RU2805502C2 - Стабилизированная гиалуроновая кислота - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к гидрогелевой композиции. Стерильная гидрогелевая композиция для использования в качестве филлера мягких тканей содержит сшитый гиалуронан, где количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, составляет меньше чем 15 мас.% относительно общего количества гиалуронана, где сшитый гиалуронан имеет структуру HA-L-HA, где каждая группа HA означает гиалуронан или его соль и L представляет собой линкер, и этот линкер ковалентно связан с каждой группой HA путем замены одного OH-фрагмента в повторяющемся звене, и L получен от молекулы LH₂, сшитый гиалуронан представляет собой продукт окисления тиол-модифицированного гиалуронана, где тиол-модифицированный гиалуронан модифицирован молекулой, имеющей тиоловую группу, образующую внутримолекулярные и межмолекулярные дисульфидные связи при окислении, и сшитый гиалуронан содержится в количестве от 0,1 до 5 мас.% относительно массы композиции. Также раскрыт способ заполнения мягких тканей. Группа изобретений обеспечивает повышенную устойчивость к разложению рецептур при хранении. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к стерильной гидрогелевой композиции, содержащей сшитый гиалуронан, и к композиции для применения в качестве филлера мягких тканей.

Уровень техники

Гиалуронан, сокращенно HA, также называемый гиалуроновой кислотой, представляет собой встречающийся в природе полисахарид с повторяющимися звеньями дисахарида, состоящими из D-глюкуроновой кислоты и Ν-ацетил-D-глюкозамина. Термины гиалуронан или гиалуроновая кислота часто используют как синонимы их солей, например, гиалуроната натрия.

Высокомолекулярный гиалуронан естественным образом присутствует в коже и известен своими вязкоупругими свойствами, а также своей очень высокой склонностью к поглощению воды. Его свойства в значительной степени способствуют эластичности кожи. Учитывая его свойства и его качества биосовместимости, переносимости и отсутствия токсичности, преимущество этого соединения уже более 10 лет используют во многих областях медицины и косметики, особенно при эстетических процедурах. Например, гиалуронан используют для заполнения морщин путем прямой инъекции в дерму в рассматриваемой области (применение в качестве дермального филлера).

Высокоочищенный немодифицированный гиалуронан биоферментативного происхождения идеально совместим и идентичен эндогенной гиалуроновой кислоте. Однако гиалуронан, несмотря на преимущество высокой совместимости с тканями тела человека, наличия высокого сродства к воде и выполнения сильной увлажняющей функции, не обладает адекватными биомеханическими свойствами. Когда гиалуронан впрыскивают в ткани кожи, происходит быстрое разложение in vivo за счет как гиалуронидазы (ферментативное расщепление), так и свободных радикалов (химическое разложение), присутствующих в тканях тела человека.

Было предложено много решений для замедления in vivo разложения гиалуронана и для модификации его химических, физических и биологических свойств, дополнительно обеспечивающих повышенную устойчивость к разложению рецептур при хранении, к нагреванию и, следовательно, к стерилизации.

Такие подходы, как правило, включают химическую модификацию гиалуронана, включающую, например, сшивание гиалуронана с помощью химических, ферментативных или фотохимических средств. Такие сшитые гиалуронановые гели могут быть приготовлены с помощью разных способов получения. Обычно такие способы требуют две основные стадии, причем первая включает гидратирование гиалуронана, чтобы превратить его в водный раствор (гидрогель), а вторая направлена на сшивание молекул гиалуронана в указанном водном растворе в присутствии агента, способного индуцировать его сшивание (также называемого «сшивающим агентом»). Примеры сшивающих агентов включают формальдегид, дивинилсульфон, бискарбодиимиды и эпоксиды. Другие решения включают модификацию гиалуронана с помощью больших групп, таких как полипептиды, чтобы индуцировать клеточное склеивание или самосборку в гидрогель.

Для производства дермальных филлеров сшивающий агент наиболее часто выбирают из эпоксидов, таких как простой диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (BDDE) или 1,2,7,8-диэпокси-октан (DEO), альдегидов или поливинилсульфонов, таких как дивинилсульфон (DVS), и, следовательно, синтетического по своей природе.

К сожалению, химические модификации гиалуронана приводят к побочным эффектам и реакциям на инородное тело, не наблюдавшимся с немодифицированным гиалуронаном, который имеет естественно низкую иммуногенность и не токсичен. В большинстве продаваемых на рынке филлеров мягких тканей на основе гиалуронана используют BDDE в качестве сшивающего агента. Вследствие реакционной природы эпоксидных групп, присутствующих в BDDE, непрореагировавший BDDE, остающийся в дермальном филлере, может обладать генотоксическими эффектами. Следовательно, BDDE в дермальных филлерах должен оставаться в следовых количествах (<2 частей на миллион), поэтому при производстве необходимы дорогие операции дополнительной очистки и тестирования. Хотя профиль безопасности BDDE-сшитых филлеров подтвержден длительными клиническими испытаниями (De Boulle, Glogau et al., 2013: A review of the metabolism of 1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid dermal fillers, Dermatol Surg (39), 1758-1766), BDDE все еще может поднимать некоторые вопросы безопасности (Choi, Yoo et al., 2015: Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents, J Biomed Mater Res Part A (103A), 3072-3080).

Из-за рисков генотоксичности, связанных с BDDE, ежегодная доза продуктов дермальных филлеров, таких как Juvederm®, которые можно применять в течение всей жизни пациента, ограничена 20 мл в год. Введение коммерчески доступного дермального филлера Restylane® ограничено объемом 6 мл на одно применение. Аналогичные ограничения накладывают на филлеры мягких тканей, содержащие DVS-сшитую гиалуроновую кислоту.

Другой проблемой химических модификаций является необходимость жестких условий реакции, таких как щелочные значения pH и высокие температуры (свыше 50°C), которым гиалуронан должен быть подвергнут во время реакции сшивания для достижения желаемой степени сшивания. Известно, что молекулярная масса гиалуронана падает из-за гидролитического расщепления при воздействии кислого рН (pH ниже 4) или щелочного pH (pH свыше 10). Кроме того, гиалуронан разрушается при более высоких температурах, свыше 40°C (Troncoso et al., 2016: A kinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide, student thesis; доступно онлайн на сайте http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf; Stern et al., 2007: The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25), 537-557; Tokita and Okamoto, 1996: Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32), 1011-1014). Также известно, что низкомолекулярные фрагменты гиалуронана с молекулярными массами меньше чем приблизительно 200 кДа обладают провоспалительными эффектами (Naor, 2016: Editorial: Interaction Between Hyaluronic Acid and Its Receptors (CD44, RHAMM) Regulates the Activity of Inflammation and Cancer, Frontiers in immunology 7:39; Monslow et al., 2015: Hyaluronan-a functional and structural sweet spot in the tissue microenvironment, Frontiers in immunology 6:231).

Хотя документ WO 2014/064632 описывает филлеры мягких тканей со стабилизированным гиалуронаном с использованием эндогенных линкерных молекул, процесс сшивания требует неэндогенных химикатов для активации гиалуронана (описанный в заявке как псевдоестественное сшивание). Хотя полиамины являются эндогенными молекулами, найденными в относительно высоких концентрациях во всех живых существах, такие агенты, как установлено, проявляют удивительную степень токсичности, когда присутствуют в избытке (см. Hoet & Nemery, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.; 278, L417-L433 (2000)).

В документе WO 2013/086024 описаны филлеры мягких тканей, содержащие гиалуронан, сшитый диаминными сшивающими агентами (такими как гексаметилендиамин) и мультиаминными сшивающими агентами (такими как 3-[3-(3-аминопропокси)-2,2-бис(3-амино-пропоксиметил)пропокси]пропиламин). Использование эндогенных линкерных молекул в описании не упоминается. Сшивание, как описано, предпочтительно проводят в мягких условиях при pH от 4 до pH 7 и при температуре в интервале от 20 до 37°C. Однако в примерах процесс получения занимает несколько дней и в качестве исходного материал служит низкомолекулярный гиалуронан (например, полимеры с молекулярной массой, например, приблизительно 100 кДа или со средней молекулярной массой, например, 310 кДа). Следовательно, в этом случае образование низкомолекулярных HA-фрагментов не предотвращено. Документ WO 2013/086024 сфокусирован на оптимизации реологического поведения готового филлера, а не на повышении его биосовместимости.

В документах WO 2014/181147 A1 и WO 2016/005785 A1 описаны дермальные филлеры со стабилизированным HA с использованием для сшивания триметафосфатной соли, что приводит к молекулам HA, сшитым эндогенной дифосфатной группой. Однако при проведении процесса сшивания гиалуроновая кислота подвергается воздействию ярко выраженного щелочного рН (pH 11) при повышенной температуре 50°C в течение 3 час и даже при температуре до 70°C в течение 72 час. При таких жестких условиях образование низкомолекулярных HA-фрагментов неизбежно (Troncoso et al., 2016, A kinetic study of the degradation of hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide, student thesis; доступно онлайн на сайте http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf; Stern et al., 2007. The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25): 537-557; Tokita и Okamoto, 1996, Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32): 1011-1014). Когда такие низкомолекулярные НА-фрагменты высвобождаются из депо геля во время биодеградации в коже человека, они могут вызывать воспалительные реакции.

Следовательно, все еще существует необходимость в разработке композиций, содержащих стабилизированный гиалуронан, полезных, например, в качестве филлеров мягких тканей, но более устойчивых к разложению, чем природный гиалуронан.

Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в создании композиции с высокой биосовместимостью и высокой устойчивостью относительно разложения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает стерильную гидрогелевую композицию, содержащую сшитый гиалуронан, при этом количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, составляет меньше чем 15% масс. относительно общего количества гиалуронана.

Стерильная композиция представляет собой гидрогель, который может быть имплантирован или инъецирован в качестве филлера мягких тканей. Небольшое содержание низкомолекулярного гиалуронана гарантирует хорошую биосовместимость, а сшивание препятствует быстрой in vivo деградации гиалуронана.

В предпочтительном варианте осуществления сшитый гиалуронан имеет структуру в соответствии с формулой I:

HA-L-HA (I),

где каждая группа HA обозначает гиалуронан или его натриевую соль в соответствии с формулой II:

(II),

где n представляет собой целое число >1 и определяет число повторений повторяющегося звена формулы II, и

L представляет собой линкер, и этот линкер ковалентно связан с каждой группой HA путем замены одного OH-фрагмента в повторяющемся звене в соответствии с формулой II, и

где L получен от молекулы LH₂, при этом молекула LH₂ представляет собой молекулу, встречающуюся естественным образом в организме людей, или конъюгат молекул, встречающихся естественным образом в организме людей.

Сшитый гиалуронан содержит поддерживающую структуру в соответствии с формулой III:

(III),

где линкер L получен от молекулы LH₂, при этом LH₂ представляет собой молекулу, встречающуюся естественным образом в организме людей, или конъюгат молекул, встречающихся естественным образом в организме людей. Соответственно, линкер L ковалентно связан с карбоксильной группой глюкуроновой кислоты в HA-повторяющемся звене.

Понятно, что сшитый гиалуронан представляет собой сложный полимер, и формулы I-III следует понимать, как схематичные. Любой гиалуронан (HA) в сшитом гиалуронане может иметь несколько модификаций за счет прикрепления линкера L, то есть, формула I не вносит ограничение, что любая HA цепочка может включать только один линкер. Сшитый гиалуронан может содержать больше двух HA цепочек. Каждая HA цепочка, содержащая множество повторяющихся звеньев, может содержать одно модифицированное звено, которое связано со вторым HA, или несколько модифицированных звеньев в случайных местах HA цепочки, которая связана с той же второй цепочкой или с другими HA цепочками.

В предпочтительном варианте осуществления от 0,5 до 10% мол. повторяющихся звеньев в сшитом гиалуронане участвуют в сшивании, например, с образованием ковалентной связи с линкером L. Другими словами, степень сшитых звеньев может составлять от 0,5 до 10% мол.

В предпочтительном варианте осуществления сшитый гиалуронан представляет собой продукт модифицированного гиалуронана, причем модифицированный гиалуронан модифицирован эндогенной молекулой, предоставляющей реакционноспособную группу для сшивания, такую как тиольные группы. В этом варианте осуществления степень модификации модифицированного гиалуронана предпочтительно находится в интервале приблизительно от 3 до 10% мол. Верхняя граница степени модификации 10% мол. дает возможность удерживать положительные характеристики гиалуронана (такие как биосовместимость, характеристики набухания). Нижнюю границу степени модификации приблизительно 3% мол. считают необходимой для формирования стабилизированных и высоковязких гелей. Следовательно, уровень сшитых звеньев в сшитом гиалуронане составляет предпочтительно от 3 до 10% мол.

Линкер L получают от молекулы LH₂, естественным образом встречающейся в организме человека, или молекулы LH₂, представляющей собой конъюгат молекул, естественным образом встречающихся в организме человека. Таким образом, линкер L формально получают путем отщепления двух атомов водорода от природной молекулы. Говоря языком химии, молекула LH₂ реагирует с HA, например, путем нуклеофильного замещения. Молекула, естественным образом встречающаяся у людей, также может быть названа эндогенной молекулой. В предпочтительном варианте осуществления L представляет собой негенотоксичный и нецитотоксичный фрагмент эндогенной молекулы.

В одном варианте осуществления молекула LH₂ представляет собой аминокислоту, пептид, гормон, вторичный мессенджер, сигнальную молекулу или их конъюгат. Эндогенная молекула LH₂ может содержать две аминогруппы, и структуру HA-L-HA представляют в соответствии с формулой III, где аминогруппы образуют амидные связи с карбоксильными группами HA-повторяющегося звена.

В одном варианте осуществления линкер L содержит фрагмент молекулы или образован из молекулы LH₂, представляющей собой глутатион, цистеамин, цистеин, гомоцистеин, бета-цистеин, содержащий пептид цистеин, конъюгат цистеамина и аминокислоты или их дисульфидный димер (в том числе их смешанные дисульфидные димеры). Сшитый гиалуронан, образованный из этих молекул, естественным образом существующих в организме человека, предпочтительно подпадает под формулу III, и амидные связи образованы с карбоксильной группой HA-повторяющегося звена. С другой стороны, производные глутатиона и цистеина также могут образовывать связь посредством сложноэфирной связи с любой спиртовой группой. Эти содержащие тиольную группу линкеры особенно полезны для варианта осуществления, где сшитый гиалуронан является продуктом реакции производного гиалуронана, модифицированного молекулой, предпочтительно эндогенной молекулой, имеющей реакционноспособную группу для сшивания. Тиольные группы представляют собой реакционноспособные группы, которые при окислении могут образовывать внутримолекулярные и межмолекулярные дисульфидные связи. Таким образом, в этом варианте осуществления сшитый гиалуронан представляет собой продукт окисления тиол-модифицированного гиалуронана.

В другом варианте осуществления эндогенной молекулой LH₂ является мочевина.

Композиция дополнительно характеризуется тем, что молекулярно-массовое (MW) распределение гиалуронана показывает количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, меньше 15% масс. относительно общего количества гиалуронана.

Понятно, что молекулярная масса гиалуронана должна быть определена в несшитом состоянии. Действительно, гидрогелевые композиции, содержащие сшитый гиалуронан, как правило, включают некоторое количество свободного, то есть, несшитого гиалуронана. Во многие гидрогели свободный гиалуронан активно добавляют в виде части композиции. С другой стороны, свободный гиалуронан может оставаться несшитым во время производства гидрогеля или может стать свободным при деградации гиалуронановых цепочек во время обработки для получения стерильного гидрогеля.

Разные подходы могут быть использованы для подтверждения молекулярно-массового распределения экстрагируемого гиалуронана в композиции, содержащей сшитый гиалуронан. В предпочтительном варианте осуществления экстрагируемый гиалуронан может быть определен с помощью восстановительной экстракции или консервативной экстракции.

С помощью восстановительной экстракции исследуемую композицию анализируют за счет экстрагирования свободного гиалуронана после обращения мостиковых связей, то есть, за счет восстановления, например, сшитого дисульфидом гиалуронана (пример 3). Этот способ включает расщепление линкера, приводящее к преобразованию сетчатой структуры гиалуронана в вязкий раствор гиалуронана. Хотя такой способ легко применим к гидрогелям, где сшивание происходит при окислении, этот способ не может быть применен с некоторыми сшивающими агентами, то есть, с BDDE-сшитым гиалуронаном. Реакционные условия для преобразования (то есть, восстановительные условия) могут приводить к дополнительному накоплению HA с низкой молекулярной массой. Соответственно, количество свободного гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, как правило, в этом способе более высокое.

С помощью консервативной экстракции свободный гиалуронан может быть исследован без манипулирования сетчатой структурой сшитого гиалуронана (пример 6). Этот подход может быть применен независимо от сшивающего агента. Гидрогель выдерживают в системе растворителей и встряхивают. В результате свободный гиалуронан просачивается в жидкую фазу, тогда как сшитый HA остается в гелевой фазе. Жидкую надосадочную фазу отделяют и анализируют на молекулярно-массовое распределение.

В некоторых случаях, с другой стороны, может быть возможно исследование молекулярно-массового распределения гиалуронана в сравнительной композиции, полученной по аналогии с исследуемой композицией без сшивания (пример 3). Однако этот подход требует подробной информации по способу производства гидрогеля.

Молекулярная масса (MW), указанная для гиалуронана, как правило, представлена средним значением всех молекул в популяции. В литературе MW обычно выражают в виде средневесовой молекулярной массы. Тем не менее, можно исследовать MW распределение образца гиалуронана, например, свободного гиалуронана, экстрагированного, как описано выше, и определять, например, фактическое количество или фракцию гиалуронана с MW <200 кДа.

MW распределение может быть исследовано при анализе эксклюзионной хроматографией по размерам (SEC), как показано ниже. Специалисту в этой области техники будет понятно, что другие подходы могут приводить к сопоставимым значениям молекулярно-массового распределения. Например, электрофорез на агарозном геле может быть использован, чтобы разделить фракции гиалуронана с разными MW в агарозном геле, с применением горизонтальной гелевой камеры и лестничной диаграммы молекулярной массы НА в качестве маркера, где окрашенные гели затем подвергают денситометрическому анализу, например, с использованием программного пакета Image J (http://imagej.net/Welcome) с последующим расчетом молекулярной массы в соответствии с публикацией Cowman et al (Analytical Biochemistry 417, 2011, pp 50-56). Затем может быть определено количество гиалуронана с MW <200 кДа. В гидрогелевой композиции в соответствии с изобретением такое количество составляет самое большее 15% масс. относительно общего количества гиалуронана в композиции. Справочное количество, то есть общее количество гиалуронана, включает весь гиалуронан в композиции, в том числе сшитый и свободный гиалуронан любой молекулярной массы. Как правило, это количество определяется концентрацией гиалуронана(ов) в композиции или может быть определено рутинными методами.

В примерах показано, что в разных гидрогелях в соответствии с изобретением фракция гиалуронана с MW <200 кДа составляет самое большее 15% масс. (пример 3). Напротив, условия сшивания, описанные для TMP-сшитых гелей (согласно WO 2016/005785 A1), приводят к фракции гиалуронана 30% масс. относительно всего гиалуронана (сравнительный пример 4). Кроме того, сравнение с существующими композициями BDDE-сшитого гиалуронана показывает улучшение с точки зрения количества низкомолекулярной фракции (пример 6). Таким образом, предложены улучшенные рецептуры с точки зрения биосовместимости благодаря небольшой фракции воспалительных гиалуронановых олигомеров.

Определение MW для композиций в соответствии с изобретением в примере 3 проводят после некоторого периода хранения (хранения при комнатной температуре), тогда как сравнительный пример 4 изучают даже перед стерилизацией. В общем случае фракция низкомолекулярного гиалуронана, как правило, растет во время обработки (стерилизации) и при хранении. Аналогичные тенденции ожидают для любых композиций сшитого гиалуронана с подобными свойствами гидрогеля (концентрация, pH, осмоляльность). Таким образом, в гидрогелях в соответствии с современным уровнем техники значительная фракция гиалуронана с MW <200 кДа после сшивания может расти даже дополнительно. В целом, для композиции желательна небольшая фракция низкомолекулярного гиалуронана, самое большее 15% масс., сразу же после переработки в стерильную гидрогелевую композицию.

Благодаря прекрасной биосовместимости композиции по изобретению и отсутствию потенциально токсичных сшивающих агентов в предпочтительных вариантах осуществления композиция может быть применена в дозах, превышающих 20 мл в год. Таким образом, она подходит для вариантов применения, в которых требуются большие объемы филлеров, таких как увеличение груди, или в случае пациентов, требующих применения на множестве участков. Следовательно, одно из применений композиции состоит в косметическом применении. Тем не менее, применимость композиции не ограничена подкожными имплантатами. Следовательно, в другом аспекте композиция предоставлена для применения в медицине, для применения в качестве филлера мягких тканей.

Такое применение (терапевтическое или косметическое) может быть отнесено к применению композиции в соответствии с изобретением в качестве филлера мягких тканей или для контурной пластики тканей. Такое применение предпочтительно включают применение, например, путем инъекции или имплантации человеку, при этом применимость не ограничена людьми.

В другом аспекте изобретение относится к способу, и этот способ включает введение композиции в соответствии с изобретением, например, путем инъекции из шприца, на конкретном участке мягких тканей. Способ относится к применению композиции в качестве филлера мягких тканей или для контурной пластики тканей для терапевтических, а также косметических целей.

В одном варианте осуществления применение или способ в соответствии этими аспектами включают то, что гидрогелевую композицию вводят человеку в участок ткани путем инъекции из шприца внутрикожно, супрапериостально или подкожно.

Гидрогелевая композиция может включать анестезирующее средство местного действия и/или один или несколько компонентов, выбираемых из множества других компонентов, таких как факторы роста, витамины, многоатомные спирты, галогениды щелочных металлов, минералы, антиоксиданты, аминокислоты, коферменты, керамические частицы (такие как частицы гидроксиапатита кальция), полимерные частицы, полимеры (такие как полиэтилен-гликоль, гликозаминогликаны, лубрицины, полисахариды и их производные), белки (такие как эластин, коллаген, кератин, фиброин шелка), антицеллюлитные агенты, противорубцовые средства, противовоспалительные агенты, противораздражающие агенты, вазоконстрикторы, антигеморрагические агенты (такие как гемостатические средства и антифибринолитические средства), подтягивающие агенты, средства против угрей, средства пигментации, средства против пигментации, противовоспалительные агенты, противоревматические агенты, противовирусные агенты, противоинфекционные агенты, антисептические агенты, химиотерапевтические агенты, цитостатические агенты, противоаллергические агенты, противоварикозные агенты, анальгетики, антибиотики, антимикотики, спазмолитики, антигистаминные препараты, средства для лечения геморроя, терапевтические средства для лечения кожи и увлажняющие средства.

Добавление анестезирующего средства местного действия к гидрогелевой композиции особенно желательно ввиду его способности ослаблять боль после инъекции. Анестезирующие средства местного действия включают лидокаин, артикаин, прилокаин, хлоропрокаин, артикаин или их комбинации, а также их соли. Предпочтительно анестезирующим средством является лидокаин, например, в форме кислотно-аддитивной соли, например, лидокаин-HCl.

В другом предпочтительном варианте осуществления композиция дополнительно содержит немодифицированный полимер, выбираемый из группы биосовместимых полисахаридов. Предпочтительно немодифицированным полисахаридом является немодифицированный гиалуронан (НА). «Немодифицированный» (несшитый) или так называемый «свободный» гиалуронан может дополнять гидрогелевую композицию. Немодифицированный НА обычно добавляют в качестве лубриканта к филлерам мягких тканей, чтобы гарантировать легкую способность к инъекции за счет снижения усилия выдавливания, требуемого для введения продуктов через иглу или канюлю. Предпочтительно свободный гиалуронановый исходный материал, используемый для производства композиции, имеет молекулярную массу в интервале приблизительно от 500 до 3500 кДа. Однако специалисту в данной области техники будет понятно, что из-за быстрой деградации нестабилизированного гиалуронана in vivo эффективность композиции в качестве филлера мягких тканей в значительной степени определяется сшитым полимером и свойствами лежащего в основе тиол-модифицированного гиалуронана. Предпочтительно, чтобы немодифицированный полисахарид находился в концентрации, ниже чем концентрация сшитого полимера. Так, например, немодифицированный гиалуронан присутствует в концентрациях от 3 до 7 мг/мл, например, 5 мг/мл, при этом концентрация предпочтительно относится к концентрации соли, например, гиалуроната натрия.

Более того, в одном варианте осуществления сшитый гиалуронан содержит, по меньшей мере, одно под-звено в соответствии с формулой IV:

(IV),

где, по меньшей мере, 1% от общего числа атомов водорода, которые изображены, как R^D и R^D1, представляет собой ²H (дейтерий). Это приводит к дополнительной стабилизации молекулы.

В другом варианте осуществления композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, 0,1 мол., по меньшей мере, одной обогащенной дейтерием гиалуроновой кислоты.

Композиция может также содержать нетоксичный стабилизатор.

Для повышения эффективности в качестве филлера мягких тканей композиция может дополнительно содержать, по меньшей мере, один ингибитор деградации гиалуроновой кислоты.

Указанный ингибитор может быть выбран из группы, включающей 1,2,3,4,6-пента-O-галлоилглюкозу, апигенин, бета-эсцин, кальтрин, цис-хинокиресинол (CHR), эхинацин, эйкозатриеновую кислоту (C20:3), фенопрофен, ауротиомалат натрия, госсипол, гепарин, гесперидин-фосфат, индометацин, L-аскорбиновую кислоту, L-карнитин, L-аминокарнитин, миокристин (натрий ауротиомалат), N-тозил-L-фенилаланинхлорметилкетон (TPCK) и N-альфа-п-тозил-L-лизинхлорметилкетон (TLCK), фосфорилированный гесперидин, поли(натрий-4-стиролсульфонат) (T-PSS), полиэстрадиол-фосфат, полифлоретин-фосфат, PS53 (полимер гидрохинон/сульфоновая кислота/формальдегид), полистирол-сульфонат натрия (N-PSS), сульфатированный 2-гидроксифенил-монолактобиозид, сульфатированный дигалактозид гидрохинона, сульфатированную вербаскозу, олигосахариды плантеозы и неомицина, тетрадецилсульфат натрия (TDSS), ненасыщенную жирную кислоту от C14:1 до C24:1 с одной двойной связью, ингибитор мочевого трипсина (UTI), уролитин B, WSG или глицирретиновую кислоту, или их комбинации.

Композиция также может содержать вязкий и гидрофильный биосовместимый спирт, предпочтительно глицерин, предпочтительно из расчета 0,5-5% масс./об.

В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит сшитый гиалуронан в количестве от 0,1 до 5% масс. относительно массы композиции.

Более того, будет понятно, что основным компонентом гидрогелевой композиции является вода. Предпочтительно для производства композиции используют воду для инъекций или очищенную воду. Помимо этого, следует заметить, что композиция может быть буферизована, чтобы она показывала физиологически приемлемое значение pH в интервале от 6,7 до 7,8. Подходящие буферы известны специалисту в данной области техники и включают, например, фосфатный буфер. Композиция также проявляет физиологически-приемлемую осмоляльность, которая подобна нормальной осмоляльности внеклеточной жидкости у субъекта, подвергаемого лечению (например, у людей). Таким образом, композиция может иметь осмоляльность в интервале 250-350 мОсм/кг и может включать дополнительные растворимые вещества для корректировки осмоляльности, такие как хлорид натрия, хлорид кальция и/или хлорид калия.

Гидрогелевая композиция в соответствии с изобретением является стерильной, что может быть достигнуто с помощью существующих подходов. Термическая стерилизация влажным жаром с помощью автоклава представляет собой один из стандартных методов, который включает обработку гелей насыщенным паром высокого давления при 121°C в течение около 15-20 мин. Автоклавирование в течение более короткого периода времени (например, приблизительно между 1 и 5 мин) и при более высоких температурах (например, приблизительно от 130 до 135°C) может обеспечить лучшее сохранение молекулярной массы молекул гиалуронана в гелях (см. официальный документ Fedegari whitepaper, US 2016/0220729). Оптимизация других параметров автоклавирования (таких как обеспечение быстрого охлаждения продукта) может дать дополнительное преимущество для сохранения молекулярной массы полимера (http://www.steriflow.com/en/news/Sterilization-hyaluronic-acid).

Термин «гидрогель», используемый в данном документе, следует понимать, как описывающий композицию, которая имеет характеристики как твердого вещества, так и текучей среды (жидкости). С одной стороны, гидрогель может быть инъецируемым, то есть, он показывает подобное текучей среде поведение. С другой стороны, гидрогель может быть достаточно плотным (или жестким), чтобы удерживать некоторую форму, например, гидрогель может быть предоставлен в форме заранее сформованного имплантата, жгута или элементарных нитей. Следовательно, термин «гидрогель» не ограничивает реологические свойства композиции количественным образом.

Гидрогелевая может быть использована там, где гидрогелевая композиция представляет собой лекарственное средство, косметическое или медицинское изделие. Гидрогель имплантируют, предпочтительно путем инъекции через иглу или канюлю, на участок применения, предпочтительно мягкие ткани. С другой стороны, гидрогель может быть имплантирован посредством хирургической операции. После нанесения гидрогель может быть назван (гидрогелевым) имплантатом или депо. Гидрогель в соответствии с изобретением является биосовместимым и образует рассасывающийся (то есть, биоразлагаемый) имплантат. Таким образом, гидрогель в соответствии с изобретением может быть применен в качестве филлера мягких тканей.

Филлеры для мягких тканей, содержащие биоматериалы, такие как стабилизированный гиалуронан, доставляют к участку ткани, где требуется контурная пластика, посредством инъецируемой гидрогелевой композиции. Цели применения или способы, относящиеся к заполнению мягких тканей, включают увеличение мягких (дермальных) тканей для коррекции врожденных аномалий, приобретенных дефектов или косметических дефектов.

Основной эффект гидрогелевой композиции является чисто физическим, так как композиция проявляет эффект заполнения, базирующийся на первоначальном объеме и набухании имплантата. Таким образом, в отсутствие любого физиологического или фармакологического взаимодействия применение может быть классифицировано как косметическое, и композицию можно рассматривать как косметическое или медицинское изделие. Области, где применение гидрогелевой композиции по изобретению может быть рассмотрено как косметическое, включают, например, уменьшение признаков старения, то есть:

- применение в тканях вульвы и влагалища для нехирургического омоложения женских половых органов;

- нанесение в дерму, подкожное или супрапериостальное применение.

Так, например, гидрогелевая композиция может быть использована (в способе) для косметических целей, например, для заполнения морщин, для лечения дефектов кожи, для восстановления утраченного объема лица или тела (например, груди, мочки уха), для уменьшения ямочек при целлюлите, для лечения деформаций слезного желоба, для формирования контуров лица или тела (например, увеличения ягодиц, увеличения бедер, увеличения икр), для увеличения полового члена (увеличения обхвата полового члена, увеличения головки полового члена).

В других случаях заполнение и увеличение мягкой ткани может привести к лечению или профилактике заболевания, то есть к уменьшению, облегчению и/или предупреждению (повторного) возникновения симптомов. В случае заболевания, которое вызвано дефектом мягких тканей, можно получить положительный результат от временного и/или локального структурного заполнения, демпфирования, поддержки или увеличения окружающих тканей с помощью нанесенного гидрогеля. Заболевания, при которых гидрогелевая композиция может быть использована для лечения или профилактики, включают:

- метатарсалгию, болевое заболевание жировой подушки подъема свода стопы, при котором гидрогелевая композиция по изобретению может быть нанесена на жировую подушку мягких тканей подъема свода стопы;

- недержание мочи или кала, по показаниям которого гидрогелевая композиция в соответствии с изобретением может быть нанесена на ткани, определяющие сфинктеры;

- вульвовагинальная атрофия (также мочеполовой синдром менопаузы), по показанию которой композиция гидрогеля по настоящему изобретению может быть нанесена на вульвовагинальную область путем инъекции в слизистую оболочку влагалища и преддверия и/или для увеличения больших половых губ, при этом реконструкция больших половых губ обеспечивает тесный контакт между обеими большими половыми губами для защиты внутренних структур вульвы;

- нарушение функции голосовых связок,

- функциональная недостаточность венозного клапана; или

- липоатрофия лица, истощающие рубцы, морфологическая асимметрия или деформация (врожденная или возникшая в результате травмы или хирургического вмешательства, например, грудной клетки или лица), по показаниям которых гидрогель применяют в реконструктивных целях.

Подробное описание изобретения

Как обсуждалось выше, предпочтительный вариант сшитого гиалуронана представляет собой продукт реакции модифицированного гиалуронана, причем модифицированный гиалуронан модифицирован с помощью эндогенной молекулы, предоставляющей реакционноспособную группу для сшивания, например, тиольные группы. Ниже приведены более подробные сведения, относящиеся к получению тиол-модифицированного гиалуронана, сшитого гиалуронана, являющегося продуктом окисления, а также содержащих его композиций.

Введение агента модификации через образование сложноэфирной связи или амидной связи между карбоксильной группой фрагмента глюкуроновой кислоты гиалуронана и агентом модификации, является предпочтительным. В процессе синтеза агент модификации может содержать тиольные группы в форме дисульфидных связей или в виде защищенных тиольных групп.

В одном предпочтительном варианте осуществления агент модификации связывают с карбоксильной группой фрагмента глюкуроновой кислоты в гиалуронане через амидную связь. Соответственно, агент модификации содержит, по меньшей мере, одну аминогруппу, способную образовывать амидную связь с карбоксильной группой фрагмента глюкуроновой кислоты в гиалуронане, и агент модификации содержит тиольную группу. Например, тиол-модифицированный гиалуронан представляет собой конъюгат гиалуронан-цистеамин, где цистеамин связан с гиалуронаном через амидную связь.

Аналогично другие несущие тиольную группу агенты модификации могут быть использованы при синтезе тиол-модифицированного гиалуронана через образование амидной связи между аминогруппой (первичной или вторичной аминогруппой, предпочтительно первичной аминогруппой) агента модификации и карбоксильной группой фрагмента глюкуроновой кислоты в гиалуронане. Эффективные агенты модификации включают, например, производные цистеамина, цистеина или гомоцистеина, где аминогруппа цистеамина, цистеина или гомоцистеин связана с карбоксильной группой аминокислоты. Такие производные предпочтительно синтезируют с использованием N-защищенных аминокислот.

Небольшая молекулярная масса агента модификации предпочтительна, чтобы сохранить уникальные физико-химические свойства гиалуронана насколько это возможно. Подходящие низкомолекулярные агенты модификации для получения сшиваемого тиол-модифицированного гиалуронана, полезного в случае композиции по изобретению, предпочтительно выбирают также из группы, включающей глутатион, цистеин и гомоцистеин.

Неограничивающими примерами подходящего линкера L или встречающейся естественным образом молекулы LH₂ являются:

- цистамин, дисульфидный димер цистеамина, то есть, L формулы V:

-NH-CH₂-CH₂-S-S-CH₂-CH₂-NH- (V);

- окисленный глутатион, дисульфидный димер глутатиона, то есть, LH₂ формулы VI:

(VI);

- цистин, дисульфидный димер цистеина, то есть, LH₂ формулы VII:

(VII);

- гомоцистин, дисульфидный димер гомоцистеина, то есть, LH₂ формулы VIII:

(VIII);

- аминокислотное производное цистамина, являющееся конъюгатом встречающихся в природе молекул цистамина и встречающихся в природе аминокислот, то есть, LH₂ формулы (IX):

(IX);

где обе группы X могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга (симметричные или асимметричные производные) и природа X зависит от аминокислоты. В одном варианте осуществления обе группы X являются атомами водорода, то есть, симметричное производное глицина;

- мочевина, то есть, LH₂ формулы X:

(X).

Сшитый гиалуронан, используемый в гидрогелевой композиции в соответствии с настоящим изобретением, может быть произведен следующим образом: вначале гиалуронан модифицируют с помощью эндогенных молекул с реакционноспособными группами для сшивания, такими как тиольные группы. Цистеамин, цистеин и глутатион представляют собой примеры таких негенотоксичных эндогенных молекул, которые естественным образом встречаются в организме человека. Например, соответствующие поддерживающие структуры тиол-модифицированного гиалуронана, сшиваемого за счет образования дисульфида, модифицированного цистеамином (HA-цистеамин) и глицинил-цистеамином (HA-глицинил-цистеамин), представлены в формуле XI:

(XI);

и в формуле XII:

(XII);

соответственно.

Реакции проводят в условиях, которые не оказывают негативного влияния на молекулярную массу гиалуроновой кислоты, таких как температура меньше 40°C и очень ограниченное, если таковое есть, время воздействия значений pH в интервале pH 11 или выше и меньше чем pH 4.

В документе EP 1115433 B1 (Aeschlimann) описан способ функционализации гиалуронана, который не подвергает риску молекулярную массу гиалуронана и который также дает молекулы гиалуронана, которые хорошо переносятся in vivo и являются биоразлагаемыми. Способ используют для получения гиалуронана с различными концевыми функциональными группами для сшивания, такими как тиольные группы. Такие боковые цепочки вводят в гиалуронан за счет опосредуемого карбодиимидом связывания содержащих первичную (защищенную) тиольную группу аминов или содержащих дисульфидную связь диамино- или дигидразидных лигандов с карбоксильной группой фрагмента глюкуроновой кислоты с использованием активного сложноэфирного промежуточного соединения. Промежуточные продукты с дисульфидными связями затем восстанавливают и промежуточные продукты с защищенными тиольными группами затем подвергают снятию защиты путем удаления защитных групп.

Документ EP 0587715 раскрывает, как синтезировать нерастворимые в воде анионные полисахариды путем растворения, по меньшей мере, одного полианионного полисахарида (например, гиалуронана), в водной смеси; активации полианионного полисахарида с помощью активирующего агента, такого как диимид, например, EDC, или ETC, или BOP; модификации активированного полианионного полисахарида с помощью модифицирующего соединения, такого как гидрат 1-гидроксибензотриазола (HOBt) или моногидрат 1-гидроксибензотриазола; и взаимодействия активированного полианионного полисахарида с подходящим нуклеофилом (таким как аминотиол) с образованием желаемой нерастворимой композиции. Утверждается, что одно главное преимущество BOP-активации полианионного полисахарида состоит в том, молекулярная масса полианионного полисахарида не уменьшается при связывании с нуклеофилом.

Опосредуемое триазином амидирование с помощью DMT-MM для эффективной и контролируемой функционализации гиалуроновой кислоты с помощью цистеамина описано Borke с соавторами. По сравнению с другими реагентами для реакций связывания (таких как EDC-опосредуемое замещение) мягкие реакционные условия и минимальная деградация цепочки полисахарида перечислены в качестве преимуществ использования этой группы связывающих агентов (Borke et al., Carbohydrate Polymers 116 (2015) 42-50). Liang с соавторами описывает введение тиольных групп в гиалуронан посредством реакции амидирования боковых карбоксилатов с помощью цистамина в присутствии CDMT и NMM, после чего следует реакция восстановления с помощью DTT (Liang et al. Carbohydrate Polymers 132 (2015) 472-480).

Современный уровень техники умалчивает о сохранении молекулярной массы гиалуронана во время сшивания в процессе получения стерильных гидрогелевых композиций.

Модифицированный гиалуронан затем очищают, при этом он все еще остается несшитым, что обеспечивает очень эффективную очистку различными методами, такими как осаждение, хроматография и диализ.

Затем, модифицированный и очищенный гиалуронан сшивают с образованием высоковязкого геля. В этом случае нет необходимости в дополнительной очистке геля с помощью диализа, который является единственным методом очистки, обычно применяемым к высоковязким водным гелям. Условия сшивания зависят от природы линкера. В случае, если гиалуронан модифицирован эндогенными молекулами с реакционноспособными тиольными группами, сшивание включает окисление тиольных групп с образованием межмолекулярных и внутримолекулярных дисульфидных связей.

После заполнения шприцев гелями их необходимо стерилизовать.

Примеры

Пример 1: Сшивание мочевиной

Растворяют 8 г гиалуроната натрия в 72 г физиологического раствора. Отдельно готовят раствор, растворяя 4 г мочевины в 16 г 0,2M HCI. Два полученных раствора смешивают до тех пор, пока конечный раствор не станет гомогенным; измеряют значение pH, которое должно находиться в интервале от 3,5 до 4.

Продукт термостатируют при 35±2°C в течение 20-24 час, затем избыток мочевины убирают; после очистки измеряют значение pH полученного продукта, которое составляет от 5,5 до 7,5.

Затем продуктом заполняют шприцы и стерилизуют с помощью автоклава.

Пример 2: Сшивание цистамином

Для получения гидрогеля порошок HA-цистеамина с MW, по меньшей мере, приблизительно 700 кДа растворяют в водной среде. Немодифицированный HA с MW, по меньшей мере, 1000 кДа и необязательно местный анестетик, такой как лидокаин-HCl, добавляют к этому раствору. Сшивание HA-цистеамина через образование дисульфидных связей происходит в мягких окислительных условиях (pH 7,4, присутствие O₂,) и при комнатной температуре, что приводит к гидрогелю, приемлемому для филлера мягких тканей. Никакой дополнительной очистки геля (например, путем диализа) не требуется. Гидрогелями заполняют шприцы и стерилизуют с помощью автоклава.

Получение TH-260417-1, TH-270217-2, TH-220317-2 и TH-070217-2

Для получения стерильной гидрогелевой композиции TH-260417-1 3580 мг HA-цистеамина (MW 730 кДа), 600 мг лидокаина-HCl и 1160 мг NaCl растворяют в 185 г воды для инъекций при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 3 час. Затем к раствору добавляют 1000 мг гиалуроната натрия (MW 2400 кДа) при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно еще 3 час. Затем фосфатный буфер (рН 11) добавляют до конечного количества 200 г рецептуры. Раствор гомогенизируют приблизительно 15 мин. После выдерживания в течение ночи при комнатной температуре теперь сшитым гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильный гидрогель имеет pH приблизительно 7,7 и осмоляльность в интервале 270-330 мОсмол/кг.

TH-270217-2 и TH-070217-2 производят таким же способом, но при меньшем размере партии (50 г). Стерильную гидрогелевую композицию TH-220317-2 производят таким же способом, как и стерильные гидрогелевые композиции TH-270217-2 и TH-070217-2, но с исходным материалом HA-цистеамин с MW приблизительно 900 кДа.

Получение TH-260417-2

Для получения стерильной гидрогелевой композиции TH-260417-2 3580 мг HA-цистеамина (MW 730 кДа), 600 мг лидокаина-HCl и 1160 мг NaCl растворяют в 185 г воды для инъекций при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 3 час. Затем к раствору добавляют 1000 мг гиалуроната натрия (MW 1300 кДа) при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно еще 3 час. Затем фосфатный буфер (рН 11) добавляют до конечного количества 200 г рецептуры. Раствор гомогенизируют приблизительно 15 мин. После выдерживания в течение ночи при комнатной температуре теперь сшитым гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильный гидрогель имеет pH приблизительно 7,7 и осмоляльность в интервале 270-330 мОсмол/кг.

Получение TH-260917_200

Для получения стерильной гидрогелевой композиции TH-260917_200 3580 мг натриевой соли HA-цистеамина (MW 730 кДа, степень модификации 151 мкмоль/г полимера), 600 мг лидокаина-HCl и 1160 мг NaCl растворяют в 185 г воды для инъекций при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 3 час. Затем к раствору добавляют 1000 мг гиалуроната натрия (MW 2400 кДа) при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно еще 3 час. Затем фосфатный буфер (рН 11) добавляют до конечного количества 200 г рецептуры. Раствор гомогенизируют приблизительно 15 мин. После выдерживания в течение ночи при комнатной температуре теперь высоковязкий гель продавливают через фильтровальную пластину с размером ячеек 200 мкм. Затем гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием (121°C/15 мин). Стерильный гидрогель имеет pH приблизительно 7,5 и осмоляльность в интервале 270-330 мОсмол/кг.

Получение TH-250417-1

Для получения стерильной гидрогелевой композиции TH-250417-1 2685 мг HA-цистеамина (MW 730 кДа), 450 мг лидокаина-HCl и 870 мг NaCl растворяют в 85,5 г фосфатного буфера (рН 3) при механическом перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Значение рН раствора, содержащего HA-цистеамин, затем доводят до pH 7,6 путем добавления щелочного фосфатного буфера, получают раствор, содержащий 2,7% (масс./масс.) HA-цистеамина. После гомогенизации в течение 10 мин раствор выдерживают в течение ночи без перемешивания при комнатной температуре. Затем сшитый гель продавливают через фильтровальную пластину с размером ячеек 200 мкм. Готовят раствор, содержащий 1,5% (масс./масс.) гиалуроната натрия с MW 2400 кДа в 10 мМ фосфатном буфере (рН 6,7). Затем добавляют 1 часть раствора, содержащего 1,5% (масс./масс.) гиалуроната натрия с MW 2400 кДа в 10 мМ фосфатном буфере (рН 6,7), к двум частям профильтрованного и сшитого гидрогеля. После механического перемешивания в течение 10 мин готовым продуктом заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильные гидрогели имеют рН приблизительно 7,4 и осмоляльность в интервале 270-330 мОсмол/кг.

Получение TH-250417-2

Для получения стерильной гидрогелевой композиции TH-250417-2 2685 мг HA-цистеамина (MW 730 кДа), 450 мг лидокаина-HCl и 870 мг NaCl растворяют в 103,5 г фосфатного буфера (рН 3) при механическом перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Значение рН раствора, содержащего HA-цистеамин, затем доводят до pH 7,6 путем добавления щелочного фосфатного буфера, получают раствор, содержащий 2,2% (масс./масс.) HA-цистеамина. После гомогенизации в течение 10 мин раствор выдерживают в течение ночи без перемешивания при комнатной температуре. Затем сшитый гель продавливают через фильтровальную пластину с размером ячеек 200 мкм. Готовят раствор, содержащий 2,5% (масс./масс.) гиалуроната натрия с MW 1300 кДа в 10 мМ фосфатном буфере (рН 6,7). Затем добавляют 1 часть раствора, содержащего 2,5% (масс./масс.) гиалуроната натрия с MW 1300 кДа в 10 мМ фосфатном буфере (рН 6,7) к трем частям профильтрованного и сшитого гидрогеля. После механического перемешивания в течение 10 мин готовым продуктом заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильные гидрогели имеют рН приблизительно 7,6 и осмоляльность в интервале 270-330 мОсмол/кг.

Получение THM-040717-1-53

Для получения стерильной гидрогелевой композиции THM-040717-1-53 750 мг натриевой соли HA-цистеамина (MW 730 кДа, степень модификации 151 мкмоль/г полимера), 450 мг гиалуроната натрия (MW 2400 кДа), 450 мг лидокаина-HCl и 795 мг NaCl растворяют в 132 г 0,01M HCl при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 21 час. Затем добавляют фосфатный буфер (рН 12,5) до конечного количества 150 г рецептуры. Раствор гомогенизируют приблизительно 15 мин. После выдерживания в течение ночи при комнатной температуре теперь высоковязким гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильный гидрогель имеет pH 7,3 и осмоляльность 267 мОсмол/кг.

Пример 3: Измерение MW экстрагируемого HA в стерильных гидрогелевых композициях, содержащих сшитый дисульфидом HA

Приготовление образца (восстановительная экстракция)

После стерилизации гидрогелей, содержащих сшитый дисульфидом HA и свободный HA, к гидрогелям добавляют восстанавливающий агент для количественного разрушения дисульфидных связей. MW распределение модифицированного HA в его восстановленной (несшитой) форме и свободного HA затем определяют одновременно. Приблизительно 900 мг гидрогеля разбавляют 1500 мг воды для инъекций, после чего следует добавление восстанавливающего агента (2500 мг TCEP^.HCl (гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина), 2,5 мг/мл воды для инъекций), чтобы расщепить дисульфидные мостики. После времени восстановления 3 час 400 мг реакционного раствора подкисляют 50 мкл 5 н. HCl. Свободный HA и модифицированный гиалуронан осаждают этанолом. Осадок выделяют центрифугированием, после чего следует солюбилизация в 4 мл водного раствора, содержащего блокирующий агент для свободных тиольных фрагментов (2-(2-амино-этилдисульфанил)пиридин-3-карбоновая кислота) в концентрации 2 мг/мл. После 3-х часового выдерживания при комнатной температуре образец дополнительно разбавляют PBS.

Определение молекулярной массы

Для анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размерам (SEC) образцы растворов разбавляют элюентом SEC, получая конечную концентрацию HA 0,1 мг/мл. Для измерений используют мультидетекторную систему эксклюзионной хроматографии (SEC) Viscotek TDAmax с контролем температуры, включающую расположенные последовательно высокоселективные детекторы - детектор с фотодиодной матрицей (Photodiode Array UV), детектор по светорассеянию (Light Scattering) (как RALS, так и LALS), рефрактометрический детектор, и вискозиметр. Рефрактометрический детектор регистрирует концентрацию образца, что в результате дает соответствующую кривую распределения. В комбинации с детекторами по светорассеянию определяют молекулярную массу (MW).

Результаты

Установлено, что низкомолекулярная фракция (MW <200 кДа) HA в стерильных гидрогелевых композициях, полученных в соответствии с примером 2, находится в интервале от 8 до 15% после хранения образцов при комнатной температуре в течение указанного количества дней (Таблица 1).

Таблица 1: Данные по молекулярной массе (MW) для различных гидрогелей в соответствии с изобретением

Испытуемый материал	MW HA [кДа]	Фракция НА MW <200 кДа [%]	Дата измерения	Дни с момента производства
TH-270217-2	566	15	10.03.2017	11
TH-070217-2	581	13	10.03.2017	31
TH-220317-2	757	8	24.03.2017	2
TH-250417-1	670	9	06.05.2017	11
TH-250417-2	710	9	06.05.2017	11
TH-260417-1	790	8	06.05.2017	10
TH-260417-2	700	8	06.05.2017	10
TH-260917_200	632	13	16.10.2017	20
THM-040717-1-53	н.о.	13	27.02.2018	238

Пример 4 (Сравнительный): Снижение молекулярной массы гиалуроновой кислоты при условиях реакции, которые необходимы для сшивания с помощью TMP (триметафосфат), как описано в документе WO 2016/005785 A1

Стадия гидратации

Гиалуронат натрия (HA) с начальной молекулярной массой 2,4 МДа гидратируют в 0,01M NaOH при конечной концентрации 90 мг/мл в течение 2,5 час с механической гомогенизацией (pH 11).

Стадия моделируемого сшивания

Один образец смеси, полученной на стадии гидратирования, выдерживают 48 час при 70°C. Деградацию главной цепочки гиалуронана останавливают путем нейтрализации с использованием фосфатного буфера (рН 7,0).

Определение молекулярной массы

Определяют молекулярную массу гиалуроната натрия, используемого в качестве исходного материала, гиалуроната натрия после стадии гидратации и всех трех образцов, полученных при имитации стадии сшивания.

Для анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размерам (SEC) образцы растворов разбавляют элюентом SEC, получая конечную концентрацию HA 0,1 мг/мл. Для измерений используют мультидетекторную систему эксклюзионной хроматографии (SEC) Viscotek TDAmax с контролем температуры, включающую расположенные последовательно высокоселективные детекторы - детектор с фотодиодной матрицей (Photodiode Array UV), детектор по светорассеянию (Light Scattering) (как RALS, так и LALS), рефрактометрический детектор, и вискозиметр. Рефрактометрический детектор регистрирует концентрацию образца, что в результате дает соответствующую кривую распределения. В комбинации с детекторами по светорассеянию определяют молекулярную массу (MW).

Результаты

Установлено, что воздействие высоких температур и высоких значений pH увеличивает низкомолекулярную фракцию HA. Через 48 час при pH 11 и при 70°C низкомолекулярная фракция составляет 30%. Следует ожидать, что низкомолекулярная фракция будет расти и дальше при проведении стадии стерилизации, которая необходима для производства конечных рецептур филлера для мягких тканей.

Таблица 2: Результаты анализа молекулярной массы

Испытуемый материал	MW HA, [кДа]	Фракция НА с MW <200 кДа, [%]
Исходный материал HA	2414	0
HA, выдержанный в течение 48 час при pH 11 и при 70°C	349	30

Пример 5: Время удерживания in vivo стерильных гидрогелевых композиций, содержащих сшитый дисульфидом HA

Динамику разложения стерильных гидрогелевых композиций TH-250417-1 и TH-260417-1 (см. пример 2 и 3) определяют на протяжении периода 2 месяца после внутрикожной инъекции в спину самок крыс Sprague Dawley суммарно с 12 применениями на рецептуру. Объем нанесенных депо филлера контролируют с помощью сканов МРТ. Рассчитывают средние объемы депо относительно объемов депо на начальной точке. Через 108 дней после имплантации средний относительный объем депо равен 115% для TH-260417-1 и 106% для TH-250417-1, указывая на высокую устойчивость относительно разложения обеих стерильных гидрогелевых композиций, содержащих сшитый дисульфидом HA.

Пример 6: Сравнение между MW распределением HA в композициях, содержащих сшитый дисульфидом HA и BDDE-сшитый HA современного уровня техники

Исследуемая композиция, содержащая сшитый дисульфидом HA (сшитый цистамином HA)

Тиол-модифицированный гиалуронан со степенью модификации 147 мкмоль тиольных групп на г полимера (MW 730 кДа) используют для производства композиции, содержащей 17,9 мг/мл натриевой соли сшитого HA-цистеамина, 3 мг/мл лидокаина-HCl и 5 мг/мл немодифицированного гиалуроната натрия (MW 1,94 МДа). Для регулирования pH и осмоляльности до физиологически приемлемых значений гидрогель также содержит 10 мМ фосфатный буфер и 95 мМ NaCl. Вкратце, натриевую соль HA-цистеамина, гиалуронат натрия, лидокаин-HCl и хлорид натрия растворяют в 0,01M HCl посредством перемешивания при комнатной температуре в течение 8 час. Сшивание инициируют путем добавления 1 части 100 мМ фосфатного буфера (рН 12,1) к 9 частям раствора для доведения рН до 7,4, после чего следует добавление разбавленного раствора пероксида водорода, так чтобы мольное отношение свободных тиольных групп тиол-модифицированного гиалуронана к пероксиду водорода составляло 2:1. После 48 час сшивания при комнатной температуре гидрогель фильтруют, заполняют им стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Средняя восстановленная после стерилизации молекулярная масса (MRPMW) сшитого полимера в композиции равна 610 кДа. Стерильный гидрогель имеет pH 7,5 и осмоляльность 296 мОсмол/кг.

Исследуемая композиция, содержащая BDDE-сшитый HA

Получают стерильный гидрогель, содержащий BDDE-сшитый HA (MW 2,7 МДа) в концентрации 23 мг/мл. Гидрогель имеет pH 7 и осмоляльность 298 мОсмол/кг.

Приготовление образца для определения MW с помощью консервативной экстракции

Обе гидрогелевые композиции изучают следующим образом. Приблизительно 200 мг гидрогеля разбавляют 1800 мг PBS. После физической («консервативной») экстракции свободного HA в течение четырех часов, дисперсию центрифугируют, после чего выделяют надосадочную жидкость.

Для анализа с помощью эксклюзионной хроматографии по размерам (SEC) надосадочную жидкость разбавляют элюентом SEC, получая конечную концентрацию HA приблизительно 0,1 мг/мл. Для измерений используют мультидетекторную систему эксклюзионной хроматографии (SEC) Viscotek TDAmax с контролем температуры, включающую расположенные последовательно высокоселективные детекторы - детектор с фотодиодной матрицей (Photodiode Array UV), детектор по светорассеянию (Light Scattering) (как RALS, так и LALS), рефрактометрический детектор, и вискозиметр. Рефрактометрический детектор регистрирует концентрацию образца, что в результате дает соответствующую кривую распределения. В комбинации с детекторами по светорассеянию определяют молекулярную массу (MW).

Результаты

Таблица 3: Результаты анализа молекулярной массы

Гидрогелевая композиция	Концентрация всего HA (мг/мл)	MW экстрагированного HA (МДа)	Концентрация экстрагированного HA (мг/мл)	Фракция с MW <200 кДа на пик (%)	Фракция с MW <200 кДа всего HA (%)
Сшитый цистамином HA	22,9	0,84	5,2	<5	<1
BDDE-сшитый HA	23	0,89*	1,3	<5	23
		0,11*	6,2	85

* - бимодальное MW распределение

Концентрация экстрагированного HA (5,2 мг/мл) стерильного гидрогеля, содержащего сшитый дисульфидом HA, очень хорошо соответствует концентрации немодифицированного HA (5 мг/мл), который добавлен к композиции при приготовлении гидрогеля. Это указывает на то, что процесс сшивания является как весьма эффективным, так и мягким, поскольку отсутствует значительное количество модифицированного HA, оставшегося несшитым при получении гидрогеля или высвобожденного при деградации цепочек гиалуронана. Первые измерения (таблица 3) проводят в пределах одного месяца после производства гидрогеля. Повторные измерения на 8 месяцев позднее не указывают на увеличение концентрации экстрагированного HA или фракции с MW <200 кДа. Количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, составляет менее 1% масс. относительно общего количества гиалуронана (включая модифицированный и немодифицированный HA).

Напротив, суммарная концентрация экстрагированного HA составляет 7,5 мг/мл в гидрогеле, содержащем BDDE-сшитый HA, что означает, что приблизительно одна треть HA, используемого для производства гидрогеля, остается несшитой или высвобождена при деградации цепочек гиалуронана во время сшивания, стерилизации и хранения. Концентрация свободного HA, который активно добавляют при производстве продукта, производителем не конкретизирована. Количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, равно 23% масс. относительно общего количества гиалуронана.

Пример 7: Получение дигидрохлорида бис (глицил)цистамина

К смеси дигидрохлорида цистамина (1 г, 4,44 ммоль) и N-(трет-бутоксикарбонил)глицина (1,59 г, 9,10 ммоль) в сухой смеси дихлорметан:ТГФ=1:1 (20 мл) добавляют вначале триэтиламин (1270 мкл, 9,16 ммоль), после чего следует добавление раствора EDC_*HCl (1,75 г, 9,10 ммоль) в дихлорметане. Реакционный раствор перемешивают в течение 5 час при комнатной температуре, затем летучие вещества упаривают при пониженном давлении. Остаток забирают в этилацетат (250 мл) и промывают 1 н. HCl (2×50 мл), полунасыщенным раствором NaHCO₃ (50 мл) и водой (50 мл). Органический слой сушат над Na₂SO₄, летучие вещества упаривают при пониженном давлении, получают N-Boc-защищенный бис(глицил)-цистамин в виде бесцветного масла. Выход: 1,575 г (88%).

Спектр ¹H ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ м.д.: 6,97 (с, 1H, NH), 5,53 (с, 1H, NH), 3,81 (д, J=5,8 Гц, 2H, α-CH ₂ ), 3,58 (кв, J=6,3 Гц, 2H, -CH ₂ -NH-), 2,82 (т, 2H, -CH ₂ -S-), 1,45 (с, 9H, -CH ₃ t-Bu); m/z=467,1 [M+H]⁺, 489,1 [M+Na]⁺.

К раствору N-Boc-защищенного бис(глицил)цистамина (300 мг, 0,64 ммоль) в MeOH (5 мл) добавляют ацетилхлорид (300 мкл, 4,20 ммоль). После прекращения экзотермической реакции смесь перемешивают в закрытой колбе в течение 5 час при комнатной температуре, затем добавляют толуол (2 мл) и летучие вещества упаривают до осаждения продукта. Белое твердое вещество выделяют путем фильтрования с отсасыванием и промывают н-пентаном (2×5 мл). Выход: 146 мг (67%), т.пл. = 184°C (с разложением).

Спектр ¹H ЯМР (400 МГц, D₂O) δ м.д.: 3,81 (с, 2H, α-CH ₂ ), 3,59 (т, J=6,3 Гц, 2H, -CH ₂ -NH), 2,88 (т, 2H, -CH ₂ -S-); m/z=266,9 [M+H]⁺, 288,9 [M+Na]⁺.

Дигидрохлорид бис(глицил)цистамина представляет собой агент модификации, который позволяет получать натриевую соль гиалуронан-глицил-цистеамина (HA-GLYC). Этот модифицированный гиалуронан образует сшитый гиалуронан HA-L-HA, где линкер LH₂ формально берет начало из конъюгата аминокислоты, глицина, и цистамина (то есть, LH₂ формулы (IX), где R представляет собой H).

Пример 8: Получение и характеристики гидрогелевой композиции, содержащей сшитый гиалуронан-глицил-цистеамин

Получают гидрогелевую композицию, содержащую 17,9 мг/мл сшитой натриевой соли гиалуронан-глицил-цистеамина (HA-GLYC) и 5 мг/мл немодифицированного гиалуроната натрия. Вкратце, 537 мг HA-GLYC (масса в сухом состоянии, MMW 610 кДа, степень модификации 162 мкмоль/г полимера) и 150 мг гиалуроната натрия (масса в сухом состоянии, MMW 2,4 МДа) растворяют в 26 г 0,01M HCl (содержащей NaCl) при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 5 час. К 19,02 г этого раствора добавляют 2,115 мл 100 мМ фосфатного буфера (pH 11,85), что приводит к доведению рН до приблизительно 7,4. Затем добавляют 273 мкл 0,3%-ного раствора H₂O₂, смесь гомогенизируют 15 мин при комнатной температуре и затем оставляют на ночь для сшивания. Сшитым гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильный гидрогель имеет рН приблизительно 7,2.

Пример 9: Получение и характеристики гидрогелевой композиции, содержащей сшитый гиалуронан-гомоцистеин

Получают гидрогелевую композицию, содержащую 17,9 мг/мл сшитой натриевой соли гиалуронан-гомоцистеина (HA-HCYS) и 5 мг/мл немодифицированного гиалуроната натрия. Вкратце, 537 мг HA-HCYS (масса в сухом состоянии, MMW 610 кДа, степень модификации 136 мкмоль/г полимера) и 150 мг гиалуроната натрия (масса в сухом состоянии, MMW 2,4 МДа) растворяют в 26 г 0,01M HCl (содержащей NaCl) при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение приблизительно 5 час, после чего следует 1 час покоя для удаления пузырьков воздуха. К 23,68 г раствора добавляют 2,63 мл 100 мМ фосфатного буфера (pH 12,04), что приводит к доведению pH раствора до приблизительно 7,2. Смесь оставляют на 48 час при комнатной температуре для сшивания, затем сшитым гидрогелем заполняют стеклянные шприцы объемом 1 мл и стерилизуют автоклавированием. Стерильный гидрогель имеет рН приблизительно 7,0.

Claims (22)

1. Стерильная гидрогелевая композиция для использования в качестве филлера мягких тканей, содержащая сшитый гиалуронан, где количество экстрагируемого гиалуронана, имеющего молекулярную массу меньше чем 200 кДа, составляет меньше чем 15 мас.% относительно общего количества гиалуронана,

где сшитый гиалуронан имеет структуру в соответствии с формулой I:

HA-L-HA (I),

где каждая группа HA означает гиалуронан или его соль в соответствии с формулой II:

(II),

где n представляет собой целое число >1 и определяет число повторений повторяющегося звена формулы II, и

L представляет собой линкер, и этот линкер ковалентно связан с каждой группой HA путем замены одного OH-фрагмента в повторяющемся звене в соответствии с формулой II, и L получен от молекулы LH₂,

сшитый гиалуронан представляет собой продукт окисления тиол-модифицированного гиалуронана, где тиол-модифицированный гиалуронан модифицирован молекулой, имеющей тиоловую группу, образующую внутримолекулярные и межмолекулярные дисульфидные связи при окислении, и

сшитый гиалуронан содержится в количестве от 0,1 до 5 мас.% относительно массы композиции.

2. Композиция по п. 1, в которой экстрагируемый гиалуронан представляет собой гиалуронан, экстрагируемый из стерильной гидрогелевой композиции за счет использования восстановительной экстракции или консервативной экстракции.

3. Композиция по п. 1 или 2,

где L получен от молекулы LH₂, где молекула LH₂ представляет собой молекулу, встречающуюся естественным образом в организме людей, или конъюгат молекул, встречающихся естественным образом в организме людей.

4. Композиция по п. 3, в которой линкер L представляет собой негенотоксичный и нецитотоксичный фрагмент эндогенной молекулы.

5. Композиция по одному из пп. 1-3, в которой молекула LH₂ представляет собой дисульфидный димер молекулы, выбранной из группы, включающей глутатион, цистеамин, цистеин, гомоцистеин, бета-цистеин, пептид-содержащий цистеин, конъюгат цистеамина и аминокислоты.

6. Композиция по одному из пп. 1-4, дополнительно содержащая по меньшей мере одно анестезирующее средство местного действия.

7. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что анестезирующее средство местного действия выбрано из группы, включающей лидокаин, артикаин, прилокаин, хлоропрокаин, артикаин и их комбинации.

8. Композиция по одному из пп. 1-7, дополнительно содержащая нетоксичный стабилизатор.

9. Композиция по одному из пп. 1-8, дополнительно содержащая по меньшей мере один ингибитор деградации гиалуроновой кислоты.

10. Композиция по п. 9, в которой указанный ингибитор выбран из группы, включающей 1,2,3,4,6-пента-O-галлоилглюкозу, апигенин, бета-эсцин, кальтрин, цис-хинокиресинол (CHR), эхинацин, эйкозатриеновую кислоту (C20:3), фенопрофен, ауротиомалат натрия, госсипол, гепарин, гесперидин-фосфат, индометацин, L-аскорбиновую кислоту, L-карнитин, L-амино-карнитин, миокристин (натрий ауротиомалат), N-тозил-L-фенил-аланинхлорметилкетон (TPCK) и N-альфа-п-тозил-L-лизинхлорметил-кетон (TLCK), фосфорилированный гесперидин, поли(натрий-4-стиролсульфонат) (T-PSS), полиэстрадиол-фосфат, полифлоретин-фосфат, PS53 (полимер гидрохинон/сульфоновая кислота/формальдегид), полистиролсульфонат натрия (N-PSS), сульфатированный 2-гидроксифенилмонолактобиозид, сульфатированный дигалактозид гидрохинона, сульфатированную вербаскозу, олигосахариды плантеозы и неомицина, тетрадецилсульфат натрия (TDSS), ненасыщенную жирную кислоту от C14:1 до C24:1 с одной двойной связью, ингибитор мочевого трипсина (UTI), уролитин B, WSG или глицирретиновую кислоту, или их комбинации.

11. Композиция по любому из пп. 1-10, дополнительно содержащая немодифицированный полимер, выбранный из группы биосовместимых полисахаридов, предпочтительно немодифицированный гиалуронан.

12. Композиция по п. 11, дополнительно содержащая вязкий и гидрофильный биосовместимый многоатомный спирт, предпочтительно глицерин.

13. Способ заполнения мягких тканей, где способ включает введение композиции по любому из пп. 1-11 в определенный участок мягких тканей.