BR112020024735B1

BR112020024735B1 - Composição hidrogel estéril, seu uso e seus métodos de produção, preenchimento de tecido macio, e implante ou depósito

Info

Publication number: BR112020024735B1
Application number: BR112020024735-9A
Authority: BR
Inventors: Martin Prinz; Ralph HOLLAUS; Robert Sachsenhofer
Original assignee: Croma-Pharma Gmbh
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2024-02-27
Also published as: JP2021526933A; CA3101410A1; BR112020024735A2; CN112334167A; JP2021526934A; KR20210021363A; KR20210021362A; WO2019238954A1; US20210259943A1; US20210260243A1; MA52880A; CN116650519A; EP3806918A1; IL279445A; MX2020013000A; IL279446A; EP3806919A1; MA52877A; BR112020024637B1; JP7374133B2

Abstract

COMPOSIÇÃO DE HIDROGEL COMPREENDENDO UM POLÍMERO RETICULADO. A presente invenção refere-se a uma composição hidrogel estéril compreendendo um polímero reticulado, em que o polímero reticulado é um produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol e em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação de hialuronano com metades de tiol de mais que cerca de 80 μmoles por grama de polímero, em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação de hialuronano com metades de tiol de menos que 280 μmoles por grama de polímero, em que a composição tem um teor de tiol residual de menos que 20% com relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol.

Description

[0001] A presente invenção se refere a uma composição de hi- drogel estéril, compreendendo um polímero reticulado, em que o polímero reticulado é um produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol, assim como seus usos e um método para produção do mesmo.

Estado da Técnica

[0002] Hialuronano, abreviado HA, também chamado ácido hialu- rônico e seus sais, por exemplo, hialuronato de sódio é um glicosami- noglicano não sulfatado, aniônico, ocorrendo naturalmente com dissa- carídeos de repetição sendo compostos por ácido D-glicurônico e N- acetil-D-glicosamina.

[0003] Hialuronano de alto peso molecular está naturalmente presente na pele e é conhecido por suas propriedades viscoelásticas e também por sua tendência muito alta para absorver água. Suas propriedades contribuem em uma grande extensão para a elasticidade da pele. Dadas suas propriedades e suas qualidades de biocompatibilida- de, tolerância e falta de toxidez, vantagem tem sido assim obtida deste composto por mais de 10 anos agora em muitas aplicações nos campos médicos e cosméticos, em particular procedimentos estéticos. Por exemplo, hialuronano é usado para preenchimento de rugas via injeção direta na derme na área sob consideração (uso como enchimento dérmico).

[0004] HA não modificado altamente purificado de origem biofer-mentativa é perfeitamente biocompatível e idêntico a hialuronano endógeno. Entretanto, à despeito de ter a vantagem de ser altamente compatível com os tecidos do corpo humano, tendo uma alta afinidade por água e realizar uma forte função de umedecimento, HA não tem adequadas propriedades biomecânicas. Quando HA é injetado em tecidos de pele, há uma rápida degradação in vivo por ambos, hialuroni- dases (degradação enzimática) e radicais livres (degradação química) presentes nos tecidos do corpo humano.

[0005] Numerosas soluções foram propostas para diminuição de degradação in vivo de HA e para modificar suas propriedades químicas, físicas, e biológicas, adicionalmente provendo aumentada resistência das formulações a degradação durante estocagem, a calor e por isso a esterilização.

[0006] Estas abordagens tipicamente envolvem modificação química de HA incluindo, por exemplo, reticulação de HA através de meios químicos, enzimáticos, ou fotoquímicos. Estes géis de hialuronano reticulados podem ser obtidos através de vários processos de preparação. Genericamente, estes processos requerem duas etapas principais, a primeira consistindo em hidratação de hialuronano de modo a converter o mesmo em uma solução aquosa (hidrogel) e a segunda tendo por alvo reticulação das moléculas de HA da dita solução aquosa na presença de um agente capaz de induzir a sua reticulação (também referido como "agente de reticulação"). Exemplos de agentes de reticulação incluem formaldeído, divinil sulfona, biscarbodiimidas, e epóxidos.

[0007] Para a produção de enchimentos dérmicos, o agente de re-ticulação é mais comumente escolhido de epóxidos, como 1,4- butanodiol diglicidil éter (BDDE), ou 1,2,7,8-diepoxi octano (DEO), aldeídos, ou poli vinil sulfonas, como divinil sulfona (DVS), e por isso é de natureza sintética.

[0008] Infelizmente, modificações químicas conduzem a efeitos colaterais e estranhas reações do corpo não observadas com HA não modificado, que tem naturalmente baixa imunogenicidade e nenhuma toxidez. Na maioria de enchimentos de tecido mole com HA comercializados BDDE é usado como um agente de reticulação. Devido à natureza reativa dos grupos epóxido presentes em BDDE, BDDE não reagido restante no enchimento dérmico pode ter efeitos genotóxicos. Assim, BDDE em enchimentos dérmicos tem de ser mantido em quantidades em traços (< 2 partes por milhão), de modo que caros procedi mentos de testes e purificação adicionais são necessários durante produção. Embora o perfil de segurança de enchimentos reticulados com BDDE seja suportado por experiência clínica de longo termo (De Boulle, Glogau et al., 2013, A review of the metabolism of 1,4- butanediol diglycidyl ether-crosslinked hyaluronic acid dermal fillers, Dermatol Surg (39): 1758-1766), BDDE ainda pode fazer surgir alguns conceitos de segurança (Choi, Yoo et al., 2015, Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents, J Biomed Mater Res Part A (103A): 3072-3080).

[0009] Devido aos riscos genotóxicos com BDDE, a dose inicial de produtos de enchimento dérmico como Juvederm, que pode ser aplicada sobre a vida de um paciente, é limitada a 20 mL por ano. Administração do produto de enchimento dérmico comercialmente disponível Restylane é limitada a um volume de 6 mL por aplicação. Limitações similares aplicam-se a enchimentos dérmicos compreendendo hialuronano reticulado com DVS.

[0010] Um outro problema com modificações químicas é a necessidade de condições de reação duras, tais como valores de pH alcalino e altas temperaturas (acima de 50oC) às quais hialuronano tem de ser submetido durante a reação de reticulação de modo a obter o desejado grau de reticulação. É conhecido que o peso molecular de HA diminui devido a degradação hidrolítica durante exposição a pH ácido (pH abaixo de 4) ou alcalino (pH acima de 10). Em adição, hialuronano é degradado em maiores temperaturas acima de 40oC (Troncoso et al., 2016, A kinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high con-centrations of sodium hydroxide, student thesis, accessed online via http://uu.diva-portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf;Stern et al., 2007. The many ways to cleave hyaluronan, Biotechnology Advances (25): 537-557; Tokita and Okamoto, 1996, Degradation of hyaluronic acid - kinetic study and thermodynamics, Eur. Polym. J. (32): 1011-1014). Ainda é sabido que fragmentos de hialuronano de baixo peso molecular com um peso molecular de menos que cerca de 200 kDa têm efeitos pró-inflamatórios (Naor, 2016, Editorial: Interaction Between Hyaluronic Acid and Its Receptors (CD44, RHAMM) Regulates the Activity of Inflammation and Cancer, Frontiers in immunology 7:39; Monslow et al., 2015, Hyaluronan-a functional and structural sweet spot in the tissue microenvironment, Frontiers in immunology 6:231).

[0011] Hidrogéis de hialuronano reticulados com dissulfeto foram primeiro descritos por Shu et al. (Biomacromolecules 3, 1304-1311, 2002).

[0012] O derivado reticulado com dissulfeto de um hialuronano modificado com tiol (HA-SH) pode ser obtido através de um mecanismo de auto-reticulação. Uma rede de polímeros hialuronano reticulados é estabelecida com formação de ligações dissulfeto entre grupos tiol (HA-S-S-HA). O grupo tiol formando uma ligação dissulfeto pode conectar os grupos pendentes de uma molécula de cadeia principal de HA comum ou uma molécula de HA da vizinhança, isto é, a reticulação pode ser intramolecular ou intermolecular, respectivamente. A formação de ligações dissulfeto a partir de grupos tiol livres é uma reação de oxidação que pode ocorrer espontaneamente, por exemplo, devido a oxigênio ubíquo, ou com adição de um agente de oxidação.

[0013] WO 2004/037164 ainda estudou hialuronano modificado com diidrazida 3,3’-ditio bis (propanoica) (DTP) ou diidrazida 44,4’- ditiobis (butírica) (DTB). Géis obtidos através de formação de dissul- feto e uso de agentes reativos tiol como ácidos polietilenoglicol di(met)acrílicos para reticulação foram avaliados para seu potencial em engenharia de tecido, isto é, como uma plataforma para cresci mento e cultura de células para implante. Em WO 2005/056608 as mesmas técnicas foram empregadas para reticular um carboxi metil hialuronano modificado com hidrazida tiolada para obter plataformas de células macromoleculares. Serban et al. descrevem a síntese de um derivado de 2-tio etil éter hialuro nano (Biomaterials 29, 13881399; 2008), que entretanto foi impróprio para reticulação pelos agentes de reticulação investigados. EP 2 103 631 descreve macromolé- culas modificadas com tiol incluindo ácido hialurônico, em que um grupo tiol é introduzido através de um método de acoplamento de hi- drazida, e seus produtos reticulados. Os produtos reticulados tanto são obtidos com um agente de reticulação como através de formação de dissulfeto.

[0014] A síntese de ácido hialurônico tiolado também foi descrita em Kafedjiiski et al. (Int J Pharm 343, 48-58; 2007) assim como seu potencial uso em liberação de droga, cura de ferimento e reparo de tecido. CN101367884A mostra a síntese de conjugados de HA- cisteamina que compreendem ambos, grupos tiol e grupos dissulfeto livres. EP 2 614 828 descreve derivados de polímero biocompatível modificado com tiol com um baixo grau de modificação e seus materiais reticulados. WO 2008/077172 descreve ácido hialurônico tiolado para aumento de tecido. Em um exemplo, WO 2008/077172 descreve uma aplicação intradérmica de uma formulação de hidrogel estéril com 2 g de ácido hialurônico contendo grupo tiol (hialuronano modificado com tiol), em que um depósito formado pelo ácido hialurônico contendo grupo tiol pode ser detectável de modo tátil sobre duas semanas; entretanto, o documento é silencioso sobre as específicas característi-cas do hialuronano modificado com tiol usado neste exemplo.

[0015] Os inventores da presente invenção ainda estudaram o potencial de hidrogéis de hialuronano modificados com tiol auto- reticulados como enchedores de tecido mole.

[0016] Entretanto, iniciais estudos in vivo com composições hidro- géis baseadas em hialuronano modificado com tiol auto reticulado mostraram comportamento de degradação mais rápida após implantação em comparação a enchedores dérmicos com um agente de reticu- lação externo. Da mesma maneira, é um objeto da presente invenção0 prover uma composição compreendendo um polímero reticulado com dissulfeto, em que o polímero reticulado com dissulfeto é um produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol (HA-SH), que tem propriedades aperfeiçoadas especialmente com relação a aplicação como enchedor de tecido mole.

Breve Descrição da Invenção

[0017] A presente invenção provê uma composição de hidrogel estéril compreendendo um polímero reticulado,

[0018] em que o polímero reticulado é um produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol,

[0019] em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação com grupos tiol de mais que cerca de 80 μmoles por grama de polímero, preferivelmente mais que cerca de 105 μmoles por grama de polímero, mais preferivelmente mais que cerca de 120 μmo- les por grama de polímero,

[0020] em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação com grupos tiol de menos que cerca de 280 μmoles por grama de polímero, preferivelmente menos que cerca de 240μmoles por grama de polímero, mais preferivelmente menos que 200 μmoles por grama de polímero e

[0021] em que a composição tem um teor de tiol residual de menos que 20% em relação ao grau de mo0dificação do hialuronano modificado com tiol.

[0022] A composição de hidrogel estéril de acordo com a presente invenção é um hidrogel baseado em um hialuronano modificado com grupos tiol (HA-SH), em que o hialuronano é reticulado por ligações dissulfeto entre os grupos tiol do hialuronano modificado (produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol). O produto de oxidação é um copolímero consistindo em seções de hialuronano não modificado e de hialuronano modificado, as últimas sendo conectadas via ligações dissulfeto. O hidrogel é livre de quaisquer adicionais agentes de reticulação bifuncionais externos, tal como divinil sulfona. A composição de hidrogel é caracterizada por compreender um produto de oxi-dação de um hialuronano modificado com tiol com um grau inicial de modificação entre cerca de 80 μmoles de grupos tiol por grama de polímero a cerca de 280 μmoles de grupos tiol por grama de polímero.

[0023] Os inventores verificaram que o grau de modificação de hia- luronano com grupos tiol é uma importante característica para influenciar o tempo de residência in vivo do hidrogel estéril. Para formação de volume de enchimentos de tecido mole é desejado que o volume do hidrogel implantado (volume depósito) permaneça constante sobre um período de tempo e assim, obtenha um efeito sustentável devido a lenta degradação. Além disso, pode ser desejado que o hidrogel aplicado mostre algum intumescimento inicial após aplicação, isto é, um aumento em volume devido a absorção de água no depósito de enchimento.

[0024] Estudos caracterizando o desempenho in vivo de composições hidrogéis estéreis são exemplificados em Exemplos 7 a 9 abaixo. O volume depósito em % em relação ao ponto de partida é calculado para compensar potenciais diferenças no volume de aplicação. O volume de depósito em t = 0 (diretamente após implantação) correspon- de a 100%. O volume de depósito pode ser monitorado, por exemplo, via explorações de formação de imagem de ressonância magnética (MRI). Será entendido que o volume de depósito como parâmetro biológico, preferivelmente determinado em modelos animais, é sujeito a grande variação individual. Da mesma maneira pontos de dados individuais são menos informativos e somente valores médios (considerando múltiplos sítios de aplicação e/ou múltiplos objetos de estudo) proporcionam dados conclusivos. É claro, o desempenho ainda dependerá de fatores tais como o tipo de tecido no sítio de implante, o método usado para medição de volume de depósito e as espécies do organismo estudado. A capacidade de transferência quantitativa dos dados, por exemplo, para aplicação em humanos, pode ser restrita. Entretanto, resultados comparáveis aos dados em ratos foram observados em u m outro estudo in vivo com camundongos (dados não mostrados). Assim, a caracterização in vivo provê uma valiosa ferramenta para avaliação e comparação de composições hidrogéis individuais umas contra as outras. Tempo de residência pode ser usado como um parâmetro para descrever a presença de um volume depósito médio durante um período de tempo, preferivelmente a presença de um volume depósito de cerca de 100% (ou mesmo maior) durante um período de tempo. Um efeito de formação de volume pode ser definido por um volume depósito de cerca de 100% (ou maior) em um certo ponto de tempo após a aplicação do hidrogel, por exemplo, medido em semana 5 (por exemplo, no dia 30) ou preferivelmente em semana 12 (por exemplo, dia 81 a 84), e eventualmente em semana 24 (por exemplo, medida em 165 a 168 dias) após implante. Preferivelmente, o volume depósito de cerca de 100% (ou maior) é detectável durante as primeiras 12 semanas ou 3 meses ou durante as primeiras 24 semanas ou 6 meses após aplicação (tempo de residência). As composições de hidrogel de acordo com a invenção mostraram um efeito de formação de volume 12 semanas (medida em dia 81 a 84) após implante sob as condições de estudo exemplificadas. Assim, as composições de hidrogel de acordo com a invenção mostram o desejado desempenho in vivo promissor para uma aplicabilidade como enchimento de tecido mole, por exemplo, em humanos. Além disso, a natureza do polímero reticulado proporciona um perfil de segurança toxicológica favorável e maiores volumes como comparado com outros enchimentos de hialuronano estabilizado podem ser aplicados (acima de 50 mL por aplicação).

[0025] O parâmetro mais crítico influenciando o efeito de formação de volume da composição hidrogel é o "grau de modificação com grupos tiol", que indica a quantidade inicial de grupos tiol (tipicamente dada em μmol) por grama (g) do hialuronano modificado com tiol e pode ser abreviada como DoM. Esta quantidade de grupos tiol é característica do material bruto hialuronano modificado com tiol e indica a quantidade de grupos tiol que são disponíveis para reticulação durante o processo de produção da composição. Grupos ou metades de tiol também podem ser referidos como grupos mercapto ou sulfidrila. Baseado em vários exemplos, os inventores identificaram uma faixa ótima para o grau de modificação entre cerca de 80 μmoles por g de polímero a cerca de 280 μmoles por g de polímero. Por um lado um grau de modificação acima de 80 μmoles por g de polímero foi necessário para produzir composições com um efeito de formação de volume de mais que 12 semanas após implantação. Surpreendentemente, por outro lado, uso de hialuronano modificado com tiol com maiores graus de modificação não resulta em um efeito de formação de volume do hidrogel produzido, isto é, um aumento no volume depósito (por exemplo, > 335 μmoles por g de polímero como mostrado no Exemplo 7). Sem desejar ser preso por teoria, é assumido que maiores graus de modificação (e consequentemente maiores taxas de reticulação) resul- tam em uma estrutura compacta do hidrogel que previne incorporação de água e pelo que proíbe um efeito de intumescimento. Assim, o grau inicial de modificação do hialuronano modificado com tiol com grupos tiol foi identificado como um fator crucial que influencia as propriedades de enchimento de tecido mole de uma composição de hidrogel estéril. O desejado efeito de formação de volume para enchimento de tecido mole somente foi obtido com composições compreendendo hia- luronano modificado com tiol reticulado com um grau inicial de modificação em uma estreita faixa de 80 a 280, preferivelmente de 100 a 240, mais preferivelmente de 120 a 200 μmoles de grupos tiol por g de polímero.

[0026] Um alto grau de reticulação (via oxidação dos grupos tiol) é benéfico para obtenção de composições hidrogéis com propriedades elásticas apropriadas para um enchedor de tecido mole para formação de volume. De modo a prover composições de hidrogel com características reproduzíveis e estáveis tais como as propriedades reológicas, a reticulação do hialuronano modificado com tiol (isto é, a formação de ligações dissulfeto) deve ser na maior parte completa antes de hidro- gel ainda ser processado (isto é, ainda sofrendo etapas de processamento como peneiramento, homogeneização, enchimento em seringas e esterilização). Entretanto, uma certa pequena quantidade de grupos tiol não deve ser disponível para formação de dissulfeto devido a fatores como impedimento estéreo.

[0027] A composição de hidrogel estéril de acordo com a invenção tem um teor de tiol residual de menos que 20% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol. Isto corresponde a mais que 80% dos grupos tiol disponíveis do hialuronano modificado com tiol sendo oxidado durante o processo de produção de hidrogel. A fração de grupos tiol não reticulados no polímero reticulado pode ser determinada via o teor de tiol residual expresso em μmol por g de po límero. Como mostrado no exemplo 17, taxas de oxidação altas e uniformes e assim um reproduzível baixo teor de tiol residual na composição de hidrogel estéril são obteníveis através de uso de um agente de oxidação, por exemplo, peróxido de hidrogênio, durante etapa de oxidação no método de produção.

[0028] Em uma realização preferida, a composição de hidrogel de acordo com a invenção tem um teor de tiol residual de menos que 15% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol.

[0029] Além de grau de modificação, parâmetros que influenciam acentuadamente as propriedades reológicas e in vivo do hidrogel são a concentração do hialuronano modificado com tiol reticulado assim como a distribuição de peso molecular das cadeias hialuronano.

[0030] Concentrações preferidas foram identificadas serem de cer ca de 11 mg/mL a cerca de 20 mg/mL.

[0031] Preferivelmente, a composição de hidrogel compreende o produto de oxidação do hialuronano modificado com tiol em uma concentração de cerca de 11 mg/mL a cerca de 20 mg/mL, mais preferivelmente de cerca de 13 mg/mL a cerca de 18 mg/mL.

[0032] A concentração do hialuronano modificado com tiol em mg/mL é dada por peso em relação ao volume da composição de hi- drogel estéril. A concentração preferivelmente se refere à concentração do sal, por exemplo, o sal de sódio do hialuronano modificado com tiol reticulado. Da mesma maneira, uma quantidade equivalente de hialuronano modificado com tiol é provida para a preparação. Maiores concentrações não são consideradas apropriadas na medida em que elas resultam em composições hidrogéis com altas viscosidades sem aceitável capacidade de injeção. Concentrações de 9 mg/mL ou menores não são consideradas apropriadas devido a baixo módulo elástico G’ observado para tais composições de hidrogel. Dentro da faixa de cerca de 14 mg/mL a cerca de 18 mg/mL, por exemplo, 15 ou 17 mg/mL, boas propriedades reológicas foram observadas.

[0033] Preferivelmente, o hialuronano modificado com tiol tem um peso molecular médio (MMW) de pelo menos cerca de 400 kDa, prefe-rivelmente pelo menos cerca de 500 kDa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 600 kDa, tal como cerca de 700 kDa.

[0034] Em uma outra realização, é preferido que o polímero reticu lado tenha um peso molecular após esterilização reduzido médio de mais que cerca de 250 kDa, preferivelmente mais que cerca de 300 kDa, mais preferivelmente mais que cerca de 350 kDa, em que o peso molecular após esterilização reduzido médio é definido com o peso molecular médio de um hialuronano modificado com tiol reduzido a partir da dita composição hidrogel estéril após exposição de dito polímero reticulado a condições redutoras. O "peso molecular após esterilização reduzido médio" do polímero reticulado foi identificado como um adicional fator crítico influenciando o efeito de formação de volume do hidrogel após implantação e será abreviado como MRPMW no seguinte. O MRPMW é determinado como o peso molecular de um hialu- ronano modificado com tiol reticulado (polímero reticulado) após uma etapa de preparação, em que o polímero reticulado da composição hidrogel é exposto a condições redutoras. No hidrogel, o polímero reticulado representa uma rede complexa, para a qual um peso molecular pode não ser determinado. Assim, é necessário reduzir o polímero reticulado, isto é, as ligações dissulfeto de reticulação são clivadas antes de determinação de peso molecular. O MRPMW é um valor que se relaciona ao peso molecular médio das cadeias de polímero do polímero reticulado na composição de hidrogel. O MRPMW é definido como peso molecular médio (MMW) de um hialuronano modificado com tiol reduzido a partir da composição de hidrogel estéril, isto é, o MMW para a fração de hialuronano modificado com tiol como determinada em, ou obtenível a partir da composição após esterilização e após redução. Usualmente, o MRPMW determinado para um hialuronano modificado com tiol a partir de composição hidrogel estéril é menor quando comparado ao peso molecular médio (MMW) do material bruto, isto é, o hialuronano modificado com tiol que é usado para a produção das correspondentes composições (ver Tabela 1). A redução do MRPMW em comparação ao MMW do material bruto é assumida ser uma consequência do procedimento de produção de hidrogel incluindo esterilização. Da mesma maneira, uso de MRPMW do polímero reticulado é mais apropriado para caracterizar a composição hidrogel do que uso de MMW do material bruto.

[0035] Entretanto, os inventores verificaram que quando usando um hialuronano modificado com tiol com um peso molecular médio (MMW) de pelo menos cerca de 400 kDa, preferivelmente pelo menos cerca de 500 kDa, mais preferivelmente pelo menos cerca de 600 kDa, tal como cerca de 700 kDa, para a produção de composições hidrogel, o MRPMW do polímero reticulado na composição hidrogel foi cerca de 250 kDa ou maior. Por exemplo, os procedimentos de produção esboçados nos exemplos partindo com um hialuronano modificado com tiol de cerca de 600 kDa resultaram em composições hidrogéis com um MRPMW do polímero reticulado estando na região mais preferível de cerca de 350 kDa ou maior. Vice-versa, um MRPMW de cerca de 250 kDa ou maior é uma evidência de que o respectivo hialuronano modificado com tiol tem um MMW sendo pelo menos cerca de 400 kDa, embora a relação quantitativa dependa do procedimento de produção.

[0036] Como notado, em uma composição de acordo com a inven ção, o MRPMW do polímero reticulado preferivelmente é de cerca de 250 kDa ou maior. Exemplos com composições compreendendo um polímero reticulado com um MRPMW abaixo de 250 kDa, por exemplo, 200 kDa (ID10), não mostram o preferido módulo elástico G’ e um vo lume depósito relativo médio acima de 100% sobre um período de tempo suficientemente longo, enquanto uma composição exemplo compreendendo um polímero reticulado com um MRPMW de 300 kDa mostrou um volume depósito relativo médio acima de 100% por 133 dias. Uma composição compreendendo um polímero reticulado com um MRPMW de 480 kDa mostrou um volume de depósito relativo médio acima de 100% por 188 dias. Em particular, o MRPMW é preferivelmente mais que 300 kDa, mais preferivelmente mais que cerca de 350 kDa. De acordo com o conhecimento do inventor, o estado da técnica é silencioso sobre MRPMW e seu papel para influenciar desempenho in vivo de um hidrogel após implantação em um tecido mole. O MRPMW está caracterizando o polímero reticulado, isto é, uma rede não uniforme, na composição hidrogel via antes uma medida indireta. Assim, não é surpreendente que os resultados tipicamente mostrem um desvio de +/- 10% ou algumas vezes mesmo maior. O Exemplo 5 especifica métodos exemplares de determinação de MRPMW. Aqueles versados na técnica estarão cientes de que outras abordagens podem chegar a valores comparáveis para este parâmetro. Por exemplo, eletroforese de gel agarose pode ser usada para separar diferentes frações de MW de hialuronano em gel agarose usando uma câmara de gel horizontal e uma escada de peso molecular de HA como marcador. Géis manchados são então analisados por densitometria seguida por cálculo de massa molecular.

[0037] Por outro lado, o hialuronano modificado com tiol preferi velmente tem um peso molecular médio (MMW) de no máximo cerca de 4500 kDa, em particular no máximo um peso molecular médio na faixa de cerca de 4000 kDa a 4200 kDa. Foi verificado que materiais de partida hialuronano com especificação de peso molecular mesmo maior não são disponíveis em quantidade e qualidade necessárias para preparação de um hialuronano modificado com tiol apropriado para preparação de composições hidrogéis estéreis em escala industrial e/ou como enchimentos dérmicos. Mais preferivelmente, o hialuronano modificado com tiol tem um peso molecular médio de no máximo 3500 kDa ou no máximo 2000 kDa. Por exemplo, o peso molecular médio do hialuronano modificado com tiol pode estar na faixa de cerca de 700 kDa a cerca de 2000 kDa.

[0038] A invenção também provê um método para produção de uma composição de hidrogel de acordo com a invenção compreendendo as etapas de: a) provimento de um hialuronano modificado com tiol, em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação com grupos tiol de mais que cerca de 80 μmoles por grama de polímero, preferivelmente mais que cerca de 105 μmoles por grama de polímero, mais preferivelmente mais que cerca de 120 μmo- les por grama de polímero, e em que o hialuronano modificado com tiol tem um grau de modificação com grupos tiol de menos que cerca de 280 μmoles por grama de polímero, preferivelmente menos que cerca de 240 por grama de polímero, mais preferivelmente menos que 200 μmoles por grama de polímero, em uma solução aquosa, b) oxidação de hialuronano modificado com tiol através de exposição de solução aquosa previamente obtida a condições que permitam o hialuronano modificado com tiol formar um polímero reticulado com dissulfeto, em que ou pelo que a solução aquosa se torna um hidrogel, em que o dito hidrogel tem um teor de tiol residual de menos que 20% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol, opcionalmente c) adição de um polímero não modificado selecionado do grupo de polissacarídeos biocompatíveis ao hidrogel previamente obtido ou à solução previamente obtida, opcionalmente d) peneiramento de hidrogel previamente obtido para obter um hidrogel com uma particular distribuição de tamanho de partícula, e) enchimento de hidrogel previamente obtido em um recipiente, preferivelmente uma seringa, e exposição de recipiente enchido a condições permitindo esterilização do hidrogel, f) obtenção de uma composição hidrogel estéril em um recipiente compreendendo um polímero reticulado.

[0039] No método para produção de um hidrogel as etapas podem ser conduzidas em diferentes sequências. Especialmente as etapas de reticulação (oxidação), adição de um polímero não modificado e penei- ramento podem ser realizadas em diferentes sequências sem necessariamente afetar a qualidade de hidrogel. Preferivelmente, as etapas são conduzidas na sequência a), c), b), d), e) e f), em que a preparação da solução (etapa a) e a adição do polímero não modificado (etapa c) podem ser realizadas simultaneamente e opcionalmente ainda um componente (por exemplo, um agente anestésico local) pode ser adicionado ao mesmo tempo.

[0040] Formação de ligações dissulfeto (reticulação) ocorre naturalmente em valores de pH fisiológicos na presença de oxigênio (por exemplo, suprido via o ar circundante ou dissolvido em uma solução aquosa). Entretanto, adição de um agente de oxidação é preferida para assegurar que as condições na etapa b) sejam suficientes para atingir o grau de oxidação que assegure que o hidrogel tenha um teor de tiol residual de menos que 20% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol. A adição ativa de um agente de oxidação acelera e completa formação de dissulfeto para obter o desejado baixo grau de teor de tiol residual. Além disso, adição de um agente de oxidação em etapa b) mostrou-se especialmente relevante para assegurar um resultado uniforme e reproduzível em processos industriais, isto é, incluindo grandes volumes de massa.

[0041] Da mesma maneira, em uma realização preferida, em etapa b) um agente de oxidação é adicionado à solução aquosa previamente obtida.

[0042] Agentes oxidantes apropriados e bem estabelecidos são, por exemplo, peróxido de hidrogênio (ou outros peróxidos), ácido as- córbico, sulfóxido de dimetila e ácido hipocloroso (hipoclorito de sódio). Sob condições de excesso de pressão gás oxigênio puro ou uma mistura gasosa de alto teor de oxigênio podem ser usados para aumentar a concentração de oxigênio disponível como agente de oxidação na solução aquosa de polímero. A quantidade preferida a ser adicionada depende do agente de oxidação e a quantidade de grupos tiol no hialu- ronano modificado com tiol. Exemplarmente, para peróxido de hidro-gênio, em etapa b) a razão molar de grupos tiol livres de hialuronano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio deve ser preferivelmente no máximo 4:1; mais preferivelmente no máximo 2:1.

[0043] Em um outro aspecto, a invenção provê a composição de acordo com a invenção para uso como medicação, em particular para uso no tratamento e prevenção de condições de tecido mole. Além disso, a invenção se refere ao uso cosmético da composição de acordo com a invenção. Tais usos (terapêutico e cosmético) podem ser referidos ao uso da composição de acordo com a invenção como en- chedor de tecido mole ou para aumento de tecido. Tais usos preferivelmente incluem a aplicação, por exemplo, através de injeção ou implantação, para um ser humano, embora a aplicabilidade não seja limitada à espécie humana.

[0044] Em um outro aspecto, a invenção se refere a um método, em que o método compreende introdução de composição de acordo com a invenção, por exemplo, através de injeção a partir de uma seringa, em u m específico sítio de tecido mole. O método se refere ao uso da composição como enchedor de tecido mole ou para aumento de tecido para propósitos terapêuticos assim como cosméticos.

[0045] Em uma realização, usos ou métodos de acordo com estes aspectos compreendem que a composição de hidrogel é introduzida em um sítio de tecido através de injeção a partir de uma seringa intra- dermicamente, supraperiostealmente ou subcutaneamente em um ser humano.

Breve Descrição das Figuras

[0046] As figuras mostram:

[0047] Figura 1: apresentação esquemática de uma subestrutura de hialuronano - cisteamina como hialuronano modificado com tiol exemplar.

[0048] Figura 2: desempenho in vivo de diferentes composições de hidrogel como volume de depósito médio sobre tempo, em que o volume de depósito após o implante é indicado em relação ao volume inicial no dia 0 (que corresponde a 100%): composição ID 5 (quadrados cheios), composição ID 4 (quadrados vazios), composição ID 6 (triângulos cheios), composição ID 10 (círculos cheios). As características para as diferentes composições são listadas em tabelas 1 e 2. A partir de composições hidrogéis mostradas na Fig. 2, somente composição ID 5 é uma composição hidrogel de acordo com a invenção.

[0049] Figura 3: apresentação esquemática de ainda hialuronanos modificados com tiol exemplares, isto é, uma subestrutura hialuronano - homocisteína (A), uma subestrutura hialuronano - glicila - cisteamina (B), e uma subestrutura N-mercapto-n-butil hialuronamida (C) e uma subestrutura HA-DGDTPDH (D).

Descrição Detalhada da Invenção

[0050] Em uma realização, a composição hidrogel estéril de acordo com a invenção preferivelmente tem um módulo elástico G’ de pelo menos cerca de 900 Pa, preferivelmente pelo menos cerca de 1000 Pa, medido a 25oC usando uma taxa de cisalhamento de 1 Hz.

[0051] No contexto de hidrogéis, o módulo elástico G’ da composição hidrogel é tipicamente usado para caracterizar suas propriedades elásticas e representa o módulo de estocagem de cisalhamento como determinado com um reômetro aplicando força de cisalhamento, por exemplo, através de rotação de uma placa (cone). Métodos padrões para determinação de módulo elástico G’ são conhecidos na técnica (Stocks D., Sundaram H., Michaels J., Durrani M.J., Wortzman M. S., Nelson D. B., Rheological Evaluation of the Physical Properties of Hyaluronic Acid Dermal Fillers, 2011, Journal of Drugs in Dermatology, 10(9), 974-980). O módulo elastico G’ é usado para caracterizar a firmeza (dureza) ou moleza de um gel. Ao mesmo tempo ele é uma medida para a habilidade do gel resistir a deformação. Em consequência, hidrogéis enchedores dérmicos com altos valores G’ são esperados proporcionarem melhor suporte e formação de volume após implante (Stocks et al., 2011). Além de ttemperatura e frequência da placa rotatória outras condições variáveis de testes podem influenciar a capacidade de comparação quantitative do modulo elastic G’. Repetidos testes tipicamente podem resultar em uma variação padrão de cerca de +/- 10% para o valor médio, por exemplo, 8%. Em alguns casos foi observado que o módulo elastico variou até 20% quando o hydrogel foi provido por extrusão através de uma agulha ou sem agulha. Assim, é recomendado permanecer próximo do protocolo como esboçado abaixo no Exemplo 4 para avaliação de modulo elastic G’.

[0052] Várias composições hidrogéis de acordo com a invenção (com um grau de modificação para o hialuronano modificado com tiol e opcionalmente a concentração do polímero como indicada) mostraram um módulo elástico G’ de > 1000 Pa. Hidrogéis com um módulo elástico G’ de menos que 900 Pa não mostram um volume de depósito relativo médio acima de 100% sobre um período de tempo suficientemente longo (composição hidrogel ID 10 no Exemplo 6), enquanto uma com- posição com um módulo elástico de 1385 Pa (compreendendo um polímero reticulado com um MRPMW de 480 kDa, composição hidrogel ID2) mostrou um volume depósito relativo médio acima de 100% por 188 dias. Estudos prévios com hidrogéis formados por hialuronano modificado com tiol reticulado não focam especificamente sobre composições de hidrogel estéreis ou sua adequação como enchedoras de tecido mole. Da mesma maneira, o estado da técnica é silencioso sobre seu módulo elástico G’ e seu papel para influenciar desempenho in vivo de um hidrogel baseado em um polímero reticulado dissulfeto após implantação em um tecido mole. Além disso, dados disponíveis para enchedores dérmicos no mercado (Stocks et al., 2011) mostram que o módulo elástico destes produtos, que compreendem pelo menos 20 mg/mL de hialuronano reticulado com BDDE, estava na faixa de cerca de 75 Pa a cerca de 660 Pa. Embora medidos sob diferentes condições de testes, estes valores mostram que os hidrogéis de hialu- ronano reticulados estabelecidos têm um módulo elástico G’ bem abaixo de 900 Pa ou mesmo 1000 Pa e assim, abaixo de preferência para a presente invenção.

[0053] As propriedades da composição hidrogel de acordo com a invenção são criticamente influenciadas pelo hialuronano modificado com tiol, especialmente seu grau de modificação. Métodos estabelecidos para determinação de grau de modificação incluem o método Ell- man ou medição de liberação de uma tiona cromofórica com reação de 2,2’-ditio dipiridina com agente transportando tiol (ver Exemplo 1) . Aqueles versados na técnica também conhecerão métodos alternativos resultando em valores similares. Aqui, o grau de modificação é dado em μmol de grupos tiol por grama de polímero. Alternativamente, o grau de modificação pode ser indicado como porcentagem, em que a quantidade de unidades de repetição modificadas é dividido pela quantidade total de unidades de repetição HA no polímero (ácido D- glicurônico e N-acetil-D-glicosamina). O grau de modificação em μmol de grupos tiol por grama de polímero pode ser convertido em porcentagem levando-se em conta o peso molecular de 400 g/mol da unidade de repetição HA. Nesta conversão, a mudança de peso molecular introduzida pela modificação é tipicamente negligenciada. Da mesma maneira, o grau de modificação como especificado para o hialuronano modificado com tiol em uma composição de acordo com a invenção pode ser expresso como variando entre 3,2% e 12,0%, preferivelmente entre 4,0% ou 11,2% ou 4,8% e 10%.

[0054] O "hialuronano modificado com tiol" (HA-SH) é um derivado contendo grupo tiol de um ácido hialurônico (HA). Ele é caracterizado pelo grau de modificação como especificado acima e é acessível via conhecidas abordagens sintéticas partindo de hialuronano que é disponível em diferentes pesos moleculares (ou faixas de pesos moleculares). Numerosos exemplos de modificações de HA com ligantes transportando grupo tiol podem ser encontrados em literatura científica e de patente: Griesser et al. provê uma revisão de polímeros de ácido hialurônico tiolado (Griesser et al., Polymers 10 (2018) 243). Aeschli- mann (EP1 115 433 B1) descreve um método de fu nacionalização de HA que não compromete o peso molecular de HA e que ainda proporciona moléculas de HA que são bem toleradas vivo e são biodegradáveis. O método é usado para gerar HA com diferentes grupos funcionais terminais para reticulação, tais como grupos tiol. Estas cadeias laterais são introduzidas em HA através de acoplamento mediado por carbo diimida de aminas contendo grupo tiol primário (protegido) ou ligantes diamino ou diidrazida contendo ligação dissulfeto para o grupo carboxila da metade ácido glicurônico usando um intermediário éster ativo. Produtos intermediários com ligação dissulfeto são então reduzidos e produtos intermediários com grupos tiol protegidos são então desprotegidos através de remoção de grupo de proteção. Um outro método é descrito por Bulpitt et al. (US 6 884 788) que compreende uma reação direta do grupo carboxila de HA com uma carbo diimida contendo ligação dissulfeto (tal como 2,2’-ditio bis(N-etil-(N’-etil carbo diimida), seguido por redução de ligação dissulfeto com um agente redutor. WO 2008/008857 A2 mostra métodos de síntese de hialuronano derivado 2-tioetil éter. EP 0 587 715 mostra como sintetizar polissaca- rídeos aniônicos insolúveis em água via dissolução de pelo menos um polissacarídeo polianiônico (por exemplo, HA), em uma mistura aquosa; ativação de polissacarídeo polianiônico com um agente de ativação tal como uma diimida, por exemplo, EDC ou ETC, ou BOP; modificação de polissacarídeo polianiônico ativado com um composto de modi-ficação tal como hidrato de 1-hidroxi benzotriazol (HOBt) ou monoidra- to de 1-hidroxi benzotriazol; e reação de polissacarídeo polianiônico ativado com um apropriado nucleofilo (tal como um amino tiol) para formar a desejada composição insolúvel. Os inventores estabelecem que uma maior vantagem da ativação BOP de polissacarídeo polia- niônico é que o peso molecular do polissacarídeo polianiônico não é diminuído com acoplamento ao nucleofilo. EP 1 790 665 B1 descreve um ácido hialurônico modificado solúvel em água, que é produzido através de introdução de um substituinte no grupo carboxi do ácido glicurônico de ácido hialurônico, via uma ligação amida usando um agente de condensação BOD em um solvente polar aprótico. Diaminas com uma ligação dissulfeto estão entre os substituintes listados. Ami- dação mediada com triazina com DMT-MM para funcionalização eficiente e controlada de ácido hialurônico com cisteamina é descrita em Borke et al., em que as condições de reação suave e a degradação mínima da cadeia de polissacarídeo são listadas como vantagens de uso deste grupo de agentes de acoplamento em comparação a outros reagentes de acoplamento tal co mo substituição mediada com EDC (Borke et al., Carbohydrate Polymers 116 (2015) 42-50). Liang et al., descrevem a introdução de grupos tiol para HA via uma reação de amidação dos carboxilatos laterais com cistamina na presença de CDMT e NMM, seguida por uma reação de redução com DTT (Liang et al., Carbohydrate Polymers 132 (2015) 472-480). A modificação tiol de HA com cloridrato de etil éster de 1-cisteína por meio do sistema catalítico duplo - carbodiimida / N-hidroxi succinimida foi descrita em Ka- fedjiiski et al. (Int J Pharm 343, 48-58; 2007). Em WO 2004/037164 hialuronano foi modificado com diidrazida 3,3’-ditio bis(propanóica) (DTP) ou diidrazida 4,4’-ditio bis(butírica) (DTB). Após redução com um agente redutor tal como DTT os correspondentes derivados de HA tiolados HA-DTPH e HA-DTBH foram obtidos. EP 2 103 631 também descreve introdução de um ligante transportando grupo tiol via os grupos carboxílicos de HA através de um método de acoplamento de hi- drazidda. Diferentes polímeros HA tiolados (HA-DGDTPDH, HA- DPDTPDH, HA-DSCDH) foram sintetizados.

[0055] De acordo com a presente invenção, o hialuronano modifi cado com tiol preferivelmente é conjugado de um agente de modificação ligado a hialuronano.

[0056] Introdução do agente de modificação via formação de uma ligação éster, ligação amida ou ligação hidrazida entre o grupo carbo- xila da metade ácido glicurônico de hialuronano e o agente de modificação é preferida. O agente de modificação pode compreender grupos tiol na forma de ligações dissulfeto ou como grupos tiol protegidos durante o processo de síntese.

[0057] Em uma realização preferida, o agente de modificação está ligado ao grupo carboxila da metade ácido glicurônico no hialuronano via uma ligação amida. Da mesma maneira, o agente de modificação compreende pelo menos um grupo amino capaz de formar a ligação amida com o grupo carboxila da metade ácido glicurônico no hialuro- nano e o agente de modificação compreende um grupo tiol. Por exem- plo, o hialuronano modificado com tiol é um conjugado hialuronano - cisteamina, em que cisteamina está ligada a hialuronano via uma ligação amida (ver Figura 1).

[0058] Similarmente, outros agentes de modificação transportando grupo tiol podem ser usados para a síntese de hialuronano modificado com tiol via formação de ligação amida entre um grupo amino (grupo amino primário ou secundário, preferivelmente grupo amino primário) do agente de modificação e o grupo carboxila da metade ácido glicu- rônico no hialuronano.

[0059] Um conjugado hialuronano - homocisteína (Figura 3A) foi sintetizado através de amidação de hialuronato de sódio com homocis- teína tiolactona, explorando sua única proteção tiol como tiolactona. Grupos tiol livres foram subsequentemente liberados com sucesso através de hidrólise alcalina na presença de um agente redutor para evitar indesejada gelificação causada por formação de dissulfeto.

[0060] Ainda agentes de modificação incluem, por exemplo, deriva dos de cisteamina, cisteína ou homocisteína, em que o terminus-N da cisteamina, cisteína ou homocisteína é acoplado com o grupo carboxila de um aminoácido. Estes derivados são preferivelmente sintetizados através de amidação de aminoácidos N-protegido com cisteamina, cis- teína ou homocisteína, usando reagentes de acoplamento de peptídeo de rotina, preferivelmente aqueles permitindo fácil purificação de produto, por exemplo, através de remoção de reagentes e produtos secundários através de uma extração aquo0sa com trabalho de reação (ver exemplo 12 A - Síntese de agentes de modificação transportando grupo tiol). Alternativamente, cisteamina, cisteína ou homocisteína são reagidas com correspondentes ésteres ativos de aminoácidos N-protegidos em solventes orgânicos, como succinimidil ésteres. Um conjugado de hialuronano - glicila - cisteamina (Figura 3 B) é um exemplo para o hia- luronano modificado com tiol, sintetizado através desta abordagem.

[0061] Um baixo peso molecular do agente de modificação é prefe rido para conservar as propriedades físico-químicas únicas de hialuro- nano tanto quanto possível. Apropriados agentes de modificação de baixo peso molecular para obtenção de um hialuronano modificado com tiol reticulável útil para uma composição de acordo com a invenção ainda são preferivelmente selecionados do grupo compreendendo glutationa, cisteína, amino alquil tióis compreendendo uma cadeia alquila C2-C6 linear ou ramificada, homocisteína, carboxilato ésteres de homocisteína (por exemplo, C2-C6 alquil ésteres de cisteína, preferivelmente etil cisteína).

[0062] Ligadores amino alquil tiol podem ser convenientemente introduzidos via correspondentes diaminas simétricas, contendo uma ligação dissulfeto como um tipo de grupo de proteção inerente, explorado com síntese de amida com hialuronano. Os dissulfetos por sua vez podem ser acessados partindo-se de amino álcoois N-protegidos. Após introdução de uma metade tio éster, por exemplo, seguindo o protocolo de Mitsunobu, saponificação do tio éster sob condições oxidantes libera os desejados compostos alvos (por exemplo, Exemplo 12 C). Uma N-mercapto-n-butil hialuronamida (Figura 3 C) é um exemplo para o hialuronano modificado com tiol sintetizado através desta abordagem.

[0063] Em uma outra realização preferida, o agente de modificação está ligado ao grupo carboxila da metade ácido glicurônico no hialuro- nano via uma ligação hidrazida. Da mesma maneira, o agente de modificação compreende pelo menos um grupo hidrazida capaz de formar a ligação amida com o grupo carboxila da metade ácido glicurônico no hialuronano e o agente de modificação compreende um grupo tiol. Por exemplo, o hialuronano modificado com tiol é um conjugado de hialu- ronano - hidrazida de ácido 3-mercapto propiônico (HA-DTPH) ou um conjugado de hialuronano - hidrazida de ácido 2-mercapto etil carbonil amino acético (HA-DGDTPDH; ver Exemplo 12 B, Figura 3 D).

[0064] O termo "estéril" como aqui usado é para ser entendido de acordo com a técnica especificando uma composição aquiescendo com os padrões microbiológicos como definidos para produtos cosméticos ou farmacêuticos, por exemplo, na United States Pharmacopoeia (USP), a European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) ou outros padrões nacionais. Classicamente, os géis de hialuronano são esterilizados após serem enchidos em seringas. Esterilização com calor- umidade térmica com uma autoclave é um dos métodos padrões, que compreende submeter os géis de HA a vapor saturado em alta pressão a 121oC por cerca de 15-20 minutos. Autoclavagem por pe-ríodos de tempo mais curtos (por exemplo, entre cerca de 1 minuto e 5 minutos) e em maiores temperaturas (por exemplo, entre cerca de 130oC e 135oC) pode conduzir a uma melhor preservação do peso molecular das moléculas de HA nos géis (ver, M.L. Bernuzzi, A. Giori, "An innovative way to thermally sterilize hyaluronic acid prefilled syringes", 2016 white paper disponível sob https://www.fedegari.com/wp-content/uploads/2019/03/WP-Fedegari- Thermal-sterilization-PFS-with-Hyaluronic-Acidv-2.pdf, US 2016/0220729). A otimização de outros parâmetros de autoclava- gem (tal como assegurar rápido resfriamento do produto) pode ser adicionalmente vantajosa para preservação de peso molecular do polímero (http://www.steriflow.com/en/news/Sterilization-hyaluronic- acid).

[0065] O termo "hidrogel" como aqui usado é para ser entendido como descrevendo uma composição que tem ambas, características sólidas e fluidas (líquidas). Por um lado, o hidrogel pode ser injetável, isto é, ele mostra um comportamento semelhante a fluido. Por outro lado, o hidrogel pode ser duro (ou rígido) o suficiente para manter uma certa forma, por exemplo, o hidrogel pode ser provido na forma de um implante pré-formado, fio ou um filamento. Assim, o termo hidrogel sozinho não limitando as propriedades reológicas da composição em uma maneira quantitativa.

[0066] Entretanto, em uma realização preferida, o hidrogel tem um módulo elástico G’ de pelo menos cerca de 900 Pa, preferivelmente pelo menos cerca de 1000 Pa, medido a 25oC usando um reômetro com uma taxa de cisalhamento de 1 Hz. O módulo elástico G’ do hi- drogel é diretamente influenciado pelos fatores - grau de reticulação (sendo definido pelo grau crítico de modificação, isto é, uma característica de acordo com a presente invenção), - a concentração do polímero reticulado, e - o MRPMW (sendo dependente do peso molecular médio do hialuronano modificado com tiol).

[0067] A seção exemplar provê várias composições, que orientam aqueles versados na técnica para variar estes fatores de modo a obter o desejado módulo elástico G’ de pelo menos cerca de 1000 Pa. É entendido que uma baixa concentração pode ser compensada com maior peso molecular e vice versa. Entretanto, as preferências para a concentração do polímero reticulado e o MPRMW proporcionam uma clara orientação de como aqueles versados na técnica podem obter um hi- drogel com o módulo elástico preferido de pelo menos cerca de 1000 Pa. O módulo elástico G’ representa um parâmetro valioso para caracterizar os hidrogéis de acordo com a invenção o qual pode ser verificado baseado no hidrogel final sem elaborados esforços técnicos.

[0068] Em uma realização preferida, a composição ainda compre ende um polímero não modificado selecionado do grupo de polissaca- rídeos biocompatíveis. Preferivelmente, o polissacarídeo não modificado é hialuronano não modificado (HA). O hialuronano não modificado (não reticulado) também referido como livre pode complementar a composição de hidrogel. HA não modificado é comumente adicionado como um lubrificante para enchedores de tecido mole para assegurar fácil capacidade de injeção através de diminuição de força de extrusão requerida para injetar os produtos através de uma agulha ou cânula. Preferivelmente, o material bruto hialuronano livre usado para a produção da composição tem um peso molecular na faixa de cerca de 500 kDa a cerca de 3500 kDa. Entretanto, devido à rápida degradação de hialuro nano não estabilizado, aqueles versados na técnica entenderão que o desempenho in vivo da composição como enchedora de tecido mole é grandemente dirigido pelo polímero reticulado e as propriedades do hialuronano modificado com tiol subjacente. É preferido que o polissacarídeo não modificado seja compreendido em uma concentração menor que o polímero reticulado. Exemplarmente, um hialuronano não modificado está compreendido nas composições em concentrações de 3 mg/mL a 7 mg/mL, tal como 5 mg/mL, em que a concentração se refere preferivelmente à concentração de um sal, por exemplo, hialuronato de sódio.

[0069] A composição hidrogel pode incluir um agente anestésico local e/ou um ou mais componentes selecionados de uma variedade de outros componentes, tais como, fatores de crescimento, vitaminas, poli álcoois, haletos de metais alcalinos, minerais, antioxidantes, ami- noácidos, coenzimas, partículas cerâmicas (tais como partículas de cálcio hidroxil apatita), partículas poliméricas, polímeros (tais como po- lietileno glicol, glicosamino glicanos, lubricinas, polissacarídeos, e seus derivados), proteínas (tais como elastina, colágeno, ceratina, fibroína de seda), agentes anticelulite, agentes anticicatriz, agentes antiinfla- matórios, agentes antiirritantes, vasoconstritores, agentes anti- hemorrágicos (tais como agentes hemostáticos e agentes antifibrinolí- ticos), agentes de tensionamento, agentes antiacne, agentes de pigmentação, agentes antiflogísticos, agentes antirreumáticos, agentes antivirais, agentes antiinfecção, agentes antissépticos, agentes quimio- terapêuticos, agentes citostáticos, agentes antialérgicos, agentes anti- varicósicos, analgésicos, antibióticos, antimicóticos, espasmolíticos, anti-histaminas, agentes para tratamento de hemorroidas, agentes terapêuticos para tratamento de pele, e agentes umectantes.

[0070] A adição de um agente anestésico local à composição de hidrogel é particularmente desejável em vista de sua habilidade para mitigar dor na injeção. Preferivelmente, o agente anestésico é lidocaí- na, tal como na forma de um sal de adição ácida, por exemplo, lidoca- ína HCl.

[0071] Em um método para produção de hidrogel um agente anestésico local e/ou um ou mais componentes podem ser adicionados durante diferentes etapas de produção, isto é, em uma realização o agente anestésico local e/ou um ou mais componentes é/são adicionados durante opcional etapa c) ou em uma outra realização independentemente de adição de polímero não modificado, por exemplo, adicionado à solução durante etapa a) ou ao hidrogel obtido em etapa c) ou d). Em uma realização preferida um agente anestésico, por exemplo, lidocaína HCl, é adicionado durante etapa a) ou durante etapa c). Em uma realização , em que etapa c) precede etapa b), isto é, em que um hialuronano não modificado é adicionado antes para reticulação, é preferido que também um agente anestésico local e/ou ainda um ou mais componentes sejam incluídos antes da etapa de reticulação.

[0072] Além disso, será entendido que um componente principal da composição hidrogel é água. Preferivelmente água para injeção ou água purificada é usada para produção da composição. Além disso, será conhecido que a composição pode ser tamponada para exibir um pH fisiologicamente aceitável na faixa de 6,7 a 7,8. Tampões apropriados são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, por exemplo, tampão fosfato. A composição também exibe uma osmolali-dade fisiologicamente aceitável, que é similar à osmolalidade normal de fluido extracelular no sujeito a ser tratado (por exemplo, em humanos). Assim, a composição pode ter uma osmolalidade na faixa de 250-350 mOsmol/kg e pode incluir adicionais solutos para ajuste de osmolalidade, tais como cloreto de sódio, cloreto de cálcio, e/ou cloreto de potássio.

[0073] A composição de hidrogel é estéril e pode ser usada (em um método), em que a composição hidrogel é um medicamento, um cosmético ou dispositivo médico. O hidrogel é implantado, preferivelmente por injeção através de uma agulha ou cânula, em um sítio de aplicação, preferivelmente um tecido mole. Alternativamente, o hidro- gel pode ser implantado via um procedimento cirúrgico. Uma vez aplicado o hidrogel pode ser referido como implante ou depósito (hidro- gel). A composição hidrogel de acordo com a invenção é biocompatí- vel e forma um implante absorvível (isto é, biodegradável). Assim, a composição de hidrogel de acordo com a invenção é utilizável como enchedora de tecido mole. A composição de hidrogel característica de acordo com a invenção mostra boa tolerância e um efeito de formação de volume in vivo após implantação para um tecido mole em ratos e camundongos. Estes estudos suportam que o hidrogel é um valioso enchedor de tecido mole para várias aplicações.

[0074] Enchedores de tecido mole compreendendo biomateriais tal como hialuronano estabilizado são liberados para o sítio de tecido, em que aumento é desejado por meio de uma composição de hidrogel injetável. Os objetos dos usos ou métodos referindo-se a enchimento de tecido mole incluem aumento de tecido mole (dérmico), para corrigir anomalias congênitas, defeitos adquiridos ou defeitos cosméticos.

[0075] O principal efeito da composição de hidrogel é puramente físico e ela tem um efeito de enchimento baseado no volume original e o intumescimento do implante. Assim, na ausência de qualquer intera- ção fisiológica ou farmacológica, o uso pode ser classificado como cosmético e a composição pode ser considerada como um cosmético ou dispositivo médico. Aplicações, em que o uso da composição hi- drogel de acordo com a invenção pode ser considerada como cosmética incluem, por exemplo, a redução de sinais de idade, por exemplo - aplicação no tecido da vulva e vagina para propósitos de rejuvenescimento genital de fêmea, não cirúrgico. - aplicação na derme, aplicação subdérmica ou supraperi- osteal.

[0076] Exemplarmente, a composição de hidrogel pode ser usada (em um método) para propósitos cosméticos, por exemplo, para enchimento de rugas, para tratamento de defeitos de pele, para restauração de volume perdido da face ou o corpo (por exemplo, mama ou lóbulo de orelha), para redução de covinhas em celulite, para tratamento de deformidades através de laceração, para conformação de contornos da face ou corpo (por exemplo, aperfeiçoamento de nádegas, aumento de quadril, aumento de panturrilha), para aumento de pênis (aperfeiçoamento de girth penile, aumento de pênis glans).

[0077] Em outros casos o enchimento e aumento de um tecido mo le pode resultar em um tratamento ou prevenção de uma doença, isto é, em que sintomas da doença são reduzidos, aliviados e/ou evitados de (re)ocorrência. Doenças que são causadas por um defeito de tecido mole podem se beneficiar do enchimento estrutural, amortecimento, suporte ou aumento temporário e/ou local do tecido circundante pelo hidrogel aplicado. Doenças, em que a composição hidrogel pode ser usada para tratamento ou prevenção incluem, por exemplo, - metatarsalgia, uma doença de dor da almofada gorda da bola do pé, para qual uso a composição hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicada na almofada gorda da bola do tecido mole do pé, - incontinência urinária ou fecal, para cujas indicações a composição hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicada no tecido definindo esfíncteres, - atrofia vulvovaginal (também síndrome genito-urinária de menopausa), para cuja indicação a composição hidrogel de acordo com a invenção pode ser aplicada na área vulvovaginal via injeção na mucosa vaginal e o vestíbulo e/ou para aumento de lábia majora, em que uma reconstrução da lábia majora assegurará um contato próximo entre ambos lábia majora para proteger as estruturas internas da vulva, - prejuízo de corda vocal, - insuficiência de válvula venosa, ou - lipoatrofia facial, cicatrizes debilitantes ou assimetria morfológica ou deformação (congênita ou resultante como consequência de trauma ou cirurgia, por exemplo, do tórax ou da face), para cujas indicações o hidrogel é aplicado para propósitos reconstrutivos.

Exemplos Exemplo 1 - Determinação de grau de modificação

[0078] Quantificação de grupos tiol em um hialuronano modificado com tiol (HA-SH) usado como material bruto para preparação de composições hidrogel é baseada em um método de química úmida empregando 2,2’-ditio dipiridina (DTDP). Metades de tiol livres que estão co- valentemente ligadas a uma cadeia principal polimérica sofrem reação de troca de tiol - dissulfeto com DTDP, enquanto um equivalente de uma tiona cromofórica é liberado. Em meio ácido tamponado (pH = 4), a absorção da resultante tiona pode ser medida fotometricamente em 343 nm.

[0079] Cerca de 420 mg de hialuronano modificado com tiol foram precisamente pesados e dissolvidos em 30 g de HCl 0,01 N sob agitação magnética contínua por 2-3 horas para preparar uma solução estoque. Então, cerca de 310 mg da solução estoque foram precisamen- te pesados e misturados com 4200 mg de tampão acetato pH 4 em um tubo Eppendorf para preparar uma solução amostra. Três soluções amostras foram preparadas de cada solução estoque. 25,0 mg de N- acetil cisteína foram precisamente pesados e dissolvidos em 25,0 mL de tampão acetato (pH 4). Esta solução foi então ainda diluída com tampão acetato (pH 4) para a preparação de uma curva de calibração. Tampão acetato foi usado para o valor branco. 500 μL de uma solução contendo 0,125 mg/mL de DTDP em tampão acetato (pH 4) foram adicionados a 500 μL de cada solução amostra (curva de calibração, solução amostra e valor branco). As soluções foram brevemente homogeneizadas e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Fi-nalmente, cada amostra (curva de calibração, solução amostra e valor branco) foi transferida em microcubetas e medida em 342 nm em um espectrofotômetro contra o valor de branco.

Exemplo 2 - Determinação de teor de tiol residual

[0080] Para a determinação do teor de tiol residual do polímero reticulado na composição de hidrogel (isto é, o polímero HA-SH após reticulação e produção das composições) foi usado um método similar como descrito acima.

[0081] Cerca de 50 mg de cada hidrogel amostra foram precisamente pesados e misturados com 1,3 mL de uma solução contendo 0,125 mg/mL de DTDP em tampão acetato (pH 4). 25,0 mg de N-acetil cisteína foram precisamente pesados e dissolvidos em 200,0 mL de tampão acetato (pH 4). Esta solução então ainda foi diluída com tampão acetato (pH 4) para a preparação de uma curva de calibração. Tampão acetato foi usado para o valor de branco. 500 μL de uma solução contendo 0,125 mg/mL de DTDP em tampão acetato (pH 4) foram adicionados a 500 μL de cada amostra da curva de calibração e o branco. Todas as amostras foram incubadas sob agitação contínua por 120 minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação de todas as amostras 500 μL de cada sobrenadante ainda foram diluídos com 500 μL de tampão acetato e medidos em 342 nm em um espectrofo- tômetro contra o valor de branco.

Exemplo 3 - Métodos de produção de um hidrogel Método A

[0082] Dissolução: hialuronano modificado com tiol, hialuronano não modificado, e lidocaína HCl são concomitantemente dissolvidos em uma solução aquosa.

[0083] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol para pontes dissulfeto através de oxigênio.

[0084] Peneiramento: Opcionalmente o hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado, hialuronano não modificado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0085] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hydrogel em seringas.

Método B

[0086] Dissolução: hialuronano modificado com tiol, hialuronano não modificado, e lidocaína HCl são simultaneamente dissolvidos em uma solução aquosa ácida.

[0087] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol para pontes dissulfeto através de um agente de oxidação e oxigênio.

[0088] Peneiramento: Opcional mente o hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado, hialuronano não modificado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0089] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hydrogel em seringas.

Método C

[0090] Dissolução: Hialuronano modificado com tiol é dissolvido em uma solução aquosa; uma solução separada compreendendo hia- luronano não modificado e lidocaína HCl em tampão fosfato (pH 6,8 - 7,6) é preparada.

[0091] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol para pontes de dissulfeto por oxigtênio.

[0092] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano mo dificado com tiol reticulado é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0093] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e a solução compreendendo hialuronano não modificado e lidocaína HCl são homogeneizadas e opcionalmente prensadas através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0094] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hydrogel em seringas.

Método D

[0095] Dissolução: hialuronano modificado com tiol é dissolvido em uma solução aquosa; uma solução separada compreendendo hialuro- nano não modificado e lidocaína HCl em tampão fosfato (pH 6,8-7,6) é preparada.

[0096] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol para pontes dissulfeto através de um agente de oxidação e oxigênio.

[0097] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano mo dificado com tiol reticulado é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0098] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e a solução compreendendo hialuronano não modificado e lidocaína HCl são homogeneizadas e opcionalmente prensadas através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[0099] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hydrogel em seringas.

Método E

[00100] Dissolução: hialuronano modificado com tiol e lidocaína HCl são dissolvidos em uma solução aquosa, uma solução separada compreendendo hialuronano não modificado em tampão fosfato (pH 6,87,6) é preparada.

[00101] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol para pontes de dissulfeto através dde oxigênio.

[00102] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00103] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol e lidocaína HCl e a solução compreendendo hialu- ronano não modificado são homogeneizadas e opcionalmente prensadas através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00104] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método F

[00105] Dissolução: hialuronano modificado com tiol e lidocaína HCl são dissolvidos em uma solução aquosa ácida; uma solução separada compreendendo hialuronano não modificado em tampão fosfato (pH 6,8-7,6) é preparada.

[00106] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto através de um agente de oxidação e oxigênio.

[00107] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00108] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e lidocaína HCl e a solução compreendendo hialuronano não modificado são homogeneizados e opcionalmente passados através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00109] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método G

[00110] Dissolução: hialuroinano modificado com tiol, hialuronano não modificado, e lidocaína HCl são consecutivamente dissolvidos em uma solução aquosa.

[00111] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto através de oxigênio.

[00112] Peneiramento: Opcional mente o hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado, hialuronano não modificado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00113] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método H

[00114] Dissolução: hialuronano modificado com tiol, hialuronano não modificado, e lidocaína HCl são consecutivamente dissolvidos em uma solução aquosa ácida.

[00115] Reticulação: após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hia- luro nano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto através de um agente de oxidação e oxigênio.

[00116] Peneiramento: opcional mente o hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado, hialuronano não modificado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00117] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método I

[00118] Solução de dissolução 1: hialuro nano modificado com tiol, hialuronano não modificado e lidocaína HCl são simultaneamente dissolvidos em água.

[00119] Solução de reticulação 1: Após ajuste do pH para cerca de 6,8 a 7,6 hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto por um agente de oxidação e oxigênio.

[00120] Solução de dissolução 2: hialuronano modificado com tiol, hialuronano não modificado, e opcionalmente lidocaína HCl são concomitantemente dissolvidos em água.

[00121] Reticulação: O pH de solução 2 é ajustado para cerca de 6,8 a 7,6, seguido imediatamente por mistura de partes iguais da solução reticulada 1 com solução 2. Hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto por um agente de oxidação e oxigênio.

[00122] Peneiramento: Opcionalmente o hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado, hialuronano não modificado e lidocaína HCl é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00123] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método J

[00124] Dissolução: hialuronano modificado com tiol e hialuronano não modificado são dissolvidos em uma solução aquosa; uma solução separada compreendendo lidocaína HCl é preparada.

[00125] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,7 a 7,8 hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto através de oxigênio.

[00126] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e hialuronano não modificado é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00127] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e hialuronano não modificado e a solução compreendendo lidocaína HCl são homogeneizadas e opcional mente prensadas através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00128] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Método K

[00129] Dissolução: hialuronano modificado com tiol e hialuro nano não modificado são dissolvidos em uma solução aquosa; uma solução separada compreendendo lidocaína HCl é preparada.

[00130] Reticulação: Após ajuste do pH para cerca de 6,7 a 7,8 hialuronano modificado com tiol é reticulado via a oxidação de grupos tiol a pontes dissulfeto através de um agente de oxidação e oxigênio.

[00131] Peneiramento: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e hialuronano não modificado é prensado através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00132] Homogeneização: O hidrogel compreendendo hialuronano modificado com tiol reticulado e hialuronano não modificado e a solução compreendendo lidocaína HCl são homogeneizadas e opcionalmente prensadas através de uma placa de filtro com um definido tamanho de tela (uma ou múltiplas vezes).

[00133] Esterilização: Autoclavagem após enchimento do hidrogel em seringas.

Exemplo 4 - Determinação de módulo elástico G’

[00134] Medições reológicas oscilatórias de todas as composições foram realizadas usando um reômetro Anton Paar MCR 102 com um sistema de cone - placa. As composições foram transferidas para o reômetro via injeção através de uma agulha 27G (ou sem agulha, em que indicado). O módulo elástico foi obtido durante um teste de frequência com deformação constante dentro de região viscoelástica linear do hidrogel em uma temperatura de 25oC e uma frequência de 1 Hz.

Exemplo 5 - Determinação de peso molecular

[00135] Um sistema SEC multidetetor, de temperatura controlada Viscotek TDAmax compreendendo detetores de alta sensitividade em séries - Arranjo de Fotodiodo UV, Dispersão de Luz (ambos RALS e LALS), Índice de Refração e Viscosímetro foi usado para as medições. O detetor de índice de refração anotou a concentração da amostra resultando na respectiva curva de distribuição. Em combinação com os detetores de dispersão de luz, o peso molecular (MW) foi determinado. Para análise de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), amostras foram diluídas com PBS resultando em uma concen-tração final de polímero de 0,1 mg/mL.

[00136] Erros ou flutuações que ocorrem durante este teste tipicamente resultam em um desvio de cerca de 10%.

[00137] Amostras para determinação do peso molecular após esterilização reduzido médio (MRPMW) foram preparadas através de dispersão de cerca de 200 mg da composição hidrogel investigada estéril em 1,8 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubação por 2 horas em temperatura ambiente. Hial uronan o modificado com tiol reticulado foi separado de hialuronano livre via centrifugação. O precipitado foi novamente disperso em PBS. Após repetitivas etapas de extração / centrifugação, o gel residual foi tratado com um agente redutor (TCEP.HCl (cloridrato de tris(2-carboxi etil) fosfina)) por 3 horas para clivar pontes dissulfeto seguido por acidulação da resultante solução com HCl 5 N (redução). O hialuronano modificado com tiol reduzido foi precipitado com etanol e recuperado por centrifugação (um hialuronano modificado com tiol da composição hidrogel estéril). O precipitado foi dissolvido em 4 mL de uma solução aquosa contendo um agente de capeamento para metades de tiol livres (ácido 2-(2-amino etil disulfanil) piridino-3-carboxílico) em uma concentração de 2 mg/mL. Após 3 horas de incubação em temperatura ambiente a amostra ainda foi diluída com PBS.

[00138] Alternativamente, o MRPMW do polímero reticulado foi determinado através de um método de subtração. Ambas abordagens resultam em valores similares. Após esterilização de uma composição de hidrogel compreendendo polímero reticulado e hialuronano livre um agente redutor foi adicionado ao hidrogel para quebrar quantitativamente ligações dissulfeto. A distribuição de MW de hialuro nano modificado com tiol em sua forma reduzida e hialuronano livre foi então determinada simultaneamente (Mw(total)). Em adição, o MW de hialuronano livre foi determinado: 200 mg da composição de hidrogel investigada estéril foram dispersos em 1,8 mL de solução salina tam- ponada com fosfato (PBS) e incubada por 2 horas em temperatura ambiente. Após centrifugação o sobrenadante foi usado para análise SEC do MW de hialuronano livre (Mw(HA)).

[00139] Através de determinação de peso molecular do hialurona- no livre (Mw(HA)) e o peso molecular combinado do hialuronano livre e hialuronano modificado com tiol reduzido (Mw(total)), o MRPMW (aqui Mw(HA-SH)) pode ser calculado de acordo com a equação (I), em que CHA e CHA-SH representam a fração de hialuronano livre e hia- luronano modificado com tiol reduzido, respectivamente.

[00140] Resultados comparativos são dados em Tabela 1 com o correspondente peso molecular médio (MMW) do material bruto HASH usado para produção de hidrogel. Tipicamente, o MRPMW é menor que o MMW. A produção da composição de hidrogel influencia a distribuição de peso molecular.

Exemplo 6 - Formulação de composições

[00141] Várias composições de hidrogel estéreis são listadas na Tabela 1, em que a principal diferença entre as composições está nas características do polímero reticulado, que é um produto de oxidação de hialuronano modificado com tiol (HA-cisteamina). Hidrogéis compreendendo 17 mg/mL de HA reticulado - cisteamina, 5 mg/mL de hia- luronato de sódio não modificado e 3 mg/mL delidocaína HCl foram produzidos em um método similar (comparar métodos B e H acima). O MMW e o grau de modificação (DoM) das propriedades do material bruto hialuronano modificado com tiol (HA-SH) assim como o MRPMW, o módulo elástico G’ e o teor de tiol residual do polímero re-ticulado foram determinadas como descrito acima. Tabela 1. Lista de 10 composições de hidrogel estéreis cada uma compreendendo um diferente polímero reticuladoUm asterisco (*) indica aqueles exemplos que não caem sob o escopo das reivindicações mas são incluídos para comparação. S.D. abrevia desvio padrão.

[00142] A formação de ligações dissulfeto foi monitorada via medição de teor de tiol residual dos polímeros reticulados e comparação com o grau inicial de modificação dos materiais brutos de polímero hia- luronano modificado com tiol. Foi verificado que em todas as 10 composições mais que 98% dos grupos tiol inicialmente disponíveis do polímero foram oxidados durante produção.

[00143] Ambos, o MRPMW do polímero reticulado e o grau inicial de modificação com grupos tiol do material bruto hialuronano modificado com tiol influenciaram as propriedades elásticas dos hidrogéis com a mesma concentração de hialuronano reticulado. Uso de polímeros hia- luronano modificados com tiol com um maio r grau de modificação para a produção das composições de hidrogel resultou em maiores taxas de reticulação como claramente evidenciado por aumentadas propriedades elásticas dos hidrogéis. Quando comparando composições hi- drogéis preparadas com hialuronano modificado com tiol com um grau médio de modificação com grupos tiol na faixa de 119 μmoles a 150 μmoles por grama de polímero (composições de hidrogel ID2, ID5, ID8 e ID10) a influência do MRPMW sobre as propriedades elásticas dos hidrogéis é claramente evidente. O módulo elástico de composições de hidrogel ID2, ID5 e ID8 estava acima de 1000 Pa. O mesmo efeito foi observado quando comparando composições de hidrogel preparadas com hialuronano modificado com tiol com um baixo grau de modificação (composições de hidrogel ID1*, ID4* e ID7*). Para composi-ções de hidrogel preparadas com hialuronano modificado com tiol com um alto grau de modificação (composições de hidrogel ID3*, ID6* e ID9*) a influencia do MRPMW de polímero sobre as propriedades elásticas foi menos pronunciada.

Exemplo 7 - Caracterização in vivo de composições de hidrogel implantadas

[00144] Várias composições de acordo com a invenção assim como composições comparativas foram investigadas para o desenvolvimento do volume de depósito médio sobre tempo após implantação via injeção. Dez composições diferentes de hidrogéis resumidos na Tabela 1 foram testadas.

[00145] As composições foram injetadas intradermicamente na pele das costas de ratos Sprague Dawley fêmeas usando 16 animais testes com uma média de 12 aplicações por composição . Oito depósitos foram aplicados por rato. 50 μL da respectiva composição foram injetados por depósito usando uma agulha 25 G e o volume dos depósitos gerados foi monitorado por MRI (Siemens Espree 1.5 T MRT device) em pontos de tempo distintos para um período de tempo total de 188 dias.

[00146] Volumes de depósito de hidrogel individuais (mm3) foram calculados de acordo com explorações MRI e monitorados sobre o tempo. Volumes calculados foram normalizados para resultados obtidos em dia 0 (imediatamente após aplicação) e são indicados em porcentagem (%). A figura 2 mostra o desenvolvimento do volume de depósito para quatro composições exemplares. Os volumes de depósitos relativos médios em dia 84 e dia 188 de diferentes composições são listados na Tabela 2 para todas as 10 composições.Tabela 2: Volume de depósito relativo médio medido no dia 84 e dia 188 em porcentagemUm asterisco (*) indica aqueles exemplos que não caem sob o escopo das reivindicações mas são incluídos para comparação.

[00147] Com a exceção de duas composições compreendendo hia- luronano modificado com tiol reticulado com um grau inicial de modificação abaixo de 50 μmoles de grupos tiol por grama de polímero (composições de hidrogel ID 1* e ID 4*), todos os depósitos de hidro- gel foram detectados pelo menos por 6 meses. Entretanto, somente três composições compreendendo um hialuronano modificado com tiol reticulado com um grau médio de modificação tiol (composições de hidrogel ID 2, ID 5 e ID 8) e um módulo elástico de mais que 1000 Pa (um MPRMW de mais que 200 kDa) mostraram um efeito de formação de volume durante 6 meses de duração de estudo. Os volumes de depósitos de todas as outras composições foram diminuídos por 50% e mais durante esta estrutura de tempo.

Exemplo 8 - Formulação e caracterização de composições hidro- gel ID11 a ID15 compreendendo um hialuronano modificado com tiol reticulado com um DoM de 151 μmoles por g de polímero

[00148] Uma composição hidrogel estéril compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de sódio de cisteamina, 3 mg/mL de li- docaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado foi produzida de acordo com o método G. Em resumo, 3580 mg de HA - sal de sódio de cisteamina (peso seco, MMW de 730 kDa, grau de modificação de 151 μmoles/g de polímero), 600 mg de lidocaína HCl (peso seco) e 1160 mg de NaCl foram dissolvidos em 185 g de água para injeção sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 3 horas. 1000 mg de hialuronato de sódio (peso seco, MW 2400kDa) foram então adicionados à solução sob agitação continuada em temperatura ambiente por cerca de outras 3 horas. Tampão fosfato pH 11 foi então adicionado para uma quantidade final de 200 g de composição. A solução foi homogeneizada por cerca de 15 minutos. Após incubação por toda noite em temperatura ambiente o hidrogel agora reticulado foi prensado através de uma placa de filtro com um tamanho de tela de 200 μm. O hidrogel foi então enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizado via autoclavagem (121oC / 15 minutos). O módulo elástico foi determinado em analogia ao Exemplo 4. O hi- drogel foi aplicado ao rreômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha) e G’ foi determinado ser 1619 +/- 143 Pa. O hidrogel estéril teve um pH de 7,34 e uma osmolalidade de 337 mOsmol/kg (hidrogel ID11).

[00149] Grau de modificação (DoM), MRPMW, e teor de tiol residual foram determinados como descrito acima e são resumidos na Tabela 3.Tabela 3: Características de uma composição hydrogelA abreviação S.D. representa desvio padrão

[00150] O mesmo hialuronano modificado com tiol (MMW 730 kDa, grau de modificação de 151 μmoles/g de polímero) foi usado para produzir quatro composições de hidrogel estéreis compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de sódio de cisteamina, 3 mg/mL de li- docaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado de acordo com o método A (sem peneiramento), método A (com penei- ramento), método B (sem peneiramento) e método E (com peneira- mento), respectivamente, como descrito no exemplo 4.

[00151] Todas as composições tiveram uma osmolalidade na faixa de 270 a 330 mOsmol/kg e um pH fisiologicamente aceitável (ver Tabela 4). O módulo elástico G’ das composições (determinado após injeção através de uma agulha 27G), o MRPMW e o teor de tiol residual de po límero reticulado no hidrogel foram determinados como descrito acima. Teor de grupo tiol residual e MRPMW do polímero reticulado em composição ID14 não foram determinados. Composição ID12 e ID14 foram produzidas da mesma batelada de hidrogel, a única diferença sendo a etapa de peneiramento. Uma vez que peneiramento não é esperado influenciar MRPMW e teor de tiol residual do polímero reticulado valores idênticos como obtidos com composição ID12 podem ser assumidos para composição ID14. Os resultados são listados na Tabela 4.

[00152] Estas composições foram testadas in vivo similarmente à montagem de teste descrita no exemplo 7 com 12 aplicações intra- dérmicas por composição. Todas as composições tiveram um efeito de formação de volume durante os primeiros 142 dias do estudo (dados não mostrados) como evidenciado por um volume de depósito relativo médio de 100% ou mais medido neste ponto de tempo e todos os prévios pontos de tempo (dia 28, dia 61, dia 84, dia 114). Após 168 dias de duração de estudo um volume de depósito relativo médio de composições ID14 e ID15 de menos que 100% foi medido. Após um certo tempo, uma redução do volume de depósito é para ser esperada uma vez que as composições são biodegradáveis. Uma comparação do volume de depósito relativo médio em dia 84 e em dia 168 é mostrada na Tabela 4.Tabela 4: Volume de depósito relativo médio medido no dia 84 e dia 168 em porcentagem.A abreviatura S.D. representa desvio padrão.

Exemplo 9 - Formulação e caracterização de uma composição hi- drogel ID16 compreendendo um hialuronano modificado com tiol reticulado com um DoM de 176 μmoles de grupos tiol por g de polímero

[00153] Um hialuronano modificado com tiol com um grau de modificação de 176 μmoles de grupos tiol por g de polímero (MMW 750 kDa) foi usado para produzir uma composição de hidrogel estéril compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de sódio de cisteami- na, 3 mg/mL de lidocaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado. A composição de hidrogel ID16 foi produzida de acordo com o método A com uma etapa de peneiramento. Peso molecular após esterilização reduzido médio (MRPMW) de polímero reticulado na composição foi de 408 kDa. O módulo elástico foi determinado em analogia ao Exemplo 6. O hidrogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha) e G’ foi determinado ser 2.052.100 mPa. O hidrogel estéril teve um pH de 7,17 e uma osmolali- dade de 316 mOsmol/kg.

[00154] A composição foi testada in vivo similarmente à montagem teste descrita acima em Exemplo 7 com 12 aplicações intradérmicas. A composição teve um efeito de formação de volume durante 81 dias de duração de estudo (dados não mostrados) como evidenciado por um volume de depósito relativo médio de 100% ou mais medido neste ponto de tempo e todos os prévios pontos de tempo (dia 23, dia 53).

Exemplo 10 - Formulação e caracterização de uma composição hidrogel ID17 compreendendo um hialuronano modificado com tiol com um MRPMW de 300 kDa

[00155] Um hialuronano modificado com tiol com um grau de modificação de 142μmoles de grupos tiol por g de polímero (MMW 710 kDa) foi usado para produzir uma composição hidrogel estéril compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de s'odio de cisteami- na, 3 mg/mL de lidocaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado. A composição de hidrogel ID17 foi produzida de acordo com o método A com uma etapa de peneiramento. Peso molecular após esterilização reduzido médio (MRPMW) de polímero reticulado na composição foi 300 kDa. O módulo elástico foi determinado em analogia ao Exemplo 4. O hidrogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha) e G’ foi determinado ser 1.243.500 mPa. O hidrogel estéril teve u m pH de 7,65 e uma osmola- lidade de 287 mOsmol/kg. A composição foi testada in vivo similar-mente à montagem de teste descrita acima no Exemplo 7 com 12 aplicações intradérmicas. A composição teve um efeito de formação de volume durante 133 dias de duração de estudo (dados não mostrados) como evidenciado por um volume de depósito relativo médio de 100% ou mais medido neste ponto de tempo e todos os pontos de tempo prévios (dia 23, dia 53, dia 81, dia 107).

Exemplo 11 - Formulação e caracterização de uma composição hidrogel estéril ID 18

[00156] Uma composição hidrogel estéril (ID18) compreendendo 14 mg/mL de HA reticulado - cisteamina, 3 mg/mL de lidocaína HCl e 7 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado foi produzida de acordo com o método B. Em resumo, 2100 mg de HA - cisteamina (peso seco, MMW 700 kDa, grau de modificação de 131 μmoles / g de polímero), 450 mg de licocaína HCl (peso seco) e 1050mg de hialuronato de sódio (peso seco, MMW 2238 kDa) foram dissolvidos em 130 g de tampão fosfato 10 mM pH 7,1 (compreendendo NaCl 88 mM) sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 17 horas. Após ajuste do pH para cerca de pH 7,1 com solução 1 M de hidróxido de sódio, tampão fosfato 10 mM pH 7,1 (compreendendo NaCl 88 mM) foi adicionado para uma quantidade final de 150 g de composição. A solução foi homogeneizada por cerca de 60 minutos. Então, 1,6 mL de uma solução 0,307% (v/v) de peróxido de hidrogênio foram adicionados. Após incubação por toda noite em temperatura ambiente o hidro- gel reticulado foi enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizados via autoclavagem. O hidrogel estéril teve um pH de cerca de 7 e uma osmolalidade de cerca de 270 mOsmol/kg.

[00157] O grau de modificação (DoM), MMW, MRPMW, e módulo elástico G’ foram determinados como descrito acima e são resumidos na Tabela 5. Para a determinação de módulo elástico G’ o hidrogel foi aplicado diretamente ao reômetro a partir da seringa (sem ligação de agulha).Tabela 5: Características de uma composição hydrogel

Exemplo 12 - Síntese de agentes de modificação transportando grupo tiol A. Preparação de dicloridrato de bis(glicil) cistamina:

[00158] A uma mistura de dicloridrato de cistamina (1 g, 4,44 mmoles) e N-(t-butoxi carbonil) glicina (1,59 g, 9,10 mmoles) em diclorome- tano seco : THF = 1 : 1 (20 mL); primeiro trietilamina (1270 μL, 9,16 mmoles) foi adicionada, seguido pela adição de uma solução de EDC*HCl (1,75 g, 9,10 mmoles) em diclorometano. A solução de reação foi agitada por 5 horas em temperatura ambiente, então voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi tomado em acetato de etila (250 mL) e lavado com HCl 1 N (2x50 mL), NaHCO3 meio ssaturada (50 mL) e água (50 mL). A camada orgânica foi seca-da sobre Na2SO4, voláteis foram evaporados sob pressão reduzida para render a bis(glicil)-cistamina protegida com N-Boc como um óleo incolor. Rendimento: 1,575 g (88%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97 (s, 1H, NH), 5.53 (s, 1H, NH), 3.81 (d, J=5.8 Hz, 2H, α-CH2), 3.58 (aq, J=6.3 Hz, 2H, -CH2-NH-), 2.82 (t, 2H, -CH2-S- ), 1.45 (s, 9H, -CH3 t- Bu); m/z = 467.1 [M+H]+, 489.1 [M+Na]+.

[00159] A uma solução da bis(glicil)-cistamina protegida com N-Boc (300 mg, 0,64 mmoles) em MeOH (5 mL) foi adicionado cloreto de acetila (300 μL, 4,20 mmoles). Após a reação exotérmica ter cessado, a mistura foi agitada em um frasco selado por 5 horas em temperatura ambiente, então toluene (2 mL) foi adicionado e voláteis foram evaporados até o produto ter precipitado. O sólido branco foi isolado via filtração com sucção e lavado com n-pentano (2x5 mL). Rendimento: 146 mg (67%). p.f. = 184oC (decomposição); 1H NMR (400 MHz, D2O) δ 3.81 (s, 2H, α-CH2), 3.59 (at, J=6.3 Hz, 2H, -CH2-NH), 2.88 (at, 2H, - CH2-S- ); m/z = 266.9 [M+H]+, 288.9 [M+Na]+.

[00160] Este agente de modificação permite a preparação de um conjugado de hialuronano - glicil - cisteamina (Figura 3 B).

B. Preparaçãode diidrazida de ácido ditio dietano diil dicarbonil diamino diacético (DGDTPDH)

[00161] A uma mistura de ácido 3,3’-ditio dipropiônico (2 g, 9,5 mmoles) e cloridrato de glicino etil éster (2,66 g, 19,0 mmoles) em di- clorometano seco : THF = 1:1 (20 mL) foi adicionada trietilamina (2,78 μL, 20,0 mmoles), seguida pela adição de uma solução de EDC*HCl (3,83 g, 20,0 mmoles) em diclorometano. A reação foi agitada por 5 horas em temperatura ambiente, então diluída com acetato de etila (400 mL). A camada orgânica foi lavada com HCl 1 N (2x50 mL), NaHCO3 meio saturada (50 mL) e água (50 mL), então secada sobre sulfato de sódio e voláteis foram evaporados sob pressão reduzida para renderem dietil éster de ácido ditio dietano diil dicarbonil diamino diacético como um sólido branco. Rendimento: 1,69 g (47%); p.f. = 121oC; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.50 (s, 1H, NH), 4.21 (q, J=7.1 Hz, 2H, -O-CH2-), 4.04 (d, J=5.3 Hz, 2H, α-CH2-N), 2.99 (t, J=7.0 Hz, 2H, -CH2-S-), 2.67 (t, 2H, α-CH2-CH2-), 1.28 (t, 3H, -CH3); m/z = 381.0 [M+H]+, 403.0 [M+Na]+.

[00162] Uma mistura do dietil éster (500 mg, 1,32 mmoles) e hidrato de hidrazina aq. 80% (0,5 mL , 12,7 mmoles) em EtOH 96% foi reflu- xada por 5 horas. O produto cristalizou com resfriamento para temperatura ambiente e foi coletado via filtração com sucção e inteiramente lavado co m EtOH frio (2x15 mL). Rendimento: 335 mg (72%), agulhas brancas; p.f. = 197oC (decomposição). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.02 (s, 1 H, -NH), 8.20 (t, J=5.7 Hz, 1 H, -NH), 4.19 (s, 2H, -NH2), 3.64 (d, J=5.8 Hz, 2H, a-CH-N), 2.87 (t, J=7.2 Hz, 2H, -CH2-S-), 2.53 (t, 2H, a-CH2-CH2-); m/z = 353.1 [M+H]+, 375.1 [M+Na]+.

[00163] Este agente de modificação permite a preparação de um conjugado de hialuronano - hidrazida de ácido 2-mercapto etil carbonil amino acético (Figura 3 D).

C. Preparação de dicloridrato de 4,4’-ditio bis[1-butanamina]

[00164] Dicloridrato de 4,4’-ditiobis[1-butanamina] foi preparado de 4-amino butan-1-ol seguindo protocolos reportados na literatura (Au- fort, M. et al., ChemBioChem. 12(4), 583-592, 2011), desproteção de N-Boc final foi adotada e realizada com MeOH/HCl para obter o produto como sal dicloridrato ao i nvés. A uma solução de dicarbamato (550 mg, 1,35 mmoles) em metanol (6 mL) foi adicionado cloreto de acetila (0,6 mL, 8,4 mmoles) em gotas. Quando a reação exotérmica cessou, a mistura foi refluxada por 5 horas. Então tolueno foi adicionado (6 mL) e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi submetido a repetida azeotropia com tolueno (6 mL), então isolado via filtração com sucção e lavado com n-pentano (2x6 mL). Rendimento: 340 mg (90%), sólido branco, p.f. = 249oC (decomposição); 1H NMR (400 MHz, D2O+DSS) δ 3.02 (t, J=7.1 Hz, 4H, CH2-N), 2.78 (t, J=6.7 Hz, 4H, -CH2-S-), 1.83-1.71 (m, 8H, C-CH2-CH2-C); m/z = 209.0 [M+H]+.

[00165] Este agente de modificação permite a preparação de uma N-mercapto-n-butil hialuronamida (Figura 3 C).

Exemplo 13 - Formulação e caracterização de uma composição hi- drogel compreendendo hialuronano reticulado - glicil cisteamina

[00166] Uma composição hidrogel (ID 19) compreendendo 17,9 mg/mL de hialuronano reticulado - sal de sódio de glicil esteamina (HA-GLYC) e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não-modificado foi produzida de acordo com o método B sem adição de lidocaína HCl. Em resumo, 537 mg de HA-GLYC (peso seco, MMW 610 kDa, grau de modificação de 162 μmoles/g de polímero, Figura 3 B) e 150 mg de hialuronato de sódio (peso seco, MMW 2,4 MDa) foram dissolvidos em 26 g de HCl 0,01 M (compreendendo NaCl) sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 5 horas. A 19,02 g desta solução foram adicionados 2115 mL de tampão fosfato 100 mM pH 11,85, o que resultou em um ajuste do pH para cerca de pH 7,4. Então 273 μL de uma solução 0,3% de H2O2 foi adicionada e a mistura foi homogeneizada por 15 minutos em temperatura ambiente e então deixada por toda a noite para reticulação. O hidrogel reticulado foi enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizado via autoclavagem. O hidrogel estéril teve um pH de cerca de 7,2.

[00167] Grau de modificação (DoM), MMW, teor de tiol residual, e módulo elástico G’ foram determinados como descrito acima e são resumidos na Tabela 6. Para a determinação de módulo elástico G’ o hidrogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha).Tabela 6: Características de uma composição hydrogel

Exemplo 14 - Formulação e caracterização de uma composição hi- drogel estéril compreendendo hialurano reticulado - homocisteína

[00168] Uma composição hidrogel (ID 20) compreendendo 17,9 mg/mL de hialurano reticulado - sal de sódio de homocisteína (HA- HCYS) e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado foi produzida de acordo com o método A sem adição de lidocaína HCl. Em resumo, 537 mg de HA-HCYS (Figura 3 A, peso seco, MMW 610 kDa, grau de modificação 136 μmoles/g de polímero, Figura 3 A) e 150 mg de hialuronato de sódio (peso seco, MMW 2,4 MDa) foram dissolvidos em 26 g de HCl 0,01 M (compreendendo NaCl) sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 5 horas seguido por 1 hora de tempo de descanso para remoção de bolhas de ar. A 23,68 g da solução , 2,63 mL de tampão fosfato 100 mM pH 12,04 foram adicionados, o que resultou em um ajuste do pH da solução para cerca de pH 7,2. A mistura foi deixada por 48 horas em temperatura ambiente para reticu- lação, então o hidrogel reticulado foi enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizado via autoclavagem. O hidrogel estéril teve um pH de cerca de 7,0.

[00169] O grau de modificação (DoM), MMW, teor de tiol residual, e módulo elástico foram determinados como descrito acima e são resumidos na Tabela 7. Para a determinação de módulo elástico G’ o hi- drogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha).Tabela 7: Características de uma composição hydrogel

Exemplo 15 - Formulação e caracterização de uma composição hidrogel estéril compreendendo hialuronano reticulado - hidrazi-da de ácido 2-mercapto etil carbonil amino acético

[00170] Uma composição hidrogel estéril (ID 21) compreendendo 17,9 mg/mL de hialuronano reticulado - sal de s'odio de hidrazida de ácido 2-mercapto etil carbonil amino acético (HA-DGDTPDH) e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado foi produzido de acordo com o método B sem adição de lidocaína HCl. Em resumo, 537 mg de HA-DGDTPDH (Figura 3 D, peso seco, MMW 770 kDa, grau de modificação de 134 μmoles/g de polímero) e 150 mg de hialuronato de sódio (peso seco, MMW 2,4 MDa) foram dissolvidos em 26 g de HCl 0,01 M (compreendendo 192 mg de NaCl) sob agitação mecânica em tem-peratura ambiente por cerca de 5 horas. A 20,20 g desta solução, 2,25 mL de tampão fosfato 100 mM pH 12,07, contendo H2O2 0,041% foram adicionados, o que resultou em um ajuste do pH da solução para cerca de pH 7,0. A mistura foi deixada por 18 horas em temperatura ambiente para reticulação. O hidrogel reticulado foi então enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizado via autoclavagem. O hidrogel estéril teve um pH de cerca de 7,0 e uma osmolalidade de 326 mOsmol/kg.

[00171] O grau de modificação (DoM), MMW, teor de tiol residual, e módulo elástico G’ foram determinados como descrito acima e são resumidos na Tabela ,8. Para a determinação de módulo elástico G’ o hidrogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha).Tabela 8: Características de uma composição hydrogel

Exemplo 16 - Formulação e caracterização de uma composição hidrogel compreendendo N-mercapto-n-butil hialuronamida reticulada

[00172] Uma composição hidrogel estéril (ID 22) compreendendo 17,9 mg/mL de sal de sódio de N-mercapto-n-butil hialuronamida reticulada e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado foi produzida de acordo com o método B sem adição de lidocaí na HCl. Em resumo, 537 mg de sal de sódio de N-mercapto-n-butil hialuronamida (Figura 3 C, peso seco, MMW 767 kDa, grau de modificação de 98 μmoles/g de polímero) e 150 mg de hialuronato de sódio (peso seco, MMW 2,4 MDa) foram dissolvidos em 26 g de HCl 0,01 M (compreendendo NaCl) sob agitação mecânica em temperatura ambiente por cerca de 5 horas. A 23,48 g desta solução, foram adicionados 2,609 mL de tampão fosfato 100 mM pH 11,81, contendo H2O2 0,029% que resultou em um ajuste do pH para cerca de 7,1. A mistura foi homogeneizada por 15 minutos em temperatura ambiente e então deixada por toda a noite para completar reticulação. O hidrogel reticulado foi enchido em seringas de vidro de 1 mL e esterilizado via autoclavagem. O hidrogel estéril teve um pH de cerca de 7,0 e uma osmolalidade de 351 mOsmol/kg.

[00173] O grau de modificação (DoM), MMW, teor de tiol residual, e módulo elástico G’ foram determinados como descrito acima e os valores médios são resumidos na Tabela 9. Para a determinação de módulo elástico G’ o hidrogel foi aplicado ao reômetro diretamente da seringa (sem ligação de agulha).Tabela 9: Características de uma composição hydrogel

Exemplo 17 - Condições de otimização para reticulação de hialu- ronano modificado com tiol em uma escala industrial

[00174] Um hialuronano modificado com tiol com um grau de modi-ficação de 140 μmoles de grupos tiol por g de polímero (MMW 820 kDa) foi usado para produzir uma composição hidrogel compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de sódio de cisteamina, 3 mg/mL de lidocaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modificado em uma escala industrial 9tamanho de batelada de 17,5 kg). Após dissolução de HA - sal de sódio de cisteamina, lidocaína HCl, hialuronato de sódio não modificado e cloreto de sódio em HCl 0,01 M via agitação por cerca de 8 horas em temperatura ambiente, a solução foi dividida em duas partes.

[00175] Uma parte (7560 g) da solução foi incubada por toda a noite sob vácuo em vaso B. Reticulação foi iniciada pela adição de uma parte de um tampão fosfato 100 mM pH 12,3 a 9 partes de solução, seguido por adição de uma solução compreendendo peróxido de hidrogênio, de modo que a razão molar de grupos tiol livres de hialuro- nano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio foi 2:1 (compare método B). O resultante pH da solução no vaso B foi 7,7 e a osmolali- dade foi de 316 mOsmol/kg.

[00176] A segunda parte (5800 g) da solução também foi incubada por toda a noite sob vácuo no vaso A, seguido por reticulação através de adição de uma parte de um tampão fosfato 100 mM pH 12,3 a 9 partes de solução (comparar método A; vaso A). Ao invés de uma solução compreendendo peróxido de hidrogênio, água para injeção foi adicionada ao volume em uma quantidade correspondente. O resultante pH da solução no vaso A foi 7,7 e a osmolalidade foi de 312 mOs- mol/kg.

[00177] Após breve homogeneização via agitação por 10 minutos ambos os vasos foram mantidos em temperatura ambiente. Para provimento de oxigênio para reticulação, um excesso de pressão de ar de +1 bar foi aplicado ao vaso A durante o inteiro período de reticulação de 10 dias (uma breve interrupção no período de 72 h a 96 g após iní- cio de reticulação foi devida a problemas técnicos). Amostras foram retiradas nos pontos de tempo e localizações listadas na tabela abaixo. A amostra de superfície foi tomada do hidrogel no vaso próximo da superfície, enquanto a amostra de fundo foi tomada da parte inferior do hidrogel próximo do fundo do vaso. O módulo elástico foi medido como descrito no exemplo 4 (amostras não foram enchidas em seringas).Tabela 10: Comparação de propriedades elásticas de hidrogéis produzidos sob diferentes condições de reticulação

[00178] O módulo elástico foi usado como um parâmetro para monitorar a firmeza dos hidrogéis, que é conhecida ser aumentada por reti- culação. A primeira amostra foi obtida diretamente após início de reti- culação. O módulo elástico G’ da amostra obtida de vaso A foi de 33.729 mPa. Em contraste, o módulo elástico da amostra obtida de vaso B foi de 2 475 700 mPa, indicando que reticulação procedeu muito mais rápido na presença do agente de oxidação peróxido de hidrogênio. Os dados listados na tabela 10 ai nda demonstram que reação de reticulação não procede homogeneamente por todo o inteiro volume durante um tempo de incubação de 10 dias quando método de produção A foi usado em uma escala industrial. A aplicação de excesso de pressão de ar para o vaso resultou em reticulação mais eficiente somente na superfície do volume em vaso A. Em contraste, a provisão de oxigênio em uma quantidade suficiente via adição de peróxido de hidrogênio resultou em uma reação de reticulação quase instantânea e homogênea (método B, vaso B).

Exemplo 18 - Monitoramento de formação de ligações dissulfeto durante reticulação via determinação de teor de grupo tiol residual

[00179] Um hialuronano modificado com tiol com um grau de modificação de 140 μmoles de grupos tiol por g de polímero (MMW 820 kDa) foi usado para produzir uma composição hidrogel compreendendo 17,9 mg/mL de HA reticulado - sal de sódio de cisteamina, 3 mg/mL de lidocaína HCl e 5 mg/mL de hialuronato de sódio não modi- ficdo. Após dissolução de HA - sal de sódio de cisteamina, lidocaína HCl, hialuronato de sódio não modificado e cloreto de sódio em HCl 0,01 M via agitação por cerca de 16 horas em temperatura ambiente, a solução foi dividida em quatro partes iguais pesando cerca de 160 g cada. A cada solução cerca de 20 g de tampão fosfato 100 mM pH 12 foram adicionados sob agitação. Após 15 minutos de homogeneização 20 g de solução diluída de peróxido de hidrogênio foram adicionados a cada uma das quatro soluções, de modo que para produção de hidro- gel E100 a razão molar de grupos tiol livres de hialuronano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio foi de 2:1; durante produção de hidrogel E50 (compreendendo 50% da concentração de peróxido de hidrogênio de E100) a razão molar de grupos tiol livres de hialuronano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio foi de 4:1; durante produção de hidrogel E30 (compreendendo 30% da concentração de peróxido de hidrogênio de E100) a razão molar de grupos tiol de hialu- ronano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio foi cerca de 7:1; durante produção de hidrogel E10 (compreendendo 10% da concentração de peróxido de hidrogênio de E100) a razão molar grupos tiol livres de hialuronano modificado com tiol para peróxido de hidrogênio foi de 20:1. Após uma breve homogeneização a reação de reticula- ção foi realizada em temperatura ambiente sem ainda agitação.

[00180] Amostras foram retiradas nos pontos de tempo listados na tabela abaixo. O teor de grupo tiol residual e o módulo elástico foram medidos como descrito acima (amostras não foram enchidas em seringas). O teor de tiol residual em % foi calculado a partir de grau inicial de modificação do hialuronano modificado com tiol (140 μmoles de grupos tiol por g de polímero).Tabela 11: Monitoramento de eficiência de reticulação via medição de teor de grupos tiol residual e módulo elástico G’ de amostras

[00181] O módulo elástico G’ das amostras foi observado atingir um plateau (G’ na faixa de 2400 Pa a 3000 Pa) quando o teor de tiol residual no hidrogel foi de menos que 20%. Reticulação de hidrogel E100 foi completada dentro de 2 dias. Quando usando uma concentração 50% menor de peróxido de hidrogênio para reticulação (hidrogel E50) a reação de reticulação levou cerca de 3 dias. Usando uma concentração 90% menor de peróxido de hidrogênio para reticulação (hidrogel E10) a reticulação não foi completada mesmo após 7 dias.

Claims

1. Composição hidrogel estéril, caracterizada pelo fato de que compreende um polímero reticulado, sendo que o polímero reticulado é um produto de oxidação de um hialuronano modificado com tiol, sendo que o hialurano modificado com tiol apresenta um grau de modificação com grupos tiol superior a cerca de 80 μmoles por grama de polímero, ou superior a cerca de 105 μmoles por grama de polímero, ou superior a cerca de 120 μmoles por grama de polímero, sendo que o hialuronano modificado com tiol apresenta um grau de modificação com grupos tiol inferior a cerca de 280 μmoles por gramas de polímero, preferivelmente inferior a cerca de 240 μmoles por grama de polímero, mais inferior a 200 μmoles por grama de polímero, sendo que a dita composição apresenta um teor de tiol residual inferior a 20% em relação ao grau de modificação do hialurona- no modificado com tiol, e sendo que o hialuronano modificado com tiol apresenta um peso molecular de pelo menos 400 kDa e está compreendido na composição em uma concentração de pelo menos cerca de 11 mg/mL, a cerca de no máximo 20 mg/mL.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta um teor de tiol residual de menos que 15% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizada pelo fato de que o hialuronano modificado com tiol é compreendido na composição com uma concentração de pelo menos 13 mg/mL a no máximo 18 mg/mL.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi cações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o hialuronano modificado com tiol apresenta um peso molecular de pelo menos cerca de 500 kDa, ou pelo menos cerca de 600 kDa.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o polímero reticulado apresenta um peso molecular após esterilização reduzido médio superior a cerca de 250 kDa, ou superior a cerca de 300 kDa, ou a cerca de 350 kDa, sendo que o peso molecular após esterilização reduzido médio é definido como o peso molecular médio de um hialuronano modificado com tiol reduzido da dita composição hidrogel estéril após exposição de dito polímero reticulado a condições redutoras.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o hialuronano modificado com tiol é um conjugado de um agente de modificação ligado a hialu- ronano via uma ligação amida, em que o agente é selecionado do grupo compreendendo glutationa, amino alquil tióis compreendendo uma cadeia alquila linear ou ramificada C2-C6, cisteína, homocisteína, derivados de aminoácidos de cisteamina, cisteína e homocisteína, carboxi- lato ésteres de homocisteína e carboxilato ésteres de cisteína.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o hialuronano modificado com tiol é um conjugado de hialuronano-cisteamina (HA-cisteamina).

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polímero não modificado selecionado do grupo de polissacarídeos bio- compatíveis, preferivelmente um hialuronano não modificado.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que apresenta um módulo elástico G’ de pelo menos cerca de 900 Pa, preferivelmente de pelo menos cerca de 1000 Pa, medido a 25oC usando uma taxa de cisa- lhamento de 1 Hz.

10. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença selecionada do grupo consistindo em metatarsalgia, incontinência urinária ou fecal, atrofia vulvovaginal, prejuízo de corda vocal, insuficiência de válvula venosa, lipoatrofia facial, cicatrizes debilitantes ou assimetria morfológica ou deformação.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada como enchimento de tecido mole.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada para aumento de tecido.

13. Uso de uma composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é como um cosmético.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada como enchimento de tecido mole.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que é para enchimento de rugas, defeitos de pele, para restauração de volume perdido da face ou do corpo, para redução de covinhas em celulite, para conformação de contornos da face ou do corpo.

16. Método para produção de uma composição de hidrogel estéril, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) prover um hialuronano modificado com tiol, sendo que o hialuronano modificado com tiol apresenta um grau de modificação com grupos tiol superior a cerca de 80 μmoles por grama de polímero, preferivelmente superior a cerca de 105 μmoles por grama de polímero, mais preferivelmente superior a cerca de 120 μmoles por grama de polímero, sendo que o hialuronano modificado com tiol apresenta um grau de modificação com grupos tiol inferior a cerca de 280 μmoles por grama de polímero, preferivelmente inferior a cerca de 240 μmoles por grama de polímero, mais preferivelmente inferior a cerca de 200 μmo- les por grama de polímero, e sendo que o hialuronano modificado com tiol apresenta um peso molecular de pelo menos cerca de 400 kDa, em uma solução aquosa (b) oxidar o hialuronano modificado com tiol através de exposição de solução aquosa obtida previamente a condições que permitam o hialuronano modificado com tiol formar um polímero reticulado, em que a solução aquosa se torna um hidrogel, cujo hidrogel apresenta um teor de tiol residual inferior a 20% em relação ao grau de modificação do hialuronano modificado com tiol, opcionalmente (c) adicionar um polímero não modificado selecionado do grupo de polissacarídeos biocompatíveis para o hidrogel obtido previamente ou à solução obtida previamente, opcionalmente (d) peneirar o hidrogel obtido previamente para obter um hidrogel com particulares tamanhos de partículas, (e) encher o hidrogel previamente obtido em um recipiente, em particular uma seringa, e expor o recipiente preenchido a condições permitindo esterilização do hidrogel, e (f) obter uma composição hidrogel estéril em um recipiente compreendendo o polímero reticulado do hialuronano modificado com tiol com uma concentração de pelo menos cerca de 11 mg/mL, a cerca de no máximo 20 mg/mL.

17. Método para produção de uma composição hidrogel, como definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as etapas são conduzidas de acordo com uma sequência selecionada do grupo consistindo em: - (a), (b), (c), (d), (e) e (f); - (a), (b), (d), (c), (e) e (f); - (a), (b), (c), (e) e (f); - (a), (b), (d), (e), e (f); - (a), (c), (b), (d), (e) e (f); e - (a), (c), (b), (e) e (f),preferivelmente (a), (c), (b), (d), (e) e (f).

18. Método para produção de uma composição hidrogel, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que, na etapa (b), um agente de oxidação é adicionado à solução aquosa previamente obtida.

19. Método para produção de uma composição hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de adição de um agente anestésico e/ou um ou mais componentes adicionais à solução durante etapa (a) ou ao hidrogel obtido em etapa opcional (c), ou etapa opcional (d) ou adição de um agente anestésico e/ou um ou mais componentes adicionais durante etapa (a) ou durante etapa opcional (c).

20. Preenchimento de tecido macio, caracterizado pelo fato de que compreende a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

21. Implante ou depósito, caracterizado pelo fato de que compreende a composição, como definida em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 9.