BR112020024637A2

BR112020024637A2 - ácido hialurônico estabilizado

Info

Publication number: BR112020024637A2
Application number: BR112020024637-9A
Authority: BR
Inventors: Robert Sachsenhofer
Original assignee: Croma-Pharma Gmbh
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-03-02
Also published as: EP3806918A1; KR20210021363A; KR20210021362A; CA3101412A1; EP3806919A1; US20210259943A1; WO2019238955A1; JP7374133B2; CA3101410A1; BR112020024735B1; CN112334167A; JP2021526933A; MA52877A; BR112020024735A2; MX2020013000A; EP3806919B1; CN116650519A; IL279445A; CN112334165A; BR112020024637B1

Abstract

A presente invenção refere-se a composição de hidrogel estéril compreendendo hialuronano, em que a quantidade de hialuronano extraível que possui um peso molecular menor do que 200 kDa é menor do que 15% em peso em relação ao peso total do hialuronano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDO HIALURÔNICO ESTABILIZADO".

[001] A presente invenção refere-se a uma composição de hidro- gel estéril que compreende um hialuronano reticulado e a composição para uso no preenchimento de tecidos moles

ESTADO DA TÉCNICA

[002] O hialuronano, abreviado HA, também chamado de ácido hialurônico é um polissacarídeo que ocorre naturalmente com uma unidade de repetição de dissacarídeo composta por ácido D- glicurônico e N-acetil-D-glicosamina. As expressões hialuronano ou ácido hialurônico são frequentemente usados como sinônimas para seus sais, por exemplo, hialuronato de sódio.

[003] O hialuronano de alto peso molecular está naturalmente presente na pele e é conhecido por suas propriedades viscoelásticas e também por sua alta propensão para absorver água. Suas proprieda- des contribuem em grande extensão para a elasticidade da pele. Da- das as suas propriedades e qualidades de biocompatibilidade, tolerân- cia e ausência de toxicidade, este composto tem sido aproveitado há mais de 10 anos em muitas aplicações nos campos médico e cosméti- co, em particular em procedimentos estéticos. Por exemplo, o hialuro- nano é usado para preencher rugas por meio de injeção direta na derme na área em consideração (uso como preenchimento dérmico).

[004] O hialuronano não modificado altamente purificado de ori- gem biofermentativa é perfeitamente biocompatível e idêntico ao ácido hialurônico endógeno. No entanto, o hialuronano, apesar de ter a van- tagem de ser altamente compatível com os tecidos do corpo humano, ter grande afinidade com a água e exercer uma acentuada função hi- dratante, não apresenta propriedades biomecânicas adequadas. Quando o hialuronano é injetado nos tecidos da pele, ocorre uma rápi- da degradação in vivo pelas hialuronidases (degradação enzimática) e pelos radicais livres (degradação química) presentes nos tecidos do corpo humano.

[005] Inúmeras soluções têm sido propostas para retardar a de- gradação in vivo do hialuronano e modificar suas propriedades quími- cas, físicas e biológicas, além de fornecer maior resistência das formu- lações à degradação durante o armazenamento, ao calor e, portanto, à esterilização.

[006] Estas abordagens envolvem tipicamente a modificação química do hialuronano incluindo, por exemplo, a reticulação do hialu- ronano por meios químicos, enzimáticos ou fotoquímicos. Estes géis de hialuronano reticulados podem ser obtidos por vários processos de preparação. Geralmente, esses processos requerem duas etapas prin- cipais, a primeira consistindo em hidratar o hialuronano a fim de con- vertê-lo em uma solução aquosa e a segunda destinada a reticular as moléculas de hialuronano da dita solução aquosa na presença de um agente capaz de induzir a reticulação das mesmas (também referido como "agente de reticulação"). Exemplos de agentes de reticulação incluem formaldeído, divinil sulfona, biscarbodi-imidas e epóxidos. Ou- tras soluções incluem a modificação do hialuronano com um grupo grande tal como um polipeptídeo para induzir o acoplamento celular ou automontagem em um hidrogel.

[007] Para a produção de preenchimentos dérmicos, o agente de reticulação é mais comumente escolhido a partir de epóxidos, tais co- mo éter diglicidílico de butanodiol (BDDE) ou 1,2,7,8-diepoxioctano (DEO), aldeídos ou polivinilsulfonas, como divinil sulfona (DVS) e, por- tanto, é de natureza sintética.

[008] Infelizmente, as modificações químicas do hialuronano le- vam a efeitos colaterais e reações de corpo estranho não observadas com o hialuronano não modificado, que tem imunogenicidade natural- mente baixa e falta de toxicidade. Na maioria dos preenchimentos de tecidos moles de hialuronano comercializados, o BDDE é usado como agente de reticulação. Devido à natureza reativa dos grupos de epóxi- do presentes em BDDE, o BDDE não reagido que permanece no pre- enchimento do tecido mole pode ter efeitos genotóxicos. Assim, BDDE em preenchimentos dérmicos deve ser mantido em quantidades resi- duais (< 2 partes por milhão), de modo que uma purificação adicional e procedimentos de teste caros sejam necessários durante a produção. Embora o perfil de segurança de preenchimentos reticulados de BDDE seja apoiado pela experiência clínica de longo prazo ((De Boulle, Glo- gau et al., 2013, A review of the metabolism of 1,4-butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid soft tissue fillers, Dermatol Surg (39): 1758-1766), BDDE may still raise some safety concerns (Choi, Yoo et al., 2015, Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents, J Biomed Mater Res Part A (103A): 3072-3080).

[009] Devido aos riscos genotóxicos associados ao BDDE, a do- se anual de produtos para preenchimento dérmico comercialmente disponíveis, tal como JuvedermO, que podem ser aplicados durante a vida de um paciente, é limitada a 20 ml por ano. A administração do produto de preenchimento dérmico RestylaneG, disponível no merca- do, é limitada a um volume de 6 ml por aplicação. Limitações similares se aplicam a preenchimentos de tecidos moles que compreendem o ácido hialurônico reticulado DVS.

[0010] Outro problema com as modificações químicas é a neces- sidade de condições de reação adversas, como valores de pH alcali- nos e altas temperaturas (acima de 50ºC) às quais o hialuronano deve ser submetido durante a reação de reticulação a fim de atingir o grau desejado de reticulação. É sabido que o peso molecular do hialurona- no diminui devido à degradação hidrolítica durante a exposição a pH ácido (pH abaixo de 4) ou alcalino (pH acima de 10). Além disso, o hia-

luronano é degradado em temperaturas mais altas acima de 40ºC (Troncoso et al., 2016, A kinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide, student thesis, acesso online via http://uu.diva- portal.org/smash/get/diva2:95437 2/FULLTEXTO1.pdf;, Stern et al,

2007. The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25): 537-557; Tokita and Okamoto, 1996, Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32): 1011- 1014). É sabido ainda que os fragmentos de hialuronano de baixo pe- so molecular com um peso molecular inferior a cerca de 200 kDa têm efeitos pró-inflamatórios (Naor, 2016, Editorial: Interaction Between Hyaluronic Acid and lts Receptors (CD44, RHAMM) Regula a atividade da inflamação e Cancer, Frontiers in immunology 7:39; Monslow et al., 2015, Hyaluronan-a functional and structural sweet spot in the tissue microenviroment, Frontiers in immunology 6: 231).

[0011] Embora WO 2014/064632 descreva preenchimentos de te- cidos moles com hialuronano estabilizado usando moléculas ligantes endógenas, o processo de reticulação requer produtos químicos não endógenos para ativar o hialuronano (descrito como reticulação pseu- donatural no pedido). Embora as poliaminas sejam moléculas endóge- nas encontradas em concentrações relativamente altas em todos os seres vivos, foi verificado que esses agentes exibem um grau surpre- endente de toxicidade quando presentes em excesso (veja Hoet & Nemery, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.; 278, L417-L433 (2000)).

[0012] WO 2013/086024 descreve preenchimentos de tecidos mo- les que compreendem hialuronano reticulado com reticuladores de di- amina (como hexametilenodiamina) e reticuladores de multiamina (tais como 3-[3-(3-amino-propoxi)-2,2-bis(3-amino-propoximetil)-propoxi]- propilamina). O uso de moléculas de ligação endógenas não é menci-

onado na descrição. A reticulação é descrita para ser realizada de pre- ferência sob condições moderadas de pH 4 a pH 7 e em temperaturas que variam entre 20ºC a 37ºC. Entretanto, nos exemplos a preparação leva vários dias e como o material de partida é o hialuronano de baixo peso molecular (por exemplo, polímeros com um peso molecular de cerca de, por exemplo, 100 kDa ou um peso molecular médio de, por exemplo, 310 kDa). Assim, a formação de fragmentos de HA de baixo peso molecular não é evitada. O foco de WO 2013/086024 foi sobre a otimização do comportamento reológico do produto de preenchimento e não sobre o aumento da biocompatibilidade.

[0013] WO 2014/181147A1 e WO 2016/005785A1 descrevem pre- enchimentos dérmicos com HA estabilizado usando um sal de trimeta- fosfato para reticulação, o que resulta em moléculas de HA reticuladas por um grupo difosfato endógeno. No entanto, durante o processo de reticulação, o ácido hialurônico é exposto a um pH alcalino pronuncia- do (pH 11) em uma temperatura elevada de 50ºC por 3 horas e mes- mo até 70ºC por 72 horas. Sob essas condições adversas, a formação de fragmentos de HA de baixo peso molecular é inevitável (Troncoso et al., 2016, A kinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide, student thesis, acesso online via http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXTO1 .pdf; Stern et al., 2007. The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25): 537-557; Tokita and Okamoto, 1996, Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32): 1011-1014). Quando esses fragmentos de HA de baixo peso mo- lecular são liberados do depósito de gel durante a biodegradação na pele humana, eles podem causar reações inflamatórias.

[0014] Consequentemente, ainda existe a necessidade de fornecer composições que compreendam hialuronano estabilizado, por exem- plo, utilizáveis como preenchimentos de tecidos moles que têm uma alta biocompatibilidade com tecidos moles, mas são mais resistentes à degradação do que o hialuronano nativo.

[0015] Portanto, um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição com alta biocompatibilidade e alta resistência à degrada- ção.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0016] A presente invenção fornece uma composição de hidrogel estéril que compreende hialuronano reticulado, em que a quantidade de hialuronano extraível com um peso molecular inferior a 200 kDa é inferior a 15% em peso em relação à quantidade total de hialuronano.

[0017] A composição estéril é um hidrogel que pode ser implanta- do ou injetado como um preenchimento de tecido mole. O baixo con- teúdo de hialuronano de baixo peso molecular garante uma boa bio- compatibilidade e a reticulação proíbe uma degradação rápida in vivo do hialuronano.

[0018] Em uma modalidade preferida, o hialuronano reticulado tem uma estrutura de acordo com a fórmula |: HA-L-HA (1), em que cada HA diz respeito ao hialuronano ou seu sal de sódio de acordo com a fórmula |!

O a

OH N . Pao o Oo OH oH (1) em que n é um inteiro > 1 e determina o número de repetições da uni- dade de repetição da fórmula Il, eL é um ligante, cujo ligante é covalentemente ligado a ca- da HA substituindo uma porção de OH na unidade de repetição de acordo com a fórmula |l, e em que L é derivado de uma molécula LH2, em que a molé- cula LH? é uma molécula que ocorre naturalmente em humanos ou um conjugado de moléculas que ocorre naturalmente em humanos.

[0019] O hialuronano reticulado compreende uma subestrutura de acordo com a fórmula Ill OH NHAc “oro 7 T TE -- o Ho

L o Ho. o o 2º Ho. o 222 OH NHAc o (II) em que L é derivado de um molécula LH2 em que a molécula LH2 é uma molécula que ocorre naturalmente em humanos ou um conjugado de moléculas que ocorrem naturalmente em humanos. Consequente- mente, o ligante L está covalentemente ligado ao grupo de ácido car- boxílico do ácido glicurônico na unidade de repetição de HA.

[0020] Deve ficar entendido que o hialuronano reticulado é um po- límero complexo e as fórmulas | a Ill devem ser compreendidas como esquemáticas. Qualquer hialuronano (HA) no hialuronano reticulado pode ter várias modificações pelo acoplamento do ligante L, isto é, a fórmula | não limita que qualquer cadeia de HA possa incluir apenas um ligante. O hialuronano reticulado pode compreender mais do que duas cadeias de HA. Cada cadeia de HA compreendendo múltiplas unidades de repetição pode conter uma unidade modificada a ser liga- da com um segundo HA ou várias unidades modificadas em sítios ale- atórios da cadeia de HA que se ligam à mesma segunda cadeia ou a outras cadeias de HA.

[0021] Em uma modalidade preferida, 0,5 a 10 moles% das unida- des de repetição no hialuronano reticulado contribuem para a reticula- ção, por exemplo, formam uma ligação covalente com um ligante L. Em outras palavras, o grau de unidades reticuladas pode ser 0,5 a 10 moles%.

[0022] Em uma modalidade preferida, o hialuronano reticulado é um produto de reação de um hialuronano modificado, em que o hialu- ronano modificado é modificado com uma molécula endógena que for- nece um grupo reativo para reticulação, tal como grupos tiol. Nesta modalidade, o grau de modificação do hialuronano modificado está de preferência na faixa entre cerca de 3 moles% a cerca de 10 moles%. Um limite superior para o grau de modificação de 10 moles% permite a manutenção das características positivas do hialuronano (tais como biocompatibilidade, comportamento de expansão). Um limite inferior para o grau de modificação de cerca de 3 moles% é considerado ne- cessário para a formação de géis estabilizados e altamente viscosos. Consequentemente, o grau de unidades reticuladas no hialuronano reticulado é de preferência de 3 a 10 moles%.

[0023] O ligante L é derivado de uma molécula LH2 que ocorre na- turalmente em humanos ou uma molécula LH2 que é um conjugado de moléculas que ocorrem naturalmente em humanos. Assim, o ligante L é obtido formalmente pela subtração de dois átomos de hidrogênio da molécula natural. Falando quimicamente, a molécula LH2 reage com o HA, por exemplo, por uma substituição nucleofílica. Uma molécula que ocorre naturalmente em humanos também pode ser referida como uma molécula endógena. Em uma modalidade preferida, L é um frag- mento não genotóxico e não citotóxico de uma molécula endógena.

[0024] Em uma modalidade, a molécula LH2 é um aminoácido, um peptídeo, um hormônio, um segundo mensageiro, uma molécula de sinalização ou um conjugado dos mesmos. A molécula endógena LH>2 pode compreender dois grupos amino e a estrutura HA-L-HA é estabe- lecida de acordo com a fórmula Ill, em que os grupos amino formam ligações amida com o grupo carboxílico da unidade de repetição de HA.

[0025] Em uma modalidade, o ligante L compreende um fragmento da molécula ou é derivado da molécula de LH2 sendo glutationa, ciste- amina, cisteina, homocisteína, beta-cisteina, um peptídeo que com- preende cisteína, um conjugado de cisteamina e um aminoácido ou seu dímero de dissulfeto (incluindo seus dímeros de dissulfeto mistos). O hialuronano reticulado derivado dessas moléculas que ocorrem na- turalmente em humanos se enquadra preferivelmente na fórmula Ill, e as ligações amida são formadas com o grupo carboxílico da unidade de repetição de HA. Alternativamente, os derivados de glutationa e de cisteina também podem formar uma ligação por meio de uma ligação éster com qualquer grupo álcool. Estes ligantes que contêm um grupo tiol são especialmente úteis para a modalidade, em que o hialuronano reticulado é o produto da reação de um derivado de hialuronano modi- ficado com uma molécula, preferivelmente uma molécula endógena, que possui um grupo reativo para reticulação. Os grupos tiol são gru- pos reativos que podem formar ligações de dissulfeto intramoleculares e intermoleculares após a oxidação. Assim, nesta modalidade, o hialu- ronano reticulado é um produto de oxidação de um hialuronano modifi- cado com tiol.

[0026] Em outra modalidade, a molécula endógena LH, é a ureia.

[0027] A composição é ainda caracterizada pelo fato de que a dis- tribuição do peso molecular (MW) do hialuronano mostra uma quanti- dade de hialuronano extraível com um peso molecular menor que 200 kDa é menor que 15% em peso em relação à quantidade total de hia- luronano.

[0028] É entendido que o peso molecular do hialuronano deve ser determinado no estado não reticulado. De fato, as composições de hi- drogel que compreendem o hialuronano reticulado incluem tipicamente uma quantidade de hialuronano livre, isto é, não reticulado. Em muitos géis de hidrogel, hialuronano livre é adicionado ativamente como parte da composição. Por outro lado, o hialuronano livre pode permanecer não reticulado durante a preparação do hidrogel ou pode ser liberado após a degradação das cadeias de hialuronano durante o processa- mento para obter um hidrogel estéril.

[0029] Diferentes abordagens podem ser aplicadas para verificar a distribuição do peso molecular do hialuronano extraível em uma com- posição que compreende hialuronano reticulado. Em uma modalidade preferida, o hialuronano extraível é determinável pela extração reduto- ra ou pela extração conservadora.

[0030] Com a extração redutora, a composição a ser investigada é analisada pela extração do hialuronano livre após a reversão da liga- ção, ou seja, pela redução de, por exemplo, hialuronano reticulado por dissulfeto (exemplo 3). Este método inclui a clivagem do ligante, resul- tando em uma transformação da rede de hialuronano em uma solução viscosa de hialuronano. Embora este método seja prontamente aplicá- vel com hidrogéis, em que a reticulação ocorre após a oxidação, este método pode não ser aplicado com alguns agentes de reticulação, isto é, hialuronano reticulado com BDDE. As condições de reação para a transformação (ou seja, condições redutoras) podem levar a um acú- mulo adicional de HA com baixo peso molecular. Consequentemente, a quantidade de hialuronano livre com um peso molecular inferior a 200 kDa tipicamente é maior com este método.

[0031] Com a extração conservadora, o hialuronano livre pode ser investigado sem manipular a rede de hialuronano reticulada (exemplo 6). Esta abordagem é aplicável independentemente do agente de reti- culação. O hidrogel é incubado com um sistema de solvente e agitado.

Assim, o hialuronano livre vaza para a fase líquida, enquanto que o HA reticulado permanece na fase de gel. A fase do sobrenadante líquido é separada e analisada quanto à distribuição do peso molecular.

[0032] Em alguns casos, pode ser possível, alternativamente, in- vestigar a distribuição do peso molecular do hialuronano em uma composição comparativa preparada em analogia à composição a ser investigada sem reticulação (veja o exemplo 3). No entanto, esta abor- dagem requer um conhecimento detalhado do processo de produção do hidrogel.

[0033] O peso molecular (MW) indicado para o hialuronano nor- malmente representa uma média de todas as moléculas na população. Na literatura, o MW é geralmente expresso como o peso molecular ponderado médio. No entanto, é possível investigar a distribuição de MW de uma amostra de hialuronano, por exemplo, o hialuronano livre extraído conforme descrito acima, e determinar, por exemplo, a quan- tidade real ou fração do hialuronano com MW < 200 kDa.

[0034] A distribuição de MW pode ser investigada pela análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), conforme exemplificado abaixo. Aquele versado na técnica reconhecerá que outras aborda- gens podem chegar a valores comparáveis para a distribuição do peso molecular. Por exemplo, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada para separar diferentes frações de MW de hialuronano em um gel de agarose usando uma câmara de gel horizontal e uma escada de peso molecular de HA como marcador, em que os géis corados são então analisados por densitometria, por exemplo, usando o pacote de programas Image J (http://.imagej.net/Welcome) seguido pelo cálculo da massa molecular de acordo com Cowman et al (Analytical Bioche- mistry 417, 2011, pp 50-56). Subsequentemente, a quantidade de hia- luronano com um MW < 200 kDa pode ser determinada. Na composi- ção de hidrogel de acordo com a invenção, esta quantidade é no má-

ximo 15% em peso em relação à quantidade total de hialuronano na composição. A quantidade de referência, isto é, a quantidade total de hialuronano, compreende todo o hialuronano na composição, incluindo hialuronano reticulado e livre de qualquer peso molecular. Tipicamen- te, esta quantidade é indicada pela concentração de hialuronano(s) na composição ou pode ser determinada por métodos de rotina.

[0035] É mostrado nos exemplos que a fração de hialuronano com um MW < 200 kDa era no máximo de 15% em peso em várias compo- sições de hidrogéis de acordo com a invenção (exemplo 3). Em con- traste, as condições de reticulação descritas para géis reticulados de TMP (de acordo com WO 2016/005785A1) resultaram em uma fração de hialuronano de 30% em peso em relação ao hialuronano total (exemplo comparativo 4). A comparação com o estado da técnica de composições de hialuronano reticulado com BDDE também mostra uma melhoria em relação à quantidade de baixo peso molecular (exemplo 6). Assim, uma formulação melhorada em relação à biocom- patibilidade é fornecida graças à baixa fração de oligômeros de hialu- ronano inflamatórios.

[0036] A determinação de MW para as composições de acordo com a invenção no exemplo 3 foi realizada após um certo prazo de validade (armazenado em temperatura ambiente), enquanto que o exemplo comparativo 4 foi investigado mesmo antes da esterilização. Em geral, a fração de hialuronano de baixo peso molecular tende a aumentar durante o processamento (esterilização) e armazenamento. Tendências similares são esperadas para quaisquer composições de hialuronano reticulado com propriedades de hidrogel similares (con- centração, pH, osmolaridade). Assim, nos hidrogéis de acordo com o estado da técnica, a fração substancial de hialuronano com um MW < 200 kDa após a reticulação pode aumentar ainda mais. Em geral, uma pequena fração de hialuronano de baixo peso molecular de no máximo

15% em peso é desejada para a composição diretamente após o pro- cessamento em uma composição de hidrogel estéril.

[0037] Devido à excelente biocompatibilidade da composição de acordo com a invenção e à ausência de reticuladores potencialmente tóxicos nas modalidades preferidas, ela pode ser aplicada em doses superiores a 20 mL por ano. Assim, é adequado para aplicações em que grandes volumes de preenchimentos são necessários, tais como aumento de mama ou para pacientes que requerem aplicação em vá- rias áreas. Consequentemente, um uso da composição é o uso cos- mético. Entretanto, a aplicabilidade não é limitada ao preenchimento dérmico. Assim, em outro aspecto, a composição é fornecida para uso como um medicamento para uso com preenchimento de tecido mole.

[0038] Essas utilizações (terapêuticas ou cosméticas) podem se referir à utilização da composição de acordo com a invenção tal como o preenchimento de tecidos moles ou para aumento de tecidos. Tais usos incluem preferivelmente a aplicação, por exemplo, pela injeção ou implantação, em um ser humano, enquanto que a aplicabilidade não se limita à espécie humana.

[0039] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método, em que o método compreende a introdução da composição de acordo com a invenção, por exemplo, pela injeção com uma seringa, em um local específico do tecido mole. O método se refere ao uso da compo- sição como preenchimento de tecido mole ou para aumento de tecido para fins terapêuticos, assim como cosméticos.

[0040] Em uma modalidade, os usos ou métodos de acordo com estes aspectos compreendem que a composição de hidrogel seja in- troduzida em um local do tecido por injeção com uma seringa por via intradérmica, supra periósteo ou subcutânea em um ser humano.

[0041] A composição de hidrogel pode incluir um agente anestési- co local e/ou um ou mais componentes selecionados a partir de uma variedade de outros componentes, tais como, fatores do crescimento, vitaminas, poliálcoois, haletos de metal alcalino, minerais, antioxidan- tes, aminoácidos, coenzimas, partículas cerâmicas, (tais como partícu- las de hidroxiapatita de cálcio), partículas poliméricas, polímeros (tais como polietileno glicol, glicosaminoglicanos, lubricina, polissacarídeos e seus derivados), proteínas (tais como elastina, colágeno, queratina, fibroina da seda), agentes anticelulite, agentes cicatrizantes, agentes anti-inflamatórios, agentes anti-irritantes, vasoconstrictores, agentes anti-hemorrágicos (tais como agentes hemostáticos e agentes antifi- brinolíticos), agentes de tensionamento, agentes antiacne, agentes para pigmentação, agentes antipigmentação, agentes antiflogísticos, agentes antirreumáticos, agentes antivirais, agentes anti-infecciosos, agentes antissépticos, agentes quimioterapêuticos, agentes citostáti- cos, agentes antialérgicos, agentes antivaricosos; analgésicos, antibió- ticos, antimicóticos, espasmolíticos, anti-histamínicos, agentes para o tratamento de hemorroidas, agentes terapêuticos para o tratamento da pele e agentes hidratantes.

[0042] A adição de um agente anestésico local à composição de hidrogel é particularmente desejável tendo em vista sua capacidade de mitigar a dor após a injeção. Os agentes anestésicos locais incluem lidocaína, articaína, prilocaína, cloroprocaína, articaína ou suas combi- nações, assim como os seus sais. Preferivelmente, o agente anestési- co é a lidocaína, tal como na forma de um sal de adição de ácido, por exemplo, lidocaína HCI.

[0043] Em uma modalidade preferida, a composição compreende ainda um polímero não modificado selecionado do grupo de polissaca- rídeos biocompatíveis. Preferivelmente, o polissacarídeo não modifi- cado é hialuronano (HA) não modificado. O hialuronano não modifica- do ou também referido como hialuronano livre pode complementar a composição de hidrogel. HA não modificado é comumente adicionado como um lubrificante para preenchimentos de tecidos moles para ga- rantir a facilidade da injeção, pela diminuição da força de extrusão ne- cessária para injetar os produtos através de uma agulha ou cânula. Preferivelmente, o material bruto de hialuronano livre usado para a produção da composição tem um peso molecular na faixa de cerca de

1.000 kDa a cerca de 3.500 kDa. No entanto, devido à rápida degra- dação do hialuronano não estabilizado, a pessoa versada na técnica entenderá que o desempenho in vivo da composição como preenchi- mento de tecido mole é amplamente direcionado pelo polímero reticu- lado e pelas propriedades do hialuronano modificado com tiol subja- cente. É preferido que o polissacarídeo não modificado esteja compre- endido em uma concentração mais baixa do que o polímero reticulado. A título de exemplo, um hialuronano não modificado está compreendi- do nas composições em concentrações de 3 mg/mL a 7 mg/mL, tal como 5 mg/mL, em que a concentração se refere preferencialmente à concentração de um sal, por exemplo, hialuronato de sódio.

[0044] Além disso, em uma modalidade, o hialuronano reticulado compreende pelo menos uma subunidade de acordo com a fórmula IV Ro ss L Rº “Ro RO -O -O o FL, “1 o (V), em que pelo menos 1% do número total de átomos de hidrogênio que são representados como Rº e Rº* é 2H (deutério). Isso resulta em uma estabilização adicional da molécula.

[0045] Em outra modalidade, a composição da invenção contém pelo menos 0,1 mol de pelo menos um ácido hialurônico enriquecido com deutério.

[0046] A composição pode compreender ainda um estabilizador não tóxico.

[0047] Para estender a eficácia como um preenchimento de tecido mole, a composição pode compreender ainda pelo menos um inibidor da degradação do ácido hialurônico.

[0048] O dito inibidor pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2,3,4,6-penta-O-galoilglicose, apigenina, beta-escina, caltrina, cis-Hinokiresinol (CHR), equinacina, ácido eicosatrienóico (C20:3) , fenoprofeno, tiomalato de ouro e sódio, gossipol, heparina, fosfato de hesperidina, indometacina, ácido L-ascórbico, L-carnitina, L- aminocarnitina, miocrisina (aurotiomalato de sódio), N-tosil-L- fenilalanina clorometil cetona (TPCK) e N-alfa-p-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), hesperidina fosforilada, poli(4-estireno-sulfonato de sódio) (T-PSS), fosfato de poliestradiol, fosfato de polifloretina, PS53 (um polímero de hidroquinona/ácido sulfônico/formaldeído), poliestire- no sulfonato de sódio (N-PSS), 2-hidroxifenil monolactobiosídeo sulfa- tado, digalactosídeo de hidroquinona sulfatado, verbascose sulfatada, planteose e oligossacarídeos de neomicina, tetradecil sulfato de sódio (TDSS), um ácido graxo insaturado C14:1 a C24:1 com uma ligação dupla, inibidor de tripsina urinária (UTI), urolitina B, WSG ou ácido gli- cirretínico, ou combinações dos mesmos.

[0049] A composição também pode compreender um álcool bio- compatível viscoso e hidrofílico, de preferência glicerol, preferivelmen- te a 0,5-5% em peso/volume.

[0050] Em uma modalidade da invenção, a composição compre- ende hialuronano reticulado em uma quantidade de 0,1 a 5% em peso em relação ao peso da composição.

[0051] Além disso, será entendido que um componente principal da composição de hidrogel é a água. Preferivelmente, água para inje-

ção ou água purificada é usada para produzir a composição. Além dis- so, será reconhecido que a composição pode ser tamponada para exi- bir um pH fisiologicamente aceitável na faixa de 6,7 a 7,8. Os tampões adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica e inclu- em, por exemplo, tampão fosfato. A composição também exibe uma osmolalidade fisiologicamente aceitável, que é similar à osmolalidade normal do fluido extracelular no indivíduo a ser tratado (por exemplo, em humanos). Assim, a composição pode ter uma osmolalidade na faixa de 250-350 mOsmol/kg e pode incluir solutos adicionais para ajustar a osmolalidade, tais como cloreto de sódio, cloreto de cálcio e/ou cloreto de potássio.

[0052] A composição de hidrogel de acordo com a invenção é es- téril, o que pode ser conseguido por abordagens que estão no estado da técnica. A esterilização térmica por calor úmido em autoclave é um dos métodos padronizados, que consiste em submeter os géis ao va- por saturado de alta pressão a 121ºC por cerca de 15-20 minutos. À autoclavagem por períodos de tempo mais curtos (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e 5 minutos) e em temperaturas mais altas (por exemplo, entre cerca de 130ºC e 135ºC) pode levar a uma melhor pre- servação do peso molecular das moléculas de hialuronano nos géis (consulte o artigo de Fedegari, US 2016/0220729). A otimização de outros parâmetros de autoclavagem (como a garantia de resfriamento rápido do produto) pode ser adicionalmente vantajosa para preservar o peso molecular do polímero (http: Ilwww.steriflow.com.en/News/Sterilization-hyaluronic-acid).

[0053] A expressão composição de hidrogel, tal como aqui utiliza- da, deve ser entendida como descrevendo uma composição que tem características sólidas e fluidas (líquidas). Por um lado, o hidrogel po- de ser injetável, ou seja, apresenta um comportamento similar ao flui- do. Por outro lado, o hidrogel pode ser duro (ou rígido) o suficiente pa-

ra manter uma certa forma, por exemplo, o hidrogel pode ser fornecido na forma de um implante, fio ou filamento pré-formados. Assim, a ex- pressão hidrogel não limita as propriedades reológicas da composição de uma maneira quantitativa.

[0054] A composição de hidrogel pode ser usada, em que a com- posição de hidrogel é um medicamento, um cosmético ou dispositivo médico. O hidrogel é implantado, de preferência por injeção através de uma agulha ou cânula, em um local de aplicação, preferivelmente um tecido mole. Alternativamente, o hidrogel pode ser implantado por meio de um procedimento cirúrgico. Uma vez aplicado, o hidrogel pode ser referido como implante (hidrogel) ou depósito. O hidrogel de acor- do com a invenção é biocompatível e forma um implante absorvível (isto é, biodegradável). Assim, o hidrogel de acordo com a invenção pode ser utilizado como preenchimento de tecidos moles.

[0055] Preenchimentos de tecidos moles que compreendem bio- materiais, tais como hialuronano estabilizado, são liberados no local do tecido, onde o aumento é desejado por meio de uma composição de hidrogel injetável. Os objetivos dos usos ou métodos que se referem ao preenchimento de tecidos moles incluem aumentar o tecido mole (dérmico), corrigir anomalias congênitas, defeitos adquiridos ou defei- tos cosméticos.

[0056] O efeito principal da composição do hidrogel é puramente físico, pois tem um efeito de preenchimento baseado no volume origi- nal e na expansão do implante. Assim, na ausência de qualquer inte- ração fisiológica ou farmacológica, o uso pode ser classificado como cosmético e a composição pode ser considerada cosmética ou disposi- tivo médico. As aplicações em que o uso da composição de hidrogel de acordo com a invenção pode ser considerado cosmético incluem, por exemplo, a redução dos sinais da idade, por exemplo, - aplicação no tecido da vulva e da vagina para propósitos de rejuvenescimento genital feminino não cirúrgico; - aplicação na derme, subderme ou supra-periósteo.

[0057] A título de exemplo, a composição de hidrogel pode ser usada (em um método) para fins cosméticos, por exemplo, para pre- encher rugas, para tratar defeitos da pele, para restaurar o volume perdido do rosto ou do corpo (por exemplo, mama, lóbulo da orelha), para reduzir marcas de celulite, para tratar deformidades lacrimais, pa- ra moldar os contornos do rosto ou do corpo (por exemplo, aumento das nádegas, aumento do quadril, aumento da panturrilha), para o aumento do pênis (aumento da circunferência peniana, aumento da glande).

[0058] Em outros casos, o preenchimento e o aumento de um te- cido mole podem resultar no tratamento ou prevenção de uma doença, ou seja, quando os sintomas da doença são reduzidos, aliviados e/ou evitados de ocorrer/recorrer. As doenças causadas por um defeito do tecido mole podem se beneficiar do preenchimento, amortecimento, suporte ou aumento estrutural temporário e/ou local do tecido circun- dante pelo hidrogel aplicado. Doenças, em que a composição de hi- drogel pode ser usada para tratamento ou prevenção incluem, por exemplo, - metatarsalgia, uma doença dolorosa da almofada gordu- rosa da bola do pé, para a qual o hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicado na almofada gordurosa do tecido mole da bola do pé, - incontinência urinária ou fecal, para a qual o hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicado nos tecidos que definem os esfíncteres, - atrofia vulvovaginal (também síndrome genito-urinária da menopausa), para a qual o hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicado na área vulvovaginal através de injeção na mucosa vagi-

nal e no vestíbulo e/ou para aumento dos grandes lábios, em que uma reconstrução dos grandes lábios irá garantir um contato próximo entre ambos os grandes lábios para proteger as estruturas internas da vulva - comprometimento das cordas vocais, - insuficiência da válvula venosa, ou - lipoatrofia facial, cicatrizes debilitantes ou assimetria ou deformação morfológica (congênita ou resultante de trauma ou cirur- gia, por exemplo, do tórax ou da face), para as quais o hidrogel se aplica para fins reconstrutivos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0059] Como discutido acima, em uma modalidade preferida, o hialuronano reticulado é um produto de reação de um hialuronano mo- dificado, em que o hialuronano modificado é modificado com uma mo- lécula endógena que fornece um grupo reativo para reticulação, tal como grupos tiol. Nos detalhes adicionais a seguir em relação à prepa- ração da preparação do hialuronano modificado com tiol, são dados o hialuronano reticulado sendo um produto de oxidação, assim como composições que compreendem o mesmo.

[0060] A introdução do agente de modificação através da forma- ção de uma ligação éster ou uma ligação amida entre o grupo carboxi- la da porção de ácido glicurônico do hialuronano e o agente de modifi- cação é preferida (s. fórmula Ill acima). O agente de modificação pode compreender grupos tiol na forma de ligações de dissulfeto ou como grupos tiol protegidos durante o processo de síntese.

[0061] Em uma modalidade preferida, o agente de modificação está ligado ao grupo carboxila da porção de ácido glicurônico no hialu- ronano por meio de uma ligação amida. Consequentemente, o agente de modificação compreende pelo menos um grupo amino capaz de formar a ligação amida com o grupo carboxila da porção de ácido gli- curônico no hialuronano e o agente de modificação compreende um grupo tiol. Por exemplo, o hialuronano modificado com tiol é um conju- gado de hialuronano-cisteamina, em que a cisteamina está ligada ao hialuronano por meio de uma ligação amida.

[0062] Da mesma forma, outros agentes de modificação contendo grupo tiol podem ser usados para a síntese de hialuronano modificado com tiol através da formação de ligação amida entre um grupo amino (grupo amino primário ou secundário, preferivelmente um grupo amino primário) do agente de modificação e o grupo carboxila da porção de ácido glicurônico no hialuronano. Os agentes de modificação poten- ciais incluem, por exemplo, derivados de cisteamina, cisteína ou ho- mocisteína, em que o grupo amino da cisteamina, cisteína ou homocis- teína é acoplado ao grupo carboxila de um aminoácido. Estes deriva- dos são preferencialmente sintetizados usando aminoácidos N- protegidos.

[0063] O baixo peso molecular do agente de modificação é prefe- rido para conservar as propriedades físico-químicas únicas do hialuro- nano o máximo possível. Agentes de modificação com baixo peso mo- lecular adequados para obter um hialuronano modificado com tiol reti- culável útil para uma composição de acordo com a invenção são, pre- ferivelmente, selecionados do grupo que compreende glutationa, ciste- na e homocisteína.

[0064] Exemplos não limitantes de ligante L adequado ou molécula LH? que ocorre naturalmente são: - cistamina, o dímero de dissulfeto de cisteamina, isto é, L de fórmula

V -NH-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-NH (V) - glutationa oxidada, o dímero de dissulfeto de glutationa, isto é, LH2 de fórmula VI

NH; o A AA AA or 6 * ) o o t o o É n o AA on

H ôNez Õ (Vl) - cistina, o dímero de dissulfeto de cisteína, isto é, LH2 de fórmula VII NH, o HO Ss Non o NH (VII) - homocistina, o dímero de dissulfeto de homocisteína, isto é, LH2 de fórmula VIII o NH, " A s AA NH? O vII) - um derivado amino de cistamina que é um conjugado de moléculas de cistamina que ocorrem naturalmente e aminoácidos que ocorrem naturalmente, isto é, LH2 de fórmula (IX) nº x Ed x No (O) em que ambos X podem ser idênticos ou diferentes um do outro (deri- vados simétricos ou assimétricos) e a natureza de X depende do ami- noácido. Em uma modalidade, ambos os X são átomos de hidrogênio, isto é, um derivado de glicina simétrico; - ureia, isto é, LH2 de fórmula (X)

À H2N NH> X).

[0065] O hialuronano reticulado utilizado na composição de hidro- gel de acordo com a presente invenção pode ser produzido como se segue: primeiro, o hialuronano é modificado com moléculas endóge- nas com grupos reativos para reticulação, tais como grupos tiol. Ciste- amina, cisteína e glutationa são exemplos de tais moléculas endóge- nas não genotóxicas que ocorrem naturalmente em humanos. Por exemplo, as sub-estruturas relevantes de hialurano modificado com tiol reticulável por formação de dissulfeto modificado com cisteamina (HA- cisteamina) e glicinil-cisteamina (HA-glicinil-cisteamina), são mostra- das na fórmula XI

HS ( OH

NH O Ho. o

OH NH

À 9 (XI) e na fórmula XII

SH DP

HN o Ho. é o a Ho o oH NHAS ) xi) respectivamente.

[0066] As reações são realizadas em condições que não afetam negativamente a massa molecular do ácido hialurônico, tais como temperaturas inferiores a 40ºC e muito limitadas se houver tempos de exposição a valores de pH na faixa de pH 11 ou maior e menor do que pHA4.

[0067] Aeschlimann (EP 1 115 433 B1) descreve um método de funcionalização do hialuronano que não compromete o peso molecular do hialuronano e que fornece ainda moléculas de hialuronano que são bem toleradas in vivo e são biodegradáveis. O método é usado para gerar o hialuronano com diferentes grupos funcionais terminais para reticulação, tais como grupos tiol. Estas cadeias laterais são introduzi- das no hialuronano por acoplamento mediado por carbodi-imida de aminas que contêm grupo tiol primário (protegido) ou ligantes de dia- mina ou di-hidrazida que contêm ao grupo carboxila da porção de áci- do glicurônico usando um éster intermediário ativo. Os produtos inter- mediários com ligações de dissulfeto são então reduzidos e os produ- tos intermediários com grupos tiol protegidos são então desprotegidos pela remoção do grupo protetor.

[0068] O documento EP O 587 715 descreve como sintetizar polis- sacarídeos aniônicos insolúveis em água através da dissolução de pe- lo menos um polissacarídeo polianiônico (por exemplo, hialuronano), em uma mistura aquosa; ativação do polissacarídeo polianiônico com um agente de ativação, tal como uma di-imida, por exemplo, EDC ou ETC ou BOP; modificação do polissacarídeo polianiônico ativado com um composto modificador, tal como hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) ou monoidrato de 1-hidroxibenzotriazol; e reação do polissaca- rídeo polianiônico ativado com um nucleófilo adequado (tal como um amino tiol) para formar a composição insolúvel desejada. Os invento- res afirmam que uma das principais vantagens da ativação de BOP do polissacarídeo polianiônico é que o peso molecular do polissacarídeo polianiônico não diminui após o acoplamento ao nucleófilo.

[0069] A amidação mediada por triazina com DMT-MM para funci- onalização eficiente e controlada do ácido hialurônico com cisteamina é descrita em Borke et al. Em comparação com outros reagentes de acoplamento (tal como a substituição mediada por EDC), as condições de reação moderadas e a degradação mínima da cadeia de polissaca- rídeo são listadas como vantagens do uso deste grupo de agentes de acoplamento (Borke et al., Carbohydrate Polymers 116 (2015) 42 -50). Liang et al. descrevem a introdução de grupos tiol ao hialuronano por meio de uma reação de amidação dos carboxilatos laterais com a cis- tamina na presença de CDMT e NMM, seguido por uma reação de re- dução com DTT (Liang et al. Carbohydrate Polymers 132 (2015) 472- 480).

[0070] O estado da técnica é omisso quanto à preservação do pe- so molecular do hialuronano durante a reticulação no curso da prepa- ração de composições de hidrogel estéreis.

[0071] O hialuronano modificado é então purificado enquanto ain- da não está reticulado, permitindo uma purificação muito eficiente por diferentes métodos, tais como precipitação, cromatografia e diálise.

[0072] Em seguida, o hialuronano modificado e purificado é reticu- lado para formar um gel altamente viscoso. Não é então necessário purificar ainda mais o gel por meio de diálise, que é o único método de purificação rotineiramente aplicado a géis aquosos altamente viscosos. A condição para reticulação depende da natureza do ligante. Caso o hialuronano seja modificado com moléculas endógenas com grupos tiol reativos, a reticulação envolve a oxidação dos grupos tiol para for- mar ligações de dissulfeto inter e intramoleculares.

[0073] Depois que os géis são colocados nas seringas, eles preci- sam ser esterilizados.

EXEMPLOS Exemplo 1. Reticulação com ureia

[0074] 8 g de hialuronato de sódio são dissolvidos em 72 g de so- lução salina. Uma solução é preparada separadamente dissolvendo 4 g de ureia em 16 g de HCI 0,2 M. As duas soluções preparadas são misturadas até que a solução final fique homogênea; o pH é medido e deve estar na faixa de 3,5 a 4. O produto é termo-estabilizado a 35(+/- 2)ºC por 20-24 horas, o excesso de ureia é então eliminado; uma vez purificado, o pH do produto obtido foi medido e estava compreendido entre 5,5 e 7,5.

[0075] O produto é então colocado em seringas e esterilizado em autoclave. Exemplo 2: Reticulação com cistamina

[0076] Para preparar um hidrogel, o pó de HA-cisteamina com um MW de pelo menos cerca de 700 kDa é dissolvido em meio aquoso. HA não modificado com um MW de pelo menos 1000 kDa e, opcio- nalmente, um anestésico local, tal como lidocaína HCl, são adiciona- dos a esta solução. A reticulação de HA-cisteamina através da forma- ção de ligações de dissulfeto ocorre então sob condições oxidativas moderadas (pH 7,4, presença de Oz) e em temperatura ambiente, o que resulta em um hidrogel adequado para um preenchimento de teci- dos moles. Nenhuma purificação adicional do gel (por exemplo, por diálise) é necessária. Os hidrogéis são colocados em seringas e esteri- lizados em autoclave. Preparação de TH-260417-1, TH-270217-2, TH-220317-2 e TH- 070217-2

[0077] Para a preparação da composição de hidrogel estéril TH- 260417-1, 3580 mg de HA-cisteamina (MW 730 kDa), 600 mg de lido- caína HCl e 1160 mg de NaCl foram dissolvidos em 185 g de água pa- ra injeção sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 3 horas. 1000 mg de hialuronato de sódio (MW 2400 kDa) foram então adicionados à solução sob agitação contínua em temperatura ambiente durante cerca de mais 3 horas. O tampão fosfato pH 11 foi então adicionado em uma quantidade final de 200 g de formulação. À solução foi homogeneizada durante cerca de 15 min. Após incubação durante a noite em temperatura ambiente, o hidrogel agora reticulado foi colocado em seringas de vidro de 1 ml e esterilizado em autoclave. O hidrogel estéril tinha um pH de cerca de 7,7 e uma osmolalidade na faixa de 270 a 330 mOsmol/kg.

[0078] TH-270217-2 e TH-070217-2 foram produzidos de acordo com o mesmo método, mas em um tamanho de lote menor (50 g). À composição de hidrogel estéril TH-220317-2 foi produzida de acordo com o mesmo método que as composições de hidrogel estéril TH- 270217-2 e TH-070217-2, mas com a matéria-prima HA-cisteamina com um MW de cerca de 900 kDa. Preparação de TH-260417-2

[0079] Para a preparação da composição de hidrogel estéril TH- 260417-2, 3580 mg de HA-cisteamina (MW 730 kDa), 600 mg de lido- caína HCl e 1160 mg de NaCl foram dissolvidos em 185 g de água pa- ra injeção sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 3 horas. 1000 mg de hialuronato de sódio (MW 1300 kDa) foram então adicionados à solução sob agitação contínua em temperatura ambiente durante cerca de mais 3 horas. O tampão fosfato pH 11 foi então adicionado até uma quantidade final de 200 g de formulação. À solução foi homogeneizada durante cerca de 15 min. Após incubação durante a noite em temperatura ambiente, o hidrogel agora reticulado foi colocado em seringas de vidro de 1 ml e esterilizado por autoclava- gem. O hidrogel estéril tinha um pH de cerca de 7,7 e uma osmolalida- de na faixa de 270 a 330 mOsmol/kg. Preparação de TH-260917 200

[0080] Para a preparação da composição de hidrogel estéril TH- 260917 200, 3580 mg de HA-sal de sódio de cisteamina (MW 730 kDa, grau de modificação 151 umol/g de polímero), 600 mg de lidocaí- na HCI e 1160 mg de NaCl foram dissolvidos em 185 g de água para