CN117440838A

CN117440838A - 包括交联透明质酸的组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN117440838A
Application number: CN202280040521.2A
Authority: CN
Inventors: S·梅尼尔; S·施奈德; L·奇鲁格; T·埃亚尔
Original assignee: Harula Co
Current assignee: Harula Co
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明涉及组合物，其包括聚合物，聚合物包括通过包括与四嗪部分或其衍生物偶联的不饱和部分或其衍生物的连接体交联的第一透明质酸(HA)链和第二HA链，其中组合物中的水溶性HA(sHA)与聚合物之间的重量比小于10％。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于具有0.6至4％的交联度。

Description

包括交联透明质酸的组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年4月13日提交的题目为“包括交联透明质酸的组合物及其使用方法”的美国临时专利申请号63/174,111；以及于2021年5月6日提交的题目为“包括透明质酸和交联透明质酸的组合物及其使用方法”的美国临时专利申请号63/184,962的优先权权益，将其内容在此通过引用全文并入。

技术领域

在本发明的一些实施方式中，其涉及交联透明质酸。

背景技术

透明质酸(HA)在皮肤填充物中的交联提供了所需的机械性能，特别是材料的提升(或丰盈)性能。

希望使用尽可能接近内源性透明质酸的材料，要求生产具有低修饰程度(例如，％交联)的材料。透明质酸和交联透明质酸都已知具有高度吸湿性。因此，当这些物质被注射到皮肤组织中时，它们有吸引组织中水分的趋势，并导致肿胀和水肿。吸水性与透明质酸和交联透明质酸的含量呈正相关。因此，由于需要降低肿胀和水肿的风险，需要生产具有低含量透明质酸和交联HA的皮肤填充物。

已知市售的基于HA的皮肤填充物包括高含量的水溶性HA级分(高达总HA含量的约40％w/w)。水溶性HA级分(sHA)通常由低至中分子量HA链，和/或HA低聚糖组成，其特征在于平均分子量(MW)小于700kDa，尤其是MW小于500kDa。

许多研究证实，发现低分子量HA(例如，10-300kDa的MW)在包括小胶质细胞在内的各种骨髓细胞中诱导促炎作用。此外，在包括哮喘、肺纤维化、COPD等的许多肺部疾病以及例如类风湿性关节炎等其他炎症性疾病中发现了低分子量(LMW)HA水平的增加。此外，已经证明LMW-HA也可以诱导血管生成和肿瘤进展。因此，存在降低皮肤填充物的sHA含量的未满足的需求。

在皮肤填充物中添加一部分未修饰的HA是一种常见的做法。这种未修饰的HA不与交联基质相互连接，并且可以作为可溶于水的级分从凝胶中释放。其目的是通过润滑减少凝胶通过细针的挤压力，并增强植入部位周围组织的水合作用。未修饰HA的典型添加是在已经交联的基质上进行的，并且具有破坏凝胶均匀性和显著降低凝胶机械性能的作用。需要开发在不降低机械性能的情况下包括期望的均匀性和流动性的组合物，以及生产这种组合物的方法。

发明内容

在本发明的一些实施方式中，本发明涉及交联透明质酸。

在一些实施方式中，一种或多种连接体由式(A)：

或式(B)：

或其组合表示；其中：---表示单键或双键；R¹、R²或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z是键、芳基或杂芳基；A选自：键、烷基和芳基；Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；并且其中R³选自：氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。

在一些实施方式中，不饱和部分包括苯乙烯部分或其衍生物，并且其中苯乙烯部分共价结合到第一HA链或第二HA链。

在一些实施方式中，苯乙烯部分或其衍生物由式IA-D表示：

在一些实施方式中，一种或多种连接体由式(C)：

或式(D)：

或其组合表示；其中：---表示单键或双键；R¹、R²或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z是键、芳基或杂芳基；A选自：键、烷基和芳基；Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；并且其中R³选自：氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。

在一些实施方式中，一种或多种连接体衍生自：

(a)由式IIA-G中任一个表示的降冰片烯部分：

和(b)由式IIIA-F中任一个表示的四嗪部分：

在一些实施方式中，一个或多个连接体中的每一个包括共价结合到四嗪部分的降冰片烯部分。

在一些实施方式中，降冰片烯部分和四嗪部分中的任一个共价结合到(i)第一HA链或(ii)第二HA链。

在一些实施方式中，共价结合通过选自以下的键：酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

在一些实施方式中，在以下(i)和(ii)之间的摩尔比通过¹HNMR测定：(i)以下的任一个：降冰片烯部分、四嗪部分或苯乙烯部分；和(ii)第一HA链，或第二HA链。

在一个实施方式中，第一HA链和第二HA链具有500,000至4,000,000道尔顿(Da)的平均分子量(MW)。

在一个实施方式中，聚合物具有0.1至10°的相位角(δ)。

在一个实施方式中，聚合物具有为10至1000Pa的弹性模量(G')。

在一个实施方式中，所述聚合物在所述组合物内的浓度为4至20mg/ml，或2至20mg/ml之间。

在一个实施方式中，sHA的特征在于平均分子量(MW)小于250kDa。

在一个实施方式中，sHA的特征在于至少0.1g/L的水溶性。

在一个实施方式中，聚合物的特征在于至多0.1g/L的水溶性。

在一个实施方式中，其中组合物中按重量计第一HA链和第二HA链的至少80％是交联的。

在一个实施方式中，组合物的特征在于小于30N的挤压力。

在一些实施方式中，组合物进一步包括可接受的载体。

在一些实施方式中，组合物进一步包括选自以下的化合物：氨基酸、矿物质、维生素、抗氧化剂、核酸、辅酶、酶、生长因子、蛋白质、抗肿瘤药物、类固醇、非甾体抗炎药物、抗生素、麻醉剂、抗微生物药物或其任何组合。

在一些实施方式中，组合物是药物组合物或药用美容品组合物。

在一些实施方式中，组合物被配制用于皮下施用、局部施用或两者。

在本发明的另一个方面中，提供了一种组合物，其包括：(a)聚合物，其包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二透明质酸链或其衍生物，其中i.第一HA链和第二HA链通过一个或多个连接体交联；ii.一种或多种连接体包括不饱和部分或其衍生物和四嗪部分或其衍生物；iii.交联的特征在于交联度在0.6％和4％之间；和(b)未修饰HA链，其特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4,000kDa之间，其中组合物的特征在于至多10°的相位角(δ)。

在一些实施方式中，组合物的特征在于基本上不含颗粒物质。

在一些实施方式中，组合物包括5％至30％重量/重量(w/w)之间的未修饰HA链。

在一些实施方式中，组合物的特征在于5牛顿(N)至30N之间的平均挤压力。

在一些实施方式中，组合物的特征在于挤压曲线(profile)没有高于2N的峰。

在一些实施方式中，组合物的特征在于弹性模量(G’)在20Pa和400Pa之间。

在一些实施方式中，组合物中聚合物的浓度在1mg/ml和25mg/ml之间。

在一些实施方式中，第一HA链和第二HA链的特征在于平均MW在500kDa和4,000kDa之间。

在一个实施方式中，未修饰的HA的特征在于至少1g/L的水溶解度。

在本发明的另一个方面，提供了一种用于填充或丰盈有需要的受试者的组织的方法，包括将本发明的组合物施用到组织中，从而填充或丰盈有需要的受试者的组织。

在一些实施方式中，组织选自：皮肤、牙龈、软骨和眼组织、肌肉和皮下组织。

在一些实施方式中，施用包括皮下或局部施用。

在本发明的另一个方面，提供了一种制造本发明的组合物的方法，所述方法包括：将包括本发明的第一HA链的第一组合物和包括本发明的第二HA链的第二组合物混合，其中第一组合物、第二组合物或者两者包括本发明的未修饰的HA链。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文将描述示例性方法和/或材料。在发生冲突的情况下，以包括定义在内的专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅为说明性的，并非旨在必然是限制性的。

根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解的是，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说从该详细描述将变得显而易见，因此在指出本发明的优选实施方式的同时，详细描述和具体示例仅通过说明的方式给出。

附图说明

图1包括根据表2条目1(曲线A)的组合物、根据表2条目2的组合物(曲线B)和根据表2条目3的组合物(曲线C)的挤压力曲线；和

图2A-2D包括30分钟后凝胶在水中的溶解实验结果图片：根据程序A(表1，条目4)(图2A)，根据程序B(表1，条目5-6)(图2B-2C)和根据程序C(表1和条目7)(图2D)。

具体实施方式

在一些实施方式中，本发明涉及包括通过包括与四嗪部分或其衍生物结合的不饱和部分或其衍生物的连接体交联的第一透明质酸(HA)链和第二HA链的聚合物。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于0.6至4％之间的交联度。

在一些实施方式中，本发明的聚合物(即交联HA)是基本上不溶于水的。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于至多0.5g/L、至多0.3g/L、至多0.2g/L、至多0.1g/L、至多0.05g/L、至多0.01g/L、至多0.005g/L、至多0.001g/L的水溶解度，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，术语“聚合物(polymer)”和“交联(cross-linked)HA”在本文中可互换使用。

在一些实施方式中，本发明的聚合物基本上是不溶于水的。

此外，本发明在其一些实施方式中部分地基于与包括相同组分但通过不同工艺获得的类似组合物相比，根据本发明的组合物表现出期望的稳定性以及改进的均匀性和改进的机械性能的发现。

组合物

在一些实施方式中，存在包括本发明的聚合物(例如本发明的不溶于水的聚合物)的组合物，其中组合物中水溶性HA(sHA)与聚合物之间的重量比为小于10％、小于8％、小于6％、小于5％、小于3％、小于2％、小于1％，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，sHA如下所述。在一些实施方式中，组合物任选地包括本发明的聚合物和/或其盐。在一些实施方式中，组合物基本上不含未修饰的HA。

在示例性实施方式中，不饱和部分是降冰片烯。

在一些实施方式中，本发明涉及包括多个交联透明质酸(HA)链或其衍生物的聚合物。如本文所用，HA链或其衍生物包括D-葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺。在一些实施方式中，本发明的聚合物包括两个或多个交联的HA链。在一些实施方式中，本发明的聚合物包括两个或多个交联的HA链，其中聚合物的特征在于0.6至4％之间、0.6至0.8％之间、0.8至1％之间、0.6至1％之间、0.6％至2％之间、1至1.5％之间、1.5至2％之间、2至4％之间、2至3％之间的交联度，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，交联度如下所述。

如本文所用，HA链的衍生物涉及化学修饰的HA。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括侧链修饰(例如羟基的乙酰化、羧基的脱羧、酯化或酰胺化)。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括一种或多种侧链修饰。在一些实施方式中，修饰是相同的。在一些实施方式中，修饰是不同的。在一些实施方式中，化学修饰的HA包括修饰的侧链的组合。

在一些实施方式中，本发明组合物中聚合物的浓度为1mg/ml至25mg/ml之间、4至20mg/ml之间、4至6mg/ml之间、6至8mg/ml之间、2至8mg/ml之间、2至10mg/ml之间、2至20mg/ml、6至8mg/ml之间、8至10mg/ml之间、10至15mg/ml之间、15至20mg/ml之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括HA，其特征在于平均分子量在500,000至1,000,000Da之间、500,000至1,500,000Da之间、500,000至5,000,000Da之间、750,000至4,000,000Da之间、1,000,000至7,500,000Da之间、2,000,000至10,000,000Da之间、1,000,000至2,000,000Da之间、2,000,000至4,000,000Da之间、650,000至8,000,000Da之间、4,000,000至10,000,000Da之间，或7,500,000至15,000,000Da之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的第二HA链包括HA，其特征在于平均分子量在500,000至1,000,000Da之间、500,000至1,500,000Da之间、500,000至5,000,000Da之间、750,000至4,000,000Da之间、1,000,000至7,500,000Da之间、2,000,000至10,000,000Da之间、1,000,000至2,000,000Da之间、2,000,000至4,000,000Da之间、650,000至8,000,000Da之间、4,000,000至10,000,000Da之间、或7,500,000至15,000,000Da之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

如本文中所使用的，术语“分子量(molecular weight)”包括选自以下的任一种平均重量值：Mn(数均摩尔质量)、NAMW(数均分子量)、Mw(质均摩尔质量)、WAMW(重均分子量)、Mz(Z均摩尔质量)、Mv(粘均摩尔质量)以及MWCO(截留分子量)。除非另有说明，此术语指Mw。

在一个实施方式中，本发明涉及包括分子量在上述范围内的聚羧酸多糖(例如透明质酸)和/或其盐或其衍生物的聚合物。

在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包括(a)聚合物，其包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物，其中：第一HA链和第二HA链通过一个或多个连接体交联；一种或多种连接体包括不饱和部分或其衍生物和四嗪部分或其衍生物；交联的特征在于交联度在0.6％和4％之间；和(b)未修饰HA链，其特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4000kDa之间。

在一些实施方式中，本发明的组合物包括本发明的聚合物，并且还进一步包括特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4000kDa之间的未修饰HA链。

在一些实施方式中，组合物的特征在于至多10°的相位角(δ)。

在一些实施方式中，组合物包括未修饰HA或未修饰HA链，包括其任何盐。在一些实施方式中，所述组合物包括药学上可接受的HA的盐。

在一些实施方式中，组合物包括第一HA链和第二HA链，包括其任何盐。

在一些实施方式中，未修饰的HA链的特征在于平均MW在300kDa至4,000kDa之间、350kDa至4,000kDa之间、400kDa至4,000kDa之间、500kDa至4,000kDa之间、550kDa至4,000kDa之间、600kDa至4,000kDa之间、700kDa至4,000kDa之间、800kDa至4,000kDa之间、300kDa至2,500kDa之间、350kDa至2,500kDa之间、400kDa至2,500kDa之间、500kDa至2,500kDa之间、550kDa至2,500kDa之间、600kDa至2,500kDa之间、700kDa至2,500kDa之间、800kDa至2,500kDa之间、300kDa至1,000kDa之间、350kDa至1,000kDa之间、400kDa至1,000kDa之间、500kDa至1,000kDa之间、550kDa至1,000kDa之间、600kDa至1,000kDa之间、700kDa至1,000kDa或800kDa至1,000kDa之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

如本文所用，“未修饰HA链(unmodified HA chain)”或其衍生物是指没有任何化学修饰且未偶联到包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物的聚合物的任何HA链(即原始的)。在一些实施方式中，未修饰HA链是指没有任何化学修饰并且未偶联到四嗪部分、降冰片烯部分和/或其衍生物的任何HA链。

在一些实施方式中，组合物包括在5％至30％重量/重量(w/w)之间、7％至30％(w/w)之间、8％至30％(w/w)之间、10％至30％(w/w)之间、5％至25％(w/w)之间、7％至25％(w/w)之间、8％至25％(w/w)之间、10％至25％(w/w)之间、5％至20％(w/w)之间、7％至20％(w/w)之间、8％至20％(w/w)之间、10％至20％(w/w)之间、5％至15％(w/w)之间、7％至15％(w/w)之间或8％至15％(w/w)的未修饰HA链，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物的特征在于基本上不含颗粒物质。如本文所用，术语“颗粒物质(particulate matter)”是指悬浮在混合物中的任何颗粒(液滴或固体)。在一些实施方式中，颗粒物质是指由凝胶级分制成或包括凝胶级分的颗粒。在一些实施方式中，颗粒物质是指颗粒的特征在于尺寸小于5mm、小于3mm、小于2mm或小于1mm，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物的特征在于基本上不含特征在于尺寸小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm、小于1mm或小于0.5mm的颗粒，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，所述组合物的特征在于基本上不含特征在于直径小于5mm、小于4mm、小于3mm、小于2mm、小于1mm或小于0.5mm的颗粒，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，颗粒直径是平均颗粒直径。在一些实施方式中，颗粒尺寸是平均颗粒尺寸。

在一些实施方式中，本发明的组合物的特征在于δ在0.1°至10°之间、0.1°至0.5°之间、0.1°至0.9°之间、0.1°至1°之间、0.1°至1.5°之间、0.1°至4.5°之间、0.1°至7.5°之间、0.1°至8.5°之间、0.1至9.5°之间、0.5°至10°之间、0.5°至0.9°之间、0.5°至1°之间、0.5°至1.5°之间、0.5°至4.5°之间、0.5°至7.5°之间、0.5°至8.5°之间、0.5至9.5°之间、0.9°至10°之间、0.9°至0.5°之间、0.9°至1°之间、0.9°至1.5°之间、0.9°至4.5°之间、0.9°至7.5°之间或0.9°至8.5°之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物的特征在于δ至多0.1°、至多0.5°、至多0.7°、至多0.9°、至多1°、至多1.5°、至多2°、至多2.7°、至多3.2°、至多4°、至多4.5°、至多6°、至多7.5°、至多8°、至多9°或至多10°，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物的特征在于挤压曲线没有高于2N、高于1.9N、高于1.8N、高于1.7N、高于1.5N或高于1N的峰，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物的特征在于相位角(δ)至多10°、至多9.5°、至多9°、至多8.5°、至多8°、至多7.5°或至多7°，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

如本文所用，术语“相位角(phase angle)”或“δ”是指材料的粘弹性度。如本领域普通技术人员显而易见的，可以根据以下等式来计算δ：

其中G”是粘度模量，G’是弹性模量。在一些实施方式中，G’和G”通过振荡流变学获得，并且在粘弹性域中针对低振荡以应力或振幅测量。

在一些实施方式中，本发明的组合物是弹性的。如本文所用，聚合物的弹性的特征在于弹性模量(G’)。在一些实施方式中，术语“弹性模量(elastic modulus)”意思是下文中确定的弹性模量。

在一些实施方式中，所述组合物的特征在于弹性模量(G’)在20Pa至400Pa之间、40Pa至400Pa之间、45Pa至400Pa之间、50Pa至400Pa之间、70Pa至400Pa之间、80Pa至400Pa之间、100Pa至400Pa之间、45Pa至350Pa之间、50Pa至350Pa之间、70Pa至350Pa之间、80Pa至350Pa之间、95Pa至350Pa之间、150Pa至350Pa之间、48Pa至250Pa之间、55Pa至250Pa之间、70Pa至250Pa之间、80Pa至250Pa之间、90Pa至250Pa之间或100Pa至250Pa之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的组合物是可注射的组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物是可挤压的组合物。在一些实施方式中，本发明的组合物的特征在于挤压力小于30牛顿(N)、小于25N、小于20N、小于15N或小于10N，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

如本文所用，术语“挤压力(extrusion force)”是指通过27G1/2”针头或直径小于27G1/2”的针头从注射器挤出本发明组合物所需的力。挤压力可以根据本文所述的方法(参见实施例部分)进行测量。

在一些实施方式中，本发明的组合物的特征在于平均挤压力在5N至30N之间、7N至30N之间、8N至30N之间、10N至30N之间、5N至20N之间、7N至20N之间、8N至20N之间、10N至20N之间、5N至18N之间、7N至18N之间、8N至18N之间、10N至18N之间、5N至15N之间、7N至15N之间、8N至15N之间或10N至15N之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的组合物的特征在于最大挤压力在5N至30N之间、7N至30N之间、8N至30N之间、10N至30N之间、5N至20N之间、7N至20N之间、8N至20N之间、10N至20N之间、5N至18N之间、7N至18N之间、8N至18N之间、10N至18N之间、5N至15N之间、7N至15N之间、8N至15N之间或10N至15N之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，聚合物在本发明组合物中的浓度为1mg/ml至25mg/ml、4至20mg/ml、4至6mg/ml、6至8mg/ml、8至10mg/ml、10至15mg/ml、15至20mg/ml，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，未修饰的HA基本上是可溶于水的。在一些实施方式中，未修饰的HA的特征在于水溶解度为至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L、至少10g/L、至少20g/L、至少50g/L，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，未修饰的HA的特征在于水溶解度在0.5g/L和10g/L之间、0.5g/L和1g/L之间、1g/L和10g之间、10g/L和30g/L之间、30g/L和50g/L之间、50g/L和100g/L之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，组合物基本上不含低MW可溶性HA(sHA)。

如本文所用，术语“低MW sHA(low MW sHA)”是指HA的水溶性聚合物和/或低聚物的特征在于MW小于300kDa、小于250kDa、小于200kDa、小于150kDa、小于100kDa、小于80kDa、小于50kDa、小于20kDa、小于10kDa、小于1kDa，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一些实施方式中，低MW sHA基本上不含化学修饰的HA(例如本发明的第一HA链和/或第二HA链)。术语“低MW sHA”和“sHA”在本文中可互换使用。

在一些实施方式中，组合物基本上不含特征在于MW小于250kDa、小于200kDa、小于150kDa、小于100kDa、小于80kDa、小于50kDa、小于20kDa、小于10kDa、小于1kDa之间的sHA，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，组合物包括0.01％至10％之间、0.05％至10％之间、0.1％至10％之间、0.5％至10％之间、0.9％至10％之间、1％至10％之间、0.01％至9.8％之间、0.05％至9.8％之间、0.1％至9.8％之间、0.5％至9.8％之间、0.9％至9.8％或1％至9.8％之间的低MW sHA，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，所述组合物包括0.01％与30％之间、0.05％与10％之间、0.1％与10％、0.5％与10％、0.9％与10％、1％与10％、0.01％与98％、0.05％与9.8％、0.1％与9.8％之间、0.5％与9.8％之间、0.9％与9.8％之间、10％与20％之间、20％与30％之间或1％与9.8％之间的低MW sHA，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，低MW sHA含量包括来自可溶性(例如水溶性和/或可从水提取的)HA含量的sHA的重量部分。在一些实施方式中，低MWs HA如下所述。可溶性HA级分中低MWsHA的含量可根据本文所述的程序(例如HPLC)测定(参见实施例部分)。

在一些实施方式中，sHA含量包括来自可溶性HA含量的sHA的重量部分。在一些实施方式中，sHA如下所述。可溶性HA级分中sHA的含量可根据本文所述的程序(例如HPLC)测定(参见实施方式部分)。

在一些实施方式中，低MW sHA包括水溶性HA链。在一些实施方式中，低MW sHA的水溶解度为至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L、至少10g/L、至少20g/L、至少50g/L，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，低MW sHA的特征在于水溶解度在0.5g/L至10g/L之间、0.5g/L至1g/L之间、1g/L至10mg/L之间、10g/L至30g/L之间、5g/L至30mg/L之间、5mg/L至20g/L之间、30g/L至50g/L之间、50g/L至100g/L之间，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，低MW sHA的特征在于水溶解度在5g/L和20g/L之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，sHA包括水溶性HA链。在一些实施方式中，sHA的水溶解度为至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L、至少10g/L、至少20g/L、至少50g/L，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，sHA的特征在于水溶解度在0.5g/L和10g/L之间、0.5g/L和1g/L之间、1g/L和10mg/L之间、10g/L和30g/L之间、5g/L和30mg/L之间、5mg/L和20g/L之间、30g/L和50g/L之间、50g/L和100g/L之间，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，sHA的特征在于水溶解度在5g/L和20g/L之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

聚合物

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括一个或多个HA链。在一些实施方式中，“一个或多个”是两个。在一些实施方式中，本发明的两个HA链是交联的。在一个实施方式中，交联是内交联。如本文所定义，术语“内(inter)”是指在存在于两个不同链中的两个部分之间形成键，而不是在存在于同一链内的两个残基之间形成“内”键。在一个实施方式中，交联是内部交联。在一些实施方式中，两个HA链通过连接体交联。

本文定义的“连接体(linker)”是指用于连接一种或多种聚羧酸多糖的不同部分或官能团的分子或高分子。在一个实施方式中，连接体还可以促进其他功能，包括但不限于保持生物活性、维持相互作用等。

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括第一HA链，其通过一个或多个连接体与第二HA链交联或共价连接，其中一个或更多个连接体包括由式(A)和/或由式(B)表示的化合物：式(A)：

式(B)：

或其组合；其中：---表示单键或双键；R¹、R²或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，或其组合，其中Z是键、芳基或杂芳基；A选自：键、烷基和芳基；Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；并且其中R³选自氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。在一些实施方式中，波浪形键表示HA。

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过一个或多个连接体连接到第二HA链的第一HA链，连接体包括由以下式表示的化合物：

式(C)

或式(D)：

或其组合；其中：表示单键或双键，并且其中Q¹、Q²、R¹、R²和R³如上所述。在一些实施方式中，波浪形键表示HA

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过连接体交联到第二HA链的第一HA链，其中连接体由式(C)或(D)表示。

在一些实施方式中，连接体包括衍生自不饱和部分的第一化合物和衍生自四嗪部分(例如包括四嗪衍生物，例如哒嗪)的第二化合物。在一些实施方式中，第一化合物和第二化合物共价结合。在一些实施方式中，第一化合物和第二化合物共价结合，从而形成由式(A)至(D)中任一个表示的化合物。

在一些实施方式中，R¹、R²和R³各自独立地包括选自以下的取代基：烷基、环烷基、芳基、杂脂环、杂芳基、烷氧基、羟基、膦酸酯、巯基、硫代烷氧基、芳氧基、硫代芳氧基、氨基、硝基、卤基、三卤甲基、氰基、酰胺、胺、链烷醇胺、羧基、磺酰基、磺氧基(sulfoxy)、亚磺酰基和磺酰胺。

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过连接体连接到第二HA链的第一HA链，其中连接体是或包括以下的任一种：

在一些实施方式中，R¹选自：-C₀-C₆烷基-NZ-、-C₀-C₆烷基-O-和-C₀-C₃烷基-C(O)-。

在一些实施方式中，Z选自：键、芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基任选地被卤素、羟基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、(C₁-C₆烷基)氨基和二(C₁-C₆烷基)氨基取代；

在一些实施方式中，R²选自：C₀-C₆烷基-NZ、-C₀-C₆烷基O-和C₀-C₃烷基-C(O)-。

在一些实施方式中，R³选自：氢、C₁-C₆烷基、芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基任选地被卤素、羟基、C₁-C₆-烷基、C₁-C₆烷氧基、(C₁-C₆-烃基)氨基和二(C₁-C₆烃基)氨基取代。

在一些实施方式中，R¹、R²或两者选自：-NZ-、-C₁-C₆烷基NZ-、-O-、-C₁-C₆烷基-O-、-C(O)-或-C₁-C₃烷基-C(O)-；-甲基-O；-戊基-O-；-C(O)-；和-甲基-C(O)-。

在一些实施方式中，Z是键。在一些实施方式中，Z选自：芳基和杂芳基，苯基；吡啶基、嘧啶基和吡嗪基；其每个任选地可以被取代。

在一些实施方式中，连接体是或包括根据任何前述实施方式的由式(C)或(D)中任一表示的化合物，其中R¹、R²或两者选自：-NZ、-C₁-C₆-烷基-NZ、-O、-C₁-C₆-烷基-O-、-C(O)-或-C₁-C₃-烷基-C(O)-；-C₁-C₆烷基-NZ-；C₁-C₃、烷基-NZ-；-甲基-NH-或-戊基-NH-；-C₁-C₆烷基-O-；-C₁-C₃烷基-O-；-甲基-O或-戊基-O-；-C₀-C₃烷基-C(O)-；C(O)-；和-甲基-C(O)-。

在一些实施方式中，R³是氢。

在一些实施方式中，R³选自：C₁-C₆烷基、芳基或杂芳基，其中芳基或杂芳基任选地被取代；芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被取代；苯基；吡啶基、嘧啶基或吡嗪基。

在一些实施方式中，本发明的连接体由式(C)或式(D)表示，其中R³选自：C₁-C₆烷基、C₁-C₃烷基和甲基或其组合。

在一些实施方式中，聚合物包括通过多个连接体交联的第一HA链和第二HA链，其连接体包括由式(C)或由式(D)表示的化合物。

在一些实施方式中，本发明的连接体通过第一HA链和第二HA链之间的反应形成。在一些实施方式中，反应是环化反应和/或环加成反应。在一些实施方式中，本发明的连接体是通过不饱和部分和四嗪部分之间的反应形成的。在一些实施方式中，本发明的连接体是通过不饱和部分和四嗪部分之间的环化反应和/或环加成反应形成的。在一些实施方式中，本发明的连接体衍生自不饱和部分和四嗪部分。在一些实施方式中，本发明的连接体衍生自降冰片烯部分和四嗪部分。

在一些实施方式中，本发明的聚合物包括通过连接体共价结合到第二HA链的第一HA链，其中连接体通过环化反应获得。在一些实施方式中，连接体通过环加成反应获得。各种环化和/或环加成反应在本领域是众所周知的(例如光化学环加成、Diels-Alder环化或导致形成环的任何其他化学反应)。在一些实施方式中，环化和/或环加成反应是或包括不饱和部分(例如降冰片烯部分)或其衍生物和四嗪部分或其衍生物的反电子需求Diels-Alder环化。

在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括如上所述的不饱和部分。在一些实施方式中，第一HA链包括与HA结合的不饱和部分。在一些实施方式中，第一HA链包括共价结合到HA的不饱和部分。在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括苯乙烯部分或其衍生物。

在一些实施方式中，苯乙烯部分由式IA-D表示：

在一些实施方式中，苯乙烯部分的衍生物包括通过共价键结合到第一HA链的式IA-ID的苯乙烯部分。

共价键的非限制性实例包括但不限于酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

在一些实施方式中，苯乙烯部分的胺共价结合到第一HA链。在一些实施方式中，苯乙烯部分与第一HA链的羧基结合。在一些实施方式中，苯乙烯部分的衍生物是指通过酰胺键结合到第一HA链的苯乙烯部分(例如，式IA的化合物)，如式IE所示：

在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括通过酰胺键共价结合到苯乙烯部分(例如式IA)的HA。

在一些实施方式中，不饱和部分是或包括降冰片烯部分或其衍生物。在一些实施方式中，本发明的第一HA链包括共价结合到HA的降冰片烯部分或其衍生物。在一些实施方式中，共价结合到本发明的第一HA链的降冰片烯部分或其衍生物的数量可以是在1和100,000之间的任何整数，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，本发明的第二HA链包括共价结合到HA的四嗪部分或其衍生物。在一些实施方式中，共价连接到本发明的第二HA链的四嗪部分或其衍生物的数量在1和100,000之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，第一HA链和/或第二HA链的至少一部分共价结合到四嗪部分或降冰片烯部分或其衍生物。

在一些实施方式中，本发明的组合物包括在10至99％之间、10至20％之间、20至50％之间、50至70％之间、70至80％之间、80至90％之间、90至99％之间的第一HA链和/或第二HA链，包括其间的任何范围，其共价结合到以下任一个：(i)四嗪部分；(ii)降冰片烯部分和/或苯乙烯部分，或其衍生物。

在一些实施方式中，每个第一HA链包括1-10,000、1-5,000、1-1,000、5,000-50,000、5,000-10,000、1,000-10,000、1,000-5,000、500-5,000、500-1000或1-500个降冰片烯部分或其衍生物，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，每个第二HA链包括1-100,000、1-50,000、1-10,000、1-5,000、1-1,000、5,000-50,000、5,000-10,000、1,000-10,000、1,000-5,000、500-5,000、500-1,000或1-500个四嗪部分或其衍生物，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，降冰片烯部分处于内构象和/或外构象。降冰片烯部分的非限制性实例包括但不限于由式IIA-IIG中的任一个表示的化合物：

四嗪部分的非限制性实例包括但不限于由式IIIA-IIIF中的任一个表示的化合物：

在一些实施方式中，降冰片烯部分是或包括式IIA的化合物：

在一些实施方式中，降冰片烯部分的衍生物包括通过共价键结合到第一HA链的由式IIA-IIG中的任一个表示的降冰片烯部分。在一些实施方式中，共价键选自酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

在一些实施方式中，降冰片烯部分的胺与第一HA链的HA结合。在一些实施方式中，降冰片烯部分与HA的羧基结合。在一些实施方式中，降冰片烯部分的衍生物是指通过酰胺键与HA结合的降冰片烯部分(例如，式IIA的化合物)，如式IF所示：

其中波浪形键表示HA。

在一些实施方式中，降冰片烯部分通过酰胺键或酯键与第一HA链的HA结合。在一些实施方式中，酰胺键或酯键通过HA和降冰片烯部分的反应形成，任选地与合适的偶联剂反应。

在一些实施方式中，通过使HA和降冰片烯部分(例如式IIA-IIG中的任何一个)与合适的偶联剂反应，将降冰片烯部分结合到第一HA链的HA。在一些实施方式中，偶联剂包括能够催化HA的羧基与降冰片烯部分的亲核基团(例如胺或羟基)之间的反应的任何化合物。

偶联剂的非限制性实例包括但不限于，1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)、羰基二咪唑、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉盐酸盐(DMTMM)和N,N,N’,N’-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(HBTU)。

在一个实施方式中，四嗪部分的衍生物与如上所述的四嗪部分相关，其通过共价键与第二HA链的HA结合。在一些实施方式中，共价键如上文所定义。

在一些实施方式中，四嗪部分的衍生物包括通过共价键与第二HA链的HA结合的由式IIIA-IIIF中的任一个表示的四嗪部分。在一些实施方式中，共价键选自酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

在一些实施方式中，四嗪部分的胺与第二HA链的HA结合。在一些实施方式中，四嗪部分与HA的羧基结合。在一些实施方式中，四嗪部分的衍生物是指通过酰胺键与HA结合的四嗪部分(例如，式IIIB的化合物)，如式IG所示：

其中波浪形键表示HA。

在一些实施方式中，四嗪部分通过酰胺键或酯键与第二HA链的HA结合。在一些实施方式中，酰胺键或酯键通过HA和降冰片烯部分的反应形成，任选地与合适的偶联剂反应。

在一些实施方式中，通过使HA和四嗪部分(例如苄基胺四嗪)与合适的偶联剂反应，将四嗪部分结合到第二HA链的HA，其中偶联剂如本文所述。

在一些实施方式中，与第一HA链的HA偶联的降冰片烯部分或其衍生物；以及与第二HA链的HA偶联的四嗪部分或其衍生物，以3：1、3：2、2：1、1：1、1：2、2：3或1：3的比例存在于本发明的聚合物中，包括其间的任何值和范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。如本文所定义的，比率是选自以下的任何比率：摩尔比、重量比或浓度比。

如本文所定义，术语“交联度(crosslinking degree)”是指形成本发明聚合物的连接体和羧化多糖的重复单元之间的摩尔比。在一些实施方式中，术语“交联度”和(第一HA链和/或第二HA链的)“修饰度(modification degree)”在本文中可互换使用。假设第一HA链的降冰片烯部分或其衍生物与第二HA链的四嗪部分或其衍生物几乎完全彼此反应(约90-100％交联产率)，因此交联度几乎完全由第一HA链和/或第二HA链条的修饰度决定。在一些实施方式中，第一HA链和第二HA链具有基本相同的修饰度。

在一些实施方式中，交联度是指分别地第一HA链或第二HA链的原始(或未反应)降冰片烯部分或四嗪部分；和形成本发明聚合物的羧化多糖的重复单元之间的摩尔比。在一些实施方式中，交联度是指本发明聚合物的连接体和重复单元之间的摩尔比。在一些实施方式中，交联度是指连接体和HA的重复单元之间的摩尔比。在一些实施方式中，交联度是指本发明的聚合物中连接体的数量与原始HA中羧基的初始数量在其与本发明的不饱和部分或四嗪部分反应之前的比率(例如，本文中也称为修饰度)。在一些实施方式中，交联度是指本发明聚合物中连接体的数量与HA的重复单元(或单体)的中值数量之间的比率。

在一些实施方式中，第一HA链的修饰度(例如不饱和部分如降冰片烯部分或苯乙烯部分与原始HA链的羧基之间的摩尔比)或第二HA链的修饰度(例如四嗪部分与原始HA链的羧基之间的摩尔比)各自独立地在0.6％至3％之间、0.7％至3％之间、0.8％至3％之间、0.6％至4％之间、0.6％至3.5％之间、0.6％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.7％至4％之间、0.7％至3.5％之间、0.7％至2.5％之间、0.7％至2.7％之间、0.7％至3.2％之间、0.8％至3.5％之间、0.8％至4％之间、0.8％至2.5％之间、0.8％至2.7％之间、0.8％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.6％至1％之间、0.6％至1.75％之间、1％至2％之间、1％至2.5％之间、2％至2.5％之间、2.25％至3％之间、2.5％至3.25％之间、3％至3.7％之间或在3.6％至4％之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，本发明聚合物的交联度为至多0.6％、至多0.7％、至多0.9％、至多1％、至多2％、至多3％或至多4％，包括其间的任何值。在一些实施方式中，本发明聚合物的交联度在0.6％至3％之间、0.7％至3％之间、0.8％至3％之间、0.6％至4％之间、0.6％至3.5％之间、0.6％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.7％至4％之间、0.7％至3.5％之间、0.7％至2.5％之间、0.7％至2.7％之间、0.7％至3.2％之间、0.8％至3.5％之间、0.8％至4％之间、0.8％至2.5％之间、0.8％至2.7％之间、0.8％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.6％至1％之间、0.6％至1.75％之间、1％至2％之间、1％至2.5％之间、2％至2.5％之间、2.25％至3％之间、2.5％至3.25％之间、3％至3.75％之间或3.6％至4％之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。在一个实施方式中，聚合物的交联度是指本发明聚合物内多个HA链的交联度的计算平均值。

在一些实施方式中，本发明的组合物包括：(i)本发明的聚合物，其特征在于交联度在0.6％至4％之间、在0.6％至3％之间、0.7％至3％之间、0.8％至3％之间、0.6％至4％之间、0.6％至3.5％之间、0.6％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.7％至4％之间、0.7％至3.5％之间、0.7％至2.5％之间、0.7％至2.7％之间、0.7％至3.2％之间、0.8％至3.5％之间、0.8％至4％之间、0.8％至2.5％之间、0.8％至2.7％之间、0.8％至3.2％之间，包括其间的任何范围；和(ii)未修饰的HA链，其特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4,000kDa之间，并且其中组合物的特征在于相位角(δ)至多10°。在一些实施方式中，本发明的组合物主要由本发明的聚合物(包括其任何盐)和未修饰HA链(包括其任何盐)组成。

在一些实施方式中，本发明的组合物包括本发明的聚合物，其特征在于交联度在0.6％至4％之间、在0.6％至3％之间、0.7％至3％之间、0.8％至3％之间、0.6％至4％之间、0.6％至3.5％之间、0.6％至3.2％之间、0.6％至2.5％之间、0.7％至4％之间、0.7％至3.5％之间、0.7％至2.5％之间、0.7％至2.7％之间、0.7％至3.2％之间、0.8％至3.5％之间、0.8％至4％之间、0.8％至2.5％之间、0.8％至2.7％之间、0.8％至3.2％之间，包括其间的任何范围；其中组合物任选地包括sHA，并且其中组合物中sHA与本发明的聚合物之间的重量比小于10％。在一些实施方式中，本发明的组合物基本上由本发明的聚合物(包括其任何盐)组成。

在一些实施方式中，本发明的聚合物基本上是不溶于水的。在一些实施方式中，本发明的聚合物的特征在于水溶解度至多0.5g/L、至多0.3g/L、至多0.2g/L、至多0.1g/L、至多0.05g/L、至多0.01g/L、至多0.005g/L、至多0.001g/L，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的聚合物和/或包括其的组合物(例如不含未修饰HA的组合物)具有相位角(δ)为0.1-25°、0.1-0.5°、0.1-0.9°、0.5-1°、0.7-1.5°、1-2.5°、2-4.5°、3-4.75°、4.7-5.5°、5-7.5°、6-8°、7-8.5°、8.25-9.5°、9-10.5°、9.5-12°。

在一些实施方式中，本发明的聚合物和/或包括其的组合物(例如不含未修饰HA的组合物)的弹性模量为10-500Pa、20-1,000Pa、30-600Pa、40-1,000Pa、40-5,000Pa、50-10,000Pa、500-50,000Pa、500-10,000Pa、500-5,000Pa、500-1,000Pa、1,000-50,000Pa、1,000-10,000Pa、1,000-5,000Pa、50-20,000Pa、500-20,000Pa或1,000-20,000Pa。在一些实施方式中，本发明的聚合物具有弹性模量至多10,000Pa、至多20,000Pa、至多30,000Pa、至多40,000Pa、或至多50,000Pa。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

制造方法

在一些实施方式中，本发明涉及制备本发明的聚合物的方法，该方法包括以下步骤：(i)将不饱和部分(例如降冰片烯部分)(或其衍生物)连接到第一透明质酸(HA)链(或其衍生物)，并将四嗪部分(或其衍生物)连接到第二HA链(或其衍生物)；(ii)混合包括降冰片烯部分(或其衍生物)的第一(HA)链(或其衍生物)和包括四嗪部分(或其衍生物)的第二HA链(或其衍生物)；和(iii)将所述第一HA链交联至所述第二HA链。

在一些实施方式中，步骤(i)进一步包括纯化连接到不饱和部分或四嗪部分的HA链。

将不饱和部分或四嗪部分附连到HA链上之后，从未反应的起始材料以及从其他反应副产物纯化得到的产物。纯化可以通过本领域已知的任何一种方法进行，例如透析、沉淀、超滤或切向流过滤。

在一些实例中，交联反应在形成交联聚合物的可用温度和条件范围内发生，并且在没有输入外部能量的情况下发生。在一个实施方式中，加热交联反应以提高反应效率。

在一些实施方式中，制备本发明聚合物的方法包括自发交联反应。在一些实施方式中，“自发化学反应(spontaneous chemical reaction)”是指没有例如光、热或自由基辅助的过程。在一些实施方式中，交联反应可以在水中、水性缓冲液中或细胞培养基中发生。培养基的非限制性实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、Hank’s平衡盐溶液、Dulbecco’sModified Eagle培养基等。在一些实施方式中，交联可以在有机溶剂中发生。有机溶剂的非限制性实例包括但不限于甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。

在一些实施方式中，交联反应可在以下宽温度范围下发生：至少-80℃、至少-50℃、至少-20℃、至少0℃、至少4℃、至少22℃、至少37℃或至少45℃且不超过65℃。在一些实施方式中，交联反应可在以下宽温度范围下发生：(-80)-(-50)℃、(-60)-(-15)℃，(-20)-(-4)℃、(-5)-0℃、(-2)-4℃、2-8℃、5-20℃，15-30℃、25-40℃或35-55℃。

在一些实施方式中，步骤(ii)和(iii)原位进行，以便通过混合第一(HA)链和第二(HA)链来形成交联聚合物。在一些实施方式中，制备过程没有后处理步骤，例如筛分或均化。

在制备方法的一些实施方式中，在交联步骤之后，未反应的降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物可以保持附连在HA链上。如本文所定义，术语“未反应(unreacted)”是指未与另一HA链或部分结合的降冰片烯部分或其衍生物和/或四嗪部分或其衍生物。

HA链上未反应的降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物的量可以通过在交联反应期间改变第一HA链与第二HA链的比率来调节，反之亦然。

制造方法(含有未修饰HA的组合物)

在一些实施方式中本发明涉及制备本发明组合物的方法，方法包括以下步骤：i)将包括包含降冰片烯部分(或其衍生物)的第一(HA)链(或其衍生物)的第一组合物与包括包含四嗪部分(或其衍生物)的第二HA链(或其衍生物)的第二组合物混合，其中第一组合物、第二组合物或二者包括未修饰的HA链；和(ii)将第一HA链交联至第二HA链。

在一些实施方式中，本发明涉及制备本发明组合物的方法，该方法包括混合以下的步骤：i)第一(HA)链(或其衍生物)，其包括降冰片烯部分(或其衍生物)，ii)第二HA链(或其衍生物)，其包括四嗪部分(或它的衍生物)，和iii)未修饰的HA链，从而将第一HA链交联至第二HA链。

在一些实施方式中，本发明涉及制备本发明的组合物的方法，该方法包括混合以下的步骤：i)第一组合物，其包括含有降冰片烯部分(或其衍生物)的第一(HA)链(或其衍生物)，ii)第二组合物，其包括含有四嗪部分(或其衍生物)的第二HA链(或其衍生物)，和iii)第三组合物，其包括未修饰的HA链，从而将第一HA链交联至第二HA链。

在一些实施方式中，方法包括在第一HA链和第二HA链交联之前，将未修饰的HA与第一HA链及第二HA链混合。

在一些实施方式中，根据本方法获得的组合物包括期望的均匀性和流动性，而不降低机械性能。

在一些实施方式中，根据本方法获得的组合物的特征在于，与通过在第一HA链和第二HA链交联之后将未修饰的HA与第一HA链及第二HA链混合的方法获得的相同组合物的特性相比，具有改进的均匀性。

在一些实施方式中，根据本方法获得的组合物的特征在于，与通过在第一HA链和第二HA链交联之后将未修饰的HA与第一HA链及第二HA链混合的方法获得的相同组合物的特性相比，具有至少一种改进的机械性能。

在一些实施方式中，选自弹性模量、流动性或相位角的一种或多种特性增强了例如至少1％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％，至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在不饱和部分或四嗪部分附连到HA链上之后，从未反应的起始材料以及从其他反应副产物纯化得到的产物。纯化可以通过本领域已知的任何一种方法进行，例如透析、沉淀、超滤或切向流过滤。

在一些实施方式中，制备本发明聚合物的方法包括自发交联反应。在一些实施方式中，所谓“自发化学反应”是指没有例如光、热或自由基辅助的过程。在一些实施方式中，交联反应可以在水中、水性缓冲液中或细胞培养基中发生。培养基的非限制性实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、Hank’s平衡盐溶液、Dulbecco’s Modified Eagle培养基等。在一些实施方式中，交联可以在有机溶剂中发生。有机溶剂的非限制性实例包括但不限于甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺等。

在一些实施方式中，交联反应可在宽范围的以下温度下发生：至少-80℃、至少-50℃、至少-20℃、至少0℃、至少4℃、至少22℃、至少37℃或至少45℃且不超过65℃。在一些实施方式中，交联反应可在宽范围的以下温度下发生：(-80)-(-50)℃、(-60)-(-15)℃、(-20)-(-4)℃、(-5)-0℃、(-2)-4℃、2-8℃、5-20℃、15-30℃、25-40℃或35-55℃。

在一些实施方式中，步骤原位进行，以便通过混合第一(HA)链和第二(HA)链条以及未修饰的HA链来形成交联聚合物。在一些实施方式中，制备过程没有后处理步骤，例如筛分或均化。

在制备方法的一些实施方式中，在交联步骤之后，未反应的降冰片烯或其衍生物和/或四嗪或其衍生物可以保持附连在HA链上。如本文所定义，术语“未反应”是指未与另一HA链或部分结合的降冰片烯部分或其衍生物和/或四嗪部分或其衍生物。

药物组合物

根据另一个实施方式，本发明提供了包括本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

根据另一个实施方式，本发明提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的本发明组合物和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物或美容品组合物包括：(i)本发明的聚合物，或(ii)本发明聚合物和未修饰的HA链，其中药物组合物或美容组合物是凝胶(例如水凝胶)的形式，进一步包括水溶液(例如作为美容上可接受或药学上可接受的载体)。

在一些实施方式中，提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量或美容有效量的本发明组合物和药学上可接受的载体和/或稀释剂。

在一些实施方式中，本发明的组合物进一步包括氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸包括任何天然存在或非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括但不限于：D-氨基酸、羟基赖氨酸、4-羟基脯氨酸、N-Cbz-保护的氨基戊酸(Nva)、鸟氨酸(O)、氨基辛酸(Aoc)、2,4-二氨基丁酸(Abu)、高精氨酸、正亮氨酸(Nle)、N-甲基氨基丁酸(MeB)、2-萘丙氨酸(2Np)、氨基庚酸(Ahp)、苯基甘氨酸、β-苯基脯氨酸、叔亮氨酸、4-氨基环己基丙氨酸(Cha)、N-甲基-正亮氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、N,N-二甲基氨基甘氨酸、N-甲基氨基甘氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、6-氨基己酸、反-4-(氨基甲基)-环己甲酸、2-、3-和4-(氨基甲基)-苯甲酸、1-氨基环戊烷羧酸、1-氨基环丙烷羧酸、氰基丙酸、2-苄基-5-氨基戊酸、正缬氨酸(Nva)、4-O-甲基-苏氨酸(TMe)、5-O-甲基-高丝氨酸(hSM)、叔丁基丙氨酸(tBu)、环戊基-丙氨酸(Cpa)、2-氨基-异丁酸(Aib)、N-甲基-甘氨酸(MeG)、N-甲基-丙氨酸(MeA)、N-甲基-苯丙氨酸(MeF)、2-噻吩基-丙氨酸(2Th)、3-噻吩基-丙氨酸(3Th)、O-甲基-酪氨酸(YMe)、3-苯并噻吩基-丙氨酸(Bzt)和D-丙氨酸(DAl)。在一些实施方式中，氨基酸是通过肽键连接的氨基酸的低聚物或二聚体。在一些实施方式中，低聚物是三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体，或在一些实施方式中，是具有通过肽键彼此结合的多于11个氨基酸的聚合物。在一些实施方式中，氨基酸以肽、多肽或蛋白质的形式包括在组合物中。在一些实施方式中，包括在本发明组合物中的肽、多肽或蛋白质是选自但不限于以下的形式：天然的、变性的、中和的、被消化的、交联的、未折叠的、还原的、氧化的或失活的形式。

在一些实施方式中，本发明的组合物进一步包括矿物质或多种矿物质。矿物质的非限制性实例包括但不限于：钾、氯化物、钠、钙、磷、镁、铁、锌、锰、铜、碘、铬、钼、硒或钴。

在一些实施方式中，本发明的组合物进一步包括维生素。维生素的非限制性实例包括但不限于：维生素A(视黄醇、视黄醛和包括β-胡萝卜素在内的四种类胡萝卜素)、维生素B₁(硫胺素)、维生素B₂(核黄素)、维生素B₃(烟酸、烟酰胺、烟酰胺核糖)、维生素B₅(泛酸)、维生素B₆(吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛)、维生素B₇(生物素)、维生素B₉(叶酸)、维生素B₁₂(氰钴胺、羟钴胺、甲基钴胺、腺苷钴胺)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D(胆钙化醇(D₃)、麦角钙化醇(D2))、维生素E(生育酚、生育三烯酚)或维生素K(叶绿醌、甲萘醌)。

在一些实施方式中，本发明的组合物进一步包括麻醉剂。如本文所用，术语“麻醉剂(anesthetic)”指的是防止例如在手术期间疼痛或完全阻断任何感觉的任何分子或物质。在一个实施方式中，麻醉剂是全身麻醉剂。在一个实施方式中，麻醉剂是局部麻醉剂。在一些实施方式中，局部麻醉剂在维持意识的同时诱导局限于身体某个区域的可逆感觉丧失。

麻醉剂的非限制性实例包括但不限于阿替卡因(articaine)、普鲁卡因(procaine)、紫地卡因(amethocaine)、利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、左布比卡因(levobupivacaine)，罗哌卡因(ropivacaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、丁卡因(dibucaine)和可卡因(cocaine)。在一些实施方式中，本发明的组合物包括0.01-0.1％(w/w)、0.05-0.15％(w/w)、0.1-0.3％(w/w)、0.2-0.5％(w/w)、0.4-0.7％(w/w)、0.6-0.85％(w/w)、0.8-1.25％(w/w)、1-1.5％(w/w)、1.4-2％(w/w)、1.75-3％(w/w)、2.5-3.75％(w/w)、3.5-4.5％(w/w)或4.25-5.25％(w/w)的麻醉剂。在一些实施方式中，本发明的组合物包括至多0.01％(w/w)、至多0.05％(w/w)、至多0.75％(w/w)、至多1％(w/w)、至多1.5％(w/w)、至多2％(w/w)、至多3％(w/w)、至多4％(w/w)或至多5.5％(w/w)的麻醉剂。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以以本发明的聚合物的药学上可接受的盐的形式配制。在另一个实施方式中，药学上可接受的盐包括衍生自无毒无机或有机酸例如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐。在一些实施方式中，盐由游离羧基形成，例如衍生自无毒无机或有机碱例如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

如本文所用，术语“载体(carrier)”是指与所公开的化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这种药物载体可以是无菌液体(例如水和油)，其包括石油、动物、植物或源自合成的那些(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。当药物组合物通过静脉施用时，水是优选的载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)。也考虑抗菌剂，例如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。载体可以总共占本文所提供的药物组合物的按重量计约0.1％至约99.9％。

如本文所用，术语“药学上可接受的(pharmaceutically acceptable)”意思是适用于施用于受试者，例如人。例如，术语“药学上可接受”可以是指经联邦或州政府监管机构批准，或在美国药典或其他公认药典中列出可用于动物，尤其是人类。

在另一个实施方式中，本发明的组合物采用以下形式：溶液、悬浮液、乳液、片剂、粉末、凝胶、泡沫、糊状物、缓释制剂等。合适的药物载体的实例描述于：E.W.Martin所著“Remington’s pharmaceutical Sciences”，其内容通过引用的方式并入本文。此类组合物将含有治疗有效量的本发明聚合物，优选为基本纯化的形式，以及合适量的载体，以便为受试者提供适当施用的形式。

根据本发明的一个实施方式，药物组合物含有0.1-95％的本发明的聚合物和/或组合物。根据本发明的另一个实施方式，药物组合物含有1-70％的聚合物和/或组合物。根据本发明的另一个实施方式，待施用的组合物或制剂可以含有有效治疗被治疗受试者的病症或疾病的量的根据本发明实施方式的聚合物和/或组合物。

在一些实施方式中，药物组合物用于治疗医疗的、美容的和/或药用美容疾病。

在一些实施方式中，本文所述的药物组合物是局部组合物。在一些实施方式中，药物组合物是可注射的组合物。在一些实施方式中，药物组合物用于全身用途。

在一些实施方式中，药物组合物是以下任一种：乳液、液体溶液、凝胶、糊状物、悬浮液、分散体、软膏、乳膏或泡沫。

本发明的药物组合物可以以任何合适的方式施用于哺乳动物(例如，人类、啮齿类动物等)，包括例如口服、非肠道、脑内、腹膜内、局部等。非肠道施用包括静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射/输注。

剂量将根据受试者和使用的特定施用途径而变化。可采用市售测定方法来确定最佳剂量范围和/或施用时间表。有效剂量可以从动物模型获得的剂量-反应曲线中推断出来。

本发明的一个实施方式涉及本发明的聚合物和/或组合物，其以单位剂型存在并通过药学领域中公知的任何方法制备。在本发明的一个实施方式中，单位剂型有以下的形式：片剂、胶囊、含片、安瓿、小瓶或预填充注射器。此外，可以任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的确切剂量也将取决于施用途径、疾病或紊乱的特性，并应根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从源自体外或体内的动物模型测试生物测定或系统的剂量-反应曲线推断。

根据一个实施方式，本发明的组合物以药物组合物的形式施用，其包括至少一种本发明的活性组分(聚合物)以及药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以以任何常规的透皮剂型单独或一起施用。

如本文所用，术语“施用(administering)”、“施用(administration)”和类似术语是指在良好的医学实践中，以提供治疗效果的方式将含有活性剂的组合物递送给受试者的任何方法。

根据感兴趣组织的位置，本发明的聚合物和/或组合物可以以适合于向感兴趣组织提供聚合物和/或者组合物的任何方式施用。因此，例如，可以将含有本发明聚合物的组合物引入，例如，注射到感兴趣的组织中，这将使聚合物分布在组织中。

在一些实施方式中，包括聚合物的药物组合物通过眼内、经皮、皮内、皮下、肌内或腹膜内施用途径施用。药物组合物的施用途径将取决于待治疗的疾病或状况。合适的施用途径包括但不限于肠外注射，例如皮内、静脉内、肌肉内、病灶内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径施用的聚合物的生物利用度可能低于通过肠外注射施用，但通过使用合适的制剂，可以设想的是通过经皮、口服、直肠、阴道、局部、鼻腔、吸入和眼部方式治疗施用本发明的组合物是可能的。

对于局部应用，本发明的聚合物和/或组合物可以与药学上可接受的载体结合，从而基于所需活性，递送有效剂量。载体可以是以下的形式，例如但不限于软膏、乳膏、凝胶、糊状物、泡沫、气雾剂、栓剂、垫或凝胶棒。

根据一些实施方式，本发明的聚合物和/或组合物可以在控释系统中递送。在另一个实施方式中，控释系统可以放置在治疗靶附近，因此只需要全身剂量的一小部分。

在一个实施方式中，将认识到的是本发明的聚合物和/或组合物可以与附加的活性剂一起提供给个体，以实现与用每种试剂单独治疗相比改进的治疗效果。在另一个实施方式中，对与联合治疗相关的不良副作用采取措施(例如，给予和选择互补剂)。

在一个实施方式中，根据待治疗的病症的严重性和反应性，剂量可以是单次或多次施用，治疗过程持续几天到几周，或者直到治愈受到影响或达到疾病状态的减轻。

在一些实施方式中，聚合物和/或组合物以治疗安全和有效的量施用。如本文所用，术语“安全和有效的量”是指当以目前描述的方式使用时，足以产生所需治疗反应而不会产生与合理收益/风险比相称的过度不良副作用(如毒性、刺激或过敏反应)的组分量。在另一个实施方式中，聚合物的治疗有效量是体内可测量的预期生物或治疗效果所需的聚合物的量。实际施用量以及施用率和施用时间将取决于所治疗疾病的特性和严重程度。治疗处方，如剂量、时间等的决定，由全科医生或专家负责，通常会考虑到需要治疗的疾病或需要纠正的缺陷、患者个人的状况、递送的部位、施用方法和医生已知的其他因素。技术和方案的例子可以在Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，21^stEd.，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，Pa(2005)中找到。在一些实施方式中，有效量或剂量的制备可以最初从体外测定中估计。在一个实施方式中，剂量可以在动物模型中配制，并且这样的信息可以用于人类的更准确地确定有用剂量。

在一个实施方式中，本文所述活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定以及动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列剂量。在一个实施方式中，剂量根据所使用的剂型和所使用的施用途径而变化。在一个实施方式中，确切的配方、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的情况来选择。[参见例如Fingl等，(1975)“ThePharmacological Basis of Therapeutics(治疗的药理学基础)”，Ch.1p.1]。

含有目前描述的聚合物作为活性成分的药物组合物可以根据常规的药物配制技术制备。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，18^th Ed.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa(1990)。另见Remington：The Science and Practice of Parmacy，21^stEd.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.(2005)。

在一个实施方式中，制备包括在相容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其放置在适当的容器中，并标记用于治疗指示的病症。

在一个实施方式中，本发明的组合物以包装或分配器装置(例如FDA批准的试剂盒)存在，其包括含有活性成分的一种或多种单位剂量形式。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔(例如泡罩包装)。在一个实施方式中，包装或分配器装置带有施用说明书。在一个实施方式中，包装或分配器上以由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式安置有与容器相关的注明事项，其中注明事项反映了该机构对组合物或人类或兽医管理形式的批准。在一个实施方式中，这种注明事项是由美国食品和药物管理局批准的处方药或批准的产品插页的标签。

使用方法

在一些实施方式中，本发明涉及一种用于填充或使有需要的受试者的组织丰盈的方法，方法包括向受试者施用包括治疗有效量的本发明组合物的药物组合物。

在一些实施方式中，本发明涉及一种用于填充或使有需要的受试者的组织丰盈的方法，该方法包括向受试者施用包括治疗有效量的本发明聚合物的药物组合物。

在一些实施方式中，如本文所定义的填充或丰盈方法是指将软填充材料注射到皮肤组织中。在一些实施方式中，填充是填充皱纹，例如面部皱纹。在一些实施方式中，填充是恢复皮肤的光滑外观或纹理。

在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到皮肤组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到牙龈组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到软骨组织中。在一些实施方式中，该方法涉及将本发明的聚合物或组合物注射到眼组织中。

根据一些实施方式，可以根据本领域已知的任何方法和使用任何注射装置进行注射。注射装置的非限制性示例包括但不限于以下的使用：注射器、微型注射器、无针装置、微针、针头、套管和导管。针规的非限制性示例包括但不限于18G、19G、20G、21G、22G、23G、24G、25G、26G、27G、28G、29G、30G、31G、32G、33G或34G。在一些实施方式中，注射是通过由人力驱动的注射装置进行的。

在一些实施方式中，本发明的方法涉及治疗有需要的受试者的关节炎。关节炎的非限制性实例包括但不限于急性传染性关节炎、焦磷酸钙关节炎、颞下颌关节炎(TMJ)、反应性关节炎、银屑病关节炎、慢性传染性关节炎、幼年特发性关节炎(JIA)、类风湿性关节炎或人工关节感染性关节炎。

在一个实施方式中，本发明的方法涉及治疗患有骨关节炎的受试者。

在一些实施方式中，本发明的方法涉及在外科手术之前或之后预防或治疗受试者的眼组织损伤。

在一些实施方式中，该方法涉及本发明的聚合物或组合物的局部应用。在一些实施方式中，本发明的聚合物被施加在皮肤组织上。在一些实施方式中，该方法涉及促进/增强有需要的受试者的伤口愈合。在一些实施方式中，该方法涉及在有需要的受试者中促进/增强伤口闭合。

在一个实施方式中，将本发明的聚合物提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的一种或多种聚合物提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的组合物提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的聚合物作为药物组合物的一部分提供给受试者，其中将其与药学上可接受的载体混合。在一个实施方式中，将一种或多种本发明的聚合物作为药物组合物的一部分提供给受试者，其中它们与药学上可接受的载体混合。在一个实施方式中，将本发明的组合物作为药物组合物的一部分提供给受试者，其中它们与药学上可接受的载体混合。

如本文使用的术语“受试者(subject)”是指动物，更具体地说是指非人类哺乳动物和人体。非人类动物受试者也可包括产前形式的动物，例如胚胎或胎儿。非人类动物的非限制性例子包括但不限于：马、牛、骆驼、山羊、绵羊、狗、猫、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠或猪。在一个实施方式中，受试者是人。人类受试者也可能包括胎儿。在一个实施方式中，有需要的受试者是患有和/或有患关节炎相关病症风险的受试者。在一些实施方式中，有需要的受试者是受组织体积减少影响的受试者。在一些实施方式中，组织体积的减少被称为“去体积化(devolumization)”。在一些实施方式中，组织去体积化包括脂肪损失、水分损失、湿度损失、细胞外基质降解、胶原损失或其他。在一些实施方式中，去体积化导致皮肤下垂和下降。在一些实施方式中，受试者患有烧伤。在一些实施方式中，需要伤口闭合方法的受试者患有体液渗漏，例如出血。如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病、紊乱或状况包括减轻其至少一种症状、降低其严重程度或抑制其进展。治疗并不意味着疾病、紊乱或状况完全治愈。为了成为有效的治疗，本文中有用的组合物仅需要降低疾病、紊乱或状况的严重程度，降低与其相关的症状的严重程度或改善患者或受试者的生活质量。

如本文所用，术语“预防(prevention)”疾病、紊乱或状况包括延迟、预防、抑制或抑制疾病、紊乱或状况的发作。如根据当前描述的主题所使用的，术语“预防”涉及其中受试者在疾病/紊乱过程的诱导或发作之前暴露于当前描述的聚合物或包括聚合物的组合物的预防过程。在任何情况下，预防(prophylaxis)这一术语都可用于包括预防(prevention)。相反，术语“治疗”是指活性剂的临床应用，以对抗其临床表现已经在患者身上实现的已经存在的疾病。

如本文所用，术语“状况(condition)”包括与正常情况的解剖和生理偏差，其构成了活体动物或其某个部分的正常状态的损害，其中断或改变了身体功能的表现。

试剂盒

根据一些实施方式，本发明提供一种试剂盒，其包括如上所述的第一HA链或其衍生物和如上所述的第二HA链或其衍生物，其中第一HA链、第二HA链或两者包括特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)至4000kDa之间的未修饰的HA链。

根据一些实施方式，本发明提供一种试剂盒，其包括偶联至不饱和部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物和偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物，其中第一HA链、第二HA链或两者包括特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4000kDa之间的未修饰HA链。术语“HA链或其衍生物”、“不饱和部分或其衍生物”和“四嗪部分或其衍生物”如上文所定义。

在一些实施方式中，试剂盒包括注射装置。在一些实施方式中，试剂盒包括旨在施用剂量的用于在皮肤内或通过皮肤注射的装置，或用于皮肤微穿孔的装置。

根据一些实施方式，本发明提供了包括本发明的聚合物的试剂盒。在一些实施方式中，如本文所述，试剂盒进一步包括未修饰的HA链和/或载体。在一些实施方式中，本发明的聚合物和未修饰的HA链存储在单独的容器中。在一些实施方式中，本发明的聚合物和未修饰的HA链是凝胶(例如水凝胶)的形式，其进一步包括水溶液(例如作为美容品上可接受或药学上可接受的载体)。在一些实施方式中，试剂盒包括本文公开的任何组合物。

在一些实施方式中，试剂盒包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物，其中所述第一HA链和所述第二HA链通过一个或多个连接体交联，其中所述一个或多个连接体包括与四嗪部分或其衍生物偶联的降冰片烯部分或其衍生物，并且其中所述聚合物的特征在于0.6至4％的交联度，其通过第一透明质酸(HA)链和第二HA链的修饰度预先确定，如通过¹HNMR测定的(例如WO2020003298中更详细描述的)。

在一些实施方式中，注射装置如上所述。在一个实施方式中，注射装置是一次性的。在一些实施方式中，注射装置适用于表皮内注射和/或皮内和/或皮下注射。在一些实施方式中，注射装置适用于美塑疗法(mesotherapy)技术。如本文所用，术语“美塑疗法”是指非手术美容药物治疗。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如上所公开的氨基酸。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如上所公开的矿物质。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如上所公开的维生素。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如上所公开的麻醉剂。

在一些实施方式中，试剂盒进一步包括如上所公开的药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，试剂盒包括本文公开的任何组合物。

在一些实施方式中，对包装进行刻痕以允许对偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物和任选地特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)至4000kDa之间的未修饰HA链、所述氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合采样。

在一个实施方式中，包装是以安瓿、瓶子或胶囊的形式。在一个实施方式中，胶囊是软胶囊。

在一些实施方式中，上述试剂盒的组份是无菌的。如本文所用，术语“无菌(sterile)”是指没有生物污染物的状态。任何灭菌方法都是可应用的，并且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

在一些实施方式中，试剂盒的使用是通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物，以及将组合物应用于填充或丰盈的方法中，所述组合物是通过将偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物和偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物混合而形成的。

在一些实施方式中，试剂盒的使用是通过进一步混合通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及未修饰的HA链形成的组合物，以及将组合物应用于填充或丰盈的方法中，所述组合物是通过将与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或及其衍生物以及未修饰的HA链混合而形成的。

在一些实施方式中，试剂盒的使用是通过进一步混合通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂或其任何组合而形成的组合物，以及将组合物应用于填充或丰盈的方法中，所述组合物是通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物以及未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质、麻醉剂，或其任何组合而形成的。

在一些实施方式中，试剂盒包括第一组合物，第一组合物包括第一HA链或其衍生物；和第二组合物，第二组合物包括第二HA链或其衍生物；其中第一HA链在第一组合物内的浓度和第二HA链在第二组合物内的浓度独立地在1至20mg/g之间、2至20mg/g之间、2至10mg/g之间、2至9mg/g之间、2至8mg/g之间、3至20mg/g之间、4至20mg/g之间、4至10mg/g之间、4至8mg/g之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，试剂盒包括说明书，其用于混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物，和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物，混合的比例约3：1、约3：2、约2：1、约1：1、约1：2，包括其间的任何范围；其中降冰片烯部分或其衍生物和四嗪部分或其衍生物如本文所述。

在一些实施方式中，试剂盒包括说明书，其用于混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链。

在一些实施方式中，试剂盒的使用是通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链，其中混合包括将组份引入注射装置中。

在一些实施方式中，试剂盒包括说明书，其用于混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物和与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或衍生物以及未修饰的HA链，其中混合在注射装置中进行。

在本试剂盒的一些实施方式中，通过混合偶联到不饱和部分(例如降冰片烯部分)或其衍生物的第一HA链或其衍生物和偶联到四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA而形成的组合物的特征在于相位角(δ)在0.1°至10°之间、0.1°至0.5°之间、0.1°至0.9°之间、0.1°至1°之间、0.1°至1.5°之间、0.1°至4.5°之间、0.1°至7.5°之间、0.1°至8.5°之间、0.1至9.5°之间、0.5°至10°之间、0.5°至0.9°之间、0.5°至1°之间、0.5°至1.5°之间、0.5°至4.5°之间、0.5°至7.5°之间、0.5°至8.5°之间、0.5至9.5°之间、0.9°至10°之间、0.9°至0.5°之间、0.9°至1°之间、0.9°至1.5°之间、0.9°至4.5°之间、0.9°至7.5°之间或0.9°至8.5°之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在本试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链而形成的组合物的特征在于弹性模量在40Pa至400Pa之间、45Pa至400Pa之间、50Pa至400Pa之间、70Pa至400Pa之间、80Pa至400Pa之间、40Pa至400Pa之间、100Pa至400Pa之间、45Pa至350Pa之间、50Pa至350Pa之间、70Pa至350Pa之间、80Pa至350Pa之间、95Pa至350Pa之间、150Pa至350Pa之间、48Pa至250Pa之间、55Pa至250Pa之间、70Pa至250Pa之间、80Pa至250Pa之间、90Pa至250Pa之间或100Pa至250Pa之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在本试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链而形成的组合物的特征在于平均挤压力在5N至30N之间、7N至20N之间、8N至20N之间、10N至20N之间、5N至18N之间、7N至18N之间、8N至18N之间、10N至18N之间、5N至15N之间、7N至15N之间、8N至15N之间或10N至15N之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在本试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链而形成的组合物的特征在于最大挤压力在5N至30N之间、7N至20N之间、8N至20N之间、10N至20N之间、5N至18N之间、7N至18N之间、8N至18N之间、10N至18N之间、5N至15N之间、7N至15N之间、8N至15N之间或10N至15N之间，包括其间的任何范围。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在本试剂盒的一些实施方式中，通过混合与降冰片烯部分或其衍生物偶联的第一HA链或其衍生物、与四嗪部分或其衍生物偶联的第二HA链或其衍生物和未修饰的HA链而形成的组合物的特征在于挤压曲线没有以下的峰：高于2N、高于1.9N、，高于1.8N、高于1.7N、高于1.5N或高于1N，包括其间的任何值。每种可能性代表本发明的一个单独的实施方式。

在一些实施方式中，试剂盒的组份被包装在容器内。

在一些实施方式中，容器由选自以下的材料制成：薄壁膜或塑料(透明或不透明)、纸板类、箔、硬塑料、金属(例如铝)、玻璃等。

在一些实施方式中，试剂盒的内容物被包装，如下所述，以允许存储组份直到需要它们为止。

在一些实施方式中，试剂盒的一些或所有组份可以被包装在合适的包装中以保持无菌。

在一些实施方式中，包装具有允许在储存期间气密密封的盖子，并且其在使用时可以被针或套管刺穿。

在一些实施方式中，试剂盒的组份存储在主试剂盒容纳元件(例如，盒子或类似结构)内的单独容器中，可以是或可以不是气密容器，例如，以进一步保持试剂盒的一些或所有组份的无菌性。

在一些实施方式中，试剂盒中提供的偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物、未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂的剂量可足以用于单个应用或用于多个应用。

在一些实施方式中，试剂盒可以具有多剂量的偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物、未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂，其包装在单个容器中，例如，单个管中，瓶子、小瓶、Eppendorf等中。

在一些实施方式中，试剂盒可以具有多剂量的单独包装的偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物、未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂，使得某些试剂盒可以具有一个以上容器的偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物，未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂。

在一些实施方式中，多剂量的偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物、偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物、未修饰的HA链、氨基酸、维生素、矿物质或麻醉剂可以包装在单个单独的容器中。

在一些实施方式中，试剂盒包括说明书，其用于制备本文使用的组合物以及如何实践本发明的方法。

在一些实施方式中，说明书可以被记录在合适的记录介质或基板上。例如，说明书可以印刷在基板例如纸张或塑料等上。

在一些实施方式中，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒或其组件(即，与包装或子包装相关)的容器的标签中等。在其他实施方式中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM、软盘等。在其他实施方式中，实际说明书不存在于试剂盒中，但是提供了用于从远程源(例如经由互联网)获得说明书的方法。该实施方式的例子是包括网址的试剂盒，在网址中可以查看说明书和/或从网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的这种方法记录在合适的基板上。

在另一个方面，如本文所述，提供了一种制备本发明的聚合物或包括聚合物和未修饰HA的组合物的方法。

在一些实施方式中，制造本发明的聚合物的方法包括混合偶联至降冰片烯部分或其衍生物的第一HA链或其衍生物和偶联至四嗪部分或其衍生物的第二HA链或其衍生物，混合的摩尔比或重量比(在第一HA链和第二HA链之间)为：约3：2、约2：1、约1：1、约1：2，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，第一HA链和第二HA链各自独立地为水性组合物(例如溶液、分散体或悬浮液)的形式。在一些实施方式中，第一HA链或第二HA链在水性组合物中的浓度如上所述(例如，在1-20mg/g之间)。

在一些实施方式中，该方法包括在适当的条件下将预定量的第一组合物与第二组合物混合。

在一些实施方式中，预定量包括本文所述的第一HA链或第二HA链的浓度，以及第一HA链和第二HA链之间的摩尔比或重量比约3：1、约3：2、约2：1、约1：1、约1：2、约1：3、在1.5：1和1：1.5之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，适当的条件包括环境气氛和温度在0至60℃之间、0至30℃之间、10至30℃之间、10至60℃之间、30至60℃之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，适当的条件包括反应时间(在混合或搅拌下)在1秒至2周之间，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，适当的条件进一步包括老化(例如在0至60℃之间的温度下且不搅拌或混合)1至30天之间、1至15天之间，包括其间的任何范围。

在一些实施方式中，制备包括聚合物和未修饰HA的组合物的方法包括在适当条件下以第一HA链与第二HA链之间的摩尔比或重量比约3：1、约3：2、约2：1、约1：1、约1：2、约1：3，在1.5：1至1：1.5之间，包括其间的任何范围，将预定量的第一组合物和第二组合物混合，其中所述适当条件、混合、第一组合物和第二组合物如本文所述，并且其中第一组合物和/或第二组合物进一步包括未修饰的HA。

在一些实施方式中，第一组合物和/或第二组合物中未修饰HA的浓度在5％至60％之间、5％至30％之间、10％至60％之间、10％至30％之间、5％至20％之间、5％至40％之间、10％至20％之间、20％至60％之间、20％至40％之间、40％至60％之间，包括其间的任何范围。

定义

如本文所用，术语“烷基(alkyl)”描述包括直链和支链基团的脂族烃。优选地，烷基具有21-100个碳原子，更优选地为21-50个碳原子。每当本文陈述数值范围例如“21-100”时，这意味着该基团，在这种情况下即烷基，可包括21个碳原子、22个碳原子和23个碳原子等，至多并包括100个碳原子。在本发明的上下文中，“长烷基(long alkyl)”是在其主链(连续共价连接原子的最长路径)中具有至少20个碳原子的烷基。因此，短烷基具有20个或更少的主链碳。如本文所定义，烷基可以是取代的或未取代的。

此处使用的术语“烷基”也包括饱和或不饱和烃，因此该术语进一步包括烯基和炔基。

如本文所定义的，术语“烯基(alkenyl)”描述具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和烷基。烯基可以被一个或多个取代基取代或未取代，如上所述。

如本文所定义的，术语“炔基(alkynyl)”是具有至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和烷基。如上所述，炔基可以被一个或多个取代基取代或未取代。

术语“环烷基(cycloalkyl)”描述了全碳单环或稠环(即共享一对相邻碳原子的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π电子系统。如本文所示，环烷基可以是取代的或未取代的。

术语“芳基(aryl)”描述了具有完全共轭π电子系统的全碳单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)基团。如本文所示，芳基可以是取代的或未取代的。

如本文所定义，术语“烷氧基(alkoxy)”描述-O-烷基和-O-环烷基。

如本文所定义，术语“芳氧基(aryloxy)”描述-O-芳基。

本文通式中的烷基、环烷基和芳基中的每一个都可以被一个或多个取代基取代，其中每个取代基可以独立地为，例如，卤离子、烷基、烷氧基、环烷基、烷氧基、硝基、胺、羟基、硫醇、硫代烷氧基、硫代羟基、羧基、酰胺、芳基和芳氧基，这取决于取代基及其在分子中的位置。还考虑了另外的取代基。

术语“卤离子(halide)”、“卤素(halogen)”或“卤基(halo)”描述氟、氯、溴或碘。

术语“卤代烷基(haloalkyl)”描述如本文所定义的烷基，其进一步被一种或多种卤离子取代。

术语“卤代烷氧基(haloalkoxy)”描述如本文所定义的烷氧基，其进一步被一种或多种卤离子取代。

术语“羟基(hydroxyl)”或“羟基(hydroxy)”描述了-OH基团。

术语“硫代羟基(thiohydroxy)”或“硫醇(thiol)”描述了-SH基团。

术语“硫代烷氧基(thioalkoxy)”描述了本文定义的-S-烷基和-S-环烷基。

术语“硫代芳氧基(thioaryloxy)”描述了本文定义的-S-芳基和-S-杂芳基。

术语“胺(amine)”描述了-NR’R”基团，其中R’和R”如本文所述。

术语“杂芳基(heteroaryl)”描述了在环中具有一个或多个原子(例如氮、氧和硫)，此外还具有完全共轭的π电子系统的单环或稠环(即共享相邻原子对的环)基团。杂芳基的实例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。

术语“杂脂环(heteroalicyclic)”或“杂环基(heterocyclyl)”描述在环中具有一个或多个原子如氮、氧和硫的单环或稠环基团。环也可以具有一个或多个双键。然而，这些环不具有完全共轭的π电子系统。代表性实例为哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。

术语“羧基(carboxy)”描述-C(＝O)-OR’基团，其中R’是氢、烷基、环烷基、烯基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)或杂脂环(通过环碳键合)，如本文所定义；或其中R’不存在，例如羧酸根阴离子和/或羧酸盐。

术语“羰基(carbonyl)”描述了-C(＝O)-R'基团，其中R'如上文所定义。

上述术语还包括其硫代衍生物(硫代羧基和硫代羰基)。

术语“硫代羰基(thiocarbonyl)”描述了-C(＝S)-R’基团，其中R’如上文所定义。

“硫代羧基(thiocarboxy)”基团描述-C(＝S)-OR'基团，其中R’如本文所定义。

“亚磺酰基(sulfinyl)”基团描述-S(＝O)-R'基团，其中R’如本文所定义。

“磺酰基(sulfonyl)”或“磺酸盐(sulfonate)”基团描述-S(＝O)₂-R’基团，其中Rx如本文所定义。

“氨基甲酰基(carbamyl)”或“氨基甲酸酯(carbamate)”基团描述-OC(＝O)-NR’R”基团，其中R’如本文所定义，R”如本文所定义。

“硝基(nitro)”是指-NO₂基团。

“氰基(cyano)”或“腈(nitrile)”基团是指-C≡N基团。

如本文所用，术语“叠氮化物(azide)”是指-N₃基团。

术语“磺酰胺(sulfonamide)”是指-S(＝O)2-NR’R”基团，其中R’和R”如本文所定义。

术语“膦酰基(phosphonyl)”或“膦酸酯(phosphonate)”描述-O-P(＝O)(OR’)₂基团，其中R'如上文所定义。

术语“亚膦基(phosphinyl)”描述了-PR’R”基团，其中R’和R”如上文所定义。

术语“烷芳基(alkaryl)”描述如本文所定义的烷基，其被芳基取代。示例性的烷芳基是苄基。

术语“杂芳基(heteroaryl)”描述了在环中具有一个或多个原子(例如氮、氧和硫)，此外还具有完全共轭的π电子系统的单环或稠环(即共享相邻原子对的环)基团。杂芳基的实例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。如上所述，杂芳基可以被一个或多个取代基取代或未取代。代表性实例为噻二唑、吡啶、吡咯、噁唑、吲哚、嘌呤等。

如本文所用，术语“卤基(halo)”和“卤离子”，其在本文中可互换地提及，描述卤素原子，即氟、氯、溴或碘，在本文中也称为氟离子、氯离子、溴离子和碘离子。

术语“卤代烷基(haloalkyl)”描述如上定义的烷基，其进一步被一种或多种卤离子取代。

一般描述

除非另有说明，本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比率范围应理解为包括该范围内的任何整数及其分数的浓度、百分比或比率，例如整数的十分之一和百分之一。

除非另有说明，本文所述的与任何物理特征(例如聚合物亚基、尺寸或厚度)有关的任何数量范围应理解为包括所述范围内的任何整数。

如本文所用，术语“受试者”或“个体(individual)”或“动物(animal)”或“患者(patient)”或“哺乳动物(mammal)”是指任何受试者，特别是需要治疗的哺乳动物受试者，例如人类。

在讨论中除非另有说明，否则修饰本发明的一个或多个特征的条件或关系特征的例如“基本上(substantially)”和“约(about)”的形容词应理解为意思是条件或特性被定义为在对于意欲应用的实施方式的操作是可接受的公差内。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中的“或(or)”一词被视为包括性“或”，而不是排他性或，并表示其连接的项目中的至少一个或任何组合。

应当理解，上文和本文其他地方使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”是指列举的组份中的“一个或多个”。除非另有特别说明，本领域普通技术人员将清楚单数的使用包括复数。因此，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“至少一个(at least one)”在本申请中可互换使用。

术语“由……组成(consisting of)”是指“包括并限于(including and limitedto)”。

术语“基本由……组成(consisting essentially of)”是指组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但仅当额外的成分、步骤和/或者部分不会实质性地改变所要求保护的组合物、方法或者结构的基本和新特性。

“示例性的(exemplary)”一词在本文中的意思是“作为例子(example)、实例(instance)或例证(illustration)”。被描述为“示例性的”的任何实施方式不必被解释为优选或优于其他实施方式和/或排除从其他实施方式中并入特征。

“任选地(optionally)”一词在本文中用于表示“在一些实施方式中提供而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的(optional)”特征，除非这些特征冲突。

在整个申请中，可以以范围形式展示本发明的各种实施方式。应当理解，范围形式的描述仅为了方便和简洁并且不应该被解释为对发明范围僵化的限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围例如从1至6的描述应当被认为具体地公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。

无论何时本文指示了数值范围，其意思是包括在所指示范围内的任何提及的数值(分数或整数)。短语“在第一个所指示数字和第二个所指示数字之间的范围”和“从第一个所指示数字至第二个所指示数字的范围”可互换使用，并且旨在包括第一个和第二个所指示数字以及其间的所有分数和整数数字。

如本文所用，术语“方法(method)”是指完成特定任务的方式、手段、技术和程序，包括，但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的技术人员已知的或他们容易从已知的方法、手段、技术和程序发展而来的那些方法、手段、技术和程序。

如本文所用的，术语“治疗(treating)”包括停止、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状，或基本上防止病况的临床或美学症状的出现。

为了更好地理解本教导并且不以任何方式限制教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反地指出，在以下说明书和所附权利要求中提出的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的期望特性而变化。至少，每个数值参数都应至少根据报告的有效位数进行解释，并采用普通舍入技术。

在本申请的说明书和权利要求书中，每个动词“包括(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”及其词形变化都用于表示该动词的一个或多个宾语不必是动词的一个或多个主语的组份、要素或部分的完整列表。

本文中使用的其他术语是指由它们在本领域中的众所周知的含义来定义。

本发明的附加目的、优点和新颖特征对于本领域的普通技术人员来说将在检查以下实施例后变得显而易见，这些实施例并非旨在限制。此外，如上文所述以及如以下权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中都得到了实验支持。

应当理解，为了清晰起见，在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开提供，或者以任何合适的子组合提供，或者在本发明的任何其他描述的实施方式中适当提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非实施方式在没有这些要素的情况下不能实现。

实施例

材料和方法

第二HA链(例如HA-四嗪)和第一HA链(如HA-降冰片烯)的制备。示例性的合成过程如在WO2020003298中更详细地描述。

通过交联第一HA链(例如HA-降冰片烯)和第二HA链(如HA-四嗪)制备交联聚合物。

在示例性程序中，将HA-四嗪和HA-降冰片烯分别溶解在pH值为7.0至8.0的磷酸盐缓冲溶液中，以获得浓度分别独立地范围在1至20mg/g或1至10mg/g之间的HA-四嗪水溶液和HA-降降冰片烯水溶液。将基本相同体积的两种溶液混合，并在37℃下放置24小时，然后在室温下进一步放置，直到流变凝胶参数稳定。

所获得的凝胶的交联度是所使用的HA-四嗪和HA-降冰片烯的修饰度的平均值。

实施例1

sHA含量的测定

已经测试了包括本发明交联聚合物的示例性组合物的每种组合物的sHA含量。此外，已经测定了市售皮肤填充物的sHA含量，如下所述。简而言之，sHA含量已根据基于HPLC的方法和通过咔唑测定法进行测定。

此外，已经确定了每种测试组合物的挤压力。表1和表2中总结了这些试验的结果。

挤压力测量

使用Mecmesin牵引台仪器测量挤压力。数据是通过从装有27G1/2”或29G1/2”或30G1/2”针头的1mL注射器中以12.5mm/min的标准速率挤出凝胶获得的。对于测试的凝胶，没有进行筛分或破碎。

sHA含量的测定(基于HPLC的方法)

每个含HA样品的分析数据报告了水凝胶样品中检测到的提取的可溶性HA的质量(μg)、其分子量(Mw)、多分散性(即p/d)(Mw/Mn)和Rz值(nm)。此外，针对多分子量(Mw)限值<50kDa、<100kDa和<250kDa，测定了可溶性HA(sHA)级分。sHA含量已通过HPLC进行定量测定，其采用经验证的HPLC方法。

这些结果在表2中详细说明，其中它们表示为％sHA和校正％sHA在Mw限值<50kDa、<100kDa和<250kDa的表征曲线。％sHA级分根据HA含量(mg/g)进行归一化，以获得有效的可比较的Mw限值结果。

将高压液相色谱法、尺寸排阻色谱法、多角度光散射和折射率检测器(HPLC-SEC-MALS-RI)连起来，用于检测通过稀释和过滤分离后释放的sHA。sHA的分析数据依赖于众所周知的方法，即，使用已知浓度(mg/mL)的样品在已知量(mL)的0.1μm过滤的150mM硝酸钠溶液(流动相)中稀释。稀释的混合物由修饰(mHA)和可溶性(sHA)透明质酸组成——样品组合物。高度网络化和较大尺寸的mHA部分通过使用0.45μm过滤器与sHA部分进行分离。所得过滤材料sHA用于提供适用于HPLC-SEC-MALS-RI分析的样品。

Agilent Technologies HPLC连接到Wyatt Technology’s Dawn 18-angle MALS和OptilabRI检测器。尺寸排阻色谱法(SEC)是两(2)个Shodex LB-806M柱。

sHA的绝对分子量(摩尔质量)——HPLC-SEC-MALS-RI确定sHA的绝分子量、分子的独特摩尔和样品质量(g)、摩尔质量(g/mol)。

流动相——使用硝酸钠溶液作为流动相。

折射率随HA浓度的变化(dn/dc)——HPLC-SEC-MALS-RI方法的定量特异性依赖于可靠的dn/dc值的使用。这些值确定了分析物(例如HA)在某温度下在特定溶剂中的折射率(dn)相对于其浓度(dc)的变化。硝酸钠流动相的dn/dc值0.165mL/g用于使用Wyatt软件对sHA进行量化和表征。

本文给出的分析结果基于样品的两次HPLC-SEC-MALS-RI系统注射。在Astra软件采集周期内自动考虑注射量(μL)变化。

sHA含量的测定(咔唑测定法)

称重凝胶(约200mg)到15mL离心管中。将过量的7mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入到每个管中。将所得混合物通过漩涡均质化，并在37℃下孵育7小时，同时轻轻旋转样品。孵育后，通过0.45μm尼龙过滤器过滤样品，以将滤液中的非可溶性凝胶与可溶性HA级分分离。滤液样品用PBS稀释以适应测定校准范围，然后使用咔唑测定法(改编自欧洲药典中透明质酸钠专著中描述的测定法)测定HA浓度。将滤液中的HA浓度转化为初始凝胶中可溶性HA的相应浓度。实验进行一式三份。

如表1所示，本发明的示例性组合物的挤压力值在可接受的范围内。

表1：sHA含量(通过咔唑测定法测定)和挤压力值

条目1代表交联度为1％的商业皮肤填充物，其特征在于sHA的级分高于10％(14.7％)。

条目2-5显示交联度对本发明示例性组合物的sHA含量的影响。0.45％时的交联不足以确保可溶性级分低于10％(条目2)。0.8％、1.0％和1.4％的交联度确保可溶性级分低于10％(条目3至5)。

条目3、4和6-9显示了在0.8％(条目3、6、8)和1.0％(条目4、7、9)的交联度下HA浓度对本发明示例性组合物的sHA含量的影响。在所研究的浓度范围(4-8mg/g)内，所有测试的本发明的示例性组合物都符合低于10％的可溶性HA级分。

条目10显示了约3％的较高交联度和非常低的sHA级分(0.6％)的效果。在该组合物中，测得的挤压力在可接受的范围内(不超过30N)，因此该组合物被认为是可挤出的。

表2：sHA含量(通过HPLC测定)

条目1、2表示具有不同连接体的交联度为1％和6％的两种商业皮肤填充物，其包括高于10％(分别为16.4％和26.7％)的可溶性HA级分。

条目3-8表示本发明的示例性组合物，表现出以下的效果：(i)0.8％-1.0％范围内的交联度和(ii)4mg/gr-8mg/gr范围内的HA浓度，其符合低于10％的可溶性HA级分。

与市售凝胶不同，条目1、2与条目3-8比较，确认本发明的示例性组合物的sHA含量低。具体地，本发明的组合物包括非常低含量的分子量低于50kDa的sHA级分，如文献中所公开的，这与显著的促炎风险有关。

此外，本发明人评估了本发明的HA凝胶的sHA含量，其包括基于苯乙烯/四嗪的交联剂(例如分别衍生自苯乙烯和四嗪部分IA和IIIB的交联剂)。包括交联度大于1％的基于苯乙烯/四嗪的交联剂的一些示例性组合物表现出在可接受范围内的sHA含量。

实施例2

可溶性级分中的流变学、挤压力和HA含量

已经测试了包括本发明的交联聚合物和未修饰HA的示例性组合物的根据不同程序(程序A-C)获得的每种组合物的流变性、挤压力和sHA含量。

此外，如上所述，已经确定了每种测试组合物的挤压力。表3和表4总结了这些试验的结果。

可溶性级分中HA含量的测定(咔唑测定法)

称重凝胶(约200mg)到15mL离心管中。将过量的7mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入到每个管中。将所得混合物通过漩涡均质化，并在37℃下孵育7小时，同时轻轻旋转样品。孵育后，通过0.45μm尼龙过滤器过滤样品，将滤液中的非可溶性凝胶与可溶性HA级分分离。滤液样品用PBS稀释以适应测定校准范围，然后使用咔唑测定法(改编自欧洲药典中透明质酸钠专著中描述的测定法)测定HA浓度。将滤液中的HA浓度转化为初始凝胶中可溶性级分的HA含量的相应百分比。实验进行一式三份。

本发明人发现，未修饰的HA与HA-四嗪和HA-降冰片烯的混合允许在不损害凝胶均质性的情况下产生预期的优点，并且因此具有有限的机械性能降低。

程序A：未添加未修改的HA。

程序B，根据本发明：同时混合HA-四嗪、HA-降冰片烯和未修饰的HA。或者，首先将HA-四嗪或HA-降冰片烯的水溶液与预定量的未修饰HA混合，随后将所得混合物分别与HA-降冰片烯或HA-四嗪反应。该反应是在材料和方法部分所述的条件下进行的。

程序C：交联反应后加入未修饰HA并机械化均质。

表3：可溶性级分中的流变学和HA含量(通过咔唑测定法测定)

条目2-3与条目1相比、条目5-7与条目4相比以及条目9-10与条目8相比表明，添加未修饰HA具有降低流变性能的预期效果，如G’的降低和相位角δ的增加所示。

如条目2与条目3相比和条目6与条目7相比所示，用程序B和C制备的凝胶的G’值是相当的(约10％至20％的差异)。

如条目2与条目3相比和条目6与条目7相比所示，用程序B制备的凝胶的相位角δ显著低于用程序C制备的水凝胶的相位角δ(175％-340％)。这些数据表明通过程序B比程序C生产出更强的凝胶、更强的抵抗力和更高的机械质量。因此，程序B通过保持较低的相位角δ值，可以更好地保持凝胶的整体粘弹性。

条目5和6以及条目9-11显示了当根据程序B制备时组合物中未修饰HA含量的剂量效应。条目5-6的组合物中的未修饰HA从10％到20％和条目9-11的组合物中未修饰HA从5％到15％对G'的降低和相位角δ的增加有逐渐的效果。

条目2和3显示，在程序B和C中，制备的凝胶的可溶性级分中HA的测量量相似(条目2对3，16.7％对17.5％)，确定当凝胶以1.4％的交联度和6mg/gr的HA浓度制备时，添加的未修饰HA不与交联基质互连。

条目5和6以及条目9-11显示，在1.9％或约3％的较高交联度和8mg/gr的较高HA浓度下，未修饰的HA不能从根据程序B制备的凝胶中作为可溶性HA级分完全回收(在条目5-6中分别含有10％和20％未修饰HA的组合物，可溶性级分中％HA为2.9％和8.7％)。在这种情况下，怀疑密度更大的交联网络阻碍了未修饰HA在水中的释放。

条目12-15显示HA浓度对根据程序B制备的制剂的影响，其中2.21％的恒定交联度和恒定量的未修饰HA添加到组合物中。组合物中HA浓度从2mg/gr(条目12)增加到10mg/gr(条目15)具有增加G’和减小相位角δ的效果，反映了凝胶的硬化。还观察到，对于浓度最低的制剂(条目12)接近10％的可溶性级分中的％HA，即添加到制剂中的量，对于浓度最高的组合物，逐渐降低至2.7％(条目15)。这一观察结果支持了前面提到的假设，即密度更大的HA网络阻碍了未修饰HA在水中的释放。

条目16显示，在组合物中添加更多未修饰的HA(30％)可以产生非常柔软的凝胶(低G’)，尽管具有高度弹性(低相位角δ)，可能非常适合更浅层真皮注射。

表4：挤压力值

条目2-3与条目1相比、条目5-7与条目4相比、条目9-11与条目8相比表明，添加未修饰的HA具有降低平均凝胶挤出力的效果，从而使患者更容易注射。

如条目2与条目3相比和条目6与条目7相比所示，用程序B和C制备的凝胶的平均挤出力是相当的。

程序B提供了比程序C更均质的凝胶，如最大挤压力和平均挤压力之间的较小差异所示：条目2与条目3相比分别为1.1N和8.2N，条目6与条目7相比分别为0.8N和2.3N。图1中还直观地观察到通过程序B与程序C制备的凝胶具有更好的凝胶均质性和更平滑的挤压曲线。

值得注意的是，对于根据程序C制备的凝胶，可以通过更强的凝胶筛分、混合或其他机械剪切过程来提高挤压曲线的均匀性和线性。然而，凝胶的机械质量会同时降低(G’的降低和相位角δ的增加)，这对皮肤填充物不利。

条目5和6、条目9-11以及条目13和16显示了当根据程序B制备时组合物中未修饰HA的含量的剂量效应。组合物中未修饰HA的平均挤压力从10％到20％(条目5-6)或从5％到15％(条目9-11)或从10％到30％(条目13和16)的降低是渐进的，然而凝胶均质性在所有情况下都是良好的，如最大和平均挤压力之间的差异所示(分别地，条目5和6为1.4N、0.8N，条目9-11为1.0N、1.1N、1.0N，条目13和16为0.4N)。

条目12-15显示HA浓度对根据程序B制备的制剂的影响，其中2.21％的恒定交联度和恒定量的未修饰HA添加到组合物中。组合物中HA浓度从2mg/gr(条目12)增加到10mg/gr(条目15)导致平均挤压力逐渐增加，同时凝胶均质性在所有情况下都是良好的，如最大和平均挤压力之间的差异所示(条目12-15分别为1.1N、0.4N、0.8N和1.1)。

实施例3

HPLC测定可溶性级分中HA含量

通过HPLC-MALS-RI测定实施例2的组合物的可溶性级分中HA和sHA的含量(如上所述测定)(表5)。

表5：HA在可溶性组份中的含量(通过HPLC测定)

可以观察到，在不存在未修饰HA的情况下制备的凝胶中，可溶性级分中的HA含量和低分子量HA片段的含量低于1％(表5，条目1)。

通过HPLC测定，在通过方法B和C制备的可比较凝胶中，可溶性级分中HA的量相似(表5，条目2-3，9.89％与11.09％相比)。

在通过方法B和C制备的两种可比较的凝胶中未检测到具有低分子量和较高促炎风险的HA片段(条目2-3)。

通过HPLC测定，在通过方法B和C制备的可比较凝胶中，可溶性级分中HA的平均分子量相似(612.3kDa与711.1kDa相比)。

实施例4

水中溶解实验

从注射器中挤出约200mg凝胶，并加入8mL用甲苯胺蓝(0.0025％)着色的水。在3次温和的混合之后，将凝胶静置在有色水中，并肉眼观察其演变。

图2A-D显示了根据实施例2的表3的条目4-7获得的凝胶在30分钟后的溶解测试结果。

来自实施例2的程序A的凝胶在没有未修饰HA的情况下制备(条目4，表1)(图2A)，以及来自实施例2中的程序B的两种凝胶(条目5，6，表3)(图2B-C)获，得了类似的结果，其中一些大尺寸碎片(>5mm)由最初均质的凝胶的随机碎片产生。相反，来自实施例2的程序C的凝胶(条目7，表3)溶解成小颗粒(<2mm)(图2D)。

这些结果表明，当HA-四嗪、HA-降冰片烯和未修饰的HA根据程序B同时混合时，交联凝胶具有良好的均质性。另一方面，程序C的使用导致大量凝胶碎裂成小颗粒，预计会对最终交联凝胶的机械质量产生负面影响。

虽然本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、改变和等价。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明真正精神范围内的所有此类修改和改变。

Claims

1.一种组合物，其包括聚合物，所述聚合物包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物，其中所述第一HA链和所述第二HA链通过一种或多种连接体交联，其中所述一种或多种连接体包括与四嗪部分或其衍生物结合的不饱和部分或其衍生物，其中所述聚合物的特征在于交联度在0.6至4％之间，并且其中在所述组合物中水溶性HA(sHA)和所述聚合物之间的重量比小于10％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种连接体由式(A)：

或其组合表示；其中：

表示单键或双键；

R¹、R²或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z是键、芳基或杂芳基；

A选自：键、烷基和芳基；

Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；

并且其中R³选自：氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述不饱和部分包括苯乙烯部分或其衍生物；并且其中所述苯乙烯部分共价结合到所述第一HA链或所述第二HA链；并且其中所述苯乙烯部分或其衍生物由式IA-D表示：

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种连接体由式(C)：

或其组合表示；其中：

表示单键或双键；

R¹、R²或两者选自：键、烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、C(O)-NH-烷基-NH和烷基-NZ，其中Z是键、芳基或杂芳基；

Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；并且其中

R³选自：氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述一种或多种连接体衍生自：

(a)由式IIA-G中任一个表示的降冰片烯部分：

和(b)由式IIIA-F中任一个表示的四嗪部分：

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述一个或多个连接体中的每一个包括与所述四嗪部分共价结合的所述降冰片烯部分。

7.根据权利要求5和6中任一项所述的组合物，其中所述降冰片烯部分和所述四嗪部分中的任何一个与(i)所述第一HA链或(ii)所述第二HA链共价结合。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述共价结合是通过选自以下的键：酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述交联度在0.7％至3％之间，或在0.8％至3％之间；其中所述组合物中按重量计至少70％的所述第一HA链和所述第二HA链是交联的。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述第一HA链和所述第二HA链的平均分子量(MW)为500,000至4,000,000道尔顿(Da)，并且其中所述聚合物的特征在于水溶解度至多0.1g/L。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其进一步包括水溶液，并且其中所述聚合物在所述组合物内的浓度在1至25mg/ml之间，或在1至10mg/ml之间。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述sHA的特征在于平均分子量(MW)小于250kDa、水溶解度至少为0.1g/L。

13.根据权利要求12所述的组合物，其进一步包括特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4000千道尔顿之间的未修饰HA链，并且其中所述组合物的特征在于相位角(δ)至多10°。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物的特征在于基本上不含颗粒物质，并且其中所述组合物包括在5％至30％重量/重量(w/w)之间的所述未修饰HA链。

15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中所述组合物包括在5％至30％重量/重量(w/w)之间的所述未修饰HA链；并且其中所述未修饰HA的特征在于水溶解度至少1g/L。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物的特征在于以下至少一个：在5牛顿(N)至30N之间的平均挤压力；在5N和30N之间的最大挤压力；挤压曲线没有高于2N的峰；和弹性模量(G’)在20Pa和400Pa之间。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述组合物的特征在于小于30N的挤压力；并且其中所述聚合物的交联度由通过¹H NMR测定的以下(i)和(ii)之间的摩尔比预先确定：(i)以下任一个：所述降冰片烯部分、所述四嗪部分或所述苯乙烯部分；和(ii)所述第一HA链或所述第二HA链。

18.一种试剂盒，其包括(i)包括权利要求1至12中任一项的第一HA链的第一组合物，其中所述第一HA链在所述第一组合物内的浓度在2至20mg/g之间；和(ii)包括权利要求1至12中任一项的第二HA链的第二组合物，其中所述第二HA链在所述第二组合物内的浓度在2至20mg/g之间。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一HA链和所述第二HA链各自独立地特征在于修饰度在0.6至4％之间，或0.6至3％之间；其中所述修饰度通过¹H NMR测定。

20.根据权利要求18和19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一组合物和所述第二组合物中的任何一种进一步包括药学上可接受的载体；并且其中所述第一组合物和所述第二组合物中的任何一种进一步包括选自以下的组份：氨基酸、矿物质、维生素和麻醉剂或其任何组合。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒中所述第一链的不饱和部分与所述第二链的四嗪部分之间的摩尔比在3：1至1：3之间。

22.根据权利要求18至21中任一项所述的试剂盒，还包括注射装置。

23.根据权利要求18至22中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于以下的说明书：a.以在3：1至1：3之间的体积/体积(v/v)比例混合所述第一组合物和所述第二组合物；和

b.施加通过混合所述第一组合物和所述第二组合物形成的混合物，用于填充或使有需要的受试者的组织丰盈。

24.根据权利要求18至23中任一项所述的试剂盒，其进一步包括将所述混合物或所述第一组合物和所述第二组合物中的任一个与化合物混合的说明书，所述化合物选自：氨基酸、矿物质、维生素和麻醉剂或其任何组合；并且其中所述混合在所述注射装置中进行。

25.一种制造权利要求1至12中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括：混合权利要求18至24中任一项的第一组合物和权利要求18到24中任一项的第二组合物，从而获得所述组合物。

26.一种组合物，包括：

(a)包括第一透明质酸(HA)链或其衍生物和第二HA链或其衍生物的聚合物，其中：

(i)所述第一HA链和所述第二HA链通过一个或多个连接体交联；

(ii)所述一种或多种连接体包括不饱和部分或其衍生物和四嗪部分或其衍生物；

(iii)所述交联的特征在于交联度在0.6％和4％之间；和

(b)未修饰HA链，其特征在于平均分子量(MW)在300千道尔顿(kDa)和4,000千道尔顿之间，并且其中所述组合物的特征在于相位角(δ)至多10°。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物包括在5％至30％重量/重量(w/w)之间的所述未修饰HA链；并且其中所述组合物的特征在于基本上不含颗粒物质。

28.根据权利要求26或27所述的组合物，其中所述组合物的特征在于以下至少一个：平均挤压力在5牛顿(N)至30N之间；最大挤压力在5N和30N之间；挤压曲线没有高于2N的峰；和弹性模量(G’)在20Pa和400Pa之间。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述聚合物的浓度在1mg/ml至25mg/ml之间；并且其中所述第一HA链和所述第二HA链的特征在于平均MW在500kDa和4000kDa之间。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种连接体由式(A)：

或其组合表示；其中：

表示单键或双键；

A选自：键、烷基和芳基；

Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述不饱和部分包括苯乙烯部分或其衍生物，并且其中所述苯乙烯部分共价结合到所述第一HA链或所述第二HA链，其中所述苯乙烯部分或其衍生物由式IA-D表示：

32.根据权利要求26至29中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个连接体中的每一个包括与所述四嗪部分共价结合的所述降冰片烯部分；其中所述降冰片烯部分和所述四嗪部分中的任何一个共价结合到(i)所述第一HA链或(ii)所述第二HA链。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述一种或多种连接体由式(C)：

或其组合表示；其中：

表示单键或双键；

Q¹、Q²或两者代表氢，或不存在；和

R³选自：氢、烷基、芳基或杂芳基，其为取代或未取代的。

34.根据权利要求32或33所述的组合物，其中所述一种或多种连接体衍生自：

(a)由式IIA-G中任一个表示的降冰片烯部分：

和(b)由式IIIA-F中任一个表示的四嗪部分：

35.根据权利要求32至34所述的组合物，其中所述共价结合是通过选自以下的键：酰胺、胺、酯、醚、尿素、硫脲和氨基甲酸酯。

36.根据权利要求26至35中任一项所述的组合物；并且其中在以下(i)和(ii)之间的摩尔比通过¹H NMR测定：(i)以下任一个：所述不饱和部分、所述四嗪部分；和(ii)所述第一HA链或所述第二HA链。

37.根据权利要求26至36中任一项所述的组合物，其中所述未修饰HA的特征在于水溶解度为至少1g/L；并且其中所述聚合物的特征在于水溶解度为至多0.1g/L。

38.根据权利要求1至17和26至37中任一项所述的组合物，其进一步包括药学上可接受的载体或药用美容品上可接收的载体；并且任选地进一步包括选自以下的化合物：氨基酸、矿物质、维生素、抗氧化剂、核酸、辅酶、酶、生长因子、蛋白质、抗肿瘤药物、类固醇、非甾体抗炎药物、抗生素、麻醉剂、抗微生物药物或其任何组合。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物或药用美容品组合物。

40.根据权利要求38和39所述的组合物，其中所述组合物配制用于皮下施用、局部施用或两者。

41.一种用于填充或使有需要的受试者的组织丰盈的方法，包括向所述组织施用权利要求38至40中任一项所述的组合物，从而填充或使有需要的受试者的组织丰盈。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述组织选自：皮肤、牙龈、软骨和眼组织、肌肉和皮下组织。

43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述施用包括皮下或局部施用。

44.一种制造权利要求26至37中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括：将预定量的包括权利要求26至37中任一项所述的第一HA链的第一组合物与包括权利要求26-37中任一项所述的第二HA链的第二组合物混合，其中所述第一组合物、所述第二组合物或两者包括权利要求26至37中任一项所述的未修饰HA链。