KR20210021362A - 가교된 폴리머를 포함하는 히드로겔 조성물 - Google Patents
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Abstract
가교된 폴리머를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물로서, 여기서 상기 가교된 폴리머는 티올-변형 히알루로난의 산화 생성물이고, 및 여기서 상기 티올-변형 히알루로난은 약 80 ㎛ol/g(폴리머) 이상의 티올 모이어티를 갖는 히알루로난의 변형도를 갖고, 여기서 상기 티올-변형 히알루로난은 약 280 ㎛ol/g(폴리머) 미만의 티올 모이어티를 갖는 히알루로난의 변형도를 갖고, 여기서 상기 조성물은 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는 살균한 히드로겔 조성물.
Description
본 발명은 가교된 폴리머를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물에 관한 것으로, 여기서 상기 가교된 폴리머는 티올-변형 히알루로난의 산화 생성물뿐만 아니라 이들의 용도 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
히알루로난, 약어로 HA, 또한 소위 히알루론산 및 그의 염, e.g. 소듐 히알루론네이트는, D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코스아민으로 구성된 반복 이당류를 갖는 자연적으로 발생하는 음이온, 비-설페이트된 글리코스아미노글리칸이다.
고분자량 히알루로난은 피부에 자연적으로 존재하고 그의 점탄성 성질 및 그의 매우 높은 물흡수 경향성이 알려져 있다. 이 성질은 피부 탄력에 크게 기여한다. 생체적합성, 용인성(tolerance) 및 무독성의 성질 및 품질로 인하여, 의학 및 화장품 분야, 특히 미용 과정의 많은 분야에서 10년 이상 동안 이 화합물의 장점들이 이용되어 왔다. 예를 들어, 히알루로난은 고려중인 면적 부위 내 피부 안으로 직접적인 주사를 통해 주름을 매우는데 사용된다(성형 필러로서 사용).
바이오발효성(biofermentative) 기원의 매우 정제된 비변형 HA는 내생의 히알루론산과 동일하고 완전히 생체적합가능하다. 그러나 물에 대한 높은 친화도를 갖고 강력한 보습기능을 갖는, 인체의 조직과 매우 적합가능한 장점을 갖고 있음에도, HA는 충분한 생체-기계적 성질을 갖지 않는다. HA가 피부 조직 내로 주입될 때, 인간 신체 조직 내에 존재하는 히알루로니다아제(효소적 분해) 및 유리 라디칼(화학적 분해)의 두 가지로 인하여 빠른 인비보 분해가 있다.
수 많은 해결책들이 HA의 인비보 분해를 느리게 하고 그의 화학적, 물리적 및 생물학적 성질을 변형시키고, 추가적으로 저장 동안 분해, 가열 및 이로 인한 살균에 대한 제형의 저항성을 증가시키기 위하여 제안되어 왔다.
이러한 접근은 전형적으로 예를 들어 화학적, 효소적 또는 광화학적 수단으로 HA를 가교하는 단계를 포함하는 HA의 화학적 변형과 관련이 있다. 이들 가교된 히알루로난 겔은 다양한 제조 공정에 의해 얻어질 수 있다. 일반적으로 이들 공정은 2개의 주요 단계가 필요하며, 제1 단계는 히알루로난을 수화시켜 수용액(히드로겔)로 전환시키는 단계로 이루어지고, 제2 단계는 상기 수용액의 HA 분자를 그의 가교를 유도할 수 있는 약제(또한 '가교제'라 함)의 존재 내에서 상기 수용액의 HA 분자를 가교시키는 것을 목적으로 한다. 가교제의 예는 포름알데히드, 디비닐 술폰, 비스카르보디이미드, 및 에폭시드를 포함한다.
성형 필러의 제조를 위하여, 가교제는 가장 일반적으로 에폭시드, 예를 들어 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(BDDE) 또는 1,2,7,8-디에폭시옥탄(DEO), 알데히드, 또는 폴리 비닐술폰, 예를 들어 디비닐술폰 (DVS)로부터 선택되므로, 자연에서 합성된다.
불행하게도, 화학적 변형은 자연적으로 낮은 면역원성과 무독성을 갖는 비변형 HA를 사용한 것으로는 관찰되지 않은 부작용과 이물 반응을 일으킨다. 시판되는 HA 연조직 필러에서 BDDE는 가교제로 사용된다. BDDE에 존재하는 에폭시드기의 반응적 성질로 인하여, 성형 필러 내에 남아있는 비-반응한 BDDE는 유전자독성 효과를 가질 수 있다. 그러므로, 성형 필러 내 BDDE는 미량(<2ppm)으로 유지되어야만 하므로, 값비싼 추가 정제 및 시험 절차가 제조 동안 필요하다. BDDE 가교된 필러의 안전성 프로파일은 오랜 기간 임상 실험으로 뒷받침되고 있지만 (De Boulle, Glogau et al., 2013, A review of the metabolism of 1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid dermal fillers, Dermatol Surg (39): 1758-1766), BDDE는 여전히 일부 안전성 문제를 일어날 수 있다(Choi, Yoo et al., 2015, Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents, J Biomed Mater Res Part A (103A): 3072-3080).
BDDE와 관련된 유전자독성 위험으로 인하여, 성형 필러 제품, 예를 들어 Juvederm®의 연간 복용량, 환자의 생애 동안 적용될 수 있는 연간 복용량은 20mL/1년으로 제한된다. 상업적으로 이용가능한 성형필러 제품 Restylane®의 투여는 6mL/1회적용의 부피로 제한된다. DVS 가교된 히알루론난을 포함하는 성형 필러에도 유사한 제한이 주어진다.
화학적 변형이 갖는 또 다른 문제는 원하는 가교의 정도를 얻기 위하여 가교반응 동안 히알루론난이 받아야만 되는 가혹한 반응 조건, 예를 들어 알카리성 pH 값 및 높은온도(50℃ 이상)이 필요하다는 것이다. 산성(pH 4 이하) 또는 알카리성 pH(pH 10 이상)에 노출하는 동안 가수분해 때문에 HA의 분자량이 감소하는 것으로 알려져 있다. 게다가, 히알루로난은 40℃ 이상의 높은 온도에서 분해된다 (Troncoso et al., 2016, A kinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide, student thesis, accessed online via http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLEXT01.pdf; Stern et al., 2007. The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25): 537-557; Tokita and Okamoto, 1996, Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32): 1011-1014). 약 200kDa 미만의 분자량을 갖는 저분자량 히알루로난 단편은 염증촉진 효과를 갖는 것으로 더 알려져 있다 (Naor, 2016, Editorial: Interaction Between Hyaluronic Acid and Its Receptors(CD44, RHAMM) Regulates the Activity of Inflammation and Cancer, Frontiers in immunology 7:39; Monslow et al., 2015, Hyaluronan-a functional and structural sweet spot in the tissue microenvironment, Frontiers in immunology 6:231).
디설파이드 가교 히알루로난 히드로겔은 Shu 등에 의해 첫번째로 설명되었다 (Biomacromolecules 3, 1304-1311, 2002).
티올-변형된 히알루로난(HA-SH)의 디설파이드 가교 유도체는 자가 가교 메커니즘에 의해 얻어질 수 있다. 가교된 히알루로난 폴리머의 네트워크는 티올기들 사이의 디설파이드 결합(HA-S-S-HA)의 형성시 성립한다. 디설파이드 결합을 형성하는 티올기는 공통의 HA 백본 분자 또는 이웃 HA 분자의 펜던트기를 연결할 수 있고, 즉 가교는 각각 분자내 또는 분자간일 수 있다. 유리 티올기의 디설파이드 결합의 형성은 예를 들어 산재한 산소 또는 산화제의 첨가로 인하여 자발적으로 일어날 수 있는 산화반응이다.
WO 2004/037164은 3,3'-디티오비스(프로판노익 디히드라지드) (DTP) 또는 4,4'-디티오비스(부티릭 디히드라지드)(DTB)로 변형된 히알루로난을 더 연구하였다. 디설파이드 형성으로 얻어진 겔 및 티올 반응제, 예를 들어 가교를 위한 폴리에틸렌글리콜 디(메트)아크릴산의 사용은 조직 공학에서 이들의 잠재력, 즉 이식용 세포의 성장 및 배양을 위한 스캐폴드로서의 잠재력에 대하여 평가되었다. WO 2005/056608에서, 동일한 기술을 사용하여 티올화된 히드라지드 변형된 카르복시메틸 히알루로난을 가교하여 매크로분자 세포 스캐폴드를 얻었다. Serban et al.등은 2-티오에틸 에테르 히알루로난 유도체의 합성을 설명하나(생체물질 29, 1388-1399; 2008), 그러나 이는 조사된 가교제에 의한 가교에는 적당하지 않았다. EP 2 103 631는 히알루론산을 포함하는 티올-변형된 매크로분자, 및 이의 가교 생성물 설명하며, 여기서 티올기는 히드라지드 결합 방법에 의해 도입된다. 가교된 생성물은 가교제와 함께 또는 디설파이드 형성에 의해 얻어진다.
티올화된 히알루론산의 합성뿐만 아니라 약물 송달, 상처 치료 및 조직 재생에서 이들의 잠재적 용도는 또한 Kafedjiiski 등(Int J Pharm 343, 48-58; 2007)에 설명되어있다. CN101367884A는 유리 티올기 및 디설파이드기를 모두 포함하는 HA-시스테아민 콘쥬게이트의 합성을 개시한다. EP 2 614 828는 낮은 변형도를 갖는 티올-변형된 생체적합성 폴리머 유도체 및 이들의 가교된 물질을 설명한다. WO 2008/077172는 조직 충진 확대(tissue augmentation)용 티올화된 히알루론산을 설명한다. 일 실시예에서, WO 2008/077172는 히알루론산 (티올-변형된 히알루로난)을 포함하는 2g 티올-기를 갖는 살균 히드로겔 제형의 피내(intradermal) 사용을 설명하며, 여기서 티올기 함유 히알루론산에 의해 형성된 데포(depot)는 2주 동안 촉각적으로 검출될 수 있으나, 본 문헌은 본 예에서 사용된 티올-변형된 히알루로난의 구체적 특징에 대해서는 침묵하고 있다.
본 발명의 발명자들은 연조직 필러로서 자가-가교된 티올-변형 히알루로난 히드로겔의 잠재성을 더 연구하였다.
그러나, 자가-가교된 티올-변형 히알루로난을 기초로 한 히드로겔 조성물을 가지고 한 초기 연구들은, 외부 가교제를 갖는 성형 필러에 비하여 임플란트 후 보다 빠른 분해 행동을 나타냈다.
따라서, 본 발명의 목적은 디설파이드 가교된 폴리머를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로, 여기서 디설파이드 가교된 폴리머는 티올-변형 히알루로난(HA-SH)의 산화 생성물이고, 이는 특히 연조직 필러로서 사용과 관련하여 개선된 성질을 갖는다.
본 발명은 가교된 폴리머를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물을 제공하며,
여기서 상기 가교된 폴리머는 티올-변형 히알루로난의 산화 생성물이고,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난은 약 80㎛ol/g(폴리머) 이상, 바람직하게는 약 105 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 보다 바람직하게는 약 120 ㎛ol/g(폴리머) 이상의 티올기를 갖는 변형도를 갖고,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난은 약 280㎛ol/g(폴리머) 미만, 바람직하게는 약 240/g(폴리머) 미만, 보다 바람직하게는 200 ㎛ol/g(폴리머) 미만의 티올기를 갖는 변형도를 갖고,
여기서 상기 조성물은 티올-변형 히알루로난의 변형도에 관하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는다.
본 발명에 따른 살균한 히드로겔 조성물은 티올기(HA-SH)를 갖는 변형 히알루로난을 기초로 한 히드로겔이고, 여기서 히알루로난은 변형 히알루로난의 티올기들(티올-변형 히알루로난의 산화 생성물) 사이의 디설파이드 결합에 의해 가교된다. 산화 생성물은 비변형 히알루로난 및 변형 히알루로난의 섹션들로 이루어진 코폴리머이며, 후자는 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. 히드로겔은 임의 추가적인 외부 이기능성 가교제, 예를 들어 디비닐 술폰이 없다. 히드로겔 조성물은 약 80 ㎛ol(티올기)/g(폴리머) 내지 약 280 ㎛ol(티올기)/g(폴리머) 사이의 초기 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난의 산화 생성물을 포함하는 것으로 특징된다.
발명자들은 티올기를 갖는 히알루로난의 변형도가 살균한 히드로겔의 인비보 잔류시간에 영향을 주는 중요한 특징들이라는 것을 발견했다. 볼륨업을 위하여, 연조직 필러는, 임플란트된 히드로겔(데포 부피)의 부피가 시간에 따라 일정하게 남아있어, 느린 분해로 인한 지속적인 효과를 얻는 것이 바람직하다. 게다가, 사용된 히드로겔이 사용 후 다소 초기 팽윤, 즉 필러 데포 내로 물 흡입으로 인하여 부피가 증가하는 것을 나타내는 것이 바람직할 수 있다.
살균한 히드로겔 조성물의 인비보 성능을 특성화하는 연구는 이하 실시예 7 내지 9에 예시된다. 출발점에 대한 데포 부피%는 사용 부피에서 잠재적 차이를 보충하도록 계산된다. t=0(임플란트 후 바로)에서 데포 부피는 100%에 대응한다. 데포 부피는, 예를 들어 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 통해 모니터링될 수 있다. 생물학적 파라미터로서 데포 부피는, 바람직하게는 동물 모델 내에서 결정된 데포 부피는 큰 개체 변이(great individual variation)의 대상인 것으로 이해될 것이다. 따라서, 개별 데이터 지점은 덜 정보적이며 단지 평균값(다중 사용 부위 및/또는 다중 연구 대상을 고려함)은 포괄적인 데이터를 제공한다. 물론, 성능은 인자들, 예를 들어 임플란트 부위에서의 조직 타입, 데포 부피를 측정하는 사용된 방법 및 연구된 생물체의 종에 따라 더 달라질 것이다. 데이터, 예를 들어 인체에서 사용하기 위하여 데이터의 정량적 이동성은 제한될 수 있다. 그러나, 랫트의 데이터에 비견할만한 결과들이 마우스로 한 또다른 인비보 연구에서 관찰되었다(미도시). 그러므로, 상기 인비보 캐릭터리제이션은 서로에 대해 개별 히드로겔 조성물을 평가하고 비교하는 귀중한 도구를 제공한다. 잔류 시간은 일정 기간 동안 검출가능한 데포의 존재, 바람직하게는 일정 기간 동안, 바람직하게는 약 100%(또는 그 이상)의 평균 상대적인 데포 부피의 존재를 설명하는 파라미터로서 사용될 수 있다. 볼륨업 효과는 히드로겔 사용 후 특정 시점, 예를 들어 임플란트 후 5주(e.g., 30일에 측정) 또는 바람직하게는 12주(e.g., 81일 내지 84일에서 측정), 보다 더 바람직하게는 24주(e.g., 165일 내지 168일에서 측정)에서 약 100%(또는 그 이상)의 데포 부피에 의해 규정될 수 있다.
바람직하게는, 약 100%(또는 그 이상)의 데포 부피는 사용 후 첫번째 12주 또는 3개월 동안 또는 첫번째 24주 또는 6개월 동안 검출가능하다(잔류 시간). 본 발명에 따른 히드로겔 조성물은 예시된 연구 조건하에서 임플란트 후 12주(81일 내지 84일에 측정됨)에 볼륨업 효과를 나타냈다. 그러므로, 본 발명에 따른 히드로겔 조성물은 예를 들어 인간 내에서 연조직 필러로서 이용가능한 전망있는 원하는 인비보 성능을 나타낸다. 게다가, 가교된 폴리머의 성질은 유리한 독소 안정성 프로파일을 제공하고, 다른 안정화된 히알루로난 필러와 비교된 보다 큰 부피(50mL/사용 이상)가 사용될 수 있다.
히드로겔 조성물의 볼륨업 효과에 영향을 미치는 가장 중요한 파라미터는 “티올기를 갖는 변형도”이고, 이는 티올기(전형적으로 ㎛ol로 주어짐)/g(티올-변형된 히알루로난)의 초기 함량을 나타내며, 약어로 DoM이다. 이 티올기 함량은 티올-변형된 히알루로난 원료 물질의 특성이고, 조성물의 생산 과정 동안 가교에 이용가능한 티올의 함량이다. 티올기 또는 모이어티는 또한 메르캅토 또는 술피드릴기를 의미할 수 있다. 다양한 실시예를 기초로, 발명자들은 약 80 ㎛ol/g(폴리머) 내지 약 280 ㎛ol/g(폴리머) 사이의 변형도가 최적 범위인 것을 확인하였다. 한편, 80 ㎛ol/g(폴리머) 이상의 변형도는 임플란트 후 12주 이상의 볼륨업 효과를 갖는 조성물을 제공하는데 필요했다. 놀랍게도, 다른 한편, 보다 높은 변형도를 갖는 티올-변형된 히알루로난을 사용한 결과, 제조된 히드로겔의 볼륨업 효과, 즉 데포 부피의 증가(e.g. 실시예 7에서 보여진 것처럼 ≥335 ㎛ol/g (폴리머))가 나타나지 않았다. 이론과 연관시키지 않고, 보다 높은 변형도(및 결과적으로 보다 높은 가교율)는 물의 통합을 방지하여 팽윤 효과를 방해하는 히드로겔의 곰팩트한 구조를 가져온다고 추측된다. 그러므로, 티올기를 갖는 티올-변형된 히알루로난의 초기 변형도는 살균한 히드로겔 조성물의 연조직 충진 성질에 영향을 미치는 중요 인자로서 확인되었다. 연조직 충진을 위한 원하는 볼륨업 효과는 단지 80 내지 280, 바람직하게는 100 내지 240, 보다 바람직하게는 120 내지 200 ㎛ol 티올기/g(폴리머)의 좁은 범위의 초기 변형도를 갖는 가교된 티올-변형된 히알루로난을 포함하는 조성물로만 얻어졌다.
높은 가교도(티올기의 산화를 통함)는 볼륨업 연조직 필러에 적당한 탄성 성질을 갖는 히드로겔 조성물을 얻는데 유리하다. 재생산 가능하고 안정한 특징들, 예를 들어 유동학적 성질을 갖는 히드로겔 조성물을 제공하기 위하여, 티올-변형 히알루로난의 가교(즉, 디설파이드 결합의 형성)는, 히드로겔이 추가 가공(즉 추가 가공 단계, 예를 들어, 체 가공, 균질화 가공, 주사기 내 충진 및 살균 가공)되기 전에 거의 완전하게 되어야만 한다. 그러나, 특정 소량의 티올기는 입체적 장애와 같은 인자로 인하여 디설파이드 형성에 이용할 수 없을 수 있다.
본 발명에 따른 히드로겔 조성물은 티올-변형된 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는다. 이는 히드로겔 생산 과정 동안 산화된 티올-변형된 히알루로난의 이용가능한 티올기의 80% 이상에 대응한다. 가교된 폴리머에서 비가교된 티올기의 분율은 ㎛ol/g(폴리머)로 표현된 잔류 티올 함량을 통해 결정될 수 있다. 실시예 17에서 개시된 것처럼, 살균한 히드로겔 조성물에서 높고 균일화된 산화율 및 그로 인한 재생산가능한 잔류 티올의 함량은 제조방법에서 산화 단계 동안 산화제, e.g., 과산화수소의 사용으로 얻어질 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 히드로겔 조성물은, 티올-변형된 히알루로난의 변형도에 대하여 15% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는다.
변형도외에, 히드로겔의 유동학적 성질 및 인비보 성질에 크게 영향을 미치는 파라미터는 가교된 티올-변형된 히알루로난의 농도뿐만 아니라 히알루로난 사슬의 분자량 분포이다.
바람직한 농도는 약 11 mg/mL 내지 약 20 mg/mL인 것으로 확인되었다.
바람직하게는, 히드로겔 조성물은 약 11 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 13 mg/mL 내지 약 18 mg/mL 농도의 티올-변형 히알루로난의 산화 생성물을 포함한다.
mg/mL의 티올-변형 히알루로난 농도는 살균한 히드로겔 조성물의 부피에 관하여 중량으로 주어진다. 농도는 바람직하게는 염의 농도, e.g. 가교된 티올-변형된 히알루로난의 소듐 염의 농도를 의미한다. 따라서, 등가 함량의 티올-변형된 히알루로난이 히드로겔의 제조를 위해 제공된다. 보다 높은 농도는, 이들이 결과적으로 높은 점도를 가지나 허용가능한 주사가능성이 없는 히드로겔 조성물을 가져오기 때문에 적당하지 않은 것으로 여겨진다. 9 mg/mL 이하의 농도는 그러한 히드로겔 조성물에 대하여 관찰된 낮은 탄성 모듈러스 G'로 인하여 적당하지 않은 것으로 여겨진다. 약 14 mg/mL 내지 약 18 mg/mL, e.g. 15 또는 17 mg/mL의 범위 내에서, 우수한 유동학적 성질이 관찰되었다.
바람직하게는, 상기 티올-변형 히알루로난은 적어도 약 400 kDa, 바람직하게는 적어도 약 500 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 약 600 kDa, 예를 들어 약 700 kDa의 평균 분자량(MMW)을 갖는다.
또 다른 실시예에서, 가교된 폴리머는 약 250kDa 이상, 바람직하게는 약 300kDa 이상, 보다 바람직하게는 약 350kDa 이상의 살균 후 평균 환원 분자량(mean reduced post sterilisation)을 갖는 것이 바람직하며, 여기서 상기 살균 후 평균 환원 분자량은 상기 가교된 폴리머를 환원 조건에 노출 시킨 후 상기 살균한 히드로겔 조성물로부터 환원된 티올-변형 히알루로난의 평균 분자량으로 규정된다. 가교된 폴리머의 "살균 후 평균 환원 분자량"은 임플란트 후 히드로겔의 볼륨업 효과에 영향을 주는 추가적인 중요 인자로서 확인되었고, 약어로 다음에서 MRPMW로 한다. MRPMW는 제조 단계 후 가교된 티올-변형된 히알루로난 (가교된 폴리머)의 분자량으로 결정되고, 여기서 히드로겔 조성물의 가교된 폴리머는 환원 조건에 노출된다. 히드로겔에서, 상기 가교된 폴리머는 복잡한 네트워크를 나타내고, 이때문에 분자량은 결정되지 않을 수도 있다. 그러므로, 가교된 폴리머를 환원시킬 필요가 있고, 즉 분자량을 결정하기 전에 가교 디설파이드 결합이 쪼개진다. MRPMW는 히드로겔 조성물에서 가교된 폴리머의 폴리머 사슬의 평균 분자량에 관련한 값이다. MRPMW는 살균한 히드로겔 조성물로부터 환원된 티올-변형된 히알루로난의 평균 분자량(MMW)으로 정의되며, 즉 살균후 및 환원 후 조성물에서 결정되거나 또는 이로부터 얻을 수 있는 티올-변형된 히알루로난의 분율에 대한 MMW이다. 보통, 살균한 히드로겔 조성물의 티올-변형된 히알루로난에 대해 결정된 MRPMW는 원료 물질, 즉 티올-변형된 히알루로난의 평균 분자량(MMW)에 비교할 때 보다 낮고, 이는 대응하는 조성물의 제조에 사용된다(표 1참조). 원료 물질의 MMW에 비교하여 MRPMW의 환원은 살균을 포함하여 히드로겔 생성 과정의 결과인 것으로 가정된다. 따라서, 가교된 폴리머의 MRPMW를 사용하는 것은 원료 물질의 MMW를 사용하는 것보다 히드로겔 조성물을 캐릭터리제이션하는 데 더 적당하다.
그러나, 발명자들은 히드로겔 조성물의 제조를 위하여 적어도 약 400 kDa, 바람직하게는 적어도 약 500 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 약 600 kDa, 예를 들어 약 700 kDa의 평균 분자량(MMW)를 갖는 티올-변형된 히알루로난을 사용할 때, 히드로겔 조성물에서 가교된 폴리머의 MRPMW는 약 250kDa 또는 그 이상이었다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 약 600kDa의 티올-변형된 히알루로난으로 출발한 실시예에서 개요된 제조 절차는 MRPMW가 가장 바람직하게는 약 350kDa 이상인 가교된 폴리머를 갖는 히드로겔 조성물을 얻었다. 그 반대로, 약 200 또는 250 kDa 또는 그 이상의 MRPMW는, 정량적 관계가 제조 절차에 따라 달라진다고 하여도, 각 티올-변형된 히알루로난이 적어도 약 400kDa인 MMW를 갖는다는 증거이다.
본 발명에 따른 조성물에서, 가교된 폴리머의 MRPMW는 바람직하게는 약 250kDa 이상이다. 250 kDa 이하, e.g. 200 kDa (ID10)의 MRPMW를 갖는 가교된 폴리머를 포함하는 조성물의 실시예는 충분히 오랜 기간 동안 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피 및 바람직한 탄성 모듈러스 G'를 나타내지 않는 반면에, 300kDa의 MRPMW을 갖는 가교된 폴리머를 포함하는 실시예 조성물은 133일 동안 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피를 나타냈다. 480 kDa의 MRPMW를 갖는 가교된 폴리머를 포함하는 조성물은 188일 동안 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피를 나타낸다. 특히, MRPMW는 바람직하게는 300kDa 이상, 보다 바람직하게는 약 350 kDa 이상이다. 발명자의 지식에 따르면, 선행기술의 상태는 연조직 내로 임플란트 후 히드로겔의 인비보 성능에 영향을 미치기 위한 티올-변형된 히알루로난의 약 MRPMW 및 이것의 역할에 대해 침묵하고 있다. MRPMW는 가교 폴리머를 캐릭터리제이션, 즉 오히려 간접적인 측정법을 통한 히드로겔 조성물에서 비-균일한 네트워크를 캐릭터리제이션한다. 그러므로, 상기 결과는 전형적으로 ±10%의 편차 또는 때때로 그 이상의 편차를 나타낸다는 것이 놀랍지 않다. 실시예 5는 MRPMW를 결정하는 예시적 방법을 구체적으로 나타낸다. 통상의 기술자는, 다른 접근법이 이 파라미터에 대하여 비교할만한 값에 도달할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 아가로오스 겔 전기영동법은 마커로서 히알루로난 분자량 사다리 및 수평의 겔 챔버를 사용하여 아가로오스 겔 내에서 다른 MW 분율의 히알루로난을 분리하는데 사용될 수 있다. 염색된 겔은 이후 농도계로 분석되고 분자량 계산이 되었다.
다른 한편, 티올-변형 히알루로난은, 바람직하게는 넉넉잡아 약 4,500 kDa의 평균 분자량 (MMW), 특히 넉넉잡아 4,000 kDa 내지 4,200 kDa의 평균분자량을 갖는다. 보다 높은 분자량 스펙을 갖는 히알루로난 출발 물질은 산업적 규모 및/또는 성형 필러로서 살균한 히드로겔 조성물을 제조하기에 적당한 티올-변형 히알루로난을 제조하는데 필요한 품질 및 정량으로 이용가능하지 않다는 것을 발견하였다. 보다 바람직하게는, 티올-변형 히알루로난은 넉넉잡아 3,500 kDa 또는 넉넉잡아 2,000 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, 티올-변형 히알루로난의 평균 분자량은 약 700 kDa 내지 약 2,000 kDa의 범위 내이다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 히드로겔 조성물을 제조하는 방법을 제공한다:
수용액에서
a)
티올-변형 히알루로난을 제공하는 단계로서,
상기 티올-변형된 히알루로난은 약 80umol/g(폴리머) 이상, 바람직하게는 약 105 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 보다 바람직하게는 약 120 ㎛ol /g(폴리머) 이상의 티올기를 갖는 변형도를 갖고,
상기 티올-변형된 히알루로난은 약 280 ㎛ol /g(폴리머) 미만, 바람직하게는 약 240 /g(폴리머) 미만, 보다 바람직하게는 200 ㎛ol /g(폴리머) 미만의 티올기를 갖는 변형도를 갖고, 및
b) 이전에 얻어진 수용액을 티올-변형된 히알루로난이 디설파이드 가교된 폴리머를 형성하게 하는 조건에 노출시켜 티올-변형된 히알루로난을 산화시키는 단계로서, 여기서 상기 수용액은 히드로겔이 되는 단계로서, 여기서 상기 히드로겔은 상기 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 가지며,
선택적으로 c) 생체적합가능한 다당류의 군으로부터 선택된 비변형 폴리머를 이전에 얻어진 히드로겔 또는 이전에 얻어진 용액에 첨가하는 단계,
선택적으로 d) 이전에 얻어진 히드로겔을 체로 처리하여 특정 입자 크기 분포를 갖는 히드로겔을 얻는 단계,
e) 상기 얻어진 히드로겔을 컨테이너, 바람직하게는 주사기 내로 충진하고, 상기 충진된 컨테이너를 히드로겔을 살균시키는 조건에 노출시키는 단계,
f) 가교된 폴리머를 포함하는 컨테이너 내의 살균한 히드로겔 조성물을 얻는 단계.
히드로겔을 제조하는 방법에서, 상기 단계들은 다른 순서로 수행될 수도 있다. 특히 가교(산화) 단계, 비변형된 폴리머를 첨가하는 단계 및 체로 거르는 단계들은 필수적으로 히드로겔 품질에 영향을 미치지 않고 다른 순서로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 단계들은 다음 순서 a), c), b), d), e) 및 f)로 수행될 수 있고, 용액의 제조(단계 a) 및 비변형된 폴리머의 첨가(단계 c)는 연속해서 수행될 수 있고 선택적으로 추가 성분(e.g. a 국소 마취제)이 동시에 첨가될 수도 있다.
디설파이드 결합(가교)의 형성은 산소의 존재(e.g. 주위 공기를 통해 공급되거나 또는 수용액에 용해되어 있음)하에서 생리학적 pH 값에서 자연적으로 발생한다. 그러나, 산화제의 첨가는 단계 b)의 조건이 히드로겔이 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 확실히 갖도록 하는 산화 정도에 도달하기에 충분하도록 확보하는 것이 바람직하다. 산화제의 활성 첨가는 원하는 낮은 정도의 잔류 티올 함량을 얻기 위하여 디설파이드 형성을 가속화하고 완결시킨다. 게다가 단계 b)에서 산화제를 첨가하는 것은 산업 공정, 즉 커다란 벌크 부피를 포함하는 공정에서 재생산가능하고 균일한 결과를 확보하는 것과 특히 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 바람직한 실시예에서, 단계 b)에서 산화제는 이전에 얻어진 수용액에 첨가된다.
적당하고 잘 성립된 산화제는, 예를 들어 과산화수소(또는 다른 과산화물), 아스코르브산, 디메틸 술폭시드 및 하이포아염소산 (소듐 히포클로라이트)이다. 초과압 조건하에서, 순수한 산소 기체 또는 높은 산소 기체 혼합물은 폴리머 수용액에서 산소 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 첨가될 바람직한 함량은 티올-변형 히알루로난에서 티올기의 함량 및 산화제에 따라 달라진다. 예시적으로, 과산화수소에 대해, 단계 b)에서, 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비는 바람직하게는 넉넉잡아 4:1; 보다 바람직하게는 넉넉잡아 2:1이어야만 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 의약으로 사용되는 본 발명에 따른 조성물, 특히 연조직 상태의 치료 및 예방에 사용되는 의약으로서 사용되는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물의 화장료 용도에 관한 것이다. 그러한 용도(치료 또는 화장료)는 연조직 필러로서 또는 조직 확대를 위하여 본 발명에 따른 조성물의 용도를 의미할 수 있다. 그러한 용도는 바람직하게는 인간에 주사 또는 임플란트에 의해 사용되는 것을 포함하나, 사용가능성은 인간 종에게 제한되지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 방법에 관한 것으로, 여기서 본 방법은 본 발명에 따른 조성물을 특정 연조직 사이트에, e.g., 주사기로부터 주사하는 것으로 도입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 치료뿐만 아니라 화장료 목적으로 연조직 필러 또는 조직 확대를 위해 조성물의 용도에 관한 것이다.
일 실시예에서, 이들 양상에 따른 용도 또는 방법은 히드로겔 조성물을 주사기로부터 피내, 상위골막성, 또는 피하로 조직 사이트로 도입되어 인간 내로 도입되는 것을 포함한다.
도면은 다음을 나타낸다:
도 1: 예시적 티올-변형 히알루로난으로서 히알루로난-시스테아민 하부구조의 개략적 설명이다.
도 2: 시간에 따른 평균 데포 부피로서 다른 히드로겔 조성물의 인비보 성능으로서, 여기서 임플란트 후 데포 부피는 0일(100%에 대응)에서의 초기 부피에 대해 나타낸다: 조성물 ID 5(채워진 사각형), 조성물 ID 4(빈 사각형), 조성물 ID 6 (채워진 삼각형), 조성물 ID 10(채워진 원). 다른 조성물에 대한 다른 특징들은 표 1 및 2에 나타낸다. 도 2에 보여진 히드로겔 조성물로부터 단지 조성물 ID 5는 본 발명에 따른 히드로겔 조성물이다.
도 3: 추가 예시적 티올-변형 히알루로난, 즉 히알루로난-호모시스테인 하부구조(A), 히알루로난-글리실-시스테아민 하부구조(B), 및 N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드 하부구조 (C) 및 HA-DGDTPDH 하부구조 (D)의 개략적 설명이다.
도 1: 예시적 티올-변형 히알루로난으로서 히알루로난-시스테아민 하부구조의 개략적 설명이다.
도 2: 시간에 따른 평균 데포 부피로서 다른 히드로겔 조성물의 인비보 성능으로서, 여기서 임플란트 후 데포 부피는 0일(100%에 대응)에서의 초기 부피에 대해 나타낸다: 조성물 ID 5(채워진 사각형), 조성물 ID 4(빈 사각형), 조성물 ID 6 (채워진 삼각형), 조성물 ID 10(채워진 원). 다른 조성물에 대한 다른 특징들은 표 1 및 2에 나타낸다. 도 2에 보여진 히드로겔 조성물로부터 단지 조성물 ID 5는 본 발명에 따른 히드로겔 조성물이다.
도 3: 추가 예시적 티올-변형 히알루로난, 즉 히알루로난-호모시스테인 하부구조(A), 히알루로난-글리실-시스테아민 하부구조(B), 및 N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드 하부구조 (C) 및 HA-DGDTPDH 하부구조 (D)의 개략적 설명이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 살균한 히드로겔 조성물은 1Hz의 전단 속도를 사용하여 25℃에서 측정된 적어도 900Pa, 바람직하게는 적어도 약 1,000Pa의 탄성 모듈러스 G'를 갖는다.
히드로겔의 관점에서, 히드로겔 조성물의 탄성 모듈러스 G'는 전형적으로 이의 탄성 성질을 특성화하는데 사용되며, 예를 들어 (콘-)플레이트를 회전시키는 것으로 레오미터 사용 전단력으로 결정된 전단 저장 모듈러스를 나타낸다. 탄성 모듈러스 G'를 정의하는 표준 방법은 문헌에 알려져 있다(Stocks D., Sundaram H., Michaels J., Durrani M.J., Wortzman M. S., Nelson D. B., Rheological Evaluation of the Physical Properties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers, 2011, JournaL of Drugs in Dermatology, 10(9), 974-980). 탄성 모듈러스 G' 는 겔의 단단함(경도) 또는 부드러움을 특성화하는데 사용된다. 동시에 이것은 변형을 저항하는 겔의 능력에 대한 측정이다. 결과적으로, 높은 G'값을 갖는 성형 필러 히드로겔은 임플란트 후 보다 나는 지지 및 볼륨화를 제공할 것으로 기재된다(Stocks et al., 2011). 회전하는 플레이트의 온도 및 주파수외에 다른 변화하는 시험 조건이 탄성 모듈러스 G'의 정량적 비교가능성에 영향을 줄 수 있다. 반복된 시험은 전형적으로 평균값에 대해 약 ±10%의 표분 편차, 예를 들어 8%를 준다. 일부 경우에 상기 탄성 모듈러스는 히드로겔이 바늘을 통해 또는 바늘없이 압출에 의해 제공될 때 20%까지 변화된다는 것이 관찰되었다. 그러므로, 탄성 모듈러스 G'를 평가하기 위하여 실시예 4에서 이하 개요된 것처럼 프로토콜에 밀접하게 머무르게 하는 것을 추천한다.
몇 가지 본 발명에 따른 히드로겔 조성물(지적된 것처럼 티올-변형 히알루로난에 대한 변형도 및 선택적으로 폴리머의 농도)은 탄성 모듈러스 G'가 > 1,000 Pa인 것을 나타냈다. 900Pa 미만의 탄성 모듈러스 G'을 갖는 히드로겔은 충분히 오랜 기간 동안(실시예 6의 히드로겔 조성물 ID 10) 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피를 나타내지 않은 반면에, 1,385Pa탄성 모듈러스를 갖는 조성물(480kDa의 MRPMW를 갖는 가교된 폴리머를 포함, 히드로겔 조성물 ID2)는 188일 동안 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피를 나타냈다. 가교된 티올-변형 히알루로난에 의해 형성된 히드로겔을 가지고 한 이전 연구들은 살균한 히드로겔 조성물 또는 그들의 연조직 필러로서의 적당성에 초점을 맞추지 않았다. 따라서, 선행기술은 연조직 내로 임플란트 후 디설파이드 가교된 폴리머를 기초로 한 히드로겔의 인비보 성능에 영향을 주는 그들의 탄성 모듈러스 G' 및 이들의 역할에 대해서 침묵하고 있다. 게다가, 시판하는 성형 필러에 대하여 이용가능한 데이터(Stocks et al., 2011)는, 적어도 20mg/mL BDDE 가교된 히알루로난을 포함하는 이들 생성물의 탄성 모듈러스가, 약 75 Pa 내지 약 660 Pa의 범위 내이었다는 것을 나타낸다. 다른 시험 조건들 하에서 측정되었음에도, 이들 값들은 성립된 가교된 히알루로난 히드로겔이 900Pa 이하 또는 심지어 1,000Pa의 탄성 모듈러스 G'를 가지므로, 본 발명에 대해서는 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 히드로겔 조성물의 성질은 티올-변형 히알루로난, 특히 그의 변형도에 의해 중요하게 영향을 받는다. 변형도를 결정하는 성립된 방법은 Ellman 방법 또는 2,2'-디티오디피리딘을 티올을 갖는 약제와 반응시 색소생산성 티올을 방출하는 것을 측정하는 방법을 포함한다(실시예 1 참조). 통상의 기술자는 결과적으로 유사한 값들을 얻을 수 있는 대안적인 방법들을 또한 알 것이다. 여기서 상기 변형도는 ㎛oL(티올기)/g(폴리머)로 주어진다. 대안적으로, 변형도는 퍼센트로 나타낼 수 있으며, 여기서 변형 반복 단위의 함량은 폴리머 내 HA-반복 단위의 총 합으로 나누어진다(D-글루쿠론산 및 D-아세틸-D-글루코스아민). ㎛oL(티올기)/g(폴리머)의 변형도는 400g(분자량)/moL(HA-반복단위)을 고려하여 퍼센트로 전환될 수 있다. 이 전환으로, 변형으로 도입된 분자량의 변화는 전형적으로 무시된다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물에서 티올-변형 히알루로난에 대해 구체화된 변형도는 3.2% 및 12.0%의 사이, 바람직하게는 4.0% 또는 11.2% 또는 4.8% 및 10%의 범위로 표현될 수 있다.
"티올-변형 히알루로난" (HA-SH)는 히알루론산(HA)의 티올기 포함 유도체이다. 이것은 상술한 것처럼 변형도에 의해 특징되며 다른 분자량(또는 분자량 범위)으로 이용가능한 히알루로난으로부터 출발하는 공지된 합성 접근법을 통해 접근가능하다. 티올기를 갖는 리간드를 가지고 한 수 많은 HA 변형예는 과학 및 특허 문헌에 발견될 수 있다: Griesser 등은 티올화된 히알루론산 폴리머의 검토를 제공한다(Griesser et al., Polymers 10 (2018) 243). Aeschlimann (EP 1 115 433 B1)는 HA의 분자량을 줄이지 않고 인비보에서 잘 견디고 생분해가능한 HA 분자를 더 제공하는 HA의 기능화 방법을 설명한다. 이 방법은 가교를 위한 다른 말단 기능기, 예를 들어 티올기를 갖는 HA를 제공하는데 사용된다. 이들 측면 사슬은 활성 에스테르 중간체를 사용하여 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 1차(보호된) 티올기 포함 아민 또는 디설파이드-결합 포함 디아미노 또는 디히드라지드 리간드를 카보디이미드-중재 결합시키는 것으로 HA 내로 도입된다. 디설파이드 결합을 갖는 중간체 생성물은 이후 환원되고 보호된 티올기를 갖는 중간체 생성물은 이후 보호기를 제거하여 탈보호된다. 다른 방법은 디설파이드-결합 포함 카보디이미드(예를 들어 2,2'-디티오bis(N-에틸-(N'-에틸카보디이미드)로 HA 카르복실기의 직접적인 반응과, 이어서 환원제로 디설파이드 결합을 환원시키는 단계를 포함하는 것이 Bulpitt et al. (US 6,884,788)에 의해 설명되어 있다. WO 2008/008857 A2는 2-티오에틸 에테르 유도된 히알루로난의 합성 방법을 개시한다. EP 0 587 715는 수성 혼합물 내에 적어도 하나의 폴리음이온 다당류(e.g., HA)를 용해시키고; 활성화제, 예를 들어 디이미드, e.g. EDC 또는 ETC, 또는 BOP으로 폴리음이온 다당류를 활성화시키고; 변형 화합물, 예를 들어 1-히드록시-벤조트리아졸 히드레이트(HOBt) 또는 1-히드록시-벤조트리아졸 모노히드레이트로 활성화된 폴리음이온 다당류를 변형시키고; 및 적당한 친핵체(예를 들어 아미노티올)로 활성화된 폴리음이온 다당류를 반응시켜 원하는 불용성 조성물을 형성하는 단계를 통해 수불용성 음이온 다당류를 합성하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 폴리음이온 다당류의 BOP 활성화의 중요 장점 중 하나는 폴리음이온 다당류의 분자량이 친핵체에 결합시 감소하지 않는다는 것이라고 언급한다. EP 1 790 665 B1는 수용해성 변형된 히알루론산을 개시하며, 이는 비양성자성 극성 용매에서 BOP 축합제를 사용하여 아미드 결합을 통해 히알루론산의 글루쿠론산의 카르복실기 내로 치환기를 도입하는 것으로 생성된다. 디설파이드 결합을 갖는 디아민은 목록의 치환체들 중 하나이다. 시스테아민으로 히알루론산의 효율적이고 제어된 기능화위하여 DMT-MM으로 트리아진-중재 아미드화하는 것이 Borke 등에 설명되어 있고, 여기서 다당류 사슬의 온화한 반응 조건 및 최소 분해는 다른 결합제 예를 들어 EDC-중재 치환에 비하여 결합제들의 군을 사용하는 장점이 있는 것으로 목록에 나타냈다(Borke et al., Carbohydrate Polymers 116 (2015) 42-50). Liang et 등은 CDMT 및 NMM의 존재 하에서 시스타민으로 부차적인 카르복실레이트의 아미드화 반응을 통해 HA에 티올기를 도입하는 것을 설명한다(Liang et al. Carbohydrate Polymers 132 (2015) 472-480). 이중 촉매계- 카보디이미드/N히드록시숙신이미드의 수단으로 1-시스테인 에틸에스테르 히드로클로라이드로 HA의 티올 변형은, Kafedjiiski et 등에 설명된다(Int J Pharm 343, 48-58; 2007). WO 2004/037164에서, 히알루로난은 3,3'-디티오비스(프로판노익 디히드라지드)(DTP) 또는 4,4'-디티오비스(부티릭 디히드라지드) (DTB)으로 변형된다. 환원제 예를 들어 DTT로 환원 후, 대응하는 티올화된 HA 유도체 HA-DTPH 및 HA-DTBH가 얻어졌다. EP 2 103 631는 또한 히드라지드 결합 방법에 의해 HA의 카르복실기를 통해 티올기를 갖는 리간드의 도입을 설명한다. 다른 티올화된 HA 폴리머(HA-DGDTPDH, HA-DPDTPDH, HA-DSCDH) 가 합성되었다.
본 발명에 따라, 티올-변형된 히알루로난은 바람직하게는 히알루로난에 결합된 변형제의 콘쥬게이트이다.
히알루론난의 글루쿠론 모이어티의 카르복실기 및 변형제 사이의 에스테르 결합, 아미드 결합 또는 히드라지드 결합을 통해 변형제를 도입하는 것이 바람직하다. 변형제는 디설파이드 결합의 형태로 티올기 또는 합성 공정 동안 보호된 티올기로서 티올기를 포함할 수 있다.
일 바람직한 실시예에서, 상기 변형제는 아미드 결합을 통해 히알루로난에서 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 연결된다. 따라서, 상기 변형제는 히알루로난에서 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기와 결합된 아미드 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 아미노기를 포함하며, 상기 변형제는 티올기를 포함한다. 예를 들어, 티올-변형된 히알루로난은 히알루로난-시스테아민 콘쥬게이트이고, 여기서 시스테아민은 아미드 결합을 통해 히알루로난에 연결된다(도 1 참조).
유사하게, 다른 티올기를 갖는 변형제는 상기 변형제의 아미노기 (1차 또는 2차 아미노기, 바람직하게는 1차 아미노기) 및 히알루로난에서 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기 사이에서 아미드 결합 형성을 통해 티올-변형된 히알루로난의 합성에 사용될 수 있다.
히알루로난-호모시스테인 콘쥬게이트(도 3A)는 티올액톤으로서 이의 독특한 티올 보호를 이용하는, 호모시스테인 티올액톤을 사용하여 소듐 히알루로네이트의 아미드화에 의해 합성되었다. 유리 티올기는 환원제의 존재하에서 알카리성 가수분해로 연속해서 성공적으로 해리되어 디설파이드 형성으로 야기된 원하지 않는 겔화를 피하였다.
게다가 변형제는 예를 들어 시스테아민, 시스테인 또는 호모시스테인의 유도체를 포함하고, 여기서 시스테아민, 시스테인 또는 호모시스테인의 N 말단은 아미노산의 카르복실기와 결합된다. 이들 유도체들은 일반적인 펩티드 결합제, 바람직하게는 e.g. 반응 작업시 수성 추출에 의해 반응물 및 부산물의 제거를 통해 손쉽게 생성물을 정제할 수 있는 것들을 사용하여, 시스테아민, 시스테인 또는 호모시스테인으로 N-보호된 아미노산의 아미드화로 합성되는 것이 바람직하다(티올기를 갖는 변형제의 합성에 대하여 실시예 12A를 참조). 대안적으로, 시스테아민, 시스테인 또는 호모시스테인은 유기 용매, 예를 들어 숙신이미딜 에스테르에서 N-보호된 아미노산의 대응하는 활성 에스테르와 반응된다. 히알루로난-글리실-시스테아민 콘쥬게이트(도 3 B)은 본 접근법에 의해 합성된 티올-변형된 히알루로난에 대한 실시예이다.
저분자량의 상기 변형제는 가능한 많이 히알루로난의 독특한 물리-화학적 성질을 유지하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물에 유용한 가교가능한 티올-변형된 히알루로난을 얻기에 적당한 낮은 분자량 변형제는 바람직하게는 다음을 포함하는 군으로부터 더 선택된다: 글루타티온, 시스테인, 선형 또는 분지된 C2-C6-알킬 사슬을 포함하는 아미노알킬티올, 호모시스테인, 호모시스테인의 카르복실레이트 에스테르 (e.g. 호모시스테인, 바람직하게는 에틸 호모시스테인의 C2-C6-알킬 에스테르), 및 시스테인의 카르복실레이트 에스테르(e.g. 시스테인, 바람직하게는 에틸 시스테인의 C2-C6-알킬 에스테르).
아미노알킬티올 링커는 히알루로난과 아미드 합성시 이용된, 내재된 보호기의 일종으로서, 디설파이드 결합을 포함하여, 대응하는 대칭 디아민을 통해 편리하게 도입될 수 있다. 디설파이드는 결국 N-보호된 아미노 알코올로부터 출발하는 것으로 접근될 수 있다: 예를 들어 Mitsunobu's 프로토콜을 따라 티오에스테르 모이어티를 도입한 후, 산화 조건 하에서 티오에스테르의 비누화에 의해 원하는 표적 화합물을 송달한다(e.g. 실시예 12C). N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드(도 3 C)는 이 접근법에 의해 합성된 티올-변형된 히알루로난의 예이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 변형제는 히드라지드 결합을 통해 히알루로난에서 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 연결된다. 따라서, 상기 변형제는 히알루로난에서 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기와 아미드 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 히드라지드 기를 포함하고, 상기 변형제는 티올기를 포함한다. 예를 들어, 티올-변형된 히알루로난은 히알루로난-3-메르캅토-프로피온산 히드라지드 콘쥬게이트(HA-DTPH) 또는 히알루로난-2-메르캅토-에틸-카보닐-아미노-아세트산 히드라지드 콘쥬게이트이다(HA-DGDTPDH; 시예 12 B, 도 3 D 참조).
여기 사용된 용어 “살균한”은, 예를 들어 USP(United States Pharmacopoeia), Ph. Eur.(the European Pharmacopoeia) 또는 다른 나라 기준에서 화장품 또는 약제학적 제품에 대해 규정된 미생물 기준을 만족시키는 조성물을 설명하는 문헌에 따라 이해된다. 전통적으로, 히알루로난 겔은 주사기 내로 충진된 후 살균된다. 오토클레이브로 열적 습열 살균은 표준 방법들 중 하나이며, 이는 HA 겔을 약 15~20분 동안 121℃에서 고온 포화 스팀에 두는 단계를 포함한다. 보다 짧은 시간(예를 들어, 약 1분 내지 5분 사이) 동안 보다 높은 온도(예를 들어 약 130℃ 내지 135℃ 사이)에서 오토클레이브하는 것으로 겔 내 HA 분자의 분자량을 더 잘 보존할 수 있게 한다 (see M.L. Bernuzzi, A. Giori, "An innovative way to thermally sterilize hyaluronic acid pre-filled syringes", 2016 white paper available under https://www.fedegari.com/wp-content/uploads/2019/03/WP-Fedegari-Thermal-sterilization-PFS-with-Hyaluronic-Acidv-2.pdf, US 2016/0220729). 다른 오토클레이브 파라미터(예를 들어 생성물의 빠른 냉각의 확보)의 최적화는 추가적으로 폴리머의 분자량을 보존하는데 유리할 것이다 (http://www.steriflow.com/en/news/Sterilization-hyaluronic-acid).
여기 사용된 용어 "히드로겔"은 고체 및 유체(액체) 특성을 모두 갖는 조성물을 설명하는 것으로 이해된다. 한편, 히드로겔은, 주사가능, 즉 유체 유사 행동을 나타낼 수 있다. 다른 한편, 히드로겔은 특정 형태를 유지하기에 충분할 정도로 뻣뻣(또는 단단)할 수 있으며, e.g., 히드로겔은 사전에 형성된 임플란트, 실 또는 필라멘트의 형태로 제공될 수 있다. 그러므로, 용어 히드로겔 단독은 정량적 방법으로 조성물의 유동학적 성질을 제한하지 않는다.
그러나, 일 실시예에서, 상기 히드로겔은 1Hz의 전단 속도를 갖는 레오미터를 사용하여 25℃에서 측정된 적어도 900Pa, 바람직하게는 적어도 1,000Pa의 탄성 모듈러스 G'를 갖는다. 히드로겔의 탄성 모듈러스 G'는 다음 인자들에 의해 영향을 받는다:
- 가교의 정도(변형의 중요 정도, 즉 본 발명에 따른 특성에 의해 규정됨),
- 가교된 폴리머의 농도, 및
- MRPMW (티올-변형된 히알루로난의 평균 분자량에 종속됨).
상기 예시적 섹션은 적어도 1,000Pa의 원하는 탄성 모듈러스 G'를 얻기 위하여 통상의 기술자들 이들 인자를 변화시키는 것을 안내하는 다양한 조성물을 제공한다. 저농도는 보다 높은 분자량으로 보상될 것이며 그 반대도 마찬가지로 이해된다. 그러나, 가교된 폴리머의 농도와 MRPMW에 대한 선호도는 통상의 기술자가 적어도 약 1,000Pa의 바람직한 탄성 모듈러스를 갖는 히드로겔을 얻을 수 있는지에 대하여 분명한 가이드를 제공한다. 탄성 모듈러스 G'는 상술한 기술적 효과없이 최종 히드로겔을 기초로 입증될 수 있는 본 발명에 따른 히드로겔을 특성화하는 귀중한 파라미터를 나타낸다.
바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 생체적합한 다당류 군으로부터 선택된 비변형 폴리머를 포함한다. 바람직하게는, 비변형 다당류는 비변형 히알루로난 (HA)이다. 상기 비변형 (비-가교된) 또는 유리 히알루로난이라고 한 것은 히드로겔 조성물을 보완할 수 있다. 비변형 HA는 공통적으로 윤활제로서 연조직 필러에 첨가되어 바늘 또는 캐뉼라를 통해 생성물을 주사하는데 필요한 압출력을 줄임으로서 주사가능성을 용이하게할 수 있다. 바람직하게는, 조성물 제조에 사용된 상기 유리 히알루로난 원료 물질은 약 500 kDa 내지 약 3,500 kDa 범위의 분자량을 갖는다. 그러나, 안정화되지 않은 히알루로난의 빠른 분해로 인하여, 통상의 기술자는 연조직 필러로서 조성물의 인비보 성능이 가교된 폴리머 및 근본적인 티올-변형된 히알루로난의 성질에 의해 크게 가속화된다는 것을 이해할 것이다. 비변형 다당류는 가교된 폴리머보다 낮은 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 예시적으로, 비변형 히알루로난은 3 mg/mL 내지 7 mg/mL, 예를 들어 5 mg/ml 농도로 조성물 내에 포함되며, 여기서 상기 농도는 바람직하게는 염, e.g. 소듐 히알루론네이트의 농도를 의미한다.
히드로겔 조성물은 국소 마취제 및/또는 다음의 다양한 다른 성분들로부터 선택된 하나 이상의 성분들을 포함할 수 있다: 예를 들어, 성장 인자, 비타민, 폴리알콜, 알칼리 금속 할라이드, 미네랄, 항산화제, 아미노산, 코엔자임, 세라믹 입자 (예를 들어 칼슘 히드록실 인회석 입자), 폴리머성 입자, 폴리머(예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 글리코스아미노글리칸, 루브리신, 다당류, 및 그들의 유도체들), 단백질(예를 들어 엘라스틴, 콜라겐, 케라틴, 실크 피브로인), 항셀룰라이트제, 흉터방지제, 항염증제, 항자극제, 혈관수축제, 항출혈제(anti-hemorrhagic agent)(예를 들어 지혈제 및 항섬유소용해제(anti-fibrinolytic agent)), 텐셔닝제(tensioning agent), 항여드름제, 색소형성제(pigmentation agent), 항-색소형성제, 항염증제(anti-phlogistic agent), 항류마티스제, 항바이러스제, 항감염제, 방부제, 화학요법제, 세포정지제(cytostatic agent), 항알레르기제, 항정맥제(anti-varicosic agent), 진통제, 항생제, 항진균제, 진경제, 항히스타민제, 치질을 치료하기 위한 약제, 피부를 치료하기 위한 약제 및 보습제.
히드로겔 조성물에 국소 마취제를 첨가하는 것은 주사시 고통을 완하시키는 이들의 능력 측면에서 특히 바람직하다. 바람직하게는 마취제는 리도카인, 예를 들어 산부가염의 형태, 예를 들어 리도카인 HCl이다.
히드로겔을 제조하는 방법에서, 국소 마취제 및/또는 하나 이상의 성분을 다른 제조 단계 동안 첨가될 수 있으며, 즉 일 실시예에서 국소 마취제 및/또는 하나 이상의 성분이 선택적 단계 c) 동안, 또는 또 다른 실시예에서 비변형 폴리머를 첨가하는 것과 독립적으로, e.g., 단계 a) 동안 상기 용액에 첨가되거나 또는 단계 c) 또는 d)에서 얻어진 히드로겔에 첨가된 비변형 폴리머를 첨가하는 것과 독립적으로 첨가된다. 바람직한 실시예에서, 마취제, e.g. 리도카인 HCl는, 단계 a) 또는 단계 c) 동안 첨가된다. 일 실시예에서, 여기서 단계 c)는 단계 b)보다 선행하고, i.e. 여기서 비변형 히알루로난이 가교 전에 첨가되고, 국소 마취제 및/또는 하나 이상의 추가 성분이 가교 단계 전에 포함되는 것이 바람직하다.
게다가, 히드로겔 조성물의 주요 성분은 물인 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 주사용 물 또는 정제된 물은 조성물을 제조하는 데 사용된다. 게다가, 조성물이 완충되어 생리학적으로 허용가능한 pH인 6.7내지 7.8의 범위를 나타낼 수 있다고 이해될 것이다. 적당한 완충제는 통상의 기술자에게 알려져 있고, 예를 들어 포스페이트 완충제를 포함한다. 상기 조성물은 또한 생리학적으로-허용가능한 삼투압몰농도를 나타내고, 이는 치료할 대상(e.g., 인간에서)의 세포외 유체의 정상 삼투압몰농도와 유사하다. 그러므로, 조성물은 250-350 mOsm/kg의 삼투압몰농도를 가질 수 있고, 상기 삼투압몰농도를 조절하기 위하여 추가적인 용질, 예를 들어 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 및/또는 포타슘 클로라이드를 포함할 수 있다.
히드로겔 조성물은 살균되고 상기 히드로겔 조성물은 의약, 화장료 또는 의료 장비로 사용될 수 있다. 히드로겔은 사용 사이트에서, 바람직하게는 연조직에 바늘 또는 캐뉼라를 통해 주사로 임플란트된다. 대안적으로, 히드로겔은 외과 절차를 통해 임플란트될 수 있다. 일단 적용되면 히드로겔은 (히드로겔)임플란트 또는 데포라고 할 수 있다. 본 발명에 따른 히드로겔 조성물은 생체적합하고 흡수가능한(즉 생분해성)임플란트를 형성한다. 그러므로, 본 발명에 따른 히드로겔 조성물은 연조직 필러로서 사용가능하다. 본 발명에 따른 특성화된 히드로겔 조성물은 랫트 및 마우스 내 연조직에 임플란트 후 우수한 용인성(tolerability) 및 인비보 볼륨업 효과를 나타내었다. 이들 연구는 히드로겔이 다양한 용도에 대해 귀중한 연조직 필러라는 것을 뒷받침한다. 생체물질, 예를 들어 안정화된 히알루로난을 포함하는 연조직 필러는, 주사가능한 히드로겔 조성물의 수단으로 확대가 필요한 조직 사이트로 이송된다. 연조직 필링이라는 용도 또는 방법의 목적은 선천적인 기형, 후천적인 결함 또는 화장료 결함을 정정하기 위하여 부드러운(피부) 조직을 확대하는 것을 포함한다.
히드로겔 조성물의 주요 효과는 이것이 원래의 부피 및 임플란트의 팽윤을 기초로 한 필링 효과를 갖기 때문에 순수하게 물리적이다. 그러므로, 임의의 생리학적 또는 약물학적 상호 작용이 없을 때, 용도는 화장료로 분류되고, 상기 조성물은 화장료 또는 의료 장비로서 여겨질 수 있다. 본 발명에 따른 히드로겔 조성물의 용도는 화장료로 여겨질 때, 사용은 예를 들어 다음과 같이 노화의 표시를 줄이는 것을 포함한다:
- 비외과적 여성 생식기 회춘 목적을 위한 외음부 및 질의 조직 내로의 사용
- 진피, 피하 또는 상위골막성(supraperiosteal) 내로 사용.
예시적으로, 히드로겔 조성물은 화장 목적을 위해, e.g. 주름 충진, 피부 결함의 치료, 얼굴 및 신체(e.g. 가슴, 귓볼)의 손상된 부피의 회복, 셀룰라이트에서 딤플의 축소, 눈물선 이상 치료, 얼굴 또는 신체의 윤곽의 형상화 (e.g. 엉덩이 증대, 히프 확대, 종아리 확대), 페니스 확대 (페니스 둘레 증대, 귀두 페니스 확대)에 사용될 수 있다.
다른 경우에 연조직의 충진 및 확대 결과 질병의 치료 또는 예방을 할 수 있으며, 즉 질병의 증후는 줄어들고, 완화되거나 및/또는 재발이 예방된다. 연조직 결함으로 야기된 질병은 사용된 히드로겔에 의해 주변 조직의 일시적이나 및/또는 국부적 구조적 필링, 댐핑(damping), 지지 또는 확대가 유리할 수 있다. 히드로겔 조성물이 치료 또는 예방으로 사용될 수 있는 질병들은 예를 들어 다음을 포함한다:
- 척골통(metatarsalgia), 발의 볼의 지방 패드에서의 고통으로 본 발명에 따른 히드로겔의 사용은 발 연조직의 볼의 지방 패드에 사용될 수 있고,
- 요실금 또는 변실금, 본 발명에 따른 히드로겔은 괄약근을 규정하는 조직에 사용될 수 있고,
- 외음질 위축증 (또한 폐경기 비뇨생식기 증후군), 본 발명에 따른 히드로겔은 주사를 통해 외음질 영역에서 질점막 및 전정기관(vestibule) 안으로 사용될 수 있거나 및/또는 대음순 확대, 여기서 대음순의 복원은 대음순 사이 밀접한 접촉을 확실하게 하여 외음부의 내부 구조를 보호하며,
- 성대 손상,
- 정맥 판막 부전(venous valve insufficiency), 또는
- 열굴 지방위축병, 쇠약하게하는 상처 또는 형태론적 비대칭 또는 변형 (선천적인 또는 트라우마 또는 수술의 결과로서, e.g. 흉곽 또는 얼굴의 변형), 히드로겔이 복원 목적으로 사용된다.
실시예
실시예 1 - 변형도의 결정
히드로겔 조성물의 제조를 위한 원료 물질로 사용된 티올-변형된 히알루로난(HA-SH)에서 티올기의 정량화는, 2,2'-디티오디피리딘(DTDP)를 사용하는 습식 화학 방법을 기초로 한다. 폴리머 백본에 공유 결합된 유리-티올 모이어티는 DTDP와 티올-디설파이드 교환 반응을 하고, 1당량의 색소생산성 티온이 방출된다. 완충된 산성 매체(pH=4)에서, 얻어진 티온의 흡수는 343nm에서 광도측정적으로 측정될 수 있다.
약 420 mg의 티올-변형된 히알루로난은 정확하게 중량이 측정되고 30g의 0.01 N HCl에 용해되었으며 2~3 시간 동안 연속해서 자기 교반하여 스톡 용액을 제조한다. 이후, 약 310mg의 스톡 용액이 정확하게 중량 측정되고, 4200mg 아세테이트 완충제 pH 4와 eppendorf튜브 내에서 혼합되어 샘플용액을 제조하였다. 3개 샘플 용액을 각 스톡 용액으로부터 제조하였다. 25.0 mg N-아세틸시스테인을 정확하게 중량 측정하고 25.0 mL의 아세테이트 완충제 (pH 4)에 용해시켰다. 이 용액을 이후 아세테이트 완충제 (pH 4)로 더 희석시켜 검량선을 만들었다. 아세테이트 완충제를 블랭크 값으로 사용하였다. 0.125 mg/mL의 DTDP이 용해된 아세테이트 완충제 (pH 4)을 포함하는 용액 500 μL을 500 μL의 각 샘플 용액 (검량선, 샘플 용액 및 블랭크 값)에 첨가하였다. 용액을 짧게 균질화시키고 실온에서 30min 동안 배양하였다. 마지막으로 각 샘플(검량선, 샘플 용액 및 블랭크 값)을 마이크로 큐벳(microcuvette)로 이송하고 블랭크 값에 대하여 분광 광도계로 342nm에서 측정하였다.
실시예 2 - 잔류 티올 함량의 결정
히드로겔 조성물에서 가교된 폴리머(즉, 상기 조성물의 가교 및 제조 후 HA-SH 폴리머)의 잔류 티올 함량의 결정을 위하여, 상술된 것과 유사한 방법이 사용되었다.
약 50 mg의 각 샘플 히드로겔을 정확하게 중량 측정하고, 0.125 mg/mL의 DTDP가 용해된 아세테이트 완충제(pH 4)을 포함하는 용액 1.3mL와 혼합하였다. 25.0 mg N-아세틸시스테인을 정확하게 중량 측정하고 200.0 mL의 아세테이트 완충제(pH 4)에 용해시켰다. 이 용액을 이후 아세테이트 완충제(pH 4)로 더 희석하여 검량선을 만들었다. 아세테이트 완충제를 블랭크 값으로 사용하였다. 0.125 mg/mL의 DTDP이 용해된 아세테이트 완충제(pH 4)을 포함하는 용액 500 μL을 500 μL의 검량선의 각 샘플 및 블랭크에 첨가하였다. 모든 샘플들을 실온에서 120min 동안 연속 교반하면서 배양하였다. 모든 샘플의 원심분리 후 500 μL의 각 상청액을 500 μ아세테이트 완충제으로 더 희석시키고, 블랭크 값에 대해 분광 광도계로 342nm에서 측정하였다.
실시예 3 - 히드로겔의 제조방법
방법 A
용해: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난, 및 리도카인 HCl를 수용액 내에 부수적으로 용해시킨다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산소로 티올기로부터 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 선택적으로 가교된 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러 번).
살균: 히드로겔을 주사기에 충진한 후 오토클레이브한다.
방법 B
용해: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난, 및 리도카인 HCl을 산성 수용액 내에 부수적으로 용해시킨다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 선택적으로 가교된 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다
방법 C
용해: 티올-변형된 히알루로난이 수용액에 용해되고; 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl이 용해된 포스페이트 용액(pH 6.8 내지 7.6)을 포함하는 별도 용액이 제조된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난을 포함하는 히드로겔 및 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 용액이 균질화되고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축된다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다
방법 D
용해: 티올-변형된 히알루로난 수용액에 용해되고; 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl이 용해된 포스페이트 완충제(pH 6.8-7.6)을 포함하는 별도 용액이 제조된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난을 포함하는 히드로겔 및 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 용액이 균질화되고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축된다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다
방법 E
용해: 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl이 수용액에 용해되고; 비변형 히알루로난이 용해된 포스페이트 완충제(pH 6.8-7.6)를 포함하는 별도 용액이 제조된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔 및 비변형 히알루로난을 포함하는 용액이 균질화되고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축된다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 F
용해: 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl이 산성 수용액에 용해되고; 비변형 히알루로난이 용해된 포스페이트 완충제(pH 6.8-7.6)를 포함하는 별도 용액이 제조된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔 및 비변형 히알루로난을 포함하는 용액이 균질화되고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축된다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 G
용해: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난, 및 리도카인 HCl가 연속해서 수용액에 용해된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 선택적으로 가교된 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을, 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 H
용해: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난, 및 리도카인 HCl이 산성 수용액에 연속적으로 용해된다.
가교: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을, 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 선택적으로 가교된 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을, 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 I
용해 용액 1: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 물에 순차적으로 용해시킨다.
가교 용액 1: pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을, 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
용해 용액 2: 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 선택적으로 리도카인 HCl을, 물에 순차적으로 용해시킨다.
가교: 용액 2의 pH를 약 6.8 내지 7.6으로 조절하고, 곧바로 등가량의 가교된 용액 1을 용액 2와 혼합한다. 티올-변형된 히알루로난을, 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 선택적으로 가교된 티올-변형된 히알루로난, 비변형 히알루로난 및 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔을, 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 J
용해: 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 수용액에 용해시키고; 리토카인 HCl을 포함하는 별도 용액을 제조한다.
가교: pH를 약 6.7 내지 7.8로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을, 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔을, 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔 및 리도카인 HCl을 포함하는 용액을 균질화시키고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축시킨다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
방법 K
용해: 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 수용액에 용해시키고; 리토카인 HCl을 포함하는 별도 용액을 제조한다.
가교: pH를 약 6.7 내지 7.8로 조절한 후, 티올-변형된 히알루로난을, 산화제 및 산소에 의해 티올기를 디설파이드 브릿지로 산화시켜 가교시킨다.
체: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔을 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하게 압축한다(한번 또는 여러번).
균질화: 가교된 티올-변형된 히알루로난 및 비변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔 및 리도카인 HCl을 포함하는 용액을 균질화시키고, 선택적으로 규정된 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통과하도록 압축된다(한번 또는 여러번).
살균: 히드로겔을 주사기 내로 충진 후 오토클레이브한다.
실시예 4 - 탄성 모듈러스 G'의 결정
모든 조성물의 진동하는 유동학적 측정은 콘-플레이트 시스템(cone-plate system)을 갖는 Anton Paar MCR 102 레오미터를 사용하여 수행되었다. 상기 조성물을 27G 바늘을 통과하는 주사(또는 바늘없이, 표시된 경우에)를 통해 레오미터로 이송하였다. 25℃의 온도 및 1Hz의 주파수에서 히드로겔의 선형 점탄성 영역 내에서 일정한 변형으로 주파수 시험 동안 탄성 모듈러스를 얻었다.
실시예 5 - 분자량의 결정
다음과 같이 일련으로 높은 민감도의 검출기를 포함하는 Viscotek TDAmax 온도 제어된, 다중-검출기 SEC 시스템이 사용되어 측정에 사용되었다: Photodiode Array UV, 광산란 (both RALS 및 LALS), 굴절률 및 Viscometer. 굴절률 검출기는 샘플의 농도를 기록하여 각 분포 곡선을 얻었다. 광산란 검출기와 함께, 분자량 (MW)이 결정되었다. 크기배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 위하여, 샘플을 PBS으로 희석하고, 최종 폴리머 농도로 0.1 mg/mL을 얻었다.
이 시험 동안 전형적으로 일어나는 에러 또는 변동은 약 10%의 편차를 가져온다.
살균 후 평균 환원된 분자량(MRPMW)의 결정을 위한 샘플은 약 200 mg의 살균한 조사된 히드로겔 조성물을 1.8 mL 포스페이트 완충염수(PBS)에 분산시키고 실온에서 2 시간 동안 배양하여 제조되었다. 가교된 티올-변형된 히알루로난을 원심 분리를 통해 유리 히알루로난과 분리하였다. 침전물을 PBS 내에 재분산시켰다. 반복 추출/원심분리 단계 후, 잔류 겔을 환원제(TCEP.HCl (tris(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드))으로 3 시간 동안 처리하여 디설파이트 브릿지를 쪼개고 이후 얻어진 용액을 5N HCl로 산성화시켰다(환원). 환원된 티올-변형된 히알루로난을 에탄올로 침전시키고 원심분리로 회수하였다(살균한 히드로겔 조성물로부터 티올-변형된 히알루로난). 상기 침전물을 유리 티올 모이어티 (2-(2-아미노에틸디설파닐)피리딘-3-카르복실산)용 캡핑제를 2mg/mL의 농도로 포함하는 4mL 수용액에 용해시켰다. 실온에서 3h 배양한 후, 샘플을 PBS로 더 희석시켰다.
대안적으로, 가교된 폴리머의 MRPMW는 공제 방법(subtraction method)로 결정되었다. 두 가지 접근법 모두 유사한 값을 가져왔다. 가교된 폴리머 및 유리 히알루로난을 포함하는 히드로겔 조성물의 살균 후, 환원제를 히드로겔에 첨가하여 정량적으로 디설파이드 결합을 쪼개었다. 환원 형태의 티올-변형된 히알루로난 및 유리 히알루로난의 MW 분포는 이후 동시에 결정되었다(M W (총합)). 추가로, 유리 히알루로난의 MW이 결정되었다: 200 mg의 살균 조사된 히드로겔 조성물을 1.8 mL 포스페이트 완충염수(PBS)에 분산시키고, 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 원심 분리 후, 상청액을 유리 히알루로난의 MW (M W (HA))의 SEC 분석을 위해 사용하였다.
유리 히알루로난의 분자량(M W (HA)) 및 유리 히알루로난 및 환원된 티올-변형된 히알루로난의 조합된 분자량(M W (total))을 결정하는 것으로, MRPMW (여기서 M W (HA-SH))는 다음 식(I)에 따라 계산되며, 여기서 C HA 및 C HA-SH 는 각각 유리 히알루로난 및 환원된 티올-변형된 히알루로난의 분율을 나타낸다:
비교 결과는 히드로겔 제조에 사용된 HA-SH 원료 물질의 대응하는 평균 분자량(MMW)와 함께 표 1에 주어진다. 전형적으로, MRPMW는 MMW 보다 낮다. 히드로겔 조성물의 제조는 분자량 분포에 영향을 미친다.
실시예 6 - 조성물의 제형
다양한 살균한 히드로겔 조성물이 표 1에 보여지고, 여기서 조성물들 사이의 주요 차이는 가교된 폴리머의 특징들 사이에 놓이고, 이것은 티올-변형 히알루로난(HA-시스테아민)의 산화 생성물이다. 17mg/mL 가교된 HA-시스테아민, 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트 및 3 mg/mL 리도카인 HCl을 포함하는 히드로겔이 유사한 방법(상기 비교 방법 B 및 H)으로 제조되었다. 티올-변형 히알루로난 (HA-SH) 원료 물질의 성질로서 MMW 및 변형도(DoM)뿐만 아니라, 가교된 폴리머의 성질로서 MRPMW, 탄성 모듈러스 G' 및 잔류 티올 함량이 상술한 것처럼 결정되었다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] |
MRPMW 산화된 HA-SH
[kDa] |
DoM HA-SH 원료 물질
[㎛ol/g] |
잔류 티올 함량 [㎛ol/g] |
탄성 모듈러스 G'
[mPa] |
|||
| 평균 | S.D. | 평균 | S.D. | 평균 | 평균 | 평균 | S.D. | |
| 1* | 576 | 24 | 430 | 28 | 48 | 0.26 | 663,438 | 20,446 |
| 2 | 628 | 8 | 480 | 10 | 119 | 0.88 | 1,384,803 | 25,982 |
| 3* | 547 | 5 | 520 | 42 | 335 | 5.92 | 2,172,653 | 185,608 |
| 4* | 1201 | 15 | 610 | 16 | 43 | 0.32 | 714,068 | 41,655 |
| 5 | 1335 | 18 | 710 | 70 | 130 | 1.06 | 1,543,920 | 59,579 |
| 6* | 957 | 13 | 560 | 19 | 350 | 4.4 | 2,408,693 | 117,637 |
| 7* | 1614 | 15 | 1000 | 40 | 51 | 0.50 | 1,126,583 | 41,929 |
| 8 | 1625 | 25 | 937 | 92 | 141 | 1.48 | 2,045,747 | 163,765 |
| 9* | 1177 | 25 | 680 | 5 | 367 | 3.99 | 2,224,367 | 13,824 |
| 10 | 277 | 12 | 200 | 20 | 150 | 0 | 896,276 | n.d. |
별표 (*)는 청구범위에는 속하지 않지만 비교를 위해 포함된 예들을 나타낸다. S.D. 는 표준 편차의 약어이다.
디설파이드 결합의 형성은 가교된 폴리머의 잔류 티올 함량을 측정하고 티올-변형 히알루로난 폴리머 원료 물질의 초기 변형도와 비교하는 것을 통해 모니터링하였다. 모든 10개 조성물에서 폴리머의 초기 이용가능한 티올기의 98% 이상이 제조 동안 산화되었다는 것이 발견되었다.
티올-변형 히알루로난 원료 물질의 티올기를 갖는 초기 변형도 및 가교된 폴리머의 MRPMW 모두 동일한 농도의 가교된 히알루로난을 갖는 히드로겔의 탄성 성질에 영향을 주었다. 히드로겔 조성물의 제조에서 보다 높은 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난 폴리머를 사용한 결과, 보다 높은 가교율을 나타냈으며, 이는 분명하게 히드로겔의 탄성 성질의 증가를 증명한다. 119 ㎛ol 내지 150 ㎛ol/g(폴리머) (히드로겔 조성물 ID2, ID5, ID8 및 ID10) 범위의 티올기를 갖는 중간 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난으로 제조된 히드로겔 조성물과 비교할 때, 히드로겔의 탄성 성질에 대한 MRPMW의 영향은 명백하게 입증된다. 히드로겔 조성물 ID2, ID5 및 ID8의 탄성 모듈러스는 1,000Pa 이상이었다. 낮은 변형도를 갖는 티올-변형된 히알루로난으로 제조된 히드로겔 조성물(히드로겔 조성물 ID1*, ID4* 및 ID7*)과 비교할 때 동일한 효과가 관찰되었다. 높은 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난으로 제조된 히드로겔 조성물(히드로겔 조성물 ID3*, ID6* 및 ID9*)에 대하여, 탄성 성질에 대한 폴리머 MRPMW에 대한 영향이 덜 두드러졌다.
실시예 7 - 임플란트된 히드로겔 조성물의 인비보 캐릭터리제이션
본 발명에 따른 다양한 조성물 뿐만 아니라 비교 조성물은 주사를 통해 임플란트한 후 시간에 따라 평균 데포 부피의 발달에 대해 조사되었다. 표 1에 요약된 10개 다른 히드로겔 조성물에 대해서 시험되었다.
조성물은 16마리 시험 동물들을 사용하여 조성물당 평균 12번 암컷 Spague DAwley 랫트의 등 피부 내로 피하 주사하였다. 8 데포가 랫트당 사용되었다. 각 조성물 50 μL을 25G 바늘을 사용하여 데포 당 주사하였고, 생성된 데포의 부피는 188일의 총 기간 동안 별도 시점에서 MRI(Siemens Espree 1.5 T MRT device)으로 모니터링하였다.
개별 히드로겔 데포 부피(mm3)는 MRI 스캔에 따라 계산되고 시간에 따라 모니터링되었다. 계산된 부피는 0일(사용 후 바로)에서 얻어진 결과들로 정규화되었고, 퍼센트(%)로 나타낸다. 도 2는 4개 예시적 조성물에 대하여 데포 부피의 발달을 나타낸다. 다른 조성물의 84일 및 188일에서의 평균 상대적인 데포 부피는 모두 10개 조성물에 대하여 표 2에 나타낸다.
| ID | 84일에서의 평균 상대적인 데포 부피 [%] |
188일에서의
평균 상대적인 데포 부피 [%] |
| 1* | 0.0 | 0.0 |
| 2 | 151.5 | 110.3 |
| 3* | 51.9 | 48.1 |
| 4* | 5.0 | 0.0 |
| 5 | 184.7 | 160.9 |
| 6* | 37.2 | 24.8 |
| 7* | 41.4 | 18.0 |
| 8 | 165.9 | 136.1 |
| 9* | 51.5 | 37.6 |
| 10 | 65.9 | 37.3 |
별표 (*)는 청구범위에는 속하지 않지만 비교를 위해 포함된 예들을 나타낸다.
50 ㎛ol(티올기)/g(폴리머) 이하의 초기 변형도를 갖는 가교된 티올-변형 히알루로난을 포함하는 2개 조성물(히드로겔 조성물 ID 1* 및 ID 4*)을 제외하고는, 모든 히드로겔 데포가 적어도 6개월 동안 검출되었다. 그러나, 티올의 중간 변형도 및 1,000Pa 이상의 탄성 모듈러스(200kDa 이상의 MPRMW)를 갖는 가교된 티올-변형 히알루로난을 포함하는 단지 3개 조성물(히드로겔 조성물 ID 2, ID 5 및 ID 8)만이 6개월 연구 기간 동안 볼륨업 효과를 나타냈다. 모든 다른 조성물의 데포 부피는 이 기간 동안 50% 이상의 감소가 있었다.
실시예 8 - 151 ㎛ol/g 폴리머의 DoM을 갖는 가교된 티올-변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔 조성물 ID11 내지 ID15의 제형 및 캐릭터리제이션
17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물은 방법 G에 따라 제조되었다. 요약하면, 3580mg HA-시스테아민 소듐염(건조 중량, MMW 730 kDa, 변형도 151 ㎛ol/g 폴리머), 600 mg 리도카인 HCl (건조 중량) 및 1160 mg NaCl를 실온에서 약 3hr 동안 기계적 교반하면서 주사용 물 185g 내에 용해시켰다. 1000 mg 소듐 히알루로네이트(건조 중량, MW 2400 kDa)를 이후 추가 3hr 동안 실온에서 계속 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 포스페이트 완충제 pH 11를 이후 최종 200g 조성물이 되도록 첨가하였다. 용액을 약 15min 동안 균질화하였다. 실온에서 밤 사이 배양한 후, 가교된 히드로겔을 200 ㎛의 메시 크기를 갖는 필터 플레이트를 통해 압축하였다. 히드로겔을 이후 1mL 유리 주사기 내로 충진하고 오토클레이브로 멸균하였다(121℃/15 min). 탄성 모듈러스는 실시예 4와 유사하게 결정되었다. 히드로겔을 주사기로부터 직접(주사바늘 부착없이) 레오미터에 사용하여 G'가 1,619 ±143 Pa로 결정되었다. 살균한 히드로겔은 pH 7.34 및 삼투압몰농도 337 mOsmol/kg (히드로겔 ID11)를 가졌다.
변형도(DoM), MRPMW, 및 잔류 티올 함량은 상술한 것처럼 결정되고 표 3에 요약되었다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] |
MRPMW 산화된 HA-SH
[kDa] |
DoM HA-SH 원료 물질
[㎛ol/g] |
잔류 티올 함량 [㎛ol/g] |
탄성 모듈러스 G'
[mPa] |
제조 방법 | pH |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | 평균 (S.D.) | |||
| 11 | 730 | 406 | 151 | 17 | 1,619,000 (143,000) | A (체 사용) | 7.34 |
| 12 | 730 | 528 | 151 | 2 | 1,965,900 | A (체 없이) | 7.66 |
| 13 | 730 | 595 | 151 | n.d. | 1,536,200 | B (체 없이) | 7.08 |
| 14 | 730 | n.d. | 151 | n.d. | 1,713,567 | A (체 없이) | 7.70 |
| 15 | 730 | 430 | 151 | 12 | 1,532,167 | E (체 없이) | 7.39 |
약어S.D.는 표준 편차를 나타낸다.
동일한 티올-변형 히알루로난(MMW 730 kDa, 변형도 151 ㎛ol/g(폴리머)을 사용하여, 실시예 4에서 설명된 것처럼, 방법 A(체 없이), 방법 A(체 사용), 방법 B (체 없이) 및 방법 E(체 사용)에 따라 각각 17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐 염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 4개의 살균한 히드로겔 조성물을 제조하였다.
모든 조성물은 270 내지 330 mOsmol/kg 범위의 삼투압몰 농도 및 생리학적으로 허용가능한 pH(표 4 참조)를 가졌다. 조성물의 탄성 모듈러스 G' (27G 바늘을 통해 주사 후 결정됨), 히드로겔의 가교된 폴리머의 MRPMW 및 잔류 티올 함량은 상술한 것처럼 결정되었다. 조성물 ID 14에서 가교된 폴리머의 잔류 티올기 함량 및 MRPMW는 결정되지 않았다. 조성물 ID12 및 ID14는 동일한 히드로겔 배치로부터 제조되고, 단지 차이는 체 단계이다. 체가 가교된 폴리머의 MRPMW 및 잔류 티올 함량에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않기 때문에, 조성물 ID12로 얻어진 것과 동일한 값들이 조성물 ID14에 대한 것으로 추정될 수 있다. 결과들은 표 4에 나타낸다.
이들 조성물들을 조성물 당 12개 피내 사용으로 실시예 7에서 설명된 시험과 유사하게 인비보 시험하였다. 모든 조성물은 연구 1차 142일 동안 볼륨업 효과를 나타냈으며(데이터로 보여지지는 않음), 이는 이 시점 및 모든 이전 시점(28일 61일 및 114일)에서 측정된 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피에 의해 입증된다. 연구 168일 후, 조성물 ID 14 및 ID 15의 평균 상대적인 데포 부피는 100% 미만으로 측정되었다. 특정 시간 후, 조성물이 생분해성이기 때문에 데포 부피의 감소가 예상된다. 84일 및 168일의 평균 상대적인 데포 부피의 비교는 표 4에 보여진다.
| ID |
84일에서의
평균 상대적인 데포 부피 [%] |
168일에서의
평균 상대적인 데포 부피 [%] |
||
| 평균 | S.D. | 평균 | S.D. | |
| 12 | 130.15 | 48.48 | 111.29 | 46.47 |
| 13 | 140.74 | 42.90 | 126.01 | 54.22 |
| 14 | 121.51 | 21.89 | 95.64 | 23.67 |
| 15 | 112.14 | 24.48 | 95.81 | 26.23 |
약어 S.D.는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 9 - 176 ㎛ol(티올기)/g(폴리머)를 갖는 가교된 티올-변형 제형을 포함하는 히드로겔 조성물 ID16의 제형 및 캐릭터리제이션
176 ㎛ol(티올기)/g(폴리머)(MMW 750 kDa)의 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난을 사용하여 17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물을 제조하였다. 히드로겔 조성물 ID 16은 체 처리 단계를 가지고 방법 A에 따라 제조되었다. 조성물 내에서 가교된 폴리머의 살균 후 평균 환원 분자량 (MRPMW)은 408 kDa이었다. 탄성 모듈러스는 실시예 6과 유사하게 결정되었다. 상기 히드로겔은 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용되고 G'가 2,052,100 mPa인 것으로 결정되었다. 살균한 히드로겔이 pH 7.17 및 삼투압몰농도 316 mOsmol/kg를 가졌다.
조성물은 12개 피내 사용과 함께 실시예 7에서 상술된 시험 셋업과 유사하게 인비보 테스트하였다. 조성물은 이 시점 및 모든 이전 시점(23일, 53일)에서 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피로 입증된 것처럼 81일 연구 기간 동안(데이터로 보여지지 않음) 볼륨업 효과를 가졌다.
실시예 10 - 300kDa의 MRPMW를 갖는 티올-변형 히알루로난을 포함하는 히드로겔 조성물 ID 17의 제형 및 캐릭터리제이션
142 ㎛ol(티올기)/g(폴리머)(MMW 710 kDa)의 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난을 사용하여, 17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐 염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물을 제조하였다. 히드로겔 조성물 ID 17은 체 처리 단계를 갖는 방법 A에 따라 제조되었다. 조성물 내 가교된 폴리머의 살균 후 평균 환원 분자량(MRPMW)는 300kDa이었다. 탄성 모듈러스는 실시예 4와 유사하게 결정되었다. 히드로겔은 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용되고 및 G'는 1,243,500 mPa으로 결정되었다. 살균한 히드로겔은 pH 7.65 및 삼투압몰농도 287 mOsmol/kg를 가졌다. 조성물은 12번 피내 사용하면서 실시예 7에서 상술한 시험 셋업과 유사하게 인비보 테스트하였다. 조성물은, 이 시점 및 모든 이전 시점(23일, 53일, 81일 및 107일)에서 측정된 100% 이상의 평균 상대적인 데포 부피로 증거된 것처럼 133일 연구 기간 동안 볼륨업 효과를 가졌다.
실시예 11- 살균한 히드로겔 조성물 ID 18의 제형 및 캐릭터리제이션
14 mg/mL 가교된 HA-시스테아민, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 7 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물(ID18)은 방법 B에 따라 제조되었다. 요약하면, 2100 mg HA-시스테아민(건조 중량, MMW 700 kDa, 변형도 131 ㎛ol/g 폴리머), 450 mg 리도카인 HCl(건조 중량) 및 1050 mg 소듐 히알루로네이트 (건조 중량, MMW 2238 kDa)를 약 17시간 동안 실온에서 기계적 교반하면서 130 g 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.1 (88mM NaCl을 포함)에 용해시켰다. 1M 소듐 히드록시드 용액으로 pH를 약 pH 7.1로 조절한 후, 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.1(88mM NaCl을 포함)를 첨가하여 150g의 최종 조성물로 만들었다. 약 60min 동안 용액을 균질화시켰다. 이후, 1.6 mL의 0.307% (v/v) 과산화수소 용액을 첨가하였다. 실온에서 밤 사이 배양한 후, 가교된 히드로겔을 1mL 유리 주사기 내로 충진시키고 오토클레이브로 멸균하였다. 살균한 히드로겔은 pH 약 7 및 삼투압몰농도 약 270 mOsmol/kg을 가졌다.
변형도 (DoM), MMW, MRPMW, 및 탄성 모듈러스 G'는 상술한 것처럼 결정되었고, 표 5에 요약되어 있다. 탄성 모듈러스 G'의 결정을 위하여 히드로겔을 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용하였다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] | MRPMW 산화된 HA-SH [kDa] | DoM HA-SH 원료 물질 [㎛ol/g] | 탄성 모듈러스 G' [mPa] |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | |
| 18 | 700 | 618 | 131 | 1,162,567 |
실시예 12 - 변형제를 갖는 티올기의 합성
A.
bis
(글리실)-시스타민 디히드로클로라이드의 제조:
시스타민 디히드로클로라이드(1g, 4.44 mmol) 및 N-(tert-부톡시카보닐)글리신 (1.59 g, 9.10 mmol)이 용해된 건조 디클로로메탄:THF = 1:1 (20 mL)의 혼합물에, 1차 트리에틸아민 (1270μL, 9.16mmol)을 첨가하고, 이어서 디클로로메탄 중 EDC*HCl (1.75 g, 9.10 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 용액을 대기 온도에서 5h 동안 교반하고, 이후 휘발성분을 감압하에서 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트(250mL) 내에 넣고, 1 N HCl(2 x 50 mL), 반포화된 NaHCO3 (50 mL) 및 물 (50 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4으로 건조시키고, 휘발성분을 감압하에서 증발시켜 N-Boc 보호된 bis(글리실)-시스타민을 무색 오일로 얻었다. 수율: 1.575 g (88%).1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97 (s, 1H, NH), 5.53 (s, 1H, NH), 3.81 (d, J=5.8 Hz, 2H, α CH 2 ), 3.58 (aq, J=6.3 Hz, 2H, -CH 2 -NH-), 2.82 (t, 2H, -CH 2 -S- ), 1.45 (s, 9H, -CH 3 t-Bu); m/z = 467.1 [M+H]+, 489.1 [M+Na]+.
MeOH(5 mL) 중 N-Boc 보호된 bis(글리실)-시스타민(300 mg, 0.64 mmol)의 용액에, 아세틸 클로라이드(300 μL, 0.64mmol)을 첨가하였다. 발열 반응이 종결된 후, 혼합물을 대기 온도에서 5h 동안 밀봉 플라스크 내에서 교반하고, 이후 톨루엔 (2 mL)을 첨가하고, 휘발성 성분을 생성물이 침전될 때까지 증발시켰다. 백색 고체를 흡인 여과를 통해 분리하고 n-펜탄 (2 x 5 mL)으로 세척하였다. 수율: 146 mg (67%). m.p. = 184℃(decomp.); 1H NMR (400 MHz, D2O) δ3.81 (s, 2H,α CH 2 ), 3.59 (at, J=6.3 Hz, 2H, -CH 2 -NH), 2.88 (at, 2H, -CH 2 -S- ); m/z = 266.9 [M+H]+, 288.9 [M+Na]+.
이 변형제는 히알루로난-글리실-시스테아민 콘주게이트를 제조할 수 있게 한다(도 3 B).
B.
디티오디에탄디일디카보닐디아미노 디아세트산 디히드라지드 (DGDTPDH)의 제조:
건조 디클로로메탄:THF = 1:1 (20 mL) 중 3,3'-디티오디프로피온산 (2 g, 9.5 mmol) 및 글리신 에틸 에스테르 히드로클로라이드(2.66 g, 19.0 mmol)의 혼합물에, 트리에틸아민 (2,78μL, 20.0mmol)을 첨가하고, 이어서 디클로메탄 중EDC*HCl (3.83 g, 20.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 대기 온도에서 5h 동안 교반하고, 이후 에틸 아세테이트(400 mL)로 희석하였다. 유기층을 1N HCl(2 x 50 mL), 반포화된 NaHCO3(50 mL) 및 물(50 mL)으로 세척하고, 이후 Na2SO4 으로 건조시키고, 휘발성분을 감압하에서 증발시켜 디티오디에탄디일디카보닐디아미노 디아세트산 디에틸에스테르를 백색 고체로 얻었다. 수율: 1.69 g (47%); m.p. = 121℃; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.50 (s, 1H, NH), 4.21 (q, J=7.1 Hz, 2H, -O-CH 2 -), 4.04 (d, J=5.3 Hz, 2H,α CH 2 -N), 2.99 (t, J=7.0 Hz, 2H, -CH 2 -S-), 2.67 (t, 2H, α CH 2 -CH2-), 1.28 (t, 3H, -CH 3 ); m/z = 381.0 [M+H]+, 403.0 [M+Na]+.
96% EtOH 중 디에틸에스테르(500 mg, 1.32 mmol) 및 80% aq. 히드라진 히드레이트(0.5 mL, 12.7 mmol)의 혼합물을 5h 동안 환류시켰다. 생성물은 실온까지 냉각시 결정화되었고 흡인 여과를 통해 수집되고 차가운 EtOH(2 x 15 mL)으로 전체적으로 세척되었다. 수율: 335 mg (72%), 백색 바늘. m.p.= 197?C (decomp.) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (s, 1 H, -NH), 8.20 (t, J=5.7 Hz, 1 H, -NH), 4.19 (s, 2H, -NH2), 3.64 (d, J=5.8 Hz, 2H, α CH 2 -N), 2.87 (t, J=7.2 Hz, 2H, -CH 2 -S-), 2.53 (t, 2H, α CH 2 -CH2-); m/z = 353.1 [M+H]+, 375.1 [M+Na]+.
이 변형제로 인하여 히알루로난-2-메르캅토-에틸-카보닐-아미노-아세트산 히드라지드 콘주게이트의 제조가 가능해진다 (도 3 D).
C.
4,4'-디티오bis[1-부탄아민]디히드로클로라이드의 제조
문헌(Aufort, M. et.al., ChemBioChem, 12(4), 583-592, 2011)에서 보고된 프로토콜에 따라 4-아미노부탄-1-올로부터 4,4'-디티오bis[1-부탄아민] 디히드로클로라이드가 제조되고, 최종 N-Boc 탈보호를 채택하고 MeOH/HCl 으로 수행하여 생성물을 디히드로클로라이드 염으로 대신 얻었다: 메탄올(6 mL) 중 디카르바메이트 (550 mg, 1.35 mmol)의 용액에 아세틸클로라이드(0.6 mL, 8.4 mmol)를 적가하였다. 발열 반응이 끝났을 때, 혼합물을 5h 동안 환류시켰다. 이후 톨루엔(6 mL)을 첨가하고, 혼합물을 감압하에서 농축시켰다. 조 생성물 톨루엔(6mL)과 반복적으로 공비 혼합시키고, 이후 흡인 여과를 통해 분리시키고 n-펜탄 (2 x 6 mL)으로 세척하였다 수율: 340 mg (90%), 백색 고체. m.p.= 249℃ (decomp.); 1H NMR (400 MHz, D2O+DSS) δ 3.02 (t, J=7.1 Hz, 4H, CH 2 -N), 2.78 (t, J=6.7 Hz, 4H, -CH 2 -S-), 1.83-1.71 (m, 8H, C-CH 2 -CH 2 -C); m/z = 209.0 [M+H]+.
이 변형제로 인하여N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드의 제조가 가능해진다 (도 3 C).
실시예 13 - 가교된 히알루로난-글리실-시스테아민을 포함하는 히드로겔 조성물의 제형 및 캐릭터리제이션
가교된 히알루로난-글리실-시스테아민 소듐 염(HA-GLYC) 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 히드로겔 조성물(ID 19)이 리도카임 HCl 첨가 없이 방법 B에 따라 제조되었다. 요약하면, 537 mg HA-GLYC (건조 중량, MMW 610 kDa, 변형도 162 ㎛ol/g 폴리머, 도 3B) 및 150 mg 소듐 히알루로네이트(건조 중량, MMW 2.4 MDa)을 실온에서 약 5h 동안 기계적 교반하에 26g 0.01 M HCl (NaCl을 포함)에 용해시켰다. 19.02g의 이 용액에, 2.115 mL의 100 mM 포스페이트 완충제 pH 11.85을 첨가하여, 그 결과 pH를 약 7.4로 조절하였다. 이후 273 μL의 0.3% H2O2 용액을 첨가하고 혼합물을 대기 온도에서 15min 동안 균질화하고, 이후 가교를 위해 밤 사이 방치하였다. 가교된 히드로겔을 1mL 유리 주사기 내로 충진시키고 오토클레이브로 멸균하였다. 살균한 히드로겔은 pH 약 7.2를 가졌다.
변형도(DoM), MMW, 잔류 티올 함량, 및 탄성 모듈러스 G'는 상술한 것처럼 결정되었고, 표 6에 요약되어있다. 탄성 모듈러스 G'의 결정을 위하여 히드로겔을 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용하였다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] | DoM HA-SH 원료 물질 [㎛ol/g] |
잔류 티올 함량
[㎛ol/g] |
탄성 모듈러스 G' [mPa] |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | |
| 19 | 610 | 162 | 0 | 1,260,467 |
실시예 14 - 가교된 히알루로난-호모시스테인을 포함하는 살균한 히드로겔 조성물의 제형 및 캐리터리제이션
17.9mg/mL 가교된 히알루로난-호모시스테인 소듐 염(HA-HCYS) 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 히드로겔 조성물(ID 20)을 리도카인 HCl의 첨가없이 방법 A에 따라 제조하였다. 요약하면, 537 mg HA-HCYS (도 3A, 건조 중량, MMW 610 kDa, 변형도 136 ㎛ol/g 폴리머, 도 3A) 및 150 mg 소듐 히알루로네이트(건조 중량, MMW 2.4 MDa)를 약 5 시간 동안 실온에서 기계적 교반하에 26 g 0.01M HCl (NaCl을 포함)에 용해시키고, 이어서 1시간 동안 휴지 시간을 두어 공기 방울을 제거하였다. 23.68g의 이 용액에, 2.63 ml 100 mM 포스페이트 완충제 pH 12.04을 첨가하고, 그 결과 용액의 pH를 약 pH 7.2로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 48시간 방치하여 가교시키고, 이후 가교된 히드로겔을 1mL 유리 주사기 내로 충진시키고, 오토클레이브로 멸균하였다. 살균한 히드로겔은 pH 약 7.0을 가졌다.
변형도(DoM), MMW, 잔류 티올 함량, 및 탄성 모듈러스 G'는 상술한 것처럼 결정되었고, 표 7에 요약되어 있다. 탄성 모듈러스 G'의 결정을 위하여 히드로겔을 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용하였다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] | DoM HA-SH 원료 물질 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 탄성 모듈러스 G' [mPa] |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | |
| 20 | 610 | 136 | 0 | 1,759,900 |
실시예 15 -가교된 히알루로난-2-메르캅토-에틸-카보닐-아미노-아세트산 히드라지드를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물의 제형 및 캐릭터리제이션
17.9mg/mL 가교된 히알루로난-2-메르캅토-에틸-카보닐-아미노-아세트산 히드라지드 소듐 염(HA-DGDTPDH) 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물(ID 21)을 리도카인 HCl의 첨가없이 방법 B에 따라 제조하였다. 요약하면, 537 mg HA-DGDTPDH(도 3D, 건조 중량, MMW 770 kDa, 변형도 134 ㎛ol/g 폴리머) 및 150 mg 소듐 히알루로네이트(건조 중량, MMW 2.4 MDa)을 약 5h 동안 실온에서 기계적 교반하에서 26g 0.01M HCl(192 mg NaCl을 포함)에 용해시켰다. 20.20g의 이 용액에, 0.041% H2O2 를 포함하는 2.25 ml 100 mM 포스페이트 완충제 pH 12.07를 첨가하고, 그 결과 용액의 pH를 약 pH 7.0으로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 18h 동안 방치하여 가교시켰다. 가교된 히드로겔을 1mL 유리 주사기로 충진시키고, 오토클레이브로 멸균하였다. 살균한 히드로겔은 pH 약 7.0 및 삼투압몰농도 326 mOsmol/kg를 가졌다.
변형도 (DoM), MMW, 잔류 티올 함량, 및 탄성 모듈러스 G' 상술한 것처럼 결정되었고, 표 8에 요약되어 있다. 탄성 모듈러스 G'의 결정을 위하여 히드로겔 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용되었다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] | DoM HA-SH 원료 물질 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 탄성 모듈러스 G' [mPa] |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | |
| 21 | 770 | 134 | 0 | 698,860 |
실시예 16 -가교된
N
-메르캅토
-n-
부틸히알루로난아미드를 포함하는 히드로겔 조성물의 제형 및 캐릭터리제이션
17.9 mg/mL 가교된 N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드 소듐염 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물(ID 22)를 리도카인 HCl의 첨가없이 방법 B에 따라 제조하였다. 요약하면, 537mg N-메르캅토-n-부틸히알루로난아미드 소듐 염(도 3 C, 건조 중량, MMW 767 kDa, 변형도 98 ㎛ol/g 폴리머) 및 150 mg 소듐 히알루로네이트 (건조 중량, MMW 2.4 MDa)를 약 5h 동안 실온에서 기계적 교반하에서 26g 0.01M HCl(NaCl을 포함)에 용해시켰다. 23.48g의 이 용액에, 2.609 mL의 100 mM 포스페이트 완충제 pH 11.81, 포함 0,029% H2O2을 첨가하였고, 그 결과 pH를 pH 7.1로 조절하였다. 혼합물을 실온에서 15min 동안 균질화시키고 이후 밤 사이 방치하여 가교를 완료하였다. 가교된 히드로겔을 1mL 유리 주사기 내로 충진시키고 오토클레이브로 멸균하였다. 살균한 히드로겔은 pH 약 7.0 및 삼투압몰농도 351 mOsmol/kg을 가졌다.
변형도 (DoM), MMW, 잔류 티올 함량, 및 탄성 모듈러스 G'는 상술한 것처럼 결정되었고 평균 값들은 표 9에 요약되어 있다. 탄성 모듈러스 G'의 결정을 위하여, 히드로겔 주사기로부터 직접(바늘 부착없이) 레오미터에 사용되었다.
| ID | MMW HA-SH 원료 물질 [kDa] | DoM HA-SH 원료 물질 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 탄성 모듈러스 G' [mPa] |
| 평균 | 평균 | 평균 | 평균 | |
| 22 | 767 | 98 | 1 | 839,510 |
실시예 17 - 산업적 규모에서 티올-변형 히알루로난의 가교를 위한 최적화 조건
140㎛ol(티올기)/g(폴리머)(MMW 820 kDa)의 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난을 사용하여, 산업적 규모(배치 사이즈 17.5kg)로 17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 히드로겔 조성물을 제조하였다. 실온에서 약 8h 동안 교반을 통해 HA-시스테아민 소듐 염, 리도카인 HCl, 비변형 소듐 히알루로네이트 및 소듐 클로라이드를 0.01 M HCl에 용해시킨 후, 용액을 2개로 나누었다.
용액의 1개(7560g)는 용기 B 내에 진공하에서 밤 사이 배양하였다. 가교는 9부 용액에 대해 100 mM 포스페이트 완충제 pH 12.3의 1부를 첨가하여 시작되었고, 이어서 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비가 2:1(비교 방법 B)이 되도록 과산화수소를 포함하는 용액을 첨가하였다. 용기 B에서 얻어진 용액의 pH는 7.7이었고, 삼투압몰농도는 316 mOsmol/kg이었다.
용액의 2번째 부분(5800g)을 또한 용기 A에서 진공하에 밤 사이 배양하였고, 이어서 용액 9부에 대해 100 mM 포스페이트 완충제 pH 12.3를 1부 첨가하여 가교시켰다(비교 방법 A; 용기 A). 과산화수소를 포함하는 용액 대신에 주사용 물을 첨가하여 대응하는 함량으로 벌크하게 만들었다. 용기 A내 얻어진 용액의 pH는 7.7이었고, 삼투압몰농도는 312 mOsmol/kg이었다.
2개 용기를 10분 동안 교반을 통해 짧게 균질화시킨 후 실온에서 유지하였다. 가교를 위하여 산소를 공급하고, 과량의 공기압 +1bar을 용기 A에 10일의 전체 가교 동안 적용하였다(가교 시작 후 72h 내지 96h의 짧은 중단은 기계적 문제로 인한 것임). 샘플을 이하 표에 나열된 시점 및 위치에서 도출하였다. 표면 샘플은 표면에 밀접한 용기 내 히드로겔로부터 취한 반면에 바닥 샘플은 용기의 바닥에 가까운 히드로겔의 하부로부터 취한 것이다. 탄성 모듈러스는 실시예 4에 설명된 것처럼 측정되었다(샘플은 주사기 내에 충진되어 있지 않았다).
| 가교의 일 | 방법 A / 용기 A | 방법 B / 용기 B | ||
| 표면 샘플 G' [mPa] |
바닥 샘플 G' [mPa] |
표면 샘플 G' [mPa] |
바닥 샘플 G' [mPa] |
|
| 3 | 531,255 | 313,810 | 2,670,550 | 2,657,800 |
| 4 | 1,500,200 | 425,365 | n. d. | n. d. |
| 5 | 1,685,750 | 491,345 | n. d. | n. d. |
| 6 | n. d. | n. d. | 2,548,750 | 2,546,000 |
| 10 | 2,269,100 | 762,660 | n. d. | n. d. |
탄성 모듈러스는 히드로겔의 단단함을 모니터링하는 파라미터로 사용되며, 이는 가교에 의해 증가하는 것으로 알려져 있다. 1차 샘플은 가교 개시 후 직접적으로 얻어졌다. 용기 A로부터 얻어진 샘플의 탄성 모듈러스 G'는 33,729 mPa이었다. 대조적으로, 용기 B로부터 얻어진 샘플의 탄성 모듈러스는 2,475,700 mPa이고, 이는 가교가 산화제인 과산화수소의 존재하에서 더 빠르게 진행된다는 것을 나타낸다. 표 10의 데이터는 제조방법 A가 산업적 규모로 사용될 때 10일의 배양 시간 동안 전체 벌크 동안 가교반응이 균일하게 수행되지 않았다는 것을 더 나타낸다. 용기에 과량의 공기압을 적용한 결과 용기 내 벌크의 표면에서만 보다 효율적인 가교가 일어났다. 대조적으로, 과산화수소의 첨가를 통해 충분한 함량으로 산소를 공급한 결과 거의 즉각적이고 균일한 가교 반응(방법 B, 용기 B)이 나타났다.
실시예 18 - 잔류 티올기 함량의 결정을 통해 디설파이드 결합의 형성을 모니터링
140 ㎛ol(티올기)/g(폴리머)(MMW 820 kDa)의 변형도를 갖는 티올-변형 히알루로난을 사용하여, 17.9 mg/mL 가교된 HA-시스테아민 소듐 염, 3 mg/mL 리도카인 HCl 및 5 mg/mL 비변형 소듐 히알루로네이트를 포함하는 히드로겔 조성물을 제조하였다. 약 16h 동안 실온에서 HA-시스테아민 소듐염, 리도카인 HCl, 비변형 소듐 히알루로네이트 및 소듐 클로라이드를 0.01 M HCl에 용해시킨 후, 용액을 약 160g으로 각각 측량하여 4개로 동등하게 나누었다. 각 용액에 약 20g의 100 mM 포스페이트 완충제 pH 12을 교반하면서 첨가하였다. 15분 후, 균질화된 20g의 희석된 과산화수소 용액을 상기 4개 용액 각각에 첨가하여, 히드로겔 E100을 제조하기 위하여 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비가 2:1이 되게 하고; 히드로겔 E50(E100의 과산화수소 농도의 50% 포함)을 제조하는 동안, 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비가 4:1이 되게 하고; 히드로겔 E30(E100의 과산화수소 농도의 30% 포함)을 제조하는 동안, 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비가 7:1이 되게 하고; 히드로겔 E10(E100의 과산화수소 농도의 10% 포함)을 제조하는 동안, 과산화수소에 대한 티올-변형 히알루로난의 유리 티올기의 몰비가 20:1이 되게 하였다. 짧은 균일화 후, 가교 반응을 실온에서 추가 교반 없이 수행하였다.
샘플을 이하 표에 나타낸 시점에서 취하였다. 잔류 티올기 함량 및 탄성 모듈러스를 상술한 바와 같이 측정하였다(샘플을 주사기 내에 충진하지 않았음). 잔류 티올 함량(%)을 티올-변형 히알루로난 (140 ㎛ol(티올기)/g 폴리머)의 초기 변형도로부터 계산하였다.
| 히드로겔 E100 | |||
| 가교 후의 일 | G' [mPa] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [%] |
| 0 | 1,703,300 | n. d. | n. d. |
| 1 | 2,928,500 | 0 | 0 |
| 2 | 3,055,900 | 0 | 0 |
| 3 | n. d. | n. d. | n. d. |
| 7 | n. d. | n. d. | n. d. |
| 히드로겔 E50 | |||
| 가교 후의 일 | G' [mPa] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [%] |
| 0 | 947,745 | n. d. | n. d. |
| 1 | 2,191,950 | 43.9 | 31 |
| 2 | 2,217,000 | 31.8 | 23 |
| 3 | 2,415,800 | 17.7 | 13 |
| 7 | 2,642,350 | n.d. | n. d. |
| 히드로겔 E30 | |||
| 가교 후의 일 | G' [mPa] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [%] |
| 0 | 707,515 | n. d. | n. d. |
| 1 | 1,514,500 | 115.5 | 83 |
| 2 | 1,795,300 | 53.2 | 38 |
| 3 | 1,975,100 | 32.4 | 23 |
| 7 | 2,415,700 | n.d. | n. d. |
| 히드로겔 E10 | |||
| 가교 후의 일 | G' [mPa] | 잔류 티올 함량 [㎛ol/g] | 잔류 티올 함량 [%] |
| 0 | 321,695 | n. d. | n. d. |
| 1 | 512,500 | 122.7 | 88 |
| 2 | 827,810 | 88.7 | 63 |
| 3 | 1,326,400 | 47.2 | 33 |
| 7 | 2,023,800 | n.d. | n. d. |
샘플의 탄성 모듈러스 G'는, 히드로겔의 잔류 티올 함량이 20% 미만일 때 안정에 도달한 것으로 관찰되었다(2400Pa 내지 3,000Pa의 범위 G'). 히드로겔 E100의 가교는 2일 내 완결되었다. 가교를 위하여 과산화 수소의 농도가 50% 이하로 사용될 때(히드로겔 E50), 가교 반응은 약 3일이 소요되었다. 가교를 위하여 과산화수소의 농도가 90% 이하로 사용되었을 때(히드로겔 E10), 가교는 7일 후에도 완결되지 않았다.
Claims (20)
- 가교된 폴리머를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물로서,
여기서 가교된 폴리머는 티올-변형 히알루로난의 산화생성물이고,
상기 티올-변형 히알루로난은 약 80 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 바람직하게는 약 105 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 보다 바람직하게는 약 120 ㎛ol/g(폴리머) 이상의 티올기를 갖는 변형도를 갖고, 및
상기 티올-변형 히알루로난은 약 280㎛ol/g(폴리머) 미만, 바람직하게는 약 240 ㎛ol/g(폴리머) 미만, 보다 바람직하게는 200 ㎛ol/g(폴리머) 미만의 티올기를 갖는 변형도를 갖고,
여기서 상기 조성물은 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항에 있어서,
여기서 상기 조성물은 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 15% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난이 적어도 약 11 mg/mL, 바람직하게는 적어도 13 mg/mL으로부터 약 넉넉잡아 20 mg/mL, 보다 바람직하게는 넉넉잡아 18 mg/mL의 농도로 조성물 내에 포함되는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난이 적어도 약 400 kDa, 바람직하게는 적어도 약 500 kDa, 보다 바람직하게는 적어도 약 600 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 가교된 폴리머는 약 250 kDa 이상, 바람직하게는 약 300 kDa 이상, 보다 바람직하게는 약 350 kDa 이상의 살균 후 평균 환원 분자량을 갖고, 여기서 상기 살균 후 평균 환원 분자량은 상기 가교된 폴리머를 환원 조건에 노출시킨 후 상기 살균한 히드로겔 조성물로부터 환원된 티올-변형 히알루로난의 평균 분자량으로 정의되는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난이 아미드 결합을 통해 히알루로난에 연결된 변형제 콘주게이트이고, 여기서 상기 약제가 글루타티온, C2-C6-선형 또는 분지된 알킬 사슬을 포함하는 아미노알킬티올, 시스테인, 호모시스테인, 시스테아민, 시스테인 및 호모시스테인의 아미노산 유도체들, 호모시스테인의 카르복실레이트 에스테르 및 시스테인의 카르복실레이트 에스테르를 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난이 히알루로난-시스테아민 콘주게이트 (HA-시스테아민)인 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 조성물이 생체적합한 다당류의 군으로부터 선택된 비변형 폴리머, 바람직하게는 비변형 히알루로난을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
여기서 상기 조성물이 1Hz의 전단 속도를 사용하여 25℃에서 측정될 때 적어도 약 900 Pa, 바람직하게는 적어도 약 1,000 Pa의 탄성 모듈러스를 갖는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
의약 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제10항에 있어서,
여기서 상기 조성물이 연조직 필러로 사용되는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제10항에 있어서,
여기서 상기 조성물이 조직 확대를 위해 사용된 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
척골통, 요실금 또는 변실금, 외음질 위축증, 성대 손상, 정맥 판막 부전, 얼굴지방위축증, 쇠약해지는 상처(debilitating scar) 또는 형태학적 비대칭(morphological asymmetry) 또는 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는, 살균한 히드로겔 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물의 화장료 용도.
- 제14항에 있어서, 상기 조성물이 연조직 필러로서 사용되는 화장료 용도.
- 제14항 또는 제15항에 있어서,
주름 충진, 얼굴 또는 신체의 잃어버린 부피의 복원, 셀룰라이트에서 딤플의 감소, 얼굴 또는 신체의 윤곽을 형상화하기 위한, 화장료 용도. - 다음 단계를 포함하는 살균한 히드로겔 조성물을 제조하는 방법:
a) 수용액 내에서 티올-변형 히알루로난을 제공하는 단계로서,
여기서 상기 티올-변형 히알루로난이 약 80 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 바람직하게는 약 105 ㎛ol/g(폴리머) 이상, 보다 바람직하게는 약 120 ㎛ol/g(폴리머) 이상의 티올기를 갖는 변형도를 갖고, 및
여기서 상기 티올-변형 히알루로난은 약 280 ㎛ol/g(폴리머) 미만, 바람직하게는 약 240/g(폴리머) 미만, 보다 바람직하게는 200 ㎛ol/g(폴리머) 미만의 티올기를 갖는 변형도를 갖는 티올-변형된 히알루로난의 제공 단계,
a) 상기 얻어진 수용액을 상기 티올-변형 히알루로난이 가교된 폴리머를 형성할 수 있게 하는 조건에 노출시켜 티올-변형 히알루로난을 산화시키는 단계로서, 여기서 상기 수용액은 히드로겔이 되고, 여기 히드로겔은 티올-변형 히알루로난의 변형도에 대하여 20% 미만의 잔류 티올 함량을 갖는, 산화 단계,
선택적으로 c) 상기 이전에 얻어진 히드로겔 또는 상기 이전에 얻어진 용액에 생체적합성 다당류의 군으로부터 선택된 비변형 폴리머를 첨가하는 단계,
선택적으로 d) 상기 이전에 얻어진 히드로겔을 특정 입자 크기를 갖는 히드로겔을 얻도록 체로 처리하는 단계,
e) 상기 이전에 얻어진 히드로겔을 컨테이너, 특히 주사기에 충진하고, 상기 충진된 컨테이너를 히드로겔을 살균할 수 있게 하는 조건에 노출시키는 단계,
f) 가교된 폴리머를 포함하는 컨테이너 내 살균한 히드로겔 폴리머를 얻는 단계. - 제13항에 따른 히드로겔을 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 단계는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 순서도에 따라 수행되는 방법:
- a), b), c), d), e) 및 f)
- a), b), d), c), e), 및 f)
- a), b), c), e) 및 f)
- a), b), d), e), 및 f)
- a), c), b), d), e) 및 f) 및
- a), c), b), e) 및 f),
바람직하게는 a), c), b), d), e) 및 f). - 제17항 또는 제18항에 있어서,
여기서 단계 b) 산화제가 이전에 얻어진 용액에 첨가되는, 방법. - 제17항 내지 제19항에 있어서,
마취제 및/또는 하나 이상의 추가 성분을 단계 a) 동안 상기 용액에, 또는 선택적 단계 c) 또는 선택적 단계 d) 동안 얻어진 히드로겔에 첨가하는 단계, 또는 마취제 및/또는 하나 이상의 추가 성분을 단계 a) 또는 선택적 단계 b) 동안 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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