交联的第一HA链，该连接体包括由式(C)或(D)表示的化合物。
在一些实施方式中，连接体包括衍生自不饱和部分的第一化合物和衍生自四嗪部分的第二化合物，如下文所述。在一些实施方式中，第一化合物和第二化合物共价结合。在一些实施方式中，第一化合物和第二化合物共价结合，从而形成由式(A)至(D)中的任一个表示的化合物。
在一些实施方式中，R1、R2和R3包括选自以下的取代基：烷基、环烷基、芳基、杂脂环族、杂芳基、烷氧基、羟基、膦酸基、硫代羟基、硫代烷氧基、芳氧基、硫代芳氧基、氨基、硝基、卤素、三卤甲基、氰基、酰胺、胺、烷胺、羧基、磺酰基、次硫酸基(sulfoxy)、亚磺酰基和磺酰胺。
在一些实施方式中，Q1、Q2或两者表示氢或不存在。
在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过连接体与第二HA链连接的第一HA链，该连接体包括选自以下的化合物：
在一些实施方式中，R1选自：-C0-C6烷基-NZ-、-C0-C6烷基-O-和C0-C3烷基-C(O)-。
在一些实施方式中，Z选自：键、芳基或杂芳基，其中所述芳基和杂芳基任选地被卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、(C1-C6烷基)氨基和二(C1-C6烷基)氨基取代。
在一些实施方式中，R2选自：C0-C6烷基-NZ、-C0-C6烷基O-和C0-C3烷基-C(O)-。
在一些实施方式中，R3选自：氢、C1-C6烷基、芳基或杂芳基，其中所述芳基和杂芳基任选地被卤素、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、(C1-C6烷基)氨基和二(C1-C6烷基)氨基取代。
在一个实施方式中，指代单键，或者在某些实施方式中指代双键——在可行时。
在一些实施方式中，R1、R2或两者选自：-NZ-、-Ci-C6烷基-NZ-、-O-、-C1-C6烷基-O-、-C(O)-或-C1-C3烷基-C(O)-；-甲基-O、-戊基-O-；-C(O)-；和-甲基-C(O)-。
在一些实施方式中，Z是键。在一些实施方式中，Z选自：芳基和杂芳基、苯基；和吡啶基、嘧啶基和吡嗪基；各基团任选地可以是取代型的。
另一个实施方式提供了根据任何前述实施方式的包括式(C)或(D)的化合物的连接体，其中R1、R2或两者选自：-NZ-、-C1-C6烷基-NZ-、-O-、-C1-C6烷基-O-、-C(O)-或-C1-C3烷基-C(O)-；-C1-C6烷基-NZ-；C1-C3烷基-NZ-；-甲基-NH-或-戊基-NH-；-C1-C6烷基-O-；-C1-C3烷基-O-；-甲基-O或-戊基-O-；-C0-C3烷基-C(O)-；C(O)-；和-甲基-C(O)-。
在一些实施方式中，R3是氢。
在一些实施方式中，R3选自：C1-C6烷基，芳基或杂芳基，其中该芳基或杂芳基可以任选地是取代的；芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基是任选地取代的；苯基；吡啶基、嘧啶基或吡嗪基。
在一些实施方式中，包括式(C)或(D)的化合物的连接体中的R3选自：C1-C6烷基、C1-C3烷基和甲基。
在一些实施方式中，聚合物包括多种包括式(C)或(D)的化合物的连接体。
在一些实施方式中，本发明涉及包括第一HA链和第二HA链的聚合物，所述第一HA链和第二HA链通过连接体相互连接，导致环化，如但不受任何特定机制束缚，包括不饱和部分(例如降冰片烯部分)或其衍生物以及四嗪部分或其衍生物的逆电子需求Diels-AldeR环化。
在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括不饱和部分，如上所述。在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括苯乙烯部分或其衍生物。
在一些实施方式中，苯乙烯部分由式IA-D表示：
在一些实施方式中，苯乙烯部分的衍生物包括经由共价键结合至第一HA链的式IA-ID的苯乙烯部分。
共价键的非限制性实例包括但不限于：酰胺、胺、酯、醚、脲、硫脲和氨基甲酸酯。
在一些实施方式中，苯乙烯部分的胺共价结合至第一HA链。在一些实施方式中，苯乙烯部分结合至第一HA链的羧基。在一些实施方式中，苯乙烯部分的衍生物指代通过酰胺键与第一HA链结合的苯乙烯部分(例如式IA的化合物)，如式IE所示：
在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括降冰片烯部分或其衍生物。在一些实施方式中，本发明的第一HA链中的降冰片烯部分或其衍生物的数目可以是1至100,000之间的任何整数。在一些实施方式中，本发明的第二HA链包括四嗪部分或其衍生物。在一些实施方式中，附接至本发明的第二HA链的四嗪部分或其衍生物的数目可以是1至100,000之间的任何整数。在一些实施方式中，各第一HA链包括1-10,000、1-5,000、1-1,000、5,000-50,000、5,000-10,000、1,000-10,000、1,000-5,000、500-5,000、500-1000或1-500个降冰片烯部分或其衍生物。在一些实施方式中，各第二HA链包括1-100,000、1-50,000、1-10,000、1-5,000、1-1,000、5,000-50,000、5,000-10,000、1,000-10,000、1,000-5,000、500-5,000、500-1,000或1-500个四嗪部分或其衍生物。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
在一些实施方式中，降冰片烯部分为内部型、外部型或其混合型构象。降冰片烯部分的非限制性实例包括但不限于式IIA-IIG的化合物：
四嗪部分的非限制性实例包括但不限于式IIIA-IIIF的化合物：
在一些实施方式中，降冰片烯部分是式IIG的化合物：
在一些实施方式中，降冰片烯部分的衍生物包括通过共价键结合至第一HA链的由式IIA-IIG表示的降冰片烯部分。
在一些实施方式中，降冰片烯部分的胺结合至第一HA链。在一些实施方式中，降冰片烯部分结合至第一HA链的羧基。在一些实施方式中，降冰片烯部分的衍生物指代通过酰胺键与第一HA链结合的降冰片烯部分(例如式IIG的化合物)，如式IF所示：
在一些实施方式中，通过使第一HA链和降冰片烯部分(例如降冰片烯甲胺、降冰片烯甲醇)与合适的偶联剂反应，使降冰片烯部分与第一HA链结合。
偶联剂的非限制性实例包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)、羰基二咪唑、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)、4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉盐酸盐(DMTMM)和N，N，N′，N′-四甲基-O-(1H苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐(HBTU)。在一个实施方式中，如上文所定义，四嗪部分的衍生物与四嗪部分有关，其通过共价键结合至第二HA链。在一些实施方式中，共价键如上文所定义。
在一些实施方式中，四嗪部分的衍生物包括通过共价键结合至第二HA链的由式IIIA-IIIF表示的四嗪部分。在一些实施方式中，四嗪部分的胺结合至第二HA链。在一些实施方式中，四嗪部分结合至第二HA链的羧基。在一些实施方式中，四嗪部分的衍生物指代通过酰胺键与第二HA链结合的四嗪部分(例如式IIIB的化合物)，如式IG所示：
在一些实施方式中，通过使第二HA链和四嗪部分(例如苄胺四嗪)与合适的偶联剂反应，使四嗪部分结合至第二HA链。
在一些实施方式中，与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链以3∶1、3∶2、2∶1、1∶1、1∶2、2∶3或1∶3的比例存在于本发明的聚合物中，包括其间的任何值和范围。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。如本文所定义，比例是选自以下的任何比例：摩尔、重量或浓度。
如本文所定义，术语“交联度”指代形成本发明聚合物的连接体与重复多羧酸化多糖之间的摩尔比。在一些实施方式中，交联度指代包括未反应的降冰片烯和四嗪的连接体与形成本发明聚合物的重复多羧酸化多糖之间的摩尔比。在一些实施方式中，本发明聚合物的交联度为至多0.1％、至多0.2％、至多0.5％、至多0.7％、至多0.9％、至多1％、至多2％、至多3％、至多4％、至多5％、至多6％、至多7％、至多8％、至多9％、至多10％或至多12％。在一些实施方式中，本发明的聚合物的交联度为0.01-0.1％、0.01-0.5％、0.05-0.1％、0.1-0.3％、0.1-0.5％、0.1-0.75％、0.1-1％、1-1.75％、1-2％、1-2.5％、2-2.5％、2.25-3％、2.5-3.25％、3-3.75％、3.6-4.2％、4-5.25％、5-6.5％、6-7.5％、7-8.5％、8-9.25％、9-10.5％或10-12.5％。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。在一个实施方式中，聚合物的交联度指代本发明聚合物内多个HA链的交联度的计算平均值。
在一些实施方式中，本发明的聚合物是弹性的。如本文所用，聚合物的弹性由弹性模量(G′)表征。在一些实施方式中，术语“弹性模量”指代如下文所确定的弹性模量。
在一些实施方式中，本发明的聚合物具有10-500Pa、20-1,000Pa、30-600Pa、40-1,000Pa、40-5,000Pa、50-10,000Pa、500-50,000Pa、500-10,000Pa、500-5,000Pa、500-1,000Pa、1,000-50,000Pa、1,000-10,000Pa、1,000-5,000Pa、50-20,000Pa、500-20,000Pa或1,000-20,000Pa的弹性模量。在一些实施方式中，本发明的聚合物具有上至10,000Pa、上至20,000Pa、上至30,000Pa、上至40,000Pa或上至50,000Pa的弹性模量。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
如本文所定义，术语“相角”或“δ”指代材料的粘弹性程度。对于本领域普通技术人员显而易见，δ可根据以下方程式计算：
其中G”为粘度模量，并且G′为弹性模量。在一些实施方式中，G′和G”是通过振荡流变学获得的，并且在应力或振幅的低振荡的粘弹性域中被测量。
在一些实施方式中，本发明的聚合物具有0.1-25°、0.1-0.5°、0.1-0.9°、0.5-1°、0.7-1.5°、1-2.5°、2-4.5°、3-4.75°、4.7-5.5°、5-7.5°、6-8°、7-8.5°、8.25-9.5°、9-10.5°、9.5-12°的相角(d)。在一些实施方式中，本发明的聚合物具有至多0.1°、至多0.5°、至多0.7°、至多0.9°、至多1°、至多1.5°、至多2°、至多2.7°、至多3.2°、至多4°、至多4.5°、至多6°、至多7.5°、至多8°、至多9°、至多10°、至多11°或至多13°的相角(d)。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明涉及制备本发明聚合物的方法，该方法包括以下步骤：(i)将不饱和部分(例如降冰片烯部分)(或其衍生物)连接至第一透明质酸(HA)链(或其衍生物)，并将四嗪部分(或其衍生物)连接至第二条HA链(或其衍生物)；(ii)将包括降冰片烯部分(或其衍生物)的第一(HA)链(或其衍生物)和包括四嗪部分(或其衍生物)的第二HA链(或其衍生物)混合；和(iii)使第一HA链与第二HA链交联。
在一些实施方式中，步骤(i)进一步包括纯化连接至不饱和部分或四嗪部分的HA链。
在不饱和部分或四嗪部分附接至HA链后，将所得产物从未反应的起始原料以及无机盐纯化。纯化可以通过本领域已知的任一种方法进行，如透析、沉淀、超滤或切向流过滤。
在一些实例中，交联反应在不输入外部能量的情况下在形成聚合物的可用范围的温度和条件下发生。在一个实施方式中，加热交联反应以增加反应效力。
在一些实施方式中，用于制备本发明聚合物的方法包括自发的交联反应。在一些实施方式中，“自发的化学反应”意为没有例如光、热或自由基辅助的过程。在一些实施方式中，交联反应可以在水中、在水性缓冲剂中或在细胞培养基中发生。培养基的非限制性实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、Hank平衡盐溶液、DulbeCCo改良Eagle培养基等。在一些实施方式中，交联可以在有机溶剂中发生。有机溶剂的非限制性实例包括但不限于甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。
在一些实施方式中，交联反应可以在至少-80℃、至少-50℃、至少-20℃、至少0℃、至少4℃、至少22℃、至少37℃或至少45℃且不超过60℃的宽范围温度下发生。在一些实施方式中，交联反应可以在(-80)-(-50)℃、(-60)-(-15)℃、(-20)-(-4)℃、(-5)-0℃、(-2)-4℃、2-8℃、5-20℃，15-30℃、25-40℃或35-55℃的宽范围温度下发生。
在一些实施方式中，步骤(ii)和(iii)原位进行，从而通过混合第一(HA)链和第二(HA)链形成交联聚合物。在一些实施方式中，该制备方法没有后处理步骤，如筛分或均质化。
在制备方法的一些实施方式中，在交联步骤之后，未反应的降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物可以保持附接至HA链。如本文所定义，术语“未反应的”指代未结合至另一个HA链或部分的降冰片烯部分或其衍生物和/或四嗪部分或其衍生物。
在一些实施方式中，降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物可以被修饰。在一些实施方式中，交联反应后修饰包括一个或多个分子与交联聚合物上的未结合的降冰片烯或其衍生物和/或未结合的四嗪或其衍生物的结合。
所述一个或多个分子的非限制性实例包括但不限于：氨基酸、麻醉剂、矿物质、维生素等。HA链上的未反应的降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物的量可以通过改变交联反应过程中第一HA链与第二HA链或反之的比例来调节。
组合物
在一些实施方式中，本发明涉及包括本发明聚合物的组合物。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括交联的和非交联的HA。在一些实施方式中，组合物的总HA聚合物含量(交联HA和非交联HA)以以下浓度存在：至多1mg/gr、至多5mg/gr、至多7mg/gr、至多8.5mg/gr、至多10mg/gr、至多12mg/gr、至多15mg/gr、至多17mg/gr、至多18.5mg/gr、至多20mg/gr、至多22mg/gr、或至多25mg/gr。在一些实施方式中，组合物的总HA聚合物含量为1-2.5mg/gr、3-5mg/gr、4-7mg/gr、6-9mg/gr、8-12mg/gr、10-13mg/gr、12-15mg/gr、14-17mg/gr、16-19mg/gr、18-22mg/gr或20-25mg/gr。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
根据另一个实施方式，本发明提供了药物组合物，其包括治疗有效量的本发明聚合物以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物可以促进聚合物向生物体的给予。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包括氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸包括任何氨基酸，天然存在的或非天然存在的。非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括但不限于D-氨基酸、羟基赖氨酸、4-羟基脯氨酸、N-Cbz保护的氨基戊酸(Nva)、鸟氨酸(O)、氨基辛酸(AoC)、2，4-二氨基丁酸(Abu)、高精氨酸、正亮氨酸(Nle)、N-甲基氨基丁酸(MeB)、2-萘基丙氨酸(2Np)、氨基庚酸(Ahp)、苯甘氨酸、β-苯脯氨酸、叔亮氨酸、4-氨基环己基丙氨酸(Cha)、N-甲基-正亮氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、N，N-二甲基氨基甘氨酸、N-甲基氨基甘氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、6-氨基己酸、反式-4-(氨基甲基)-环己烷羧酸、2-、3-和4-(氨基甲基)-苯甲酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环丙烷羧酸、氰基丙酸、2-苄基-5-氨基戊酸、正缬氨酸(Nva)、4-O-甲基苏氨酸(TMe)、5-O-甲基-高丝氨酸(hSM)、叔丁基丙氨酸(tBu)、环戊基丙氨酸(Cpa)、2-氨基异丁酸(Aib)、N-甲基甘氨酸(MeG)、N-甲基-丙氨酸(MeA)、N-甲基-苯丙氨酸(MeF)、2-噻吩基-丙氨酸(2Th)、3-噻吩基-丙氨酸(3Th)、O-甲基-酪氨酸(YMe)、3-苯并噻吩基丙氨酸(Bzt)和D-丙氨酸(DAl)。在一些实施方式中，氨基酸是通过肽键连接的氨基酸低聚物或二聚物。在一些实施方式中，低聚物是三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物，或者在一些实施方式中，是具有通过肽键彼此结合的超过11个氨基酸的聚合物。在一些实施方式中，氨基酸以肽、多肽或蛋白质的形式被包括在组合物中。在一些实施方式中，本发明的组合物中包括的肽、多肽或蛋白质处于选自但不限于下列的形式：天然的、变性的、中和的、消化的、交联的、未折叠的、还原的、氧化的或失活的形式。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包括一种或多种矿物质。矿物的非限制性实例包括但不限于：钾、氯离子、钠、钙、磷、镁、铁、锌、锰、铜、碘、铬、钼、硒或钴。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包括维生素。维生素的非限制性实例包括但不限于：维生素A(视黄醇、视网醛和四种类胡萝卜素，包括β-胡萝卜素)、维生素B1(硫胺)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸、烟酰胺、烟酰胺核苷)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸盐(酯))、维生素B12(氰钴胺、羟钴胺胺、甲基钴胺、腺苷钴胺)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(胆钙化固醇(D3)、麦角钙化固醇(D2))、维生素E(生育酚、生育三烯酚)或维生素K(叶绿醌、甲基萘醌)。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包括麻醉剂。如本文所用，术语“麻醉剂”指代防止疼痛(如在手术期间)或完全阻断任何感觉的任何分子或物质。在一个实施方式中，麻醉剂是全身(general)麻醉剂。在一个实施方式中，麻醉剂是局部麻醉剂。在一些实施方式中，局部麻醉剂在维持意识的同时引起限于身体某个区域的可逆的感觉丧失。
麻醉剂的非限制性实例包括但不限于阿替卡因、普鲁卡因(procaine)、氨甲卡因(amethocaine)、利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、左旋布比卡因(levobupivacaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、地布卡因(dibucaine)和可卡因。在一些实施方式中、本发明的组合物包括0.01-0.1％(w/w)、0.05-0.15％(w/w)、0.1-0.3％(w/w)、0.2-0.5％(w/w)、0.4-0.7％(w/w)、0.6-0.85％(w/w)、0.8-1.25％(w/w)、1-1.5％(w/w)、1.4-2％(w/w)、1.75-3％(w/w)、2.5-3.75％(w/w)、3.5-4.5％(w/w)或4.25-5.25％(w/w)的麻醉剂。在一些实施方式中、本发明的组合物包括至多0.01％(w/w)、至多0.05％(w/w)、至多0.75％(w/w)、至多1％(w/w)、至多1.5％(w/w)、至多2％(w/w)、至多3％(w/w)、至多4％(w/w)或至多5.5％(w/w)的麻醉剂。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包括非交联的HA。在一些实施方式中，非交联的HA指代不与另一聚合物(例如另一HA聚合物)相互连接的任何HA聚合物。在一些实施方式中，术语“相互连接”指代通过不饱和部分(例如降冰片烯部分)或其衍生物与四嗪部分或其衍生物形成的共价键。在一些实施方式中，如本文所定义，非交联HA的百分比是最终产物(即组合物)中非交联HA在总HA含量中的计算比例。在一些实施方式中，组合物包括1至6mg/gr、2至7mg/gr、3至8mg/gr、4至9mg/gr、5至10mg/gr、6至11mg/gr、7至12mg/gr、8至13mg/gr、9至14mg/gr、10至15mg/gr、11至16mg/gr、12至17mg/gr、13至18mg/gr、14至19mg/gr、15至20mg/gr、16至21mg/gr、17至22mg/gr、18至25mg/gr或其间任何范围的总HA含量。在一些实施方式中，本发明的组合物中的非交联HA含量为：至多5％、至多7％、至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多27％、至多30％或35％。在一些实施方式中，非交联HA以以下浓度存在于组合物中：1-5％、2.5-7％、4-9％、8-12％、10-16％、15-20％、18-25％、22-28％或27-35％。各可能性表示本发明的一个单独实施方式。
在另一实施方式中，本发明的药物组合物可以以本发明聚合物的药学上可接受的盐的形式配制。在另一实施方式中，药学上可接受的盐包括衍生自无毒的无机或有机酸(如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等)的盐。在一些实施方式中，所述盐用游离羧基形成，如衍生自无毒的无机或有机碱(如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)的盐。
如本文所用，术语“载体”指代与本公开的化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当药物组合物被静脉内给予时，水是优选的载体。盐溶液以及右旋糖溶液和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如需，组合物还可包括少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；并且用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖，也被考虑。载体可总共占本文所提出的药物组合物的按重量计约0.1％至约99.9％。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意为适于给予对象，例如人。例如，术语“药学上可接受的”可意为被联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出用于动物和更具体地人类。
在另一实施方式中，本发明的组合物采取溶液剂、悬浮液、乳液、片剂、粉末、凝胶、泡沫、糊剂、持续释放制剂等形式。合适的药物载体的实例被描述于：Remington′sPharmaceutical Sciences″，E.W.Martin著，其内容在此通过引用并入。这样的组合物将包括治疗有效量的本发明的聚合物，优选以基本上纯化的形式，以及适量的载体，以提供用于向对象适当给予的形式。
根据本发明的实施方式，药物组合物包含0.1-95％的本发明聚合物(一种或多种)。根据本发明的另一个实施方式，药物组合物包含1-70％的聚合物。根据本发明的另一实施方式，待给予的组合物或制剂可以包含一定量的聚合物，根据本发明的实施方式有效治疗所治疗对象的状况或疾病的量。
本发明的实施方式涉及以单位剂型呈现并且通过药学领域中公知的任何方法制备的本发明的聚合物。在本发明的实施方式中，单位剂型为片剂、胶囊、锭剂、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。另外，可任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中要采用的精确剂量还将取决于给予途径以及疾病或病症的属性，并且应根据从业者的判断和各患者的情况来决定。可以从体外或体内动物模型试验生物测定或系统得出的剂量-响应曲线推算有效剂量。
根据一个实施方式，本发明的组合物以药物组合物的形式给予，所述药物组合物包括本发明的活性成分(聚合物)中的至少一种以及药学上可接受的载体或稀释剂。在另一实施方式中，本发明的组合物可以被单独给予或以任何常规经皮剂型一起给予。
如本文所用，术语“给予”、“给药”和类似术语指代在合理的医学实践中以提供治疗效果的方式将包含活性剂的组合物递送至对象的任何方法。
根据目标组织的位置，本发明的聚合物可以以任何适于向目标组织提供聚合物的方式给予。因此，例如，可以将包含本发明聚合物的组合物引入(例如注射)到目标组织中，其将使聚合物分布在组织中。
在一些实施方式中，包括所述聚合物的药物组合物通过眼科、经皮、皮内、皮下、肌内或腹膜内给予途径来给予。药物组合物的给予途径将取决于待治疗的疾病或状况。合适的给予途径包括但不限于肠胃外注射，例如，皮内、静脉内、肌内、损伤内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径给予的聚合物的生物利用度可低于通过肠胃外注射给予时，但通过使用适当的制剂，考虑通过经皮、口服、直肠、阴道、局部、鼻部、吸入和眼部治疗方式来给予本发明的组合物是可能的。
对于局部应用，可以将本发明的聚合物与药学上可接受的载体组合，从而基于期望的活性来递送有效剂量。载体可以是例如但不限于油膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫或胶凝棒的形式。
根据一些实施方式，本发明的聚合物可以在控释系统中递送。在再另一实施方式中，控释系统可被置于治疗目标附近，因此仅需全身剂量的一部分。
在一个实施方式中，将理解，本发明的聚合物可以与其他活性剂一起被提供给个体以实现与用各试剂单独治疗相比改善的治疗效果。在另一实施方式中，采取针对联合疗法相关不利副作用的措施(例如，补充剂的施用(用药，dosing)和选择)。
在一个实施方式中，根据待治疗状况的严重性和响应性，用药可以是单次或多次给予，并且治疗过程持续数天至数周或直至引起治愈或实现状态疾病减轻。
在一些实施方式中，以治疗安全和有效量给予聚合物。如本文所用，术语“安全和有效量”指代足以产生期望的治疗响应而在以当前描述的方式使用时没有与合理效益/风险比相称的过度不利副作用(例如毒性、刺激或过敏响应)的组分量。在另一实施方式中，聚合物的治疗有效量是体内可测的预期生物学或治疗效果所需的聚合物量。实际给予量以及给予速率和时间过程将取决于所治疗疾状况的属性和严重性。治疗处方(例如剂量、计时等的决定)在全科从业者或专科从业者的责任之内，并且一般要考虑待治疗的障碍或要纠正的缺陷、个体患者的情况、递送位点、给予方法和从业者已知的其他因素。技术和方案的实例可以在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21stEd.，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，Pa.，(2005)中找到。在一些实施方式中，有效量或剂量的制备可以最初从体外测定估测。在一个实施方式中，剂量可以在动物模型中配制，并且这种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。
在一个实施方式中，本文所述活性成分的毒性和治疗功效可以在体外在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。在一个实施方式中，剂量根据所用剂型和所用给予途径而变化。在一个实施方式中，各个医师可以根据患者的情况来选择确切的制剂、给予途径和剂量。[参见，例如，Fingl，et al.，(1975)″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1p.1]。
包含当前描述的聚合物作为活性成分的药物组合物可以按照常规的药物混合技术来制备。参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，MackPublishing Co.，Easton，Pa.(1990)。另见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，21st Ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.(2005)。
在一个实施方式中，组合物，包括在相容性药物载体中配制的本发明的制剂，被制备，被布置在适当的容器中，并被标记用于治疗指定状况。
在一个实施方式中，本发明的组合物呈现于包装或分配器装置中，如FDA批准的试剂盒，其包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，如吸塑包装(blister pack)。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有给予说明。在一个实施方式中，包装或分配器由容器关联的告示物容纳，该告示物是由调控药物生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该告示物反映了该机构对组合物形式或人类或兽给予的批准。在一个实施方式中，这种该告示物是美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)批准的用于处方药物的标签或被批准的产品插页。
使用方法。
在一些实施方式中，本发明涉及在有需要的对象中填充或充盈组织的方法，该方法包括向对象给予药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的本发明聚合物。
在一些实施方式中，如本文所定义的填充或充盈方法指代软填充材料在皮肤组织中的注射。在一些实施方式中，填充是填充皱纹，如面部皱纹。在一些实施方式中，填充是恢复皮肤的光滑外观或质地。
在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到皮肤组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到牙龈组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到软骨组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到眼科组织中。
根据一些实施方式，注射可以根据任何方法和使用本领域已知的任何注射装置进行。注射装置的非限制性实例包括但不限于注射器、微注射器、无针装置、微针、针、套管和导管的使用。针规(needle gauges)的非限制性实例包括但不限于18G、19G、20G、21G、22G、23G、24G、25G、26G、27G、28G、29G、30G、31G、32G、33G或34G。
在一些实施方式中，本发明的方法涉及治疗有需要的对象中的关节炎。关节炎的非限制性实例包括但不限于急性感染性关节炎、焦磷酸钙关节炎、颞下颌关节(TMJ)关节炎、反应性关节炎、银屑病性关节炎、慢性感染性关节炎、幼年特发性关节炎(JIA)、类风湿性关节炎(RA)或假体关节感染性关节炎。
在一个实施方式中，本发明的方法涉及治疗患有骨关节炎的对象。
在一些实施方式中，本发明的方法涉及在外科程序之前或之后预防或治疗对象的眼科组织损伤。
在一些实施方式中，该方法涉及局部施用本发明的聚合物或组合物。在一些实施方式中，本发明的聚合物被施用在皮肤组织上。在一些实施方式中，该方法涉及促进/增强有需要的对象中的伤口愈合。在一些实施方式中，该方法涉及促进/增强有需要的对象中的伤口闭合。
在一个实施方式中，将本发明的聚合物本身提供给对象。在一个实施方式中，将一种或多种本发明的聚合物本身提供给对象。在一个实施方式中，将本发明的聚合物作为药物组合物(其中其与药学上可接受的载体混合)的一部分提供给对象。在一个实施方式中，将一种或多种本发明的聚合物作为药物组合物(其中其与药学上可接受的载体混合)的一部分提供给对象。
如本文所用的术语“对象”指代动物，更具体地指代非人类哺乳动物和人类生物体。非人类动物对象还可包括动物的产前形式，例如胚胎或胎儿。非人类动物的非限制性实例包括但不限于：马、牛、骆驼、山羊、绵羊、狗、猫、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠或猪。在一个实施方式中，所述对象是人。人类对象也可包括胎儿。在一个实施方式中，有需要的对象是患有关节炎相关状况和/或有患关节炎相关状况风险的对象。在一些实施方式中，有需要的对象是遭受组织体积减少的对象。在一些实施方式中，组织体积减少被称为“去充盈化”。在一些实施方式中，组织去充盈化包括脂肪损失、水损失、水分损失、胞外基质降解、胶原蛋白损失或其他。在一些实施方式中，去充盈化引起皮肤下垂和恶化。在一些实施方式中，对象遭受烧伤。在一些实施方式中，需要伤口闭合方法的对象遭受体液泄漏，如出血。如本文所用，术语疾病、障碍或状况的“治疗“或“处理”涵盖其至少一种症状的减轻、其严重性的降低或其进展的抑制。治疗并不意味着该疾病、障碍或状况完全治愈。作为有效的治疗，本文中有用的组合物仅需降低疾病、障碍或状况的严重性，降低其相关症状的严重性，或提供患者或对象的生活质量的改善。
如本文所用，术语疾病、障碍或状况的“预防”包括延迟、预防、抑制或抑制疾病、障碍或状况的发作。如根据当前描述的主题所用，术语“预防”涉及这样的预防方法：其中在疾病/障碍过程引发或发作之前，使对象暴露于当前描述的聚合物或包括该聚合物的组合物。在任何情况下，术语预防都可用于涵盖防止。相反，术语“治疗”指代临床施用活性剂，以对抗患者体内已存在的其临床症状已发生的状况。
如本文所用，术语“状况”包括自正常态的解剖学和生理学偏差，其构成活体动物或其部分之一的正常状态的损害，该损害中断或改变身体功能的执行。
试剂盒
根据一些实施方式，本发明提供了试剂盒，其包括与不饱和部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物。术语“HA链或其衍生物”、“不饱和部分或其衍生物”和“四嗪部分或其衍生物”如上文所定义。
在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包括与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物，以及被指定用于给予剂量的用于在皮肤中或通过皮肤注射的装置或用于皮肤微穿孔的装置。
根据一些实施方式，本发明提供了试剂盒，其包括聚合物，该聚合物包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物，其中所述第一HA链和所述第二HA链通过一个或多个连接体交联，其中所述一个或多个连接体包括与四嗪部分或其衍生物偶联的降冰片烯部分或其衍生物，并且其中所述聚合物的特征在于通过1H NMR测定的交联度为0.2至4％。
在一些实施方式中，注射装置如上公开。在一个实施方式中，注射装置是一次性的。在一些实施方式中，注射装置适于表皮内和/或真皮内和/或皮下注射。在一些实施方式中，注射装置适于美塑疗法(mesotherapy)技术。如本文所用，术语“美塑疗法”指代非外科美容药物治疗。
在一些实施方式中，试剂盒还包括如上公开的氨基酸。
在一些实施方式中，试剂盒还包括如上公开的矿物质。
在一些实施方式中，试剂盒还包括如上公开的维生素。
在一些实施方式中，试剂盒还包括如上公开的麻醉剂。
在一些实施方式中，试剂盒还包括如上公开的药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，对包装进行刻痕(scored)，以允许对与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或任何组合取样。
在一个实施方式中，包装为安瓿、长瓶或胶囊的形式。在一个实施方式中，胶囊是软胶囊。
在一些实施方式中，以上公开的试剂盒的组分是无菌的。如本文所用，术语“无菌的，，指代没有生物污染物的状态。任何灭菌方法都是适用的，并且对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，试剂盒还包括游离HA链或其衍生物。如本文所定义，游离HA链或其衍生物是不与四嗪部分、降冰片烯部分或其衍生物偶联的HA链。
根据一些实施方式，通过以下来使用试剂盒：混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物，和将通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物而形成的组合物应用于填充或充盈方法。
在一些实施方式中，通过以下来利用试剂盒：将通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或衍生物偶联的第二HA链或其衍生物而形成的组合物与游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合进一步混合，以及将通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物而形成的组合物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合应用于填充或充盈方法。
在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约3∶1的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约3∶2的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约2∶1的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约1∶1的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约1∶2的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约2∶3的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以约1∶3的比例混合的说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以上述任何比例或其间任何比例混合的说明书。
在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物与与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合混合的说明书。
在一些实施方式中，通过以下来利用试剂盒：将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合混合，其中混合包括将该组分引入注射装置。
在一些实施方式中，试剂盒包括关于将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合混合的说明书，其中在注射装置中进行混合。
在本主题试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合而形成的组合物的交联度为0.01-0.1％、0.01-0.5％、0.05-0.1％、0.1-0.3％、0.1-0.5％、0.1-0.75％、0.1-1％、1-1.75％、1-2％、1-2.5％、2-2.5％、2.25-3％、2.5-3.25％、3-3.75％、3.6-4.2％、4-5.25％、5-6.5％、6-7.5％、7-8.5％、8-9.25％、9-10.5％、10-12.5％或其间任何范围。
在本主题试剂盒的一些实施方式中，通过混合与不饱和部分(例如降冰片烯部分)或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合而形成的组合物的相角(δ)为0.1-0.5°、0.1-0.9°、0.5-1°、0.7-1.5°、1-2.5°、2-4.5°、3-4.75°、4.7-5.5°、5-7.5°、6-8°、7-8.5°、8.25-9.5°、9-10.5°、9.5-12°或其间任何范围。
在本主题试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合而形成的组合物的弹性模量为10-500Pa、20-1,000Pa、30-600Pa、40-1,000Pa、40-5,000Pa、50-10,000Pa、500-50,000Pa、500-10,000Pa、500-5,000Pa、500-1,000Pa、1,000-50,000Pa、1,000-10,000Pa、1,000-5,000Pa、50-20,000Pa、500-20,000Pa、或1,000-20,000Pa或其间任何范围。
在一些实施方式中，试剂盒的组分被包装在容器内。
在一些实施方式中，容器由选自以下的材料制成：薄壁膜或塑料(透明或不透明)、基于纸板型、箔、刚性塑料、金属(例如铝)、玻璃等。
在一些实施方式中，试剂盒的内容物如下所述被包装，以允许组分存储到其被需要。
在一些实施方式中，试剂盒的一些或全部组分可以被包装在合适的包装中以保持无菌性。
在一些实施方式中，包装具有盖，该盖允许在存储期间气密密封并且在使用时可以被针或套管穿刺。
在一些实施方式中，试剂盒的组分被存储在主试剂盒容纳元件内的分开的容器中，例如盒或类似结构，可以是或可以不是气密容器，例如，以进一步保持试剂盒的组分中的一些或全部的无菌性。
在一些实施方式中，试剂盒中提供的与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂的剂量可足以用于单次施用或多次施用。
在一些实施方式中，试剂盒可以具有多剂量的与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂，其被包装在单一容器中，例如单一管、长瓶、小瓶、Eppendorf等。
在一些实施方式中，试剂盒可以具有单独包装的多剂量的与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂，以使某些试剂盒可具有多于一个容器的与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂。
在一些实施方式中，多剂量的与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物、游离HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂可被装在一个单独的容器中。
在一些实施方式中，试剂盒包括关于制备其中所用组合物以及如何实施本发明的方法的说明书。
在一些实施方式中，说明书可以被记录在合适的记录介质或基材上。例如，说明书可以被印刷在诸如纸或塑料等的基材上。
在一些实施方式中，说明书可以在试剂盒中作为包装插页、在试剂盒的容器或其部件的标签中(即，与包装或子包装关联)存在等。在其他实施方式中，说明书作为电子存储数据文件存在，存在于适当的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM，磁盘等。在其他实施方式中，试剂盒中不存在实际的说明书，而是用于从远程来源(例如，通过互联网)获得说明书的方式。这种实施方式的实例是这样的试剂盒：其包含网址，该网址上可以查看说明书和/或可以从该网址下载说明书。如同说明书，这种获得说明书的方式被记录在合适的基材上。
除非另有说明，本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比例范围应被理解为包括该范围内的任何整数浓度、百分比或比例及其分数，例如整数的十分之一和百分之一。
除非另有说明，本文所述的与任何物理特征如聚合物亚单元、尺寸或厚度有关的任何数值范围应被理解为包括所述范围内的任何整数。
如本文所用，术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指代需要治疗的任何对象，具体地哺乳动物对象，例如人。
在讨论中，除非另有说明，修饰本发明的实施方式的一个或多个特征的情况或关系的形容词(如“基本上”和“约”)被理解为意为该情况或特征被限定为在实施方式的操作对于目的应用而言可接受的公差范围之内。除非另有说明，说明书和权利要求书中的词语“或”被认为是包容性的“或”，而不是排他性的“或”，并且表示其关联项目中的至少一项或任何组合。
应当理解，如上文和本文其他部分使用的术语“一个”和“一种”指代所列组分中的“一个(种)或多个(种)”。本领域的普通技术人员清楚，除非另外特别说明，单数的使用包括复数。因此，术语“一个”、“一种”和“至少一个(种)”在本申请中被可互换地使用。
为了更好地理解本教导而不以任何方式限制教导的范围，除非另有说明，说明书和权利要求书中使用的所有表示数量、百分比或比例的数值以及其他数值将被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，以下说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是近似值，其可以根据所要获得的期望性质而变化。至少，各数值参数应至少根据所报告的有效数的数值并通过应用常规舍入技术来解释。
在本申请的说明书和权利要求书中，动词“包括”、“包含”和“具有”中的每一个及其变型用来表示该动词的一个或多个客体不一定是该动词的主体或主体的组分、元素或部分的完全列举。
本文所用的其他术语旨在由其本领域公知含义来定义。
本发明的其他目的、优点和新特征在考察以下实施例(其并非旨在限制)后对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。另外，如上文所述且如所附权利要求所述的本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中均得到实验支持。
应理解，为清楚起见在分开的实施方式环境中描述的本发明的某些特征也可以在单一实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在单一实施方式环境中描述的本发明的各种特征也可以分开地提供或以任何合适的子组合或在合适时在本发明的任何其他所述实施方式中提供。在各种实施方式环境中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式没有那些要素就不能工作。
在一个实施方式中，术语“烷基”包括脂族烃，包括直链和支链基团。优选地，烷基具有21至100个碳原子，更优选地21至50个碳原子。无论何时本文描述了数值范围；例如“21-100”，其表示该基团(在这种情况下，烷基)可包括21个碳原子、22个碳原子、23个碳原子等，上至并且包括100个碳原子。
在一个实施方式中，术语“长烷基”包括在其主链中具有至少20个碳原子的烷基(连续的共价附接的原子的最长路径)。因此，短烷基具有20个或更少的主链碳。在一个实施方式中，烷基可以是取代的或未取代的。在一个实施方式中，本文所用的术语“烷基”还涵盖饱和或不饱和烃，因此该术语进一步涵盖烯基和炔基。
在一个实施方式中，术语“烯基”描述了具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和的如本文所定义的烷基。烯基可以被一个或多个取代基取代或未被取代，如上所述。在一个实施方式中，如本文所定义的术语“炔基”是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和的烷基。炔基可以被一个或多个取代基取代或未被取代。
在一个实施方式中，术语“不饱和”描述了含有一个或多个不饱和键的化合物。在一些实施方式中，不饱和键指代双键和/或三键。
在一个实施方式中，术语“环烷基”描述了全碳单环环或稠合环(即，共享相邻一对碳原子的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子体系。环烷基可以是取代的或未取代的。
在一个实施方式中，术语“芳基”描述具有完全共轭π电子体系的全碳单环或稠环多环(即，共享相邻的碳原子对的环)基团。在一个实施方式中，芳基可以是取代的或未取代的。
在一个实施方式中，术语“烷氧基”描述-O-烷基和-O-环烷基。在一个实施方式中，术语“芳氧基”描述-O-芳基。在一个实施方式中，本文通式中的术语烷基、环烷基和芳基可被一个或多个取代基取代，其中各取代基可独立地是例如卤基(halide)、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基、硝基、胺、羟基、巯基、硫代烷氧基、硫代羟基、羧基、酰胺、芳基和芳氧基，取决于被取代的基团及其在分子中的位置。
在一个实施方式中，“卤基/卤离子”、“卤素”或“卤代”描述氟、氯、溴或碘。在一个实施方式中，“卤代烷基”描述了进一步被一个或多个卤基取代的如本文所定义的烷基。在一个实施方式中，“卤代烷氧基”描述了进一步被一个或多个卤基取代的如本文所定义的烷氧基。在一个实施方式中，术语“羟基”(“hydroxyl”或“hydroxy”)描述-OH基团。在一个实施方式中，术语“硫代羟基”或“巯基”描述-SH基团。在一个实施方式中，术语“硫代烷氧基”描述-S-烷基和-S-环烷基。在一个实施方式中，术语“硫代芳氧基”描述-S-芳基和-S-杂芳基。在一个实施方式中，术语“胺”描述具有R’和R”的-NR’R”基团。在一个实施方式中，术语“杂芳基”描述环中具有一个或多个诸如如氮、氧和硫的原子并且另外还具有完全共轭的π电子体系的单环环或稠合环(即，共享相邻一对原子的环)。杂芳基的非限制实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。
在一个实施方式中，术语“杂脂环族”或“杂环基”描述环中具有一个或多个诸如氮、氧和硫的原子的单环环或稠合环基团。该环还可以具有一个或多个双键。在一个实施方式中，该环不具有完全共轭的π电子体系。代表性实例是哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉基等。
在一个实施方式中，术语“羧基”或“羧酸基”描述-C(＝O)-OR′基团，其中R′是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)或杂脂环族(通过环碳键合)。
在一个实施方式中，术语“羰基”描述-C(＝O)-R′基团，其中R′如上文所定义。在一个实施方式中，上述术语还包括其硫代衍生物(硫代羧基和硫代羰基)。
在一个实施方式中，术语“硫代羰基”描述-C(＝S)-R′基团，其中R′如上文所定义。在一个实施方式中，术语“硫代羧基”描述-C(＝S)-OR′基团，其中R′如本文所定义。在一个实施方式中，术语“亚磺酰基″描述-S(＝O)-R′基团，其中R′如本文所定义。在一个实施方式中，术语“磺酰基”或“磺酸基”描述-S(＝O)2-R′基团，其中R′如本文所定义。在一个实施方式中，术语“氨基甲酰基”或“氨基甲酸基”描述-OC(＝O)-NR′R”基团，其中R′如本文所定义且R”如R′一般定义。
在一个实施方式中，术语“硝基”指代-NO2基团。在一个实施方式中，术语“氰基”或“腈”基团指代-C≡指代-N3基团。在一个实施方式中，术语“磺酰胺”指代-S(＝O)2-NR′R”基团，其中R′和R”如本文所定义。指-N3基团。在一个实施方式中，术语“磺酰胺”指代-S(＝O)2-NR′R”基团，其中R′和R”如本文所定义。
在一个实施方式中，术语“膦酰基”或“膦酸基”描述-O-P(＝O)(OR′)2基团，其中R′如上文所定义。在一个实施方式中，术语“次膦酰基”描述-PR′R”基团，其中R′和R”如上文所定义。
在一个实施方式中，术语“烷芳基”描述了被芳基或杂芳基取代的如本文所定义的烷基。在一个实施方式中，烷芳基是苄基。
在一个实施方式中，术语“杂芳基”描述环中具有一个或多个诸如例如氮、氧和硫的原子并且另外还具有完全共轭的π电子体系的单环环或稠合环(即，共享相邻一对原子的环)。杂芳基的非限制实例包括吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可以被一个或多个取代基取代或未被取代，如上所述。代表性实例是噻二唑、吡啶、吡咯、/>唑、吲哚、嘌呤等。
在一个实施方式中，术语“卤代”和“卤基”在本文中被可互换地使用，描述了卤素原子，即氟、氯、溴或碘，在本文中也称为氟基、氯基、溴基和碘基。在一个实施方式中，术语“卤代烷基”描述了进一步被一个或多个卤基取代的如上所定义的烷基。
实施例
材料和方法。
方法A：HA-四嗪或HA-降冰片烯的制备。
将透明质酸钠盐以5至10mg/g的浓度溶于2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲剂(100mM，pH 5.5)中。获得均匀溶液后，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉盐酸盐(DMTMM)，然后加入所要偶联的伯胺。根据期望的修饰度调节试剂量。将反应在10至50℃下保持搅动24小时，然后用NaCI饱和溶液透析(MWCO＝12kDa)24小时，然后用纯化水透析几次。将该溶液转移至烧瓶，冷却至-80℃并冷冻干燥，以提供固体形式的修饰HA产物。
方法B：HA-四嗪或HA-降冰片烯或HA-苯乙烯的制备。
将透明质酸钠盐以5至10mg/g的浓度溶解在双蒸水(DDW)中。获得均匀溶液后，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉盐酸盐(DMTMM)，然后加入所要偶联的伯胺。根据期望的修饰度调节试剂量。将反应在20到90℃下保持搅动4小时，然后用NaCl饱和溶液透析(MWCO＝12kDa)24小时，然后用纯化水透析几次。将该溶液转移至烧瓶，冷却至-80℃并冷冻干燥，以提供固体形式的修饰HA产物。
确定HA-四嗪，HA-降冰片烯，HA-苯乙烯的修饰度和凝胶的交联度。
为了确定修饰度，将修饰HA(例如HA-四嗪或HA-降冰片烯或HA-苯乙烯)的干燥样品溶解在D2O中，并用透明质酸酶(来自牛睾丸，IV-S型，来自Sigma Aldrich)以300单位/mL的最终浓度处理，直至溶液是液体。通过1H NMR分析样品。通过计算积分比来确定修饰度，如下所述。
计算HA-四嗪(式IIIB)的修饰度，相应于四嗪的芳族质子的峰下面积(7.5至7.7ppm和8.1至8.9ppm，8H)与相应于透明质酸的葡萄糖胺残基的N-乙酰化质子的峰下面积(2.0ppm，3H)之比。HA-四嗪的1H NMR波谱被提供在图1中。
HA-降冰片烯(式IIA)的修饰度：相应于亚烷基质子的峰下面积(5.8至6.3ppm，2H)与相应于透明质酸的葡萄糖胺残基的N-酰基质子的峰下面积(2.0ppm，3H)之比。HA-降冰片烯的1H NMR波谱被提供在图2中。
HA-苯乙烯(式IA)的修饰度：相应于亚烷基质子的峰下面积(5.36ppm、5.90ppm和6.8ppm，3H时)与相应于透明质酸的葡萄糖胺残基的N-乙酰基质子的信号下方面积(2.0ppm，3H)之比。HA-苯乙烯的1H NMR波谱被提供在图3中。
凝胶的交联度根据以下方程式计算：
[Dc＝(Dm(Tet)/M(Tet)+Dm(Nor)/M(Nor))/(M(Tet)+M(Nor))]。
其中：
-Dc是凝胶的交联度；
-Dm(Tet)是HA-四嗪的修饰度，通过1H NMR确定；
-Dm(Nor)是HA-降冰片烯的修饰度，通过1H NMR确定；
-M(Tet)是参与交联的HA-四嗪的重量；
-M(Nor)是参与交联的HA-降冰片烯的重量。
HA-四嗪和HA-降冰片烯的交联
将HA-四嗪和HA-降冰片烯的两个样品分别以下文指定的浓度(表1)溶解在pH值在6.8至7.8范围内的磷酸盐缓冲溶液中。混合相同体积的两种溶液，并在37℃下保持搅动18小时，然后进一步在室温下搅动，直至流变凝胶参数稳定。对于包括非交联透明质酸的样品，在反应后加入相同浓度的非交联透明质酸，并在搅动下均质化。所得凝胶的交联度是所用HA-四嗪和HA-降冰片烯的修饰度的平均值。
流变参数的测量。
相角δ(以°为单位)和弹性模量G′(以Pa为单位)的测量在25℃下以1Hz的频率，以1至1,000Pa的应力扫描或0.35至3500％的应变扫描，利用流变仪(TheRmo HaakeMARS 6000或RS1或TA DHR1)，用锯齿状或喷砂板——板几何结构为20mm直径——进行。
表1.流变测试总结
条目7-24中使用的连接体展示在所附权利要求5和7中。
实施例1
HA交联聚合物的流变参数
首先，检查市售的皮肤填充剂(表1，条目1-6、25、26)。数据显示，小于10°的δ仅在具有高含量HA(20mg/gr-条目1-3)和/或高交联度(6-9％-条目2-5)的商品中获得。还观察到具有高含量HA和高交联度导致δ大于10°的产品(条目6)。较低浓度(12mg/gr，条目25-26)并且高或低交联度(6％-条目25或1％-条目26)的产品导致δ大于10°。
将含有10mg/gr透明质酸的样品以各种交联度配制(表1，条目7-10、20)。交联度在3.5％至0.9％范围内得到低δ。然而，非常低的交联度，如0.35％，未能导致凝胶形成(条目10)。
然后用10mg/gr的透明质酸配制样品，并最终产物中添加不同含量的非交联HA(表1，条目11-14)。如通过δ值增加而观察到，非交联HA的添加降低了交联材料的提升能力。尽管如此，包含上至20％的HA含量的凝胶仍显示δ值在10°以下。
将具有固定交联度的样品进一步以1.3％或0.9％以及各种HA含量配制(表1，条目15-17、20-22)。从15mg/gr至10mg/gr和5mg/gr的减少(条目15-17)或从10mg/gr至7.5mg/gr和5mg/gr的减少(条目20-22)降低了交联材料的凝胶弹性模量(G’)。然而，即使HA含量低达5mg/gr，δ值仍保持在10°以下。
为了测试交联分子的一般性(普遍性，generality)，将四嗪衍生物和降冰片烯衍生物与固定的HA含量(10mg/gr；表1，条目18-19)混合。如示，获得10°以下的δ值。
为了测试降冰片烯被另一不饱和部分取代，将HA通过苯乙烯修饰(式IA)。将四嗪衍生物与苯乙烯衍生物以1.1％的交联度和10mg/gr或7.5mg/gr的HA含量混合，提供10°以下的δ值(表1，条目23-24)。
线性粘弹性区域(LVR)表示动态应变/应力扫描下的弹性模量(G′)的线性区域。较长的LVR区域关联于凝胶的优越特性，因为其随着施力的增加而保留其粘弹性。LVR是作为流变仪(TA DHR1)的标准应变扫描周期中的起点(G′曲线的2个切线的交点)测量，如图4所示。
商品皮肤填充剂提供了一系列起点值，从非常低达9.4Pa(表2，条目7)到非常高达421Pa(表2，条目2)。商品的LVR数据清楚地表明与HA含量的相关下(表2，在交联度为6％的条目3-6，交联度为1％时的条目1和7)。商业产品的LVR数据也显示出与交联度的明显相关性(表2，条目1-3，在20mg/gr下)。根据本发明的凝胶显示LVR和HA含量与交联度之间相似的相关性(表2，条目8-13)。然而，根据本发明的凝胶显示出与市售产品相比更高的LVR，因此具有更优的材料特性，同时包括较低的HA含量和较低的交联度(表2，条目8-12vs条目1、4-7，和条目13vs条目7)。
表2.LVR值比较
实施例2
HA交联聚合物的可挤出性
将HA-四嗪和HA-降冰片烯的两个样品分别以相同的浓度溶解于pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中。随后，将相同体积的各样品混合在一起，并立即引入1mL长的环烯烃聚合物(COP)注射器中。将所有注射器在37℃下培育18小时，然后进一步在室温下(培育)，直至流变凝胶参数稳定。
利用Mecmesin牵引台式仪器测量挤出力。通过从配备有27G1/2”或291/2”或30G1/2”针的1mL注射器以12.5mm/min的标准速率挤出凝胶而采集数据。对于如上所述制备的凝胶，不进行筛分或破碎。
代表性的挤出力数据列于表3。Restylane和Voluma分别被提供以29G1/2”和27G1/2”针(表3，条目1-2)，并且具有相对较高的G值(表1，条目1、3)。Volbella被提供以30G1/2”针(表3，条目3)和中等范围G′(表1，条目5)。
表3中的条目4-9代表本发明的凝胶，其在1mL注射器内制备而不进行筛分或均质化。如表3所示，挤出力值在可接受的范围内。条目4的凝胶通过27G1/2”针挤出，而条目5-9的凝胶通过30G1/2”针挤出。
表3.挤出力值。
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实施例3
水中的凝胶溶胀
通过将200mg各产品/产物与DDW(1.0ml)混合并在37℃下培育6小时来制备凝胶样品。在将混合物离心(在10,000rpm下10分钟，两次)后，小心地取出水上清液，并称重剩余的溶胀凝胶。溶胀比通过以下方程式计算：。
溶胀比＝(溶胀凝胶的重量)/(凝胶的初始重量)。
表4.水中的凝胶溶胀比
结果表明，与具有较高HA含量和/或较高交联度的商品皮肤填充剂(表4，条目1-3)相比，根据本发明制备的凝胶(表4，条目4-6)的凝胶溶胀比较低。水中的凝胶溶胀减少很可能降低体内溶胀和浮肿的风险。
实施例4。
体内植入数据
利用27G1/2”皮下针对五只Sprague-Dawley大鼠皮下注射凝胶样品(相应于表4的条目1、2、4-6)。在第1天，每只动物接受100微升凝胶样品的5次注射。每个凝胶样品在各种动物中注射5次。注射后95天跟踪动物。在任何动物的任何注射位点均未发现红斑或水肿。在研究期间未发现任何动物的总体健康状况发生变化。注射后95天后对注射位点的组织病理学评价未显示任何注射位点的病理变化。
在注射后第1天至第95天的研究过程中，用电子卡尺测量皮下凝胶块的尺寸。皮下凝胶尺寸通过触诊在皮肤下检测到的和用电子卡尺测量的球块的长度×宽度计算。每个产品5个注射位点的平均数据(图5)显示了测试物2(表4的条目5所描述的凝胶)和测试物3(表4的条目4所描述的凝胶)的凝胶块尺寸显著大于两个对照，即具有较高HA含量和/或较高交联度的商品皮肤填充剂(对照1在表4的条目2中被描述，对照2在表2的条目1中被描述)。具有5mg/gr的非常低HA含量的测试物1(表4的条目6所描述的凝胶)显示皮下凝胶球块的尺寸与具有20mg/gr的显著较高HA含量的对照2(表4的条目1所描述的凝胶)相同。
尽管已经在本文中示例和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现将想到很多改动、替换、改变和等同形式。因此，应理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这种改动和改变。

Claims (17)

1.聚合物，包括第一透明质酸(HA)链和第二HA链，其中所述第一HA链和所述第二HA链通过一个或多个连接体交联，其中所述一个或多个连接体包括与四嗪部分结合的不饱和部分，
其中所述不饱和部分是：
其中所述四嗪部分是：
其中所述交联的特征在于交联度为0.2至4％。
2.根据权利要求1所述的聚合物，其中所述第一HA链和所述第二HA链的平均分子量为100,000至4,000,000道尔顿(Da)。
3.根据权利要求1所述的聚合物，其具有0.1至10°的相角(δ)。
4.根据权利要求1所述的聚合物，其具有10至1,000Pa的弹性模量(G')。
5.根据权利要求1所述的聚合物，其包含的HA含量为1mg/gr至20mg/gr。
6.根据权利要求1所述的聚合物，其中所述交联度通过1H NMR确定。
7.组合物，其包括根据权利要求1所述的聚合物和药学上可接受的载体，其中所述聚合物在所述组合物中的w/w浓度为0.1-1.9％之间。
8.根据权利要求7所述的组合物，进一步包括所述组合物中总HA含量的0.1-30％w/w的非交联HA。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，进一步包括选自以下的化合物：氨基酸、矿物质、维生素、抗氧化剂、核酸、辅酶、酶、生长因子、蛋白质、抗肿瘤药物、类固醇、非类固醇抗炎药物、抗生素、麻醉剂、抗微生物药物或其任何组合。
10.根据权利要求7所述的组合物用于制备在有需要的对象中填充或充盈组织的产品的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述组织选自：皮肤、牙龈、软骨和眼科组织、肌肉和皮下组织。
12.制备根据权利要求1所述的聚合物的方法，所述方法包括：将第一透明质酸(HA)链与第二HA链混合，其中所述第一HA链包括不饱和部分，并且所述第二HA链包括四嗪部分；其中所述不饱和部分和所述四嗪部分以3∶1至1∶3的摩尔比存在；从而使所述第一HA链与所述第二HA链交联，
其中所述不饱和部分是：
其中所述四嗪部分是：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一HA链和所述第二HA链具有100,000至4,000,000道尔顿(Da)的平均分子量Mw。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述交联包括在所述不饱和部分与所述四嗪部分之间形成共价键。
15.试剂盒，其包括与不饱和部分偶联的第一HA链，以及与四嗪部分偶联的第二HA链，并且其中所述试剂盒包括将所述第一HA链和所述第二HA链以3：1至1：3的比例混合从而获得根据权利要求7所述的组合物的说明书；
其中所述不饱和部分是：
其中所述四嗪部分是：
16.根据权利要求15所述的试剂盒，进一步包括药学上可接受的载体以及任选地选自以下的组分：游离HA链、氨基酸、矿物质、维生素或麻醉剂。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，包括关于将所述组合物与游离HA链、氨基酸、矿物质、维生素、麻醉剂或其任何组合混合的说明书；任选地，其中所述混合在注射装置中进行。
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