BR112013012772B1 - Preparação e/ou formulação de proteínas reticuladas com polissacarídeos - Google Patents

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Jens Sommer-Knudsen
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Elastagen Pty Ltd
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Abstract

preparação e/ou formulação de protínas reticuladas com polissacarídeos. trata-se de composições e/ou formulações terapêuticas que compreendem: ao menos uma matriz de proteína reticulada, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende ao menos um resíduo de proteina e ao menos um resíduo contendo sacarídeo, e métodos de produção das mesmas. a matriz de proteína reticulada pode ser derivada a partir da reticulação de uma completa proteína ou substancialmente completa, tal como tropoelastina, elastina, albumina, colágeno, monômeros de colágeno, imunoglobulinas, insulina e/ou derivados ou combinações dos mesmos, com um agente de reticulação contendo sacarídeo, tal como agente de reticulação de polissacarídeo derivado a partir de, por exemplo, ácido hialucrônico ou um derivado de celulose. as composições terapêuticas podem ser administradas de maneira tópica ou por injeção. a presente descrição também fornece métodos, sistemas e/ou kits para a preparação e/ou formulação das composições apresentadas no presente documento.

Description

PREPARAÇÃO E/OU FORMULAÇÃO DE PROTEÍNAS RETICULADAS COM POLISSACARÍDEOS
REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
Este pedido está relacionado ao pedido provisório
5 U.S.: U.S.61/3444.940, depositado em 23 de novembro de
2010; o qual está aqui incorporado a título de referência,
em sua totalidade.
CAMPO
A presente descrição refere-se e pode ser
10 aplicada à preparação e/ou formulação de proteínas
reticuladas com polissacarideos.
FUNDAMENTOS
Os implantes injetáveis são atualmente usados para avultar ou aumentar tecidos em aplicações médicas que 15 se situam na faixa a partir da reconstrução de corda vocal, *?
incontinência urinaria e fecal a tratamentos estéticos para rugas. Os implantes atuais são feitos a partir de uma faixa de materiais que incluem ácido hialurônico, proteínas, tais como colágeno, polímeros, tais como ácido polilático e 20 biomateriais, tais como hidroxiapatita.
Por exemplo, o ácido hialurônico (HA), às vezes mencionado como hialuronano ou hialuronato, consiste em um mucopolissacarideo de ocorrência natural encontrado, por exemplo, em fluido sinovial, humor vítreo, paredes de vaso 25 sanguíneo e cordão umbilical, e em outros tecidos conjuntivos. O polissacarideo consiste em resíduos de Nacetíl-D-glucosamina e ácido D-glucurônico alternados unidos por ligações β-1-3 glucuronídicas e β-1-4 glucosaminídicas alternadas. Os produtos à base de ácido 30 hialurônico são reticulados com o uso de uma variedade de abordagens que incluem, por exemplo, produtos químicos, tais como
BDDE e divinilsulfano. 0 ácido hialurônico reticulado é, então, micronizado para possibilitar a injeção (por exemplo, Restylane® e Juvéderm®). Os implantes de ácido hialurônico produzem seu efeito pelo aumento volume de tecido e retenção de umidade no implante e de são lentamente reabsorvidos pelo corpo.
Outro exemplo consiste em implantes à base de colágeno que têm tido como base o colágeno extraído a partir de tecidos de animal ou humano, adicionalmente reticulados (por exemplo, glutaraldeído (Zyplast®) ou reticulações à base de ribose (Evolence®)), homogeneizados e, então, suspensos em solução salina pronta para implantação.
Os implantes de colágeno produzem seu efeito por meio do aumento de volume de tecido de uma maneira similar aos produtos de ácido hialurônico;
no entanto, também permitem maior infiltração celular no implante e a produção de material de colágeno nascente.
As abordagens que utilizam polímeros, tais como ácido polilático (por exemplo, Sculptra®) e biomateriais, tais como hidroxiapatita (por exemplo, Radiesse®) têm tido como base a produção de uma suspensão de material particulado em um gel injetável, tipicamente um polissacarídeo, tal como ácido hialurônico ou carboximetil 25 celulose. Os implantes particulados produzem seu efeito por meio da indução de uma resposta de corpo estranho às partículas que conduz à encapsulação de fibroblasto das partículas e produção de colágeno - aumento de volume do tecido através do acúmulo de tecido adicional.
Um problema com as abordagens atuais em relação a agentes de aumento de volume de tecido consiste no fato de que os mesmos não possibilitam a liberação de biomateriais que têm por base ou incorporam proteínas completas ou 5 proteínas substancialmente completas. As formulações que têm por base ou incorporam material de proteína completa ou substancialmente completa, similar àquele encontrado naturalmente no corpo, são mais propensas a manter os níveis de biocompatibilidade e autorreconhecimento desejável para muitas das aplicações pretendidas. O processo de reticulação química conduz tipicamente a reticulações intramoleculares substanciais que podem romper a estrutura natural da molécula; as técnicas de micronização ou homogeneização usadas para possibilitar a 15 injeção de produto não são conducentes à manutenção de uma estrutura molecular de proteína completa ou substancialmente completa. Além disso, os agentes de reticulação química usados para reticular ácido hialurônico e proteínas têm toxicidade conhecida e podem causar 20 irritação, inflamação ou carregar riscos carcinogênicos.
A presente descrição é direcionada, em parte, ao fornecimento de formulações injetáveis de biomateriais coerentes que têm por base ou são derivados a partir de proteínas, e possibilitam que os resíduos de proteína 25 incorporados mantenham sua estrutura completa, ou substancialmente completa, e também possibilitam que os resíduos de proteína sejam protegidos contra rápida reabsorção e/ou decomposição devido, por exemplo, à proteólise. Além disso, a presente descrição é direcionada, 30 em parte, a biomateriais com base em, e derivados a partir de, proteínas completas, ou substancialmente completas, que são receptivas a injeção de agulha, retém uma estrutura coerente, são suficientemente retículadas para diminuir a velocidade de reabsorção in vivo ou combinações dos mesmos.
Além disso, a presente descrição é direcionada, em parte, a biomateriais que são substancialmente desprovidos de agentes de reticulação química tóxicos. A presente descrição também fornece, em parte, métodos, sistemas e/ou kits para a preparação e/ou formulação de ao menos uma 10 matriz de proteína reticulada, que compreende ao menos um resíduo de proteína e ao menos um resíduo de agente de reticulação de biomolécula, em que ao menos uma molécula de proteína é reticulada com ao menos um agente de reticulação de biomolécula para formar a matriz de proteína reticulada.
Além disso, a presente descrição também fornece, em parte, sistemas e/ou kits para a preparação e/ou formulação de ao menos uma matriz de proteína reticulada, que compreende ao menos um resíduo de proteína e ao menos um resíduo de polissacarídeo, em que as moléculas de proteína, tais como 20 moléculas de proteína substancialmente completa ou moléculas de proteína completa, são retículadas com agentes de reticulação de polissacarídeo para formar a ao menos uma matriz de proteína reticulada. Há uma necessidade pelas composições, métodos, sistemas e/ou kits apresentados no 25 presente documento.
SUMÁRIO
Em determinadas modalidades, a composição injetável pode consistir em ao menos uma matriz de proteína reticulada, em que a ao menos uma matriz de proteína 30 reticulada compreende: i) ao menos um resíduo de proteína;
e ii) ao menos um resíduo de reticulação contendo sacarideo.
Em determinadas modalidades, injetável pode consistir em uma composição a composição substancialmente solúvel em um meio aquoso e/ou fisiológico.
Em determinadas modalidades, composição injetável pode ser um substancialmente solúvel, parcialmente solúvel ou substancialmente insolúvel em um meio aquoso e/ou fisiológico.
Em determinadas modalidades, a composição injetável pode compreender ao menos um resíduo contendo sacarideo derivado a partir de ao menos uma molécula de reticulação contendo sacarideo que pode ser substancialmente biodisponível, substancialmente biodisponível, substancialmente biodegradável, substancialmente biorreabsorvível.
resíduo contendo bioabsorvível,
Em determinados sacarideo pode resíduo de polissacarídeo, ao e/ou substancialmente aspectos, o compreender menos um oligossacarídeo ou combinações dos mesmos. Em ao menos ao menos resíduo um um de determinados aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos um polissacarídeo, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo compreende um resíduo de polissacarídeo de peso molecular baixo, médio e/ou alto. Em determinados 25 aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos um resíduo de polissacarídeo que tem um peso molecular entre cerca determinados compreender de 500 a aspectos, ao menos um compreende ao menos um cerca de 500.000 Daltons.
a composição injetável resíduo contendo sacarideo,
Em pode que resíduo de polissacarídeo ou ao menos um resíduo de oligossacarídeo que compreende um ou mais grupos funcionais de carga negativa e/ou um ou mais grupos funcionais de carga positiva. Em determinados aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos 5 um resíduo de polissacarídeo polianiônico ou ao menos um resíduo de oligossacarídeo polianiônico. Em determinados aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos um resíduo de polissacarídeo que é derivado a partir de ou compreende o resíduo de ácido hialurônico, um derivado de 10 celulose, carboxi celulose, carboximetil celulose, hidroximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, hidroxi-propilcelulose, carboximetil amilose, goma xantana, goma guar, cx-glucano, β-glucano, carboximetil β-l,4-glucano, β-l,3-glucano, alginatos, dextrano, um derivado de glicosaminoglicano, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina, ou biomateriais, tais como ácido polilático, ácido poliglicólico, ácido poli(lático-cofosfato de tricálcio, 1-hidroxiapatita e/ou os sais farmaceuticamente aceitáveis, derivados e/ou combinações dos mesmos. Em determinados aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos uma matriz de proteína reticulada que compreende ao menos um resíduo contendo sacarídeo em uma concentração entre cerca de 0,01% a cerca de 30%.
Em determinadas modalidades, a composição injetável pode compreender ao menos um resíduo de proteína que é derivado a partir de ou compreende o resíduo de uma proteína completa. Em determinados aspectos, a composição 30 injetável pode compreender ao menos um resíduo de proteína que compreende um resíduo de cadeia lateral contendo amina, que compreende ao menos um resíduo de lisina e/ou ao menos um resíduo de arginina. Em determinados aspectos, a composição injetável pode compreender ao menos um resíduo 5 de proteína que é derivado a partir de ou compreende o resíduo de tropoelastina, elastina, albumina, colágeno, monômeros de colágeno, imunoglobulinas, insulina e/ou derivados ou combinações dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a composição 10 injetável pode compreender ao menos uma matriz de proteína reticulada que é extrudável a ao menos ou cerca de 10 cm.
Em determinadas modalidades, a composição injetável é extrudável. Em determinadas modalidades, a composição injetável é extrudável a um comprimento entre cerca de 5 cm 15 a cerca de 30 cm. Em determinadas modalidades, a composição injetável pode compreender ao menos uma matriz de proteína reticulada que compreende cerca de ou ao menos cerca de 25 mg/ml de resíduo de proteína. Em determinadas modalidades, a composição injetável pode compreender ao menos uma matriz 20 de proteína reticulada que compreende entre cerca de 1 mg/ml a cerca de 250 mg/ml de resíduo de proteína.
Em determinadas modalidades, a composição injetável pode compreender ao menos uma matriz de proteína reticulada gue é preparada mediante o emprego de: i) um 25 agente de ativação e/ou agente de acoplamento; e ii) um agente de modificação e/ou agente de acoplamento auxiliar; para formar uma ou mais ligações e/ou reticulações.
Em determinadas modalidades, a composição injetável pode ser empregada de maneira terapêutica, que 30 compreende cirurgia, estética, aumento de volume de tecido, tratamento de incontinência, produtos de reposição dérmica, dermatologia, cirurgia dermatológica, cirurgia de olhos, reumatologia, farmacologia e/ou no campo de cosméticos.
Em determinadas modalidades, são apresentados métodos de preparação da composição, compreende reticular ao menos uma molécula de proteína com ao menos uma molécula de reticulação contendo sacarideo. Em determinadas modalidades, os métodos de preparação da composição compreendem: i) modificar ao menos uma molécula contendo 10 sacarideo para compreender ao menos um grupo químico reativo que é complementar a um grupo químico reativo na ao menos uma molécula de proteína; ii) combinar a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada com a ao menos uma molécula de proteína; e iii) formar ao menos uma ligação 15 entre a ao menos uma molécula de proteína e a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada.
Em determinadas modalidades, os métodos de preparação da composição compreendem: i) modificar a ao menos uma molécula contendo sacarideo para compreender ao 20 menos um grupo químico reativo; ii) combinar a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada com a ao menos uma molécula de proteína, em que a ao menos uma molécula de proteína compreende ao menos um grupo químico reativo complementar ao grupo reativo na ao menos uma molécula 25 contendo sacarideo modificada; e iii) formar ao menos uma ligação covalente entre a ao menos uma molécula de proteína e a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada.
Em determinados aspectos, a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada pode compreender uma molécula 30 de polissacarídeo modificada que tem sido preparada mediante a fixação de ao menos uma porção que compreende um ligante reativo capaz de conjugar a uma molécula de proteina ou molécula de proteína modificada durante a síntese de polissacarídeo de fase sólida. Em determinados aspectos, a ao menos uma porção pode ser fixada por uma ligação covalente. Adicionalmente, a ao menos uma porção pode compreender um grupo espaçador. Adicionalmente, o grupo espaçador pode compreender óxido de etileno
polimerizado. 0 grupo espaçador também pode consistir em
PEG ou PEO.
Em determinadas modalidades, o conjugado pode ser
formado com uma ligação covalente. Adicionalmente, em
determinadas modalidades, a ligação covalente pode ser
selecionada a partir do grupo que compreende: uma amida, uma oxima, uma hidrazona, um sulfeto, um éter, uma amina, tal como uma amina secundária ou terciária, um éter de enol, um tioléter, um éster, um triazol e um dissulfeto. Em determinados aspectos, a ligação covalente pode compreender uma amida ou uma hidrazona.
Em determinadas modalidades, os métodos apresentados podem ser robustos, mais eficientes, de custo eficaz, simples e/ou combinações dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína ou resíduos de proteína modificados. Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender dois resíduos de proteína diferentes ou resíduos de proteína modificados.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de polissacarideo ou resíduos de polissacarídeo modificados. Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender dois resíduos de polissacarídeo diferentes ou resíduos de polissacarídeo modificados.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode consistir em uma composição injetável.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Os desenhos em anexo facilitam um entendimento das diversas modalidades desta descrição. As modalidades exemplíficadoras de processos, sistemas, kits, preparações, métodos, purificações, ou combinações dos mesmos, serão agora descritas em detalhes adicionais, a título de exemplo somente, com referência às figuras em anexo, nas quais:
A Figura 1 ilustra, de acordo com determinadas modalidades, uma estrutura de repetição ideal de ácido hialurônico. O ácido hialurônico é um polissacarídeo que consiste em unidades de ácido β-D-glucurônico-[1,3]-β-D-Nacetil-glucosamina dissacarídeo, que compreende um grupo carboxila por unidade de dissacarídeo, o qual pode ser ativado e reticulado.
A Figura 2 ilustra, de acordo com determinadas
modalidades, uma reação mediada por EDC e NHS com uma
molécula contendo carboxilato (D e uma amina (2),
possíveis estruturas intermediárias ilustradas incluem um O-acilisourea éster e um intermediário de NHS éster, formado a partir de um agente de modificação, tal como Nhidroxisuccinimida (NHS), para formar um intermediário de carboxilato ativado por NHS que é capaz de reagir com um grupo amino primário (1) para formar uma ligação de amida.
A Figura 3 ilustra, de acordo com determinadas modalidades, um gel SDS PAGE de proteína extraída a partir da formulação do Exemplo 5, que foi absorvida em PBS, contendo as seguintes faixas: Marcador (faixa M) ; Sobrenadante (faixas A e B) ; e TE puro (faixa TE) .
DESCRIÇÃO DETALHADA
A seguinte descrição detalhada é fornecida em relação a várias modalidades que podem compartilhar características e recursos comuns. Deve-se compreender que uma ou mais características de uma modalidade podem ser combináveis com uma ou mais características das outras modalidades. Além disso, uma única característica ou combinação de características em determinadas modalidades pode constituir modalidades adicionais.
Neste relatório descritivo, a palavra compreender deve ser compreendida em seu sentido aberto, isto é, no sentido de incluir e, deste modo, não limitado a seu sentido fechado, isto é, o sentido de consistir somente em. Um significado correspondente deve ser atribuído às palavras correspondentes compreende, compreendido e compreendendo, onde as mesmas aparecem.
Os presentes títulos usados na descrição detalhada são incluídos somente para facilidade de referência do leitor e não deveríam ser usados para limitar o assunto encontrado por toda a descrição ou as reivindicações. Os presentes usados na construção do escopo limitações de reivindicação.
Exceto onde definido técnicos usados no presente .ítulos não deveríam ser das reivindicações ou das ao contrário, os termos documento têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um elemento versado na técnica.
O termo ativado pode incluir uma forma intermediária de uma molécula que pode ser suscetível e/ou vulnerável ao ataque nucleofílico e/ou substituição nucleofílica por um composto nucleofílico. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma molécula que contém grupo carboxila, tal como uma molécula contendo sacarídeo que compreende um grupo carboxila, por exemplo, um polissacarídeo que compreende um grupo carboxila, pode ser ativada quando, por exemplo, é tratada com um agente de ativação para formar um intermediário ativado, tal como um éster ativado, em que o intermediário ativado pode ser suscetível e/ou vulnerável ao ataque nucleofílico e/ou substituição nucleofílica por um composto nucleofílico, tal como uma amina, para formar uma ligação entre a molécula contendo grupo carboxila e o composto nucleofílico, tal como uma ligação de amida. Em determinadas modalidades, uma molécula que contém hidroxila, tal como uma molécula contendo sacarídeo que compreende um grupo hidroxila, por exemplo, um polissacarídeo que compreende um grupo hidroxila, pode ser ativada quando, por exemplo, é tratada com um agente de ativação para formar um intermediário ativado, tal como uma epóxi ou grupo reativo halohidrina, em que o intermediário ativado pode ser capaz de reagir com um composto, tal como uma amina, para formar uma ligação entre a molécula contendo grupo hidroxila e o composto, tal como uma ligação de amina secundária ou terciária.
O termo aminoácido pode se referir a aaminoácidos que são racêmicos, ou da configuração D ou L.
Em determinadas modalidades, um aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural, tal como um aminoácido de ocorrência não natural derivado de modo sintético.
designação d
que precede uma designação de aminoácido (por exemplo, dAla,
D do aminoácido.
dSer, dVal, etc.) se refere ao isômero
A designação dl que precede uma designação de aminoácido (por exemplo, dlSer) se refere a uma mistura dos isômeros L e D do aminoácido.
O termo substância biocompativei pode incluir a capacidade de um material em executar com uma resposta de hospedeiro adequada em uma situação especifica, por exemplo, uma situação que não tem efeitos prejudiciais ou tóxicos medicamente inaceitáveis sobre a função biológica.
O termo bioconjugado pode se referir a um conjugado derivado a partir de ao menos duas biomoléculas, a partir de ao menos dois biopolimeros, ou a partir de ao menos uma biomolécula e ao menos um outro biopolimero. O bioconjugado também pode incluir um conjugado derivado a partir de três ou mais biomoléculas, biopolimeros e/ou combinações dos mesmos, de tal modo que ao menos um dentre as biomoléculas e/ou biopolimeros seja conjugada a mais do que uma biomolécula e/ou biopolimero, de modo que tenham reticulações intermoleculares. O bioconjugado também pode incluir uma ou mais ligações entre os componentes individuais que têm sido conjugados, tais como uma reticulação intramolecular. Em determinadas modalidades, o bioconjugado pode ter uma ou mais reticulações intermoleculares, por exemplo, o bioconjugado pode ser somente reticulado de maneira intermolecular, ou pode ser reticulado de maneira substancial ou predominantemente intermolecular. Em determinadas modalidades, o bioconjugado pode ter uma ou mais reticulações intramoleculares, por exemplo, o bioconjugado pode ser somente reticulado de maneira intramolecular, ou pode ser reticulado de maneira substancial ou predominantemente intramolecular.
Em determinadas modalidades, o bioconjugado pode ter tanto reticulações intermoleculares como reticulações intramoleculares. O bioconjugado também pode incluir um ou mais grupos espaçadores entre a um ou mais ligações que unem o um ou mais componentes individuais, ou o grupo espaçador pode ficar entre o componente individual e a ligação. Por exemplo, o grupo espaçador pode incluir, mas não é limitado a, uma porção de óxido de etileno, um polímero formado a parir de porções -(-CH2-CH2-O-) - de repetição, polietileno glicol (PEG), óxido de polietileno (PEO) e/ou derivados dos mesmos.
O termo biomolécula pode se referir a um composto encontrado na natureza, um derivado de um composto encontrado na natureza (isto é, uma molécula de ocorrência natural), um análogo modificado de maneira sintética de um composto encontrado na natureza, um análogo produzido por engenharia genética de um composto encontrado na natureza, ou um análogo modificado geneticamente de um composto encontrado na natureza. Por exemplo, uma biomolécula pode incluir, mas não se limita a, um aminoácido, peptídeo, peptídeo bioativo, peptídeo produzido por engenharia genética, proteína, glicoproteina, proteína bioativa, proteína parcialmente digerida, proteínas em sua forma próativa, proteína produzida por engenharia genética, enzima, anticorpo, anticorpo produzido por engenharia genética, sacarideo, dissacarideo, trissacarideo, oligossacarideo, polissacarídeo, oligonucleotídeo, RNA, DNA, ácido nucleico peptídico (PNA), antígeno, oligossacarideo, substrato para 5 uma enzima, substrato para um receptor nuclear e/ou derivados ou combinações dos mesmos.
termo biopolimero pode se referir a um composto encontrado na natureza, um derivado de um composto encontrado na natureza, um análogo modificado de maneira 10 sintética de um composto encontrado na natureza, um análogo produzido por engenharia genética de um composto encontrado na natureza, um análogo modificado geneticamente de um composto encontrado na natureza, em que o biopolimero pode ser composto de unidades monoméricas.
Por exemplo, os biopolímeros podem incluir, mas não se limitam a, peptídeos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), oligonucleotídeos,
RNA,
DNA, proteínas, enzimas, anticorpos, glicoproteínas, trissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, e/ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, o biopolimero pode ser linear ou ramificado, ou pode ser de um projeto tridimensional particular, tal como uma estrutura em estrela, ou estrutura semelhante à matriz. Os exemplos de unidades monoméricas incluem, mas não se limitam a, aminoácidos, derivados de aminoácido, monossacarídeos,
dissacarídeos, trissacarídeos, derivados de açúcar,
monômeros de PNA, nucleotídeos, nucleosídeos e/ou derivados
ou combinações dos mesmos.
Em determinadas modalidades, os compostos
fornecidos no presente documento podem conter centros quirais. Tais centros quirais podem ser da configuração (R) ou (S), ou pode ser misturas das mesmas. Por exemplo, os compostos fornecidos no presente documento podem ser puros de maneira enantiomérica, puros de maneira diastereomérica ou puros de maneira estereoisomérica. Em determinadas modalidades, os compostos fornecidos no presente documento podem ser misturas estereoisoméricas ou misturas diastereoméricas. Por exemplo, no caso de resíduos de aminoácido, cada resíduo pode ser da forma L ou D. Por exemplo, a configuração preferida para os resíduos de aminoácido de ocorrência natural é L.
O termo grupos reativos complementares representa aqueles grupos que, quando reagidos em conjunto, formam uma ligação covalente. Por exemplo, um grupo reativo amino pode se referir a uma porção que pode reagir diretamente com porção que contém amina reativa para formar uma ligação de amida ou uma ligação de amina. Por exemplo, um grupo reativo tiol pode se referir a uma porção que pode reagir diretamente com grupo contendo sulfidril reativo para formar uma ligação de sulfeto estável. Por exemplo, um grupo amino pode ser complementar a um derivado de carboxila. Por exemplo, um grupo amino pode ser complementar a um derivado de hidroxila. Por exemplo, um grupo hidrazino pode ser complementar a um derivado de carbonila. Por exemplo, um grupo oxiamino também pode consistir em complementar a um derivado de carbonila.
termo conjugado pode representar um composto que contém ao menos dois ou mais componentes que são ligados em conjunto, tal como ao menos Duas ou mais biomoléculas e/ou biopolímeros que ligados em conjunto. Os componentes individuais podem ser ligados em conjunto diretamente através de uma ou mais ligações covalentes, uma ou mais ligações iônicas, por meio de quelação, e/ou misturas ou combinações de ligações das mesmas. Em determinadas modalidades, o conjugado pode compreender ligações diretas entre os componentes individuais, tais como ligações iônicas, ou ligações covalentes, por exemplo, ligações de amina, ligando diretamente as ao menos duas ou mais biomoléculas e/ou biopolimeros em conjunto. Por exemplo, o conjugado pode compreender um primeiro componente, tal como uma proteína, que pode ser ligado diretamente através de uma ou mais ligações covalentes a um segundo componente, tal como um polissacarídeo, para formar um conjugado, por exemplo, um conjugado de proteínapolissacarideo. Em determinadas modalidades, o conjugado pode compreender um grupo espaçador entre os componentes individuais, em que o conjugado compreende ao menos duas ligações através do grupo espaçador para unir os dois componentes individuais em conjunto. Por exemplo, uma primeira biomolécula pode formar uma primeira ligação com um grupo espaçador e uma segunda biomolécula pode formar uma segunda ligação com o grupo espaçador. O conjugado pode incluir um ou mais grupos espaçadores entre a uma ou mais ligações que unem os dois ou mais componentes individuais em conjunto, ou pode ficar entre o componente individual e a ligação. Por exemplo, o grupo espaçador pode incluir, mas não se limita a, uma porção glicol, uma porção de óxido de etileno, um polímero formado a partir de porções -(-CH2CH2-O-)- de repetição, tais como polietileno glicol (PEG), ou óxido de polietileno (PEO), uma poliamina, um poliol e/ou derivados ou combinações dos mesmos.
O termo matriz de proteína reticulada pode se referir a um ou mais resíduos de proteína que compreendem ao menos uma ou mais reticulações a ao menos um ou mais resíduos de molécula, tais como um ou mais resíduos de biomolécula e/ou um ou mais resíduos de biopolímero ou derivados ou combinações dos mesmos.
O termo resíduo pode se referir àquela parte de material molecular ou material molecular residual que permanece em um produto de reação. Por exemplo, a parte de material molecular de proteína que permanece em um produto de reação, tal como um produto reticulado derivado a partir da reação de uma molécula de proteína e um agente de reticulação, é chamada de resíduo de proteína. Por exemplo, a parte de um material molecular que contém sacarídeo que permanece em um produto de reação, tal como um produto reticulado derivado a partir da reação de uma molécula contendo sacarídeo e uma molécula de proteína, é chamada de resíduo contendo sacarídeo.
Os termos agulha fina ou agulha de calibre fino ou injeção de agulha fina pode se referir, mas não se limitam a, ao uso de uma agulha de um tamanho de cerca de 25G ou menor. As agulhas de calibre maiores também podem ser usadas em determinadas aplicações, conforme discutido adicionalmente no presente documento.
O termo ácido hialurônico ou HA pode incluir ácido hialurônico e qualquer um de seus sais de hialuronato, que incluem, por exemplo, hialuronato de sódio (o sal de sódio), hialuronato de potássio, hialuronato de magnésio e hialuronato de cálcio. O ácido hialurônico a partir de uma variedade de fontes pode ser usado no presente documento. Por exemplo, o ácido hialurônico pode ser extraído a partir de tecidos animais, coletados como um produto de fermentação bacteriana, ou produzidos em quantidades comerciais por meio de tecnologia de bioprocesso.
O termo ligação pode se referir à conexão ou ligação entre dois componentes moleculares individuais que são ligados em conjunto. Em determinadas modalidades, os componentes moleculares individuais que podem ser ligados em conjunto podem incluir, mas não se limitam a, biopolímeros, biopolímeros modificados, tais como biopolímeros modificados de maneira biológica e/ou de maneira sintética, biomoléculas, biomoléculas modificadas, tais como biomoléculas modificadas de maneira biológica e/ou de maneira sintética. Por exemplo, a conexão ou ligação entre duas biomoléculas, entre uma biomolécula e um grupo espaçador, entre dois biopolímeros, entre um biopolímero e um grupo espaçador, entre duas moléculas modificadas e/ou derivados ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, a ligação pode ser estável a termolise ou hidrólise, ou ambas. Em determinadas modalidades, a ligação pode ser biocompatível. Em determinadas modalidades, a ligação pode ser formada pela formação de uma ligação covalente, uma ligação iônica e/ou combinações das mesmas. Por exemplo, a ligação pode ser formada pela formação de uma combinação de uma ou mais ligações covalentes e/ou uma ou mais ligações iônicas. Em determinadas modalidades, a ligação covalente pode incluir, mas não se limita a, a formação de uma ligação de amida, uma ligação de oxima, uma ligação de hidrazona, uma ligação de triazol, uma ligação de sulfeto, uma ligação de éter, uma ligação de amina, tal como uma ligação de amina secundária ou terciária, uma ligação de éter de enol, uma ligação de éster, uma ligação de dissulfeto, ou misturas das mesmas. Em determinadas modalidades, a ligação de amida pode ser formada, por exemplo, entre um grupo ácido carboxilico ou uma porção ácido carboxilico ativada de uma biomolécula que contém sacarideo e um grupo amina de uma biomolécula que contém aminoácido, tal como uma proteína, por exemplo, uma proteína que compreende um resíduo de lisina. Por exemplo, em determinadas modalidades, a ligação de amida pode ficar entre, por exemplo, uma biomolécula que compreende uma porção de sacarideo modificada, tal como uma porção polissacarídeo modificada com um grupo espaçador, e uma biomolécula que compreende uma porção aminoácido, tal como uma proteína. Em determinadas modalidades, a ligação de amida pode ficar entre, por exemplo, uma biomolécula que compreende uma porção sacarideo e uma biomolécula que compreende uma porção aminoácido modificada, tal como uma proteína modificada com um grupo espaçador.
O termo modificado pode se referir a uma modificação de uma molécula e/ou uma porção na molécula, tal como uma biomolécula ou um biopolímero, por meio de processos de ocorrência natural, modificações químicas sintéticas, bioengenharia, ou similares, e/ou combinações ou variações dos mesmos. Em determinadas modalidades, a molécula e/ou porção sobre a molécula pode ser modificada pela transformação de uma porção já existente na molécula, tal como por meio de processos transformadores químicos sintéticos e/ou por processos de ocorrência natural, a fixação de uma porção adicional e/ou combinações ou variações dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, a fixação de uma porção na molécula pode ser por meio da formação de uma ligação covalente. Em determinadas modalidades, por exemplo, a molécula modificada que compreende uma porção transformada, pode ser capaz ou mais capaz de reagir com grupo reativo complementar para formar uma ligação, reticulação e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, por exemplo, a molécula modificada que compreende uma porção fixada, pode ser capaz ou mais capaz de reagir com grupo reativo complementar para formar uma ligação, reticulação e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, a molécula modificada que compreende a porção transformada e/ou fixada, pode incluir, por exemplo, um grupo reativo, um grupo ligável, um grupo espaçador, um grupo reativo complementar e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, a molécula modificada que compreende a porção transformada e/ou fixada, pode compreender uma porção, tal como um grupo reativo, que pode ser formada e/ou desprotegida por meio de modificações químicas sintéticas ou por processos de ocorrência natural para ficar disponível para reagir para formar uma ligação ou reticulação, por exemplo, por meio da reação com um grupo reativo complementar. Por exemplo, em determinadas modalidades, a molécula modificada pode ser derivada por meio da ativação de um grupo químico, tal como um grupo carboxila, mediante a fixação de um grupo espaçador, por meio da desproteção de uma porção reativa e/ou combinações ou variações dos mesmos.
Os termos mol ou concentração molar (M) de polissacarideos, para uso na presente invenção, se referem aos moles da unidade monomérica de repetição contida no polímero.
O termo polissacarídeo pode incluir, por exemplo, uma molécula contendo sacarídeo que compreende ao menos três resíduos de sacarídeo, por exemplo, ao menos três unidades de repetição de monômero de sacarídeo, tais como ao menos três unidades de repetição de monossacarídeo, ao menos três unidades de repetição de dissacarídeo, ao menos três unidades de repetição de trissacarídeo, ao menos três unidades de repetição de oligossacarídeo e/ou combinações ou derivados das mesmas. Em determinadas modalidades, um polissacarídeo pode compreender os mesmos e/ou diferentes resíduos de sacarídeo, por exemplo, um ou mais dos mesmos e/ou diferentes resíduos de sacarídeo, dois ou mais dos mesmos e/ou diferentes resíduos de sacarídeo, três ou more dos mesmos e/ou diferentes resíduos de sacarídeo e/ou combinações ou derivados dos mesmos.
termo molécula contendo sacarídeo pode incluir, por exemplo, uma molécula que compreende um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um oligossacarídeo e/ou um polissacarídeo. Em determinadas modalidades, por exemplo, a molécula contendo sacarídeo pode compreender uma unidade de repetição de monômero que compreende um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um oligossacarídeo, ou um polissacarídeo. Em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarideo pode compreender uma ou mais das mesmas ou diferentes unidades de repetição de monômero de sacarideo, por exemplo, a molécula contendo sacarideo pode compreender uma ou mais das mesmas ou diferentes unidades de repetição de monômero de dissacarideo, trissacarideo, oligossacarideo, e/ou polissacarídeo.
Em determinadas modalidades, o resíduo contendo sacarideo pode ser derivado a partir de um oligossacarideo, oligossacarideo modificado, polissacarídeo, polissacarídeo modificado e/ou derivados dos mesmos, ou pode ser derivado a partir de uma molécula de reticulação contendo sacarideo, por exemplo, um reticulador de oligossacarideo, reticulador de oligossacarideo modificado, reticulador de polissacarídeo, reticulador de polissacarídeo modificado e/ou derivados dos mesmos.
O termo proteína, unidade de proteína ou monômero de proteína pode incluir, por exemplo, uma proteína completa, uma proteína substancialmente completa, um fragmento de proteína, uma proteína bioativa, um fragmento de proteína bioativa, uma proteína na forma próativa, uma proteína inativa, uma proteína que compreende um local ativo, uma proteína que compreende um local de ligação, uma proteína que compreende um local de divagem proteolítica, uma proteína parcialmente digerida, uma proteína parcialmente hidrolisada, uma proteína que compreende uma ou mais mutações de ponto único, uma proteína que compreende cerca de 50 a cerca de 99,99% de proteína completa, uma proteína que compreende a conservação de cerca de 50% a cerca de 99,99% dos aminoácidos em uma proteína completa. Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, por exemplo, um
peptídeo que compreende ao menos uma sequência de peptídeo
bioativo , um peptídeo que compreende ao menos um local de
ligação de receptor, um peptídeo que compreende ao menos um
local de divagem proteolítica, um oligopeptídeo, um polipeptídeo e/ou combinações ou derivados dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, por exemplo, uma proteína que compreende ao menos um resíduo de lisina, ao menos um resíduo de arginina, ao menos um resíduo de cisteína, ao menos um resíduo de serina, ao menos um resíduo de treonina, ao menos uma resíduo de tirosina, ao menos um resíduo de glutamato, ao menos um resíduo de aspartato, ao menos um resíduo de prolina e/ou combinações ou derivados dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, por exemplo, uma proteína que compreende ao menos um resíduo dimérico, tal como ao menos um resíduo de cistina.
Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, por exemplo, uma proteína que compreende ao menos um grupo amina, uma proteína que compreende ao menos uma cadeia lateral contendo amina, uma proteína que compreende ao menos um resíduo de aminoácido contendo amina, tal como uma proteína que compreende ao menos um resíduo de lisina, uma proteína que compreende ao menos um resíduo de arginina e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, a proteína pode incluir uma proteína que compreende uma região rica em amina, tal como uma região rica em lisina ou uma região rica em arginina e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, por exemplo, uma proteína de poli(amina-resíduo) , tais como uma polilisina, poliarginina e/ou combinações ou derivados das mesas.
Em determinadas modalidades, uma proteína pode incluir homopolímeros ou copolímeros, por exemplo, homopolímeros ou copolímeros de resíduos de aminoácido. Por exemplo, em determinadas modalidades, a proteína pode compreender um homopolímero ou copolímero de resíduos de lisina, resíduos de arginina e/ou resíduos de histidina, tal como uma proteína que compreende uma região rica em lisina. Em determinadas modalidades, por exemplo, a proteína que compreende uma região rica em lisina pode compreender ao menos duas unidades de lisina, tal como, que compreende uma região de polilisina, por exemplo, que compreende ao menos 5 unidades de lisina. Em determinadas modalidades, por exemplo, a proteína que compreende uma região rica em arginina pode compreender ao menos duas unidades de arginina, tal como que compreende uma região de poliarginina, por exemplo, que compreende ao menos 5 unidades de arginina. Em determinadas modalidades, a proteína pode compreender ao menos duas diferentes regiões ricas em resíduo, por exemplo, uma proteína que compreende ao menos uma região rica em lisina e ao menos uma região rica em arginina e/ou combinações ou derivados das mesmas. Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir, mas não se limita a, tropoelastina, elastina, albumina, colágeno, monômeros de colágeno, imunoglobulinas, insulina e/ou derivados ou combinações dos mesmos.
Em determinadas modalidades, a proteína pode incluir uma proteína modificada ou derivado de proteína. Em determinadas modalidades, por exemplo, uma proteína modificada ou derivado de proteína pode ser uma proteína preparada a partir de e/ou derivada a partir de ou por meio de processos de ocorrência natural, modificação química sintética e/ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, por exemplo, uma proteína modificada ou derivado de proteína pode ser uma proteína preparada partir de e/ou derivada a partir de ou por meio de processos de ocorrência natural, tais como aqueles que ocorrem em células eucarióticas, células procarióticas e/ou combinações dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, os processos de ocorrência natural podem incluir, síntese de proteína, degradação de proteína, hidrólise, processamento enzimático e/ou conjugação, oxidação, redução, glicosilação, aminação, carboxilação, incorporação de um resíduo de aminoácido ou grupo espaçador de um grupo ligante), modificação e/ou derivação de um resíduo de aminoácido ou grupo espaçador, e/ou combinações ou variações dos mesmos. Em determinadas modalidades, por exemplo, uma proteína modificada ou derivado de proteína pode ser uma proteína preparada a partir de e/ou derivada a partir de ou por meio de modificação química sintética. Por exemplo, em determinadas modalidades, a modificação química sintética pode incluir, oxidação, redução, conjugação, hidrólise, aminação, esterificação, amidação, aminação redutiva, ativação de grupo carboxila, modificação de grupo carboxila, incorporação de um resíduo de aminoácido ou grupo espaçador (às vezes chamado de um grupo ligante), modificação e/ou derivação de um resíduo de aminoácido ou grupo espaçador e/ou combinações dos mesmos. Em determinadas modalidades, a proteína modificada ou derivado de proteína pode ser preparada por meio de síntese de fase sólida, síntese de fase de solução e/ou combinações das mesmas.
Em determinadas modalidades, uma proteína modificada ou derivado de proteína pode ser preparada a partir de uma proteína que compreende uma região rica em resíduo de aminoácido contendo amina, tal como uma região rica em lisina.
Em determinadas modalidades, resíduo de proteína pode ser derivado a partir de uma proteína e/ou derivados da mesma, conforme apresentado no presente documento.
O termo grupo espaçador pode incluir, por exemplo, uma porção que une um ou mais componentes individuais, tal como que une uma proteína e um polissacarídeo.
O termo molécula sintética pode se referir a uma pequena molécula ou um polímero que não é derivado naturalmente. Por exemplo, uma molécula sintética pode ser preparada por meio de modificação química através de síntese de fase sólida, síntese de fase de solução, ou combinações das mesmas.
Determinadas modalidades fornecem métodos para modificar ou derivar uma molécula contendo sacarídeo, tal como um polissacarídeo, com um grupo químico que é capaz de formar uma ligação covalente quando combinado com uma proteína. O polissacarídeo pode ser modificado de uma forma que possibilita que o mesmo permaneça solúvel, ou suficientemente solúvel, em água e/ou solução salina. A maioria dos reagentes restantes que seguem a modificação do polissacarideo é removida através, por exemplo, de precipitação ou filtração. A molécula contendo sacarideo modificada, tal como um polissacarideo, pode ser, então, usada como o agente de reticulação. Uma solução do polissacarideo modificado pode ser, então, misturada com a proteína ou proteínas exigidas e deixada reagir. Os grupos químicos modificados no polissacarideo modificado reagem com a proteína para formar os biomateriais. Os biomateriais produzidos desta forma têm algumas propriedades únicas, quando comparados com os biomateriais produzidos com o uso de abordagens convencionais. Por exemplo, as formulações produzidas a partir de proteínas reticuladas com o uso de produtos químicos que causam reticulações intramoleculares são tipicamente opacas e muitas vezes de cor branca colorida com tons de amarelo ou marrom. As formulações obtidas com determinados métodos apresentados são formulações sem cor transparentes. Adicionalmente, as proteínas reticuladas com produtos químicos, por exemplo, glutaraldeído, podem ter produto químico residual que permanece na formulação que podem causar inflamação in vivo e/ou reduzir a biocompatibilidade do produto. As formulações obtidas com determinados métodos apresentados são substancialmente desprovidas de quaisquer tais produtos químicos residuais.
As formulações produzidas que utilizam reticuladores químicos ou moléculas de reticulação curtas muitas vezes conduzem a biomateriais que precisam ser micronizados ou homogeneizados para possibilitar sua liberação com o uso de seringas ou agulhas; ou, exigem que o nível de reticulação seja mantido a um nível mínimo para possibilitar a extrusão de agulha. As proteínas reticuladas com produtos químicos, por exemplo, glutaraldeído, que são excessivamente reticuladas não podem ser extrudadas através de agulhas de calibre fino.
As formulações feitas por determinados métodos apresentados podem ser extrudadas através de agulhas de calibre fino sem processamento adicional ou processamento adicional substancial. Determinadas formulações apresentadas retêm coesão suficiente mesmo após a extrusão de agulha, de tal modo que tiras de material suficientemente longas possam ser extrudadas a partir da agulha sem a ruptura de material (por exemplo >10 cm, >12 cm, >15 cm,>18 cm, >20 cm, etc.) . Adicionalmente, o uso de determinadas modalidades descritas no presente documento, formulações à base de proteínas completas e o uso de um polissacarídeo modificado como o agente de reticulação produzem uma matriz de estrutura flexível que é capaz de produzir biomateriais completamente consistentes que ainda retêm flexibilidade suficiente para permitir a ejeção através de agulhas de calibre fino.
Matriz de proteína reticulada
A matriz de proteína reticulada pode variar nas modalidades apresentadas.
Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser derivada a partir da reticulação de uma ou mais moléculas de proteína, tais como uma ou mais proteínas completas, com uma ou mais moléculas contendo sacarídeo, tais como uma ou mais moléculas contendo sacarídeo modificadas.
Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode incluir, um ou mais resíduos de reticulados com um ou mais resíduos proteína que são contendo sacarideo, tais como uma proteína reticulada com sacarideo, uma proteína reticulada com dissacarídeo, uma proteína reticulada com trissacarídeo, uma proteína reticulada com oligossacarideo, ou uma proteína reticulada com polissacarídeo.
A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, uma ou mais ligações entre um ou mais resíduos de proteína através de uma ou mais ligações um ou mais resíduos de polissacarídeo, por exemplo, um ou mais resíduos de proteína podem ser conectados ou ligados em conjunto através de uma ou mais ligações a um ou mais resíduos contendo sacarideo. A matriz de proteína reticulada pode incluir, de proteína ligado a sacarideo, tal como um por exemplo, ao menos um resíduo ao menos um resíduo contendo resíduo de oligossacarídeo ou um resíduo de polissacarídeo, por uma ou mais ligações covalentes e/ou uma ou mais ligações iônicas ou combinações das mesmas.
A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, ligações, isto é, uma ou mais reticulações, por exemplo, uma ou mais reticulações intermoleculares e/ou uma ou mais reticulações intramoleculares ou misturas ou combinações das mesmas. A matriz de proteína reticulada pode ser reticulada de maneira intermolecular, reticulada de maneira substancialmente intermolecular, reticulada de maneira intramolecular, reticulada de maneira substancialmente intramolecular e/ou ser tanto reticulada de maneira intramolecular como intermolecular. A matriz de proteína reticulada pode ser derivada a partir de um ou mais reticuladores, tais como um reticulador contendo sacarídeo, por exemplo, um polissacarídeo ou polissacarídeo modificado, tal como ácido hialurônico ou ácido hialurônico modificado. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser derivada a partir de um ou mais reticuladores, e o um ou mais reticuladores podem ligar e/ou reticular a uma ou mais moléculas de proteína e/ou formar uma ou mais ligações mesma molécula de proteína. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode compreender uma estrutura de matriz, por exemplo, uma matriz de resíduos de proteína ligados e/ou reticulados, a um ou mais resíduos reticulador contendo sacarídeo. A estrutura de matriz de uma matriz de proteína reticulada pode fornecer flexibilidade, em que o grau de reticulação dentro da matriz de proteína reticulada pode alterar a flexibilidade fornecida.
Em determinadas modalidades, o uso de uma matriz de proteína reticulada derivada a partir de uma proteína completa substancialmente desprovida de reticulações intramoleculares, conforme apresentado no presente documento, pode resultar em uma formulação que é mais compatível em tecido, otimiza o crescimento de tecido, otimiza o recrescimento de tecido, ou combinações dos mesmos. Tal formulação também pode ser remodelada em estruturas mais típicas e desejáveis e/ou incorporadas no novo tecido.
Em determinadas modalidades, o uso de uma matriz de proteína reticulada derivada a partir de uma proteína substancialmente completa substancialmente desprovida de reticulações intramoleculares, conforme apresentado no presente documento, pode resultar em uma formulação que é mais compatível em tecido, otimiza o crescimento e recrescimento de tecido, ou combinações dos mesmos. Tal formulação também pode ser remodelada em estruturas mais típicas e desejáveis e/ou incorporadas no novo tecido.
Outras modalidades apresentadas no presente documento podem ter um determinado grau de reticulação intramolecular no resíduo de proteína da matriz de proteína reticulada e ainda fornecer propriedades suficientes para serem aceitáveis para o uso.
Em determinadas modalidades, o uso de uma matriz de proteína reticulada derivada a partir de uma proteína substancialmente completa, em que a estrutura do resíduo de proteína não é substancialmente mascarada pelo processo de reticulação pode resultar em uma formulação que é mais compatível em tecido, otimiza o crescimento e recrescimento de tecido, ou combinações dos mesmos. Tal formulação também pode ser remodelada em estruturas mais típicas e desejáveis e/ou incorporadas no novo tecido.
Grau de reticulação
Em determinadas modalidades, a solubilidade do agente de reticulação contendo sacarídeo, tal como um agente de reticulação de polissacarídeo, pode ser mantida por meio do uso de uma razão particular de reagentes químicos utilizados durante a modificação, derivação e/ou o manuseio do polissacarídeo. Em determinadas modalidades, para assegurar que o polissacarídeo derivado não reticule com si próprio, pode-se exigir que determinadas precauções sejam utilizadas durante o processo pós-derivação. Por exemplo, o HA derivado pode precisar ser processado de maneira razoavelmente rápida depois que o mesmo é precipitado, a fim de remover por lavagem os reagentes restantes. Em determinadas modalidades, a precipitação do HA derivado, a remoção por lavagem dos reagentes e a resuspensão em uma solução de água podem ser realizadas em aproximadamente 30 minutos. Outros períodos de tempo podem ser usados dependendo da situação particular. Por exemplo, a precipitação do HA derivado a remoção por lavagem dos reagentes e a re-suspensão em uma solução de água podem ser realizadas em ao menos 20, 30 40, 50 minutos, 1 hora ou 2 horas.
Em determinadas modalidades, também pode ser útil dividir, adicionalmente, o precipitado de HA derivado em partes menores antes da dissolução, a fim de aumentar a velocidade da dissolução que pode levar várias horas, por exemplo, ao menos 1, 2 ou 3 horas. Uma vez dissolvido, pode ser desejável, em determinadas aplicações, utilizar o polissacarídeo derivado dentro de um determinado período de tempo, por exemplo, dentro de ao menos 1, 2, 3, 4 ou 24 horas. No entanto, isto pode não ser necessário e irá depender da formulação e/ou aplicação particular.
Em determinadas modalidades, a molécula de proteína utilizada para formar a matriz de proteína reticulada na formulação pode ser limitada pela exigência por grupos reativos adequados para possibilitar que seja reticulada pelo agente de reticulação de polissacarídeo.
Em determinadas modalidades, ao menos ou cerca de 50% do monômero de proteína pode ser reticulado com uma biomolécula e/ou biopolímero, tal como uma molécula contendo sacarideo, por exemplo, um oligossacarideo, polissacarideo, ou derivados dos mesmos.
Em outras modalidades, ao menos ou cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 95%, 98% ou 99% do monômero de proteína pode ser reticulado com uma biomolécula e/ou biopolímero ou derivados dos mesmos. Em determinadas modalidades, o monômero de proteína pode ser substancial ou completamente reticulado com uma biomolécula e/ou biopolímero.
Em determinadas modalidades, o número de reticulações por possíveis locais de reticulação por polissacarideo pode ser ao menos 0,5%, 1%, 5%, 10%, 15%,
20%, 25%, 30%, 35% ou 50%.
Em determinadas modalidades, o número de unidades de proteína ou monômero de proteínas não incorporado no complexo ou matriz de proteína reticulada e deixado não ligado pode ser de ao menos 1, 3, 5, 7, 9, 10%, 15% ou 20%. É desejável, em determinadas aplicações, minimizar a porcentagem de unidades de proteína deixadas não ligadas após a formação do complexo ou matriz de proteína reticulada. Por exemplo, em determinadas aplicações, pode ser desejável ter menos do que 20%, 15%, 10%, 7%, 5%, 3% ou 1% das unidades de proteína não ligadas na formulação após a reticulação. A ausência de monômeros de proteína ou unidades de proteína não ligadas consiste em um dos benefícios de determinadas aplicações da presente descrição.
As porcentagens podem depender de uma série de considerações, que incluem, mas não se limitam a, a proteína selecionada e o tipo de química selecionado para a aplicação particular. Por exemplo, para ligações de tropoelastina e lisina, o número potencial de locais em algumas aplicações é tipicamente em torno de 30 a cerca de 35, assim, a razão podería ser a partir de 1 a 35 (ou em torno de 3% a 100%) . Em relação a esta combinação, as porcentagens preferidas para a matriz de proteína reticulada pode ser de ao menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% do número potencial de locais sobre a uma ou mais moléculas de proteína são reticuladas com uma ou mais biomoléculas e/ou biopolimeros, tais como moléculas contendo sacarideo, ou derivados dos mesmos.
Outra consideração consiste no comprimento da molécula contendo sacarideo, tal como polissacarideo, e na química que é usada para a ativação, derivação ou modificação. Por exemplo, em determinadas aplicações, 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30% ou 5 a 30% do um ou mais grupos ácido carboxílico em um grupo carboxila no oligossacarídeo ou polissacarideo podem ser ativados com um agente de ativação, tal como NHS, para formar 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30% ou 5 a 30% de locais de ésteres ativados que estão disponíveis para a reticulação com a proteína. Por exemplo, em determinadas aplicações, 1 a 30%, 1 a 50%, 3 a 30% ou 5 a 30% do um ou mais grupos hidroxila no oligossacarídeo ou polissacarideo podem ser ativados com um agente de ativação, tal como alil glicidil éter e adicionalmente modificados com um haleto, tal como bromo, para formar 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30%, 5 a 30% ou 1 a 50% de locais de epóxi ou halohirina ativados que estão disponíveis para reticulação com a proteína. Também podem ser usadas outras químicas que são mais ou menos eficientes. Outra consideração consiste em manter a porcentagem das unidades de proteína que podem ser deixadas como monômero (isto é, não ligadas) baixa, por exemplo, 5% ou menos.
Em determinadas modalidades, o monômero de proteína pode ser reticulado com uma biomolécula e/ou biopolímero, de tal modo que entre cerca de 40% a cerca de 99% do monômero de proteína possa ser incorporado na formulação. Em outras modalidades, o monômero de proteína
pode ser reticulado de tal modo que entre cerca de 30% a
cerca de 99%, cerca de 40% a cerca de 99%, cerca de 50% a
cerca de 100%, cerca de 60% a cerca de 100%, cerca de 70% a
cerca de 99%, 80% a cerca de 100% ou cerca de 90% a cerca
de 100% do monômero de proteína possa ser incorporado na
formulação.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode ter resistência aceitável à biodegradação, degradação, termolise, hidrólise, e/ou combinações dos mesmos, durante um período de tempo. Em determinadas modalidades, uma formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada pode ter resistência aceitável à biodegradação, degradação, termolise, hidrólise, e/ou combinações dos mesmos, durante um período de tempo. Dependendo da matriz de proteína reticulada, este período de tempo pode ser de ao menos 1, 2, 3, 6, 9 ou 12 meses.
Dependendo da formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada, este período de tempo pode ser de ao menos 1, 2, 3, 6, 9 ou 12 meses.
Em determinadas modalidades, uma formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada pode permanecer aceitavelmente intata e/ou conservar-se por a partir de 1 semana a 1 ano in vivo. Dependendo da formulação particular, o período de tempo pode variar. Por exemplo, a formulação que compreende uma matriz de proteína 5 reticulada pode conservar-se por ao menos 1 a 4 semanas, 2 a 8 semanas, 1 a 3 meses, 1 a 6 meses, 3 a 9 meses ou 6 a 12 meses, 1 semana a 24 meses, ou 12 meses a 24 meses. Em determinadas modalidades, a formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada pode conservar-se in vivo por 10 ao menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses ou 24 meses.
Por exemplo, em determinadas modalidades, uma formulação que compreende uma proteína reticulada, tal como um implante de 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml ou 0,5 ml, 1 ml, 2 15 ml ou 3 ml, pode conservar-se por cerca de 1 semana a cerca de 2 anos in vivo.
Em determinadas modalidades, o componente de matriz de proteína reticulada dentro de uma formulação pode ser estável a termolise, resistente a termolise, estável a 20 hidrólise, resistente a hidrólise, ou combinações dos mesmos, durante o armazenamento da formulação. Por exemplo, a formulação pode ser estável por ao menos 6, 12 ou 24 meses em armazenamento em uma temperatura de cerca de 2 a 8 °C. O componente de matriz de proteína reticulada dentro de 25 uma formulação pode ser estável a termolise, resistente a termolise, estável a hidrólise, resistente a hidrólise, ou combinações dos mesmos, durante o armazenamento da formulação, se liofilizada e armazenada em uma temperatura adequada, por exemplo, menor que ou em cerca de -10 °C, então, pode ficar estável por vários anos. 0 componente de matriz de proteína reticulada dentro de uma formulação pode ser estável a e/ou resistente a termolise e/ou hidrólise durante o armazenamento da formulação em temperatura ambiente por ao menos 1, 2, 3, 4 semanas, 1, 2, 6 ou 12 meses. Em determinadas modalidades, o componente de matriz de proteína reticulada dentro de uma formulação pode ser estável a e/ou resistente a termolise e/ou hidrólise durante o armazenamento em temperatura ambiente por entre ao menos 1 semana a 12 meses, 2 semanas a 8 meses, 1 semana 10 a 5 semanas ou 1 mês a 6 meses.
Matrizes de proteína reticuladas homólogas e heterólogas
A matriz de proteína reticulada pode variar em estrutura e composição. A matriz de proteína reticulada 15 pode incluir, por exemplo, uma matriz de proteína reticulada que compreende um ou mais resíduos de proteína homogêneos ou homólogos reticulados com uma ou mais biomoléculas homogêneas ou homólogas, tais como biopolímeros homólogos. Por exemplo, as moléculas contendo 20 sacarídeo homólogas. Uma matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína homólogos reticulados com um ou mais resíduos de biomolécula heterogêneos ou heterólogos, por exemplo, dois ou mais resíduos de biomolécula diferentes, tais como resíduos de 25 biopolímero heterólogos. Por exemplo, resíduos contendo sacarídeo heterólogos. Uma proteína reticulada com uma ou mais moléculas diferentes ou duas ou mais moléculas diferentes, por exemplo, biomoléculas ou biopolímeros diferentes e/ou derivados ou combinações dos mesmos. A 30 matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína reticulados com um ou mais resíduos contendo sacarídeo diferentes, tais como um ou mais resíduos de oligossacarídeo ou polissacarídeo diferentes, e/ou combinações dos mesmos.
A matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína reticulados com uma mistura de um ou mais resíduos de polissacarídeo diferentes, tais como uma combinação ou mistura de resíduos de ácido hialurônico e resíduos de carboximetil celulose. A matriz de proteína reticulada pode ser preparada a partir da reticulação de uma ou mais moléculas de proteína com uma mistura de um ou mais polissacarídeos ativados diferentes, tais como uma combinação ou mistura de ácido hialurônico ativado e carboximetil celulose ativado.
A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, uma matriz de proteína reticulada que compreende um resíduo de proteína heterólogo, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína diferentes, reticulado com resíduos de biomolécula homólogos, tais como resíduos de biopolímero homólogos, por exemplo, resíduos de molécula contendo sacarídeo homólogos. A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, uma matriz de proteína reticulada que compreende um resíduo de proteína heterólogo, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína diferentes, reticulados com um resíduo de biomolécula heterólogo, por exemplo, dois ou mais resíduos de biomolécula diferentes, tais como resíduos de biopolímero heterólogos, por exemplo, resíduos contendo sacarídeo heterólogos. A matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína diferentes, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína diferentes,
reticulados com um resíduo de molécula, por exemplo, um
resíduo de biomolécula, um resíduo de biopolímero e/ou
derivados ou combinações dos mesmos. A proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína
diferentes, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína
diferentes, reticulados com um resíduo contendo sacarideo,
tal como um oligossacarídeo ou um resíduo de
polissacarídeo.
A matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína diferentes, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína diferentes, reticulados com um ou mais resíduos de molécula diferentes, por exemplo, um ou mais resíduos de biomolécula diferentes, um ou mais resíduos de biopolímero diferentes, e/ou derivados ou combinações dos mesmos. Por exemplo, uma matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de proteína diferentes, por exemplo, dois ou mais resíduos de proteína diferentes, reticulados com um ou mais resíduos contendo sacarideo diferentes, por exemplo, um ou mais resíduos de oligossacarídeo diferentes e/ou um ou mais resíduos de polissacarídeo diferentes, tais como dois ou mais resíduos de oligossacarídeo diferentes e/ou dois ou mais resíduos de polissacarídeo diferentes, ou misturas ou combinações dos mesmos.
A matriz de proteína reticulada pode compreender um resíduo de proteína reticulado com um ou mais resíduos de molécula diferentes, por exemplo, um ou mais resíduos de biomolécula diferentes, um ou mais resíduos de biopolímero diferentes, e/ou derivados ou combinações dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender um resíduo de proteína reticulado com um ou mais resíduos contendo sacarídeo diferentes, por exemplo, dois ou mais resíduos contendo sacarídeo diferentes, por exemplo, um ou mais resíduos de oligossacarídeo diferentes e/ou um ou mais resíduos de polissacarídeo diferentes, tais como dois ou mais resíduos de oligossacarídeo diferentes e/ou dois ou mais resíduos de polissacarídeo diferentes, ou misturas ou combinações dos mesmos.
A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, um ou mais resíduos de proteína por resíduo de polissacarídeo, tal como dois ou mais resíduos de proteína por resíduo de polissacarídeo. A matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, um ou mais resíduos de polissacarídeo por resíduo de proteína, tal como dois ou mais resíduos de polissacarídeo por resíduo de proteína. Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, uma razão de cerca de 0, 1% a 1,5% de resíduo de polissacarídeo a cerca de 2,5% a 10% de resíduo de proteína. Outros exemplos de razões são: 0,75% a 1,5% de resíduo de polissacarídeo a 3% a 6% de resíduo de proteína; 0,1% a 1,5% de resíduo de polissacarídeo a 0,1% a 6% de resíduo de proteína; 0,25% a 0,85% de resíduo de polissacarídeo a 1% a 4% de resíduo de proteína; 0,1% a 3% de resíduo de polissacarídeo a 0,5% a 15% de resíduo de proteína; menos ou igual a 3% de resíduo de polissacarídeo a ao menos 0,5% de resíduo de proteína; ao menos 0,25% de resíduo de polissacarídeo a menos ou igual a 15% de resíduo de proteína; ao menos 0,01% de resíduo de polissacarídeo a menos ou igual a 12% de resíduo de proteína; ou ao menos 1% de resíduo de polissacarídeo a menos ou igual a 8% de resíduo de proteína. Outras razões podem ser usadas e irão depender das propriedades desejadas e da estrutura da molécula de proteína usada para derivar a matriz de proteína reticulada. Por exemplo, em formulações mais leves, a quantidade de molécula de polissacarídeo usada pode ser reduzida. Por exemplo, em determinadas formulações, o uso de sacarídeos de cadeia mais longa pode permitir o uso de uma quantidade menor de molécula de polissacarídeo e ainda produzir formulações aceitáveis.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender um material biocompatível e/ou biodisponível. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode consistir em e/ou ser derivada a partir de um material biocompatível e/ou biodisponível; ou a matriz de proteína reticulada pode ser biocompatível e/ou biodisponível.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender e/ou ser derivada a partir de um reticulador solúvel em água, por exemplo, um reticulador contendo sacarídeo solúvel em água ou um reticulador contendo sacarídeo modificado solúvel em água, tal como um reticulador de oligossacarídeo solúvel em água ou um reticulador de oligossacarídeo modificado solúvel em água. A matriz de proteína reticulada também pode compreender e/ou ser derivada a partir de um reticulador contendo polissacarídeo solúvel em água ou um reticulador contendo polissacarídeo modificado solúvel em água.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, um conjugado de biomolécula-proteína ou um conjugado de biopolímeroproteina ou combinações dos mesmos. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode incluir um conjugado de molécula contendo sacarídeo-proteína, tal como um conjugado de sacarídeo-proteína, um conjugado de dissacarídeoproteína, um conjugado de trissacarídeo-proteína, um conjugado de oligossacarídeo-proteína, um conjugado de polissacarídeo-proteína, e/ou combinações dos mesmos.
Molécula contendo sacarídeo
Em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarídeo, tal como um oligossacarídeo, pode compreender um ou mais dissacarídeos, um ou mais trissacarídeos, dois ou mais dissacarídeos, dois ou mais trissacarídeos, três ou mais dissacarídeos, três ou mais trissacarídeos, e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Por exemplo, um oligossacarídeo pode compreender ao menos ou cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 11 resíduos ou unidades de sacarídeo. Um oligossacarídeo usado para derivar a matriz de proteína reticulada, em determinadas formulações, também pode compreender entre cerca de 3 a cerca de 15, 3 a cerca de 14, cerca de 3 a cerca de 12, cerca de 3 a cerca de 11, cerca de 3 a cerca de 10, cerca de 4 a cerca de 15, cerca de 5 a cerca de 15, ou cerca de 5 a cerca de 10 resíduos ou unidades de sacarídeo.
Em determinadas modalidades, o polissacarídeo pode compreender um ou mais resíduos ou unidades de dissacarídeo, um ou mais resíduos ou unidades de trissacarídeo, um ou mais oligossacarídeos; dois ou mais resíduos ou unidades de dissacarídeo, dois ou mais resíduos ou unidades de trissacarídeo, dois ou mais oligossacarideos; três ou mais resíduos ou unidades de dissacarídeo, três ou mais resíduos ou unidades de trissacarídeo, três ou mais oligossacarideos, ou combinações dos mesmos. Por exemplo, um polissacarídeo pode compreender ao menos ou cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 800, 1.000, 1.200, 1.500, 2.000, 5.000, 10.000 ou 20.000 unidades ou resíduos de sacarídeo. Um polissacarídeo usado para derivar a matriz de proteína reticulada, em determinadas formulações, também pode compreender entre cerca de 25 a cerca de 5000, 500 a cerca de 2000, cerca de 3000 a cerca de 5000, cerca de 150 a cerca de 250, cerca de
175 a cerca de 225, cerca de 100 a cerca de 175, cerca de
150 a cerca de 200, ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos
ou unidades de sacarídeo.
Em determinadas modalidades, o HA pode ser usado na faixa de cerca de 100 a 300 resíduos ou unidades de sacarídeo, por exemplo, cerca de 200 resíduos ou unidades de sacarídeo. Em outras modalidades, o HA pode ser usado na faixa de 200 a 20.000 resíduos ou unidades de sacarídeo. Em outras modalidades, o HA pode ser usado na faixa de cerca de 500 a 2000 resíduos ou unidades de sacarídeo. Em outras modalidades, o HA pode ser usado na faixa de 3000 a 5000 resíduos ou unidades de sacarídeo. Em outras formulações, o HA usado pode compreender ao menos ou cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 200, 500, 800, 1.000, 1.200, 1.500, 2.000, 5.000, 10.000 ou 20.000 resíduos ou unidades de sacarídeo. O HA usado para derivar a matriz de proteína reticulada, em determinadas formulações, também pode compreender entre cerca de 25 a cerca de 5000, 500 a cerca de 2000, cerca de 3000 a cerca de 5000, cerca de 150 a
cerca de 250, cerca de 175 a cerca de 225, cerca de 100 a
cerca de 175, cerca de 150 a cerca de 200, ou cerca de 100
a cerca < de 200 resíduos ou unidades de sacarídeo.
A molécula contendo sacarídeo, tal como um polissacarídeo, pode ser de peso molecular baixo, médio ou alto. Por exemplo, a composição ou formulação pode ser derivada a partir de um agente de reticulação de polissacarídeo ou polissacarídeo de peso molecular baixo, médio ou alto.
A molécula contendo sacarídeo de baixo peso molecular pode compreender um peso molecular entre cerca de 25.000 a cerca de 300.000 Daltons, por exemplo, entre cerca de 50.000 a cerca de 275.000 Daltons, cerca de 100.000 a cerca de 250.000 Daltons, ou cerca de 50.000 a cerca de 300.000 Daltons. A molécula contendo sacarídeo de peso molecular médio pode compreender um peso molecular entre cerca de 300.000 a cerca de 900.000 Daltons, cerca de 600.000 a cerca de 800.000, cerca de 500.000 a cerca de 900.000, ou cerca de 500.000 a cerca de 750.000 Daltons. A molécula contendo sacarídeo de peso molecular alto pode compreender um peso molecular entre cerca de 900.000 a cerca de 4.000.000 Daltons, cerca de 1.000.000 a cerca de 3.500.000, cerca de 900.000 a cerca de 3.500.000, cerca de 1.500.000 a cerca de 3.700.000, ou cerca de 1.250.000 a cerca de 3.000.000 Daltons. Também é observado que podem ser usados os polissacarideos que têm faixas de peso molecular que combinam as faixas dadas no presente documento. Por exemplo, pode ser usado um polissacarídeo que tem uma faixa de peso molecular de cerca de 25.000 a cerca de 750.000, cerca de 50.000 a cerca de 900.000, cerca de 100.000 a cerca de 750.000, ou cerca de 250.000 a cerca de 500.000 Daltons. Outras faixas também podem ser selecionadas.
Em determinadas modalidades, a capacidade de utilizar polissacarideos de baixo peso molecular a médio peso molecular torna estas abordagens mais fáceis a partir de uma perspectiva de fabricação/processamento. Por exemplo, o uso de HA de peso molecular menor permite que o HA seja modificado, precipitado e lavado e o HA permanece uma solução com viscosidade razoavelmente baixa que pode ser prontamente usada como o agente de reticulação. O uso de polissacarideos de peso molecular maior pode fornecer problemas de manuseio adicionais (por exemplo, solução viscosa, problemas com mistura, aeração, etc.), mas, em determinadas modalidades, uma ampla gama de pesos moleculares pode ser usada para se alcançar os resultados desejados. Uma abordagem para manusear polissacarideos de peso molecular maior pode consistir em utilizar uma solução mais diluída. Por exemplo, (por exemplo, utilizar HA de
1.500.000 Daltons, mas utilizar 0,1% de solução para manter a viscosidade baixa).
A matriz de proteína reticulada pode compreender o resíduo contendo sacarideo, tal como um resíduo de polissacarídeo, em uma concentração entre cerca de 0,1% a cerca de 15%. Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender o resíduo contendo
sacarideo em uma concentração entre cerca de 0,1% a cerca
de 10%, cerca de 0,2% a cerca de 5%, cerca de 0,25% a cerca
de 5%, cerca de 0,1% a cerca de 3 .5%, cerca de 0, 20% a
cerca de 3%, cerca de 0,25% a cerca de 3%, cerca de 0,5% a
cerca de 4%, cerca de 0, 5% a cerca de 3%, cerca de 0,75% a
cerca de 3.5%, cerca de 1% a cerca de 3%, cerca de 1,5% a
cerca de 3.5%, ou cerca de 0,2% a cerca de 4 %.
A molécula contendo sacarideo , tal como um
polissacarideo, pode compreender um peso molecular de ao menos ou cerca de 500 Daltons, por exemplo, um peso molecular de ao menos ou cerca de 5.000, 10.000, 25.000, 50.000, 100.000, 150.000, 200.000, 250.000, 300.000, 500.000, 750.000 ou 1.500.000 Daltons.
Em determinadas modalidades, uma molécula, tal como uma biomolécula ou um biopolimero, pode compreender, ao menos uma porção ligável, tal como ao menos uma porção reticulável, por exemplo, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, uma amina, um tiol, um álcool, um alceno, um alcino, um grupo ciano, ou uma azida e/ou modificações, derivados, ou combinações dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma biomolécula ou um biopolimero, tal como uma proteína ou uma molécula contendo, sacarideo, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarideo, pode compreender, ao menos uma porção reticulável, tal como um grupo carboxila, um grupo hidroxila, uma amina, um tiol, um álcool, um alceno, um alcino, um grupo ciano, ou uma azida e/ou modificações, derivados, ou combinações dos mesmos.
Em determinadas modalidades, uma porção ligável, tal como uma porção reticulável, pode consistir em uma porção que é capaz de ativação, por exemplo, de uma porção grupo carboxila ou uma porção grupo hidroxila, de tal modo que a ativação da porção ligável permita e/ou facilite uma reação com um grupo reativo complementar na mesma e/ou uma
segunda molécula para formar uma ligação, tal como uma
ligação covalente, com a mesma e/ou segunda molécula, por
exemplo, formar uma reticulação a uma segunda molécula, tal
como uma segunda biomolécula ou biopolímero.
Em determinadas modalidades, uma molécula, tal
como uma biomolécula ou um biopolímero, por exemplo, uma
molécula contendo sacarídeo ou uma proteína, pode
modo que o grupo grupo espaçador, de tal compreender, um espaçador seja capaz de ligar à mesma e/ou uma segunda molécula, por exemplo, uma segunda biomolécula ou biopolímero. Por exemplo, em determinadas modalidades, um grupo espaçador pode compreender ao menos uma ou mais porções ligáveis, possibilitando, assim, que o grupo espaçador se ligue à mesma e/ou uma segunda molécula. Em determinadas modalidades, por exemplo, uma molécula, tal como uma molécula contendo sacarídeo ou uma proteína, pode compreender, um grupo espaçador que compreende ao menos uma ou mais porções ligáveis, possibilitando, assim, que a molécula forme uma ligação, tal como uma reticulação, a uma segunda molécula, tal como uma segunda biomolécula ou biopolímero, por exemplo, uma proteína ou uma molécula contendo sacarídeo, através de uma ligação formada pela porção ligável no grupo espaçador. Por exemplo, em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarídeo, tal como um oligossacarídeo, polissacarídeo, ou polissacarídeo modificado, pode compreender um grupo espaçador que compreende ao menos uma ou mais porções ligáveis, tais como um grupo carboxila ou um grupo carboxila ativado ou modificado, possibilitando, assim, que o polissacarídeo forme uma ligação, tal como uma reticulação, a uma segunda molécula, tal como uma proteína, por exemplo, uma proteína que compreende uma amina, através de uma ligação de amida formada pela porção ligável no grupo espaçador no oligossacarídeo, polissacarídeo ou polissacarídeo modificado.
Em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarideo, tal como um oligossacarídeo ou um polissacarídeo, pode compreender grupos funcionais de carga negativa ou grupos funcionais de carga positiva, por exemplo, um oligossacarídeo que compreende grupos funcionais de carga negativa ou grupos funcionais de carga positiva; ou um polissacarídeo que compreende grupos funcionais de carga negativa ou grupos funcionais de carga positiva; e/ou derivados ou combinações dos mesmos. Por exemplo, em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarideo, tal como um oligossacarídeo ou um polissacarídeo, pode compreender um ácido idurônico, ácido glucurônico, ou um resíduo de N-acetilglucosamina. Em determinadas modalidades, por exemplo, a molécula contendo sacarideo pode incluir, por exemplo, um oligossacarídeo que compreende um grupo carboxila ou um polissacarídeo que compreende um grupo carboxila, tal como um polissacarídeo contendo ácido policarboxílico, por exemplo, ácido hialurônico ou carboximetil celulose; um oligossacarídeo que compreende um grupo amina ou um polissacarídeo que compreende um grupo amina; e/ou derivados dos mesmos.
Características estruturais - Linear ou Ramificado
Em determinadas modalidades, a molécula contendo sacarideo pode incluir, oligossacarídeos lineares, oligossacarideos ramificados, polissacarideos lineares e/ou polissacarideos ramificados. A molécula contendo sacarideo pode incluir, mas não se limita a, oligossacarideos e/ou polissacarideos, tais como ácido hialurônico (HA); um derivado de celulose, por exemplo, carboxi celulose, carboximetil celulose, hidroximetil celulose, hidroxipropil celulose (HPC), hidroxipropil metilcelulose (HPMC), hidroxi-propilcelulosecarboximetil amilose (CMA); goma xantana; goma guar; a-glucano; β-glucano; β-l,4-glucano; β1,3-glucano; alginatos; carboximetil dextrano; um derivado de glicosaminoglicano; condroitina-6-sulfato; sulfato de dermatina; heparina; sulfato de heparina; ácido polilático (PLA); ou biomateriais, tais como ácido poliglicólico (PGA); ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA); fosfato de tricálcio (TCP); 1-hidroxiapatita (PAH); e/ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou derivados ou combinações dos mesmos. A molécula contendo sacarideo pode incluir, uma pectina e/ou um derivado da mesma, que inclui oligossacarideos e/ou polissacarideos lineares e ramificados.
Ά molécula contendo sacarideo pode consistir em uma molécula contendo sacarideo preparada a partir de e/ou derivado a partir de ou por meio de processos de ocorrência natural, modificação química sintética e/ou combinações dos mesmos.
Por exemplo, a molécula contendo sacarideo pode incluir moléculas contendo sacarideo preparadas e/ou derivadas a partir de células eucarióticas ou células procarióticas, por exemplo, processos de ocorrência natural que ocorrem através de células eucarióticas ou células procarióticas, ou combinações dos mesmos.
Por exemplo, a molécula contendo sacarídeo pode incluir moléculas contendo sacarídeo preparadas e/ou derivadas por meio de modificação química sintética, tal como por meio de síntese de fase sólida. A molécula contendo sacarídeo incorpora um ligante durante síntese de polissacarídeo de fase sólida.
A molécula contendo sacarídeo pode compreender uma molécula contendo sacarídeo substancialmente solúvel, por exemplo, completamente solúvel, parcialmente solúvel, tal como um oligossacarídeo ou polissacarídeo que é substancialmente solúvel em uma solução aquosa e/ou solução fisiológica.
A molécula contendo sacarídeo pode compreender, por exemplo, um polianiônico sacarídeo, um sacarídeo policatiônico, uma molécula de sacarídeo biocompatível, um sacarídeo biodisponível, um sacarídeo biodegradável, um sacarídeo bioabsorvível, um sacarídeo biorreabsorvível, ou combinações dos mesmos.
Proteína e Polissacarídeo
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode incluir, por exemplo, um componente de resíduo contendo sacarídeo que tem um caráter de carga eletrônica que complementa o caráter de carga eletrônica do componente de resíduo de proteína na matriz de proteína reticulada. O caráter de complementação de carga de cada componente pode ajudar e/ou facilitar a união dos componentes. O caráter de complementação de carga de cada componente pode contribuir para as propriedades gerais totais da composição. A matriz de proteína reticulada pode incluir, adicionalmente, contraíons farmacêutica e/ou fisiologicamente aceitáveis que podem complementar um componente de resíduo contendo sacarídeo que tem um caráter de carga eletrônica, ou contraíons farmacêutica e/ou fisiologicamente aceitáveis que podem complementar um caráter de carga eletrônica do componente de resíduo de proteína, ou ambos. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode compreender um componente de resíduo contendo sacarídeo polianiônico, tal como resíduo de polissacarídeo polianiônico reticulado a um resíduo de proteína de carga positiva. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode compreender um componente de resíduo contendo sacarídeo policatiônico, tal como resíduo de polissacarídeo policatiônico reticulado a um resíduo de proteína de carga negativa.
Escolha de Proteína e Polissacarídeo
Em determinadas modalidades, a escolha do componente de proteína incluído na matriz de proteína reticulada, tal como tropoelastina, pode ser com base nas exigências funcionais finais do produto de biomaterial resultante.
Por exemplo, o componente de resíduo de proteína incluído na matriz de proteína reticulada pode incluir resíduos de proteína, tais como resíduos de albumina ou colágeno. Em determinadas modalidades, escolha do componente de resíduo de proteína incluído na matriz de proteína reticulada pode ser com base na exigência de bioatividade final do produto resultante. Em determinadas modalidades, de biomaterial a escolha do componente de resíduo de proteína incluído na matriz de proteína reticulada pode ser com base no desejo de incluir uma combinação de resíduos de proteína no produto de biomaterial resultante.
Em determinadas modalidades, o componente de resíduo de proteína incluído na formulação de matriz de proteína reticulada pode variar na formulação. Por exemplo, em determinadas modalidades, a formulação pode ter a partir de 25 a 50 mg/ml de resíduo de proteína e 1 a 30 mg/ml do resíduo de agente de reticulação de polissacarídeo. Em determinadas formulações, o componente de resíduo de proteína incluído na formulação de matriz de proteína reticulada pode ser a partir de 1 a 200 mg/ml; 5 a 30 mg/ml, 20 a 100 mg/ml, 50 a 200 mg/ml, 20 a 100 mg/ml, 25 a 80 mg/ml, 30 a 60 mg/ml, 40 a 70 mg/ml ou 25 a 65 mg/ml. Em determinadas modalidades, a faixa adequada de quantidades do componente de resíduo de proteína e a faixa adequada de quantidades do componente de resíduo de polissacarídeo incluído na formulação de matriz de proteína reticulada podem ser diferentes com base nas exigências da aplicação particular.
Acoplamento / Conjugação / Reticulação
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada pode meio de ligação, tal como acoplamento e/ou reticulação, de uma proteína, tal como uma proteína contendo amina, a uma molécula contendo sacarídeo que compreende um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo carboxila ativado, um grupo hidroxila ativado, um grupo carboxila modificado ou um grupo hidroxila modificado, tal como um oligossacarídeo, polissacarídeo, e/ou derivado dos mesmos, que compreende um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo carboxila ativado, um grupo hidroxila ativado, um grupo carboxila modificado ou um grupo hidroxila modificado, para formar uma amida ou ligação de amina. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio de acoplamento e/ou reticulação de uma proteína, tal como uma proteína contendo resíduo de amina, a um oligossacarídeo e/ou oligossacarídeo modificado que compreende um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo carboxila ativado, um grupo hidroxila ativado, um grupo carboxila modificado ou um grupo hidroxila modificado, para formar uma amida ou ligação de amina entre a proteína e o oligossacarídeo. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio do acoplamento e/ou reticulação de uma proteína, tal como uma proteína contendo resíduo de amina, a um polissacarídeo e/ou polissacarídeo modificado que compreende um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um grupo carboxila ativado, um grupo hidroxila ativado, um grupo carboxila modificado ou um grupo hidroxila modificado, para formar uma amida ou uma ligação de amina entre a proteína e o polissacarídeo.
Em determinadas modalidades, a formação de uma matriz de proteína reticulada pode ser facilitada por meio do emprego de um agente de ativação e/ou agente de acoplamento ou do emprego tanto de um agente de ativação e/ou agente de acoplamento como um agente de modificação e/ou agente de acoplamento auxiliar para formar uma ligação e/ou reticulação entre o componente de proteína da proteína reticulada e a segunda molécula da proteína reticulada, tal como uma biomolécula, biopolímero, ou um grupo espaçador, ou combinações ou derivados dos mesmos. A matriz de proteína reticulada pode ser preparada mediante o emprego de um agente de ativação e/ou agente de acoplamento para formar uma ligação e/ou reticulação. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio da ativação de um ou mais grupos ácido carboxílico em um oligossacarídeo ou polissacarídeo contendo grupo carboxila, tal como ácido hialurônico, com um agente de ativação e/ou agente de acoplamento para formar um oligossacarídeo ativado ou polissacarídeo ativado, e acoplamento e/ou reticulação do oligossacarídeo ativado ou polissacarídeo ativado a uma proteína, tal como uma proteína contendo resíduo de amina, para formar uma ligação de amida entre o oligossacarídeo ou polissacarídeo e a proteína. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio da ativação de um ou mais grupos hidroxila em um oligossacarídeo ou polissacarídeo contendo grupo hidroxila, tal como ácido hialurônico, com um agente de ativação e/ou agente de acoplamento para formar um oligossacarídeo ativado ou polissacarídeo ativado, e acoplamento e/ou reticulação do oligossacarídeo ativado ou polissacarídeo ativado a uma proteína, tal como uma proteína contendo resíduo de amina, para formar uma ligação de amina entre o oligossacarídeo ou polissacarídeo e a proteína.
Agente de ativação / Agente de acoplamento/
Agente de modificação
Em determinadas modalidades, um agente de
ativação, às vezes chamado de um agente de acoplamento,
pode incluir, mas não se limita a, uma diimida, tal como uma carbodiimida ou uma carbodiimida solúvel em água, por exemplo, l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimidametiodida (ETC), l-ciclohexil-3- (2morfolinoetil)-carbodiimida (CMC), e/ou |os sais correspondentes ou misturas dos mesmos. O agente de ativação também pode incluir, por exemplo, benzotriazol-1iloxitris-(dimetilamino)-fosfôniohexafluorofosfato (reagente
Bop),
O-benzotriazol-l-il-N,N,N',Ν'te trame tilurônio hexafluorofosfato,
b.romo-tris(dimetilamino)-fosfôniohexafluorofosfato e/ou os sais de haleto correspondentes ou misturas dos mesmos.
Em determinadas modalidades, um agente de ativação, às vezes chamado de um agente de acoplamento, pode incluir, mas não se limita a, um epóxido, tal como alil glicidil éter ou um haloalceno, tal como cloreto de alila, e/ou os sais correspondentes ou misturas dos mesmos.
A matriz de proteína reticulada pode ser preparada mediante o emprego tanto de um agente de ativação e/ou agente de acoplamento como um agente de modificação e/ou agente de acoplamento auxiliar para formar uma ligação e/ou reticulação. Por exemplo, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio da ativação de um ou mais grupos ácido carboxílico em um oligossacarídeo ou polissacarideo contendo grupo carboxila, tais como ácido hialurônico, com um agente de ativação e/ou agente de acoplamento para formar um oligossacarídeo ativado ou polissacarideo ativado, modificação do um ou mais grupos carboxílicos ativados no oligossacarídeo ativado ou polissacarideo ativado com um agente de modificação e/ou agente de acoplamento auxiliar para formar um oligossacarídeo modificado ou polissacarídeo modificado, e acoplamento e/ou reticulação do oligossacarídeo modificado ou polissacarídeo modificado a uma proteína, tal como uma proteína contendo resíduo de amina, para formar uma ligação de amida entre o oligossacarídeo ou polissacarídeo e a proteína.
Em determinadas modalidades, um agente de modificação, às vezes chamado de um agente de acoplamento auxiliar, pode incluir, mas não se limita a, um reagente que, na presença de uma porção carboxila e/ou hidroxila ativada, tal como uma porção carboxila e/ou hidroxila ativada em um polissacarídeo, reage com a porção carboxila e/ou hidroxila ativada para formar uma espécie modificada que pode ser mais estável ou mais capaz de reagir com um nucleófilo. Por exemplo, o agente de modificação, ou agente de acoplamento auxiliar, pode incluir, mas não se limita a, N-hidroxi-succinimida (NHS), N-hidroxisulfosuccinimida (sulf-NHS), 1-hidroxi-benzotriazol hidrato (HOBt), 1hidroxibenzotriazol monohidrato, 3,4-dihidro-3-hidroxi-4oxo-1,2,3- benzotriazol (HOOBt), l-hidroxi-7azabenzotriazol (HAT), 4-nitrofenol, 2-nitrofenol, 4nitrotiofenol, 2-nitrotiofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, imidazol, tetrazol, 4dimetilaminopiridina, um haleto e/ou outros compostos relacionados.
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio da ativação e/ou modificação de uma molécula contendo sacarideo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, tais como um oligossacarídeo ou um polissacarídeo, por exemplo, ácido hialurônico, com um agente de ativação e/ou um agente de modificação, e combinação com uma proteína, para formar uma ou mais ligações e/ou reticulações, tais como um ou mais ligações de amida ou amina, entre a molécula contendo sacarideo e a proteína.
O método de preparação de uma matriz de proteína reticulada pode compreender misturar e/ou combinar um agente de ativação e/ou agente de modificação com uma molécula contendo sacarideo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, por exemplo, ácido hialurônico, para formar uma molécula contendo sacarideo ativada e/ou modificada, e misturar e/ou combinar a molécula contendo sacarideo ativada e/ou modificada com uma proteína, para formar uma ou mais ligações e/ou reticulações, tais um ou mais ligações de amida ou amina, entre a molécula contendo sacarideo e a proteína. Por exemplo, uma molécula contendo sacarideo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, tais como ácido hialurônico, pode ser ativada e/ou modificada com um agente de ativação, tal como EDC ou alil glicidil éter e/ou agente de modificação, tal como NHS, HOBt ou bromo. Por exemplo, a molécula contendo sacarideo ativada e/ou compreender um ou mais grupos carboxila ativados e/ou modificados como ésteres modificados, tais como triazol ésteres modificada pode e/ou hidroxila ativados e/ou ativados e/ou modificados ou como N-hidroxisuccinimida ésteres ativados e/ou modificados, epóxidos ativados e/ou modificados, ou halohidrinas ativadas e/ou modificadas. Uma molécula contendo sacarideo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, tais como ácido hialurônico, pode ser ativada e/ou modificada com um agente de ativação, tal como EDC ou alil glicidil éter, e/ou agente de modificação, tal como NHS, HOBt ou bromo, e pode ser combinada, misturada e/ou reagida com um composto contendo uma ou mais porções amina, tais como uma proteina que compreende uma ou mais cadeias laterais que contêm amina, para formar uma ou mais ligações e/ou reticulações, tais como ligações de amida ou amina, entre a molécula contendo sacarídeo e o composto contendo uma ou mais porções amina.
Em determinadas modalidades, uma molécula que compreende uma ou mais porções aminas, tais como uma proteina, peptideo, ou grupo espaçador, que compreende uma ou mais porções aminas, pode ser acoplada a um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila em uma molécula contendo sacarídeo, por exemplo, pode ser acoplada em um ambiente aquoso a um oligossacarídeo ou polissacarídeo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, tais como um oligossacarídeo ou polissacarídeo que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila que têm sido ativados e/ou modificados com um agente de ativação e/ou agente de modificação.
Em determinadas modalidades, o método usado para modificar um polissacarídeo pode depender da proteína que é reticulada e/ou do polissacarídeo usado como o reticulador. Por exemplo, o método usado para modificar um polissacarídeo pode compreender o uso de oxidação de periodato. O método usado para modificar um polissacarídeo pode compreender o uso de um agente de ativação, tal como uma carbodiimida, por exemplo, EDC. 0 método usado para modificar um polissacarídeo pode compreender o uso de um agente de ativação, tal como um epóxido, por exemplo, alil glicidil éter. O método usado para modificar um polissacarideo pode compreender, adicionalmente, o uso de um agente de modificação, tal como N-hidroxisuccinimida (NHS) ou um haleto, tal como bromo. Por exemplo, o ácido hialurônico e/ou carboximetil celulose pode ser ativado por um agente de ativação, tal como uma carbodiimida, e pode ser adicionalmente modificado por um agente de modificação, tal como N-hidroxisuccinimida. Por exemplo, o ácido hialurônico e/ou carboximetil celulose pode ser ativado por um agente de ativação, tal como um epóxido, e pode ser adicionalmente modificado por um agente de modificação, tal como bromo.
Reagente molecular bifuncional
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode ser preparada por meio da reação de uma proteína com um reagente multifuncional, tal como uma molécula contendo sacarídeo que compreende duas ou mais porções reativas ou um grupo espaçador que compreende duas ou mais porções reativas, para formar duas ou mais ligações ou reticulações.
Por exemplo, o reagente multifuncional pode compreender duas ou mais das mesmas ou diferentes porções reativas, tais como uma mistura de grupos carboxila e/ou hidroxila, grupos carboxila e/ou hidroxila ativados, grupos carboxila e/ou hidroxila modificados e/ou combinações ou derivados dos mesmos. Por exemplo, cada uma das porções reativas no reagente multifuncional pode ser reativa com grupos reativos complementares na mesma ou outra molécula. Por exemplo, uma ou mais das porções reativas no reagente multifuncional pode exigir que a desproteção, tal como a remoção de um grupo de proteção, seja capaz de reagir com os grupos reativos complementares na mesma ou outra molécula.
Grupo espaçador
O grupo espaçador pode incluir uma porção que une um ou mais componentes individuais. O grupo espaçador pode ser ligado a uma ou mais moléculas, por exemplo, ligado a uma proteína por uma ligação covalente, ligado a um polissacarídeo por uma ligação covalente, ligado tanto a uma proteína como a um polissacarídeo por ligações covalentes e/ou combinações dos mesmos. O grupo espaçador pode incluir, por exemplo, mas não se limita a, uma porção glicol, uma porção óxido de etileno, um polímero formado a partir de porções - (-CH2-CH2-O-) - de repetição, tais como polietileno glicol (PEG), ou óxido de polietileno (PEO), uma poliamina, ou um poliol. O espaçador pode ser estável a termolise ou hidrólise, ou ambos. O espaçador pode ser biocompatível, biodisponível, solúvel e/ou substancialmente solúvel em meio aquoso e/ou fisiológico, ou combinações dos mesmos. A biomolécula ou biopolímero pode compreender um ou mais resíduos de grupo espaçador, por exemplo, tais como um polietileno glicol (PEG) ou um grupo óxido de polietileno (PEO). A matriz de proteína reticulada pode compreender um ou mais resíduos de grupo espaçador, por exemplo, tais como um polietileno glicol (PEG) ou um grupo óxido de polietileno (PEO). A molécula contendo sacarídeo pode compreender um ou mais resíduos de grupo espaçador, por exemplo, tais como um polietileno glicol (PEG) ou um grupo óxido de polietileno (PEO). A molécula contendo sacarídeo pode compreender uma ou porções que incluem um grupo reativo, por exemplo, um grupo reativo que pode formar uma ligação covalente quando reagido com um grupo reativo complementar que pode ser parte de uma proteína ou proteína modificada. A proteína ou proteína modificada pode compreender uma ou porções que incluem um grupo reativo, por exemplo, um grupo reativo que pode formar uma ligação covalente quando reagido com um grupo reativo complementar que pode ser parte de uma molécula contendo sacarídeo.
Grau de Modificação de Polissacarídeo
Em determinadas modalidades, o reticulador contendo sacarídeo, que compreende um ou mais grupos carboxila e/ou hidroxila, por exemplo, ácido hialurônico, pode ser ativado e/ou modificado para compreender uma faixa de grupos carboxila e/ou hidroxila ativados e/ou modificados e uma faixa de grupos carboxila e/ou hidroxila que não são ativados e/ou modificados. Por exemplo, o reticulador contendo sacarídeo ativado e/ou modificado pode ser ativado e/ou modificado para compreender ao menos ou cerca de 2% de grupos carboxila e/ou hidroxila ativados e/ou modificados, tais como ao menos ou cerca de 0,5%, 1%, 3% 5%, 10%, 20%, 25%, 30% ou 35% de grupos carboxila e/ou hidroxila ativados e/ou modificados. Em determinadas aplicações, o reticulador contendo sacarídeo pode conter grupos carboxila e/ou hidroxila substancial ou completamente ativados e/ou modificados. Em determinadas modalidades, o reticulador contendo sacarídeo ativado e/ou modificado pode ser ativado e/ou modificado para compreender entre cerca de 0,5% a cerca de 40%, cerca de 1% a cerca de 30%, cerca de 1% a cerca de 25%, cerca de 3% a cerca de 30% ou cerca de 5% a cerca de 25%, grupos carboxila e/ou hidroxila ativados e/ou modificados.
Em determinadas modalidades, a variância no nível de grupos ativados e/ou modificados no reticulador contendo sacarídeo pode aumentar ou diminuir a capacidade do reticulador contendo sacarídeo reticular com uma biomolécula. Por exemplo, o nível de grupos ativados e/ou modificados no reticulador contendo sacarídeo pode resultar na formação de uma ou mais conexões entre o reticulador contendo sacarídeo e a biomolécula ou biopolimero. A variância no nível de reticulador contendo sacarídeo que compreende grupos ativados e/ou modificados empregados para preparar a proteína reticulada pode controlar ou controlar substancialmente o número de grupos ativados e/ou modificados capazes de reagir com uma biomolécula ou biopolimero, tal como ligar e/ou reticular com uma proteína, pode estabilizar ou estabilizar substancialmente a proteína.
Extrusão
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode ser extrudada através de uma agulha. Por exemplo, extrudada através de uma agulha de calibre fino. A matriz de proteína reticulada pode reter coesão suficiente, por exemplo, reter coesão suficiente mesmo após a extrusão de agulha, de tal modo que uma tira longa de material possa ser extrudada a partir da agulha sem a ruptura do material. Por exemplo, tal como uma tira de material de ao menos cerca de 15 cm pode ser extrudada a partir da agulha sem a ruptura do material. A matriz de proteína reticulada pode compreender uma estrutura de matriz flexível. Por exemplo, a estrutura de matriz flexível da matriz de proteína reticulada pode facilitar a produção de biomateriais consistentes que retêm flexibilidade suficiente para serem ejetados através de uma agulha fina. Em determinadas modalidades, uma formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada pode ser extrudada através de uma agulha, por exemplo, extrudada através de uma agulha de calibre fino sem a necessidade por processamento adicional. Em determinadas modalidades, uma formulação que compreende uma matriz de proteína reticulada pode reter coesão suficiente mesmo após a extrusão de agulha, de tal modo que uma tira longa de material possa ser extrudada a partir da agulha sem a ruptura do material, tal como uma tira de material de ao menos cerca de 15 cm. Em determinadas modalidades, uma formulação pode compreender uma matriz de proteína reticulada que compreende estrutura de matriz flexível.
Por exemplo, em determinadas modalidades, a estrutura de matriz flexível da matriz de proteína reticulada na formulação pode facilitar produção de biomateriais consistentes, tais como biomateriais consistentes que retêm flexibilidade, por exemplo, flexibilidade substancial e/ou suficiente, e pode permitir que a formulação e/ou biomaterial seja ejetado através de uma agulha, por exemplo, uma agulha de calibre fino.
Métodos de preparação
Em determinadas modalidades, a concentração de um
polissacarídeo na reação pode ser entre cerca de 0,1% a
cerca de 5%, por exemplo, entre cerca de 0,25% a cerca de
3%, cerca de 0,5% a cerca de 3%, ou cerca de 0,25% a 3,5% .
Em determinadas modalidades, a estequiometria do reagente pode variar com a química e polissacarídeo escolhido. Por exemplo, para HA:EDC:NHS, a razão pode ser 1:1:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:0,5:2, 1:0,5:3. Com NHS, descobriuse que a razão de 1:1:1 proporciona bons resultados em termos de incorporação de NHS em um agente de reticulação de polissacarídeo solúvel.
Em determinadas modalidades, a razão molar de polissacarídeo para agente de ativação pode ser de ao menos 1:1 a ao menos cerca de 1:4. Em determinadas modalidades, a razão molar do agente de ativação para as unidades de ácido carboxílico do polissacarídeo pode ser entre cerca de 2% a cerca de 200%, por exemplo, entre cerca de 5% a cerca de 100%. Em determinadas modalidades, a razão molar do agente de modificação para o agente de ativação pode ser entre cerca de 1:1 a cerca de 3:1, por exemplo, entre cerca de 1,5:1 a cerca de 2.5:1, tal como cerca de 2:1.
Em determinadas modalidades, o pH para realizar a preparação da reação de reticulador de polissacarídeo pode ser de ao menos 4, 5, 6, 7, 8,0 ou 8,5. Em determinadas modalidades, o pH para a realização da preparação da reação de reticulador de polissacarídeo pode ser entre cerca de 5 a cerca de 15, cerca de 6,5 a cerca de 9, cerca de 7 a cerca de 8,6. Outros pHs também podem ser usados.
Em determinadas modalidades, a faixa de temperatura da reação de ativação, acoplamento e/ou reticulação é conduzida em uma temperatura entre cerca de 15 °C a cerca de 30 °C, 20 °C a cerca de 25 °C, ou em temperatura ambiente.
Em determinadas modalidades, o método de purificação e/ou isolamento do polissacarídeo derivado pode ser robusto, simples, de alto rendimento, ou combinações dos mesmos. Por exemplo, o método pode render ao menos 40% de polissacarídeo derivado isolado, em relação ao polissacarídeo de partida. Em outros métodos, o rendimento pode ser de ao menos 40%, 50%, 60% ,65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de polissacarídeo derivado isolado, em relação ao polissacarídeo de partida ou polissacarídeo modificado.
Usos terapêuticos
As composições, materiais, formulações, métodos de uso, sistemas e/ou kits de matriz de proteína reticulada apresentados no presente documento podem ser empregados em diversos ambientes terapêuticos, que incluem, mas não se limitam a, empregados em medicina humana ou veterinária, tal como em cirurgia.
Por exemplo, podem ser empregados de maneira terapêutica em cirurgia reparadora, cirurgia estática, estética, aumento de volume de tecido, tal como incontinência ou em produtos de reposição dérmica, dermatologia, tal como cirurgia dermatológica, cirurgia de olhos, reumatologia, farmacologia, ou no campo de cosméticos. Outros usos terapêuticos podem incluir estancar hemorragia em cirurgia geral, reconstruir nervos e vasos em cirurgia plástica, neuro e reconstrutora, e fixar a pele, transplantes vasculares ou de cartilagem ou enxertos em cirurgia ortopédica, tal como tratamento de osteoartrite do joelho (joelho inflamatório), cirurgia vascular e plástica. Determinadas modalidades podem ser úteis como veículos para a liberação de células ou moléculas bioativas, tais como fatores de crescimento para estimular o reparo focal; liberação local de fatores de crescimento em combinação com as composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada podem facilitar a cicatrização de ferida e regeneração de tecido em muitas situações, tais como na promoção de formação óssea, estimulação de reparo de cartilagem em procedimentos ortopédicos, tratamento de condições patológicas de ferida, tais como úlceras crônicas e/ou servem como um arcabouço para gerar tecidos artificiais através da proliferação de células autólogas em cultura. Em determinadas modalidades, a natureza injetável das composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada pode torná-las adequadas para o aumento de tecido em cirurgia plástica, por exemplo, como um material de enchimento biocompatível inerte, tal como para o preenchimento de dobras dérmicas ou para a reconstrução de lábios. Em determinadas modalidades, as composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada podem ser úteis para a suplementação de uma cavidade do corpo ou um déficit. Em determinadas modalidades, as composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada pode ser úteis em medicina estática, tratamento ortopédico, restauração de volume efundido durante cirurgia, tal como durante a cirurgia de olhos, e/ou aplicação tópica em tecido lesionado ou saudável, tal como a pele, por exemplo, aplicação tópica em cosmetologia e/ou dermatologia. Em determinadas modalidades, as composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada podem ser úteis em preenchimento de rugas faciais, linhas de expressão, tratamento de pele envelhecida, tecido com cicatriz e/ou depressões da pele, tais como lipodistrofia.
Determinadas modalidades podem ser usadas para estabilizar uma proteína, por exemplo, uma proteína bioativa, utilizadas para liberar uma ou mais proteínas estabilizadas, por exemplo, uma ou mais proteínas bioativas.
Determinadas modalidades podem incluir uma substância ativa farmacêutica dispersa por toda parte e podem ser úteis como um sistema de liberação de fármaco. Determinadas modalidades podem incluir, por exemplo, proteínas, fatores de crescimento, enzimas, fármacos, biopolímeros, polímeros sintéticos biologicamente compatíveis e/ou combinações, derivados, ou variações dos mesmos.
Características; estabilidade
Em determinadas modalidades, a matriz de proteína reticulada pode compreender ao menos uma dentre as seguintes propriedades, que incluem, mas não se limitam a, injetável, biocompatível, substancialmente biocompatível, estável, substancialmente estável, mantém bioatividade, mantém substancialmente a bioatividade, mantém a conformação bioativa, substancial, um módulo fornece elasticidade ou elasticidade elástico, um módulo viscoso, fornece rigidez estrutural ou rigidez substancial, resistência ou resistência substancial ao calor, resistência ou resistência substancial termolise, resistência ou resistência substancial biodegradação, pode ser biodegradável, pode não estranho ou uma resposta provocar uma resposta de corpo de corpo estranho considerável (isto é, autorreconhecimento), tem um nível de pureza de ao menos cerca de 25%, extrudável, extrudável através de uma agulha, extrudável através de uma agulha de calibre fino.
Em determinadas modalidades, a composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode compreender uma molécula contendo sacarideo que tem ao menos uma dentre as seguintes propriedades, que incluem, mas não se limitam a, solubilidade substancial, solubilidade aquosa, substancialmente solúvel em uma solução aquosa e/ou uma solução tampão aquosa, solubilidade fisiológica, solubilidade fisiológica substancial, injetável, biocompativel, substancialmente biocompativel, estável, substancialmente estável, mantém a bioatividade, mantém substancialmente a bioatividade, mantém a conformação bioativa, resistência ou resistência substancial à biodegradação, pode ser biodegradável, pode não provocar uma resposta de corpo estranho ou uma resposta de corpo estranho considerável (isto é, autorreconhecimento), ou tem um nível de pureza de ao menos cerca de 25%.
Em determinadas modalidades, a composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode ter e/ou compreender ao menos uma dentre as seguintes propriedades, que incluem, mas não se limitam a, injetável, biocompativel, substancialmente biocompativel, estável, substancialmente estável, mantém a bioatividade, mantém substancialmente a bioatividade, mantém a conformação bioativa, fornece elasticidade ou elasticidade substancial, um módulo elástico, um módulo viscoso, fornece rigidez estrutural ou rigidez substancial resistência ou resistência substancial ao calor, resistência ou resistência substancial a termolise, resistência ou resistência substancial à biodegradação, pode ser biodegradável, pode não provocar uma resposta de corpo estranho ou uma resposta de corpo estranho considerável (isto é, autorreconhecimento), tem um nível de pureza de ao menos cerca de 25%, extrudável, extrudável através de uma agulha, ou extrudável através de uma agulha de calibre fino.
Determinadas modalidades podem ter um módulo elástico entre cerca de 500 Pa a cerca de 50 Pa, cerca de 450 Pa a cerca de 100 Pa, cerca de 400 Pa a cerca de 125
Pa; cerca de 400 Pa a cerca de 150 Pa ou cerca de 385 Pa a cerca de 150 Pa. 0 módulo elástico irá variar dependendo da concentração e componentes usados. Por exemplo, para um produto de matriz de tropoelastina a 4 % reticulada com HA a 1, o módulo elástico/de armazenamento é estável através de uma faixa de frequências em torne de 80 a 100 Pa e domina o material com o módulo de perda começando em torno de 5 a lOPa e aumentando gradualmente com frequências angulares crescentes.
Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 25G. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é coerente e conserva-se sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 25G.
Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 2 0 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 27G. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é coerente e conserva-se sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 27G.
Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 2 0 cm ou 2 5 cm, quando extrudado através de uma agulha de 30G. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é coerente e conserva-se sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 30G.
Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 2 0 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 31G. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é coerente e conserva-se sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudado através de uma agulha de 31G.
Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm através de uma agulha de calibre fino. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável entre cerca de 5 cm a cerca de 30 cm, cerca de 10 cm a cerca de 20 cm; cerca de 10 cm a cerca de 15 cm ou cerca de 15 cm a cerca de 30 cm. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 2 0 cm ou 25 cm através de uma agulha de calibre fino. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável, que é coerente e conserva-se sem suporte, de ao menos cerca de 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm através de uma agulha de calibre fino. Determinadas modalidades podem ter um comprimento extrudável entre cerca de 5 cm a cerca de 30 cm, cerca de 10 cm a cerca de 20 cm; cerca de 10 cm a cerca de 15 cm ou cerca de 15 cm a cerca de 3 0 cm que é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte quando extrudado.
Em determinadas modalidades, a composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode ser estabilizada pelo componente de proteína do produto. A estabilidade da composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode resultar a partir de uma combinação de um componente de resíduo de proteína completa e um componente de resíduo de reticulação, tal como um componente de resíduo de polissacarídeo. Em determinadas modalidades, as propriedades de um material final podem não depender da viscosidade do componente de resíduo de polissacarídeo, tal como o componente molecular de polissacarídeo de partida. A composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode ser estabilizada pelo componente de resíduo de reticulação do produto, tal como um resíduo de reticulação contendo sacarídeo, por exemplo, um resíduo reticulador de polissacarídeo.
Em determinadas modalidades, a composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada compreende um resíduo de proteína reticulado biocompatível.
Em determinadas modalidades, a composição, material e/ou formulação de matriz de proteína reticulada pode ser adequada para a incorporação em uma seringa.
Em determinadas modalidades, as agulhas de calibre fino podem ser usadas. Por exemplo, agulhas de 25G, 27G, 29G, 30G ou 31G podem ser usadas. No entanto, determinadas modalidades podem ser usadas com agulhas de calibre maior, por exemplo, 20G a 25G, 15G a 25G, 15G a 20G, 10G a 20G, 10G a 15G, etc. Em determinadas modalidades, o tamanho da agulha pode depender do material injetado, por exemplo, do tipo e/ou consistência do material injetado, do desejo de liberar uma quantidade particular de volume de material e/ou combinações ou variações dos mesmos. Determinadas modalidades possibilitam o uso de agulhas de calibre fino, onde a formulação apresentada retém coesão suficiente após a extrusão de agulha, de tal modo que tiras de material de >15 cm de comprimento possam ser extrudadas a partir da agulha sem a ruptura do material. Por exemplo, com determinadas modalidades, as tiras de material de >15 cm de comprimento podem ser extrudadas a partir da agulha de 25G, 27G, 29G ou 30G sem a ruptura do material.
Para determinadas aplicações, por exemplo, aplicações de aumento de volume, tais como o colo da bexiga, uma agulha de 18, 19, 20, 21, 22 ou 23G pode ser usada. As agulhas maiores podem ser usadas em determinadas aplicações, à medida que o comprimento da agulha é maior (usualmente várias polegadas) e, assim, o fluxo através da agulha está sujeito a mais resistência. Em determinadas aplicações, o volume a ser injetado também pode ser aumentado por vários mililitros, por exemplo, ao menos 1,5 ml, 2 ml, 2,5 ml, 3 ml ou 4 ml. Em determinadas aplicações, onde o volume menor pode ser usado, (por exemplo, 'retroinjeção' ou preenchimento de rugas finas ou aumento de pele fina) o volume usado pode ser menor, por exemplo, menor do que 2 ml, 1,5 ml, 1,0 ml, 0,75 ml, 0,5 ml ou 0,1 ml. Tipicamente, estas aplicações utilizam uma agulha de calibre estreito mais curta, por exemplo, 29G, 30G ou 31G que tem 1,27 centímetros (½ polegada) de comprimento.
O calibre da agulha e comprimento da agulha usada pode variar dependendo da aplicação e/ou da formulação particular. Por exemplo, as formulações com níveis maiores de derivação (por exemplo, a 30% de possíveis locais modificados,
1, 5% de polissacarídeo e
5% de teor de proteína), as quais podem ser usadas para fornecer suporte de tecido mais estruturalmente persistente, seriam tipicamente aplicadas com o uso de uma agulha mais larga como 27 ou 25G x W ou 1 (1,2 7 ou
2,54 centímetros) . Outro exemplo seria uma formulação com baixa derivação (em torno de 5%) , baixo HA (<1%) e/ou proteína liberada através de uma agulha mais fina, tal como uma agulha de 31G.
Em determinadas modalidades, o material extrudado pode ser extrudado sem suporte- usualmente extrudado a partir de uma superfície inicial verticalmente ou em um ângulo de 45° a partir do vertical. A capacidade de formar fios coerentes de material pode torná-lo particularmente atrativo para aplicações onde a retroinjeção do implante é realizada na pele em uma matriz ou estrutura para fornecer suporte estrutural.
Outros métodos de liberação também podem ser usados, por exemplo, cânulas, cateteres, cateteres de polimero flexivel e/ou seringas com nenhuma agulha.
Em determinadas modalidades, ao menos um dos benefícios dos métodos e/ou composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada apresentados no presente documento, consiste no fato de que a quantidade de proteína que pode ser incluída na formulação de material resultante não é uma fator limitante. Por exemplo, o teor de resíduo de proteína incluído na matriz de proteína reticulada pode compreender cerca de 35 ou 40 mg/ml acima da quantidade na qual pode se tornar resistente à extrusão de agulha, quando se utiliza outros métodos de reticulação de proteínas, tais como reticuladores químicos, tais como glutaraldeído (à medida que o material reticulado pode ser completamente denso). O resíduo de proteína pode ser reticulado de maneira intramolecular, intermolecular e/ou combinações dos mesmos. O resíduo de proteína pode ser substancialmente ou somente reticulado de maneira intermolecular. A formulação de matriz de proteína reticulada pode ser mais flexível e/ou pode ser receptiva à injeção em altas concentrações de proteína.
As composições, materiais e/ou formulações de matriz de proteína reticulada apresentadas no presente documento podem ser utilizadas em um kit ou embalagem. Em determinadas modalidades, o kit ou embalagem compreende uma seringa que tem sido pré-preenchida com a composição de matriz de proteína reticulada e uma variedade de agulhas ou sistemas de liberação por agulha de tamanho adequado, tais como um sistema do tipo rolamento de agulha, um sistema do tipo caneta de injeção automática ou um sistema do tipo pistola de injeção de mesoterapia. A embalagem ou kit também pode conter instruções para injeção da composição fornecida. Em outras modalidades, o kit ou embalagem pode compreender ao menos uma seringa, ao menos um recipiente separado, tal como um frasco ou ampola que contém a composição a ser usada, multiagulhas, e instruções sobre como utilizar o kit.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos e protocolos são dados como modalidades particulares da descrição e para demonstrar as vantagens das mesmas. Compreende-se que os exemplos e protocolos são dados a título de ilustração e não se destinam a limitar o relatório descritivo ou as reivindicações que se seguem.
Procedimento para Derivação de Ácido hialurônico (HA) com o uso de EDC e NHS:
1. Dissolver HA em água a uma concentração final de 1% (possivelmente até 2%).
2. Adicionar 1 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) por g de HA a ser derivado.
3. Adicionar 1 g de l-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) por grama de HA.
4. Assegurar que os reagentes são completamente dissolvidos por agitação cuidadosa (aproximadamente 10 a 20 min.).
5. Reagir por 60 min. em 20 a 25°C.
6. Adicionar NaCl a uma concentração final de 1%.
7. Precipitar HA derivado por meio da adição de
Volumes de isopropanol (IPA).
8. Recuperar HA derivado precipitado por meio de filtração, centrifugação delicada ou outro meio adequado e descartar o sobrenadante.
9. Pressionar delicadamente o HA derivado recuperado para remover o líquido em excesso.
10. Lavar HA derivado precipitado em 60% de IPA.
11. Remover e descartar o fluido de lavagem.
12. Pressionar delicadamente o HA derivado recuperado para remover o líquido em excesso.
13 . Pesar a quantidade de HA derivado
recuperado.
14 . Dissolver o HA derivado recuperado em água
estéril a uma concentração final de 2,5% com base na
quantidade inicial de HA dissolvido na etapa 1.
15. Analisar a quantidade de derivação de NHS (com base na modificação química e análise de UV).
16. Analisar a concentração de HA derivado dissolvido (com base na modificação química e análise de UV ou peso seco).
17. Ajustar a concentração de HA derivado a 2% (20 mg/ml).
18. Filtrar com filtro estéril o HA derivado.
Nota: As etapas 7 a 14 deveríam ser conduzidas o mais rápido possível, por exemplo, menos que 30 min. deveríam ser deixados para estas etapas no total (embora a dissolução real de HA precipitado possa levar mais tempo).
Procedimento para a Preparação de Matriz de proteína reticulada
1. Dissolver a proteína em PBS estéril a uma concentração final de 100 mg/ml e esterilizar com filtro.
2. Analisar a concentração de proteína (por exemplo, com base na análise de UV).
3. Misturar volumes iguais de 20mg/ml de HA derivado com lOOmg/ml de proteína sob misturar/agitação
cuidadosa sem a introdução de quaisquer bolhas de ar.
4. Deixar gelificar por 30 a 60minutes (20 a
25°C).
5. Preencher as seringas.
A seguir estão procedimentos comuns usados nos
exemplos que se seguem.
EXEMPLO 1
Diagrama esquemático para uma Produção de um reticulador de ácido hialurônico solúvel com o uso de uma Carbodiimida e N-Hidroxisuccinimida (NHS):
ácido hialurônico (HA) é um polissacarídeo que consiste em unidades de ácido β-D-glucurônico-[1D3]-β-D-Nacetil-glucosamina dissacarídeo. A estrutura ideal de HA é mostrada na Figura 1.
Conforme pode ser observado, o HA contém um grupo carboxila por unidade de dissacarideo, e é este grupo funcional que pode ser utilizado na ao menos uma das abordagens de reticulação apresentadas no presente documento. Nesta abordagem, é formada uma ligação química covalente entre o grupo carboxila do HA e os grupos amino livres da proteína. Isto pode ser feito mediante a reação do HA com uma carbodiimida, tal como l-Etil-3-(3dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), formando um oacilisoureia éster ativo. Embora este composto seja reativo com nucleófilos, tais como grupos amino primários, também é instável e irá hidrolisar rapidamente em água na ausência de quaisquer grupos reativos adequados. Portanto, é muitas vezes preferido formar um éster ativo intermediário mais estável a partir do o-acilisoureia éster ativo, o qual pode ser efetuado por meio de uma reação de condensação com o uso de compostos, tais como N-hidroxisuccinimida (NHS) ou Sulfo-N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS). Isto resulta na formação de HA ativado por NHS, o qual, então, pode reagir com grupos amino primários a partir da proteína para formar ligações de amina muito estáveis. As esquemáticas destas reações são mostradas na Figura 2.
Um dos principais benefícios desta abordagem consiste no fato de que o HA pode ser derivado antes de ser misturado com a proteína, o qual irá limitar ou evitar a presença de reagentes de derivação residuais na formulação final. As abordagens principais para a remoção dos reagentes em excesso consistem na precipitação com solventes orgânicos miscíveis em água, tais como álcool isopropílico (IPA) ou etanol, seguida pela lavagem com uma mistura de água/solvente ou na diafiltração com o uso de uma membrana semipermeável com um corte de peso molecular adequado. Uma vez que o HA derivado tem sido purificado, o mesmo pode ser, então, dissolvido em água ou um tampão adequado, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, então, ser misturado com a proteína para formar uma formulação reticulada através da reação entre os ácidos carboxílicos ativados com NHS do HA e os grupos amino a partir da proteína. Nesta abordagem, o HA se torna de modo eficaz o reticulador para a proteína. Espera-se que as propriedades da formulação resultante sejam diferentes de uma formulação onde a proteína é reticulada com um reticulador curto; ou onde o HA é reticulado por um reticulador curto na ausência de uma proteína.
EXEMPLO 2
Diagrama esquemático para uma Produção de um reticulador de ácido hialurônico solúvel com o uso do reagente heterobifuncional alil glicidil éter (AGE)
Esta abordagem é com base na derivação de ácido hialurônico (HA) com um reagente heterobifuncional que permite uma abordagem de duas etapas para a reticulação de proteínas com HA. O método escolhido neste exemplo consistiu no uso de alil glicidil éter (AGE) , onde a incorporação inicial de AGE acontece quando o grupo oxirano reage com os grupos hidroxila do HA sob condições fortemente alcalinas, formando uma ligação de éter estável. Os grupos alila incorporados deste modo podem ser, então, convertidos em halohidrinas por meio da reação com um haleto, tal como bromo. Estas halohidrinas pode, então, reagir com a proteína através de grupos amino primários por meio da formação de ligações de amina secundária estáveis. A reação entre halohidrinas e grupos amino primários acontece de modo mais eficaz em valores altos de pH, mas alguma reação começará a ocorrer acima do pH 8,5 a 9.
NaOH . HA-OH + AGE --->HA-R-CH=CH2
2. HA-R-CH=CH2 + Br2 + H2O ->HA-R-CH (OH) -CH2Br + HBr
HiiOH
3. HA-R-CH (OH) -CH2Br + Pr-NH2--->HA-R-CH (OH)-CH2~
NH-Pr + HBr
O esquema de reação mostrado acima para a reticulação de proteínas com HA. HA = Ácido hialurônico, R = 0-CH2-CH (OH) -CH2-O-CH2, AGE = Alil glicidil éter, Pr = Proteína.
EXEMPLO 3
Preparação de um Reticulador de polissacarideo A:
Neste Exemplo, 5 ml de uma solução de ácido hialurônico de baixo peso molecular a 1%, 1 ml de H2O, 100 mg de NHS (Sigma) e 100 mg de EDC (Sigma) foram misturados em conjunto e deixados reagir por 1 hora em temperatura ambiente. O ácido hialurônico derivado foi, então, precipitado com dois volumes de IPA, pressionado brevemente para reduzir o teor de água e solvente do precipitado, lavado com 66% de etanol, então, dissolvido novamente em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (Sigma) em temperatura ambiente. O HA derivado dissolveu-se completamente dentro de 1 hora. A concentração do HA derivado foi medida com o uso de um analisador de umidade e, então, diluído a uma solução de 2% antes do uso na reticulação de proteína. Todas as preparações eram esteriles e os experimentos foram, onde possível, conduzidos em uma capela de fluxo laminar.
EXEMPLO 4
Preparação de um Reticulador de polissacarídeo B:
Neste Exemplo, 5 ml de uma solução de carboximetil celulose a 1%, 1 ml de H2O, 100 mg de NHS (Sigma) e 100 mg de EDC (Sigma) foram misturados em conjunto e deixados reagir por 1 hora em temperatura ambiente. O carboximetil celulose derivado foi, então, precipitado com dois volumes de ΙΡΆ, pressionado brevemente para reduzir o teor de água e solvente do precipitado, lavado com 66% de etanol, então, dissolvido novamente em 4 ml de solução salina tamponada com fosfato (Sigma) em temperatura ambiente. Todas as preparações eram esteriles e os experimentos foram, onde possível, conduzidos em uma capela de fluxo laminar.
EXEMPLO 5
Preparação de um Reticulador de polissacarídeo C:
Neste exemplo, 4 ml de HA a 2% foi misturado com 0,5 ml de 10M NaOH e 0,5 ml de AGE e deixado reagir por 1 hora em temperatura ambiente. A solução foi, então, neutralizada com 1 ml de 9M ácido acético, 40 mg de NaCl foram adicionados seguido pela precipitação com 2 volumes de ΙΡΑ. O precipitado foi lavado com 60% de IPA, seco por absorvente em papel filtro e, então, dissolvido em 3 ml de água. Os grupos alila incorporados foram, então, convertidos com água de bromo (250 pL foram adicionados, mas a quantidade necessária para a conversão completa foi entre 200 e 250 pL) . Para remover o bromo em excesso, a solução foi precipitada novamente por meio da adição de 30 mg de NaCl seguido por 2 volumes de IPA. O precipitado foi lavado com 60% de IPA, seco por absorvente em papel filtro e, então, dissolvido novamente em 2 ml de água. 0,5 ml da solução foi usado para testar a concentração final de HA derivado em um analisador de umidade e descobriu-se que o teor de matéria seca era de 2,59 %. O HA derivado foi diluído a uma solução de 2 % antes do uso na reticulação de proteína.
EXEMPLO 6
Preparação de uma formulação à base de proteína com o uso de rh Tropoelastina 1:
Neste exemplo, 250 pL de uma solução de 200mg/ml de rh tropoelastina em solução salina tamponada com fosfato (Elastagen) foram misturados com 250 pL de solução salina tamponada com fosfato seguido pela a adição de 500 pL do reticulador de ácido hialurônico do Exemplo 3. A combinação foi misturada cuidadosamente seguida pela breve centrifugação para remover as bolhas de ar. O material foi deixado por 30 min. em temperatura ambiente para formular. A formulação foi, então, preenchida em uma seringa de 1 ml estéril em uma capela de fluxo laminar. Todas as formulações feitas desta forma apresentaram as propriedades de materiais consistentes que eram extrudáveis através de agulhas de 31G de calibre fino como fios coerentes de 10 a 20 cm de comprimento.
EXEMPLO 7
Preparação de uma formulação à base de proteína com o uso de albumina de soro bovino (BSA):
Neste Exemplo, 250 pL de uma solução de 200mg/ml de BSA em solução salina tamponada com fosfato (Sigma) foram misturados com 250 pL de solução salina tamponada com fosfato seguido pela adição de 500 pL do reticulador de ácido hialurônico do Exemplo 3. A combinação foi misturada cuidadosamente seguida pela breve centrifugação para remover as bolhas de ar. O material foi deixado por 30 min. em temperatura ambiente para formular. Todas as formulações feitas desta forma apresentaram as propriedades de materiais consistentes que eram extrudáveis através de agulhas de 31G de calibre fino como fios coerentes de 10 a 20 cm de comprimento.
EXEMPLO 8
Preparação de uma formulação à base de proteína com o uso de rhHSA:
Neste Exemplo, uma solução de 2 0mg/ml de HSA recombinante (Sigma) em solução salina tamponada com fosfato (Sigma) foi misturada com um volume igual do reticulador de ácido hialurônico do Exemplo 3. A combinação foi misturada cuidadosamente seguida pela breve centrifugação para remover as bolhas de ar. O material foi deixado por 30 min. em temperatura ambiente para formular. Isto produzir uma formulação de HSA incolor transparente reticulada mole que foi extrudável através de agulhas de 31G de calibre fino.
EXEMPLO 9
Preparação de uma formulação à base de proteína com o uso de rh Tropoelastina 2:
Neste Exemplo, 500 pL de uma solução de lOOmg/ml de rh tropoelastina em solução salina tamponada com fosfato (Elastagen) foram misturados com 500 pL de reticulador de ácido hialurônico a 2 % do Exemplo 5 em pH 8,5. A combinação foi misturada cuidadosamente seguida pela breve centrifugação para remover as bolhas de ar. O material foi deixado por 12 horas em temperatura ambiente para formular. A formulação produzida consistiu em uma formulação de matriz incolor transparente consistente de tropoelastina reticulada com HA.
EXEMPLO 10
Avaliação de teor de monômero em formulações
Neste Exemplo, uma alíquota da formulação produzida no Exemplo 6 foi imersa em PBS e o sobrenadante resultante foi analisado por SDS-PAGE (o gel resultante é ilustrado na Figura 3).
Carga: Formulação produzida no Exemplo 6, imersa em PBS
Faixa M: Marcador.
Faixas A e B: Sobrenadante.
Faixa TE: TE puro.
Conforme pode ser observado a partir do gel, nenhum monômero foi extraído a partir da preparação de HATE.
EXEMPLO 11
Avaliação de reologia de formulação
Neste Exemplo, o comportamento reológico em fluxos de cisalhamento da formulação produzida no Exemplo 6 foi estudado com o uso de um reômetro Haake RS150 com a utilização de uma geometria de placa e. Um cone de titânico de 35 mm/l° foi usado no estudo com a temperatura mantida em 25°C.
A resposta da formulação ao fluxo de cisalhamento de pequena amplitude, com frequência angular variada, é dominada pelo módulo de armazenamento (G' ) na faixa de frequência angular de 0,1 e 100 rad/s. Sobre esta faixa, o módulo de armazenamento foi relativamente insensível a mudanças em frequência angular. No fluxo de cisalhamento fixo, a deformação aumenta linearmente com tensão até cerca de 200 Pa. Além deste valor, uma pequena mudança na tensão aplicada conduziu a um aumento significante em deformação. Quando a viscosidade de cisalhamento foi registrada em relação à taxa de cisalhamento, o fluido demonstrou uma viscosidade constante de cerca de 260 Pas em baixas taxas de cisalhamento. A viscosidade, no entanto, diminui rapidamente com taxa de cisalhamento crescente além de uma taxa de cisalhamento de cerca de 0,4/s.
As propriedades reológicas da formulação à base de proteína no Exemplo 6 são significantemente diferentes dos polissacarídeos não reticulados e dos produtos de polissacarídeo reticulados com reticuladores curtos, tais como BDDE, os quais são, então, micronizados para possibilitar a extrusão de agulha fina. Estes produtos de polissacarídeo agem de maneira mais similar a fluidos viscosos e têm uma contribuição maior para suas propriedades reológicas a partir do módulo de perda (G) sobre as mesmas frequências examinadas. O valor relativamente constante do módulo complexo da formulação produzida no Exemplo 6 fornece um ponto de diferença particular para os produtos à base de polissacarídeo.
A seguir, as modalidades ou exemplos adiciona(is são fornecidos:
Modalidade 1. Uma composição, que compreende ao menos uma matriz de proteína reticulada, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende:
i) ao menos um resíduo de proteína; e ii) ao menos um resíduo contendo sacarídeo.
2. A composição de acordo com a modalidade 1, em que a composição consiste em uma composição injetável.
3. A composição, de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que a composição é liberada por meio de cânula, cateter, cateter de polímero flexível, seringa com agulha, ou seringa sem agulha.
4. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 3, em que a composição é extrudável a um comprimento de ao menos 10 cm.
5. A composição de acordo com uma ou mais
dentre as modalidades 1 a 4, em que a composição é
extrudável através de agulhas de 18G a 31G a um comprimento
entre cerca de 5 cm a cerca de 30 cm e a composição
extrudada conserva-se substancialmente sem suporte de superfície.
6. A composição de acordo com uma ou mais modalidades 1 a 5, em que a composição é extrudável através de uma agulha de 25G a um comprimento de ao menos 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm ou 25 cm.
7. A composição de acordo com uma ou mais modalidades 1 a 6, em que a composição é extrudável ao comprimento de ao menos 10 cm, 15 cm, 20 cm ou 25 cm, quando extrudada através de uma agulha de calibre fino.
8. A composição de acordo com uma ou mais modalidades 1 a 7, em que a composição é extrudável a um comprimento entre 5 cm a30 cm, 10 cm a 20 cm; ou 15 cm a 30 cm, sem suporte de superfície adicional, quando extrudada através de uma agulha de calibre fino e em que a composição extrudada é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente.
9. A composição de acordo com uma ou mais modalidades 1 a 8, em que a composição é extrudável a um comprimento de ao menos 10 cm, 15 cm, 20 cm ou 25 cm, sem suporte físico adicional, quando extrudada através de um calibre médio e a composição extrudada é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente.
10. A composição de acordo com uma ou mais modalidades 1 a 9, em que a composição é extrudável a um comprimento de ao menos 10 cm, 15 cm, 2 0 cm ou 2 5 cm sem suporte de superfície adicional, quando extrudada através de uma agulha de calibre grande e a composição extrudada é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente.
11. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 10, em que a composição é extrudável a um comprimento de ao menos 10 cm, 20 cm ou 30 cm sem suporte de superfície adicional em um ângulo de ao menos 45° a partir da vertical e forma fios coerentes de material.
12. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 11, em que a composição extrudada forma fios coerentes de material.
13. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 12, em que a composição pode ser extrudada sem processamento adicional substancial.
14. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 13, em que a composição pode ser extrudada sem processamento adicional substancial através de uma agulha de calibre fino e quando extrudada é substancialmente coerente e conserva-se substancialmente sem suporte físico adicional.
15. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 14, em que a composição retém coesão suficiente após a extrusão de agulha de tal modo que as tiras de composição extrudada não se rompem durante a extrusão.
16. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 15, em que a composição retém coesão suficiente após a extrusão de agulha de tal modo que as tiras da composição maiores do que 10 cm, maiores do que 12 cm, maiores do que 15 cm, maiores do que 18 cm ou maiores do que 20 cm possam ser extrudadas a partir da agulha sem que as tiras da composição se rompam.
17. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 16, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende um resíduo de proteína completa.
18. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 17, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende um resíduo de proteína substancialmente completa.
19. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 18, em que a composição é substancialmente flexível de tal modo que possa ser ejetada através de uma agulha.
20. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 19, em que a composição tem flexibilidade suficiente para permitir a ejeção através de agulhas de calibre fino.
21. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 20, em que a composição possibilita que o ao menos um resíduo de proteína retenha seu comprimento completo, ou substancialmente completo, e o ao menos um resíduo de proteína é protegido contra a rápida reabsorção ou decomposição.
22. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 21, em que a composição possibilita que o ao menos um resíduo de proteína retenha seu comprimento completo, ou substancialmente completo, e em que a composição é injetável por agulha, retém uma estrutura coerente, e é suficientemente reticulada para reduzir a velocidade de reabsorção da composição in vivo.
23. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 22, em que o ao menos um resíduo de proteína é substancialmente completo e substancialmente desprovido de reticulações intramoleculares.
24. A composição de acordo com uma ou mais
dentre as modalidades 1 a 23, em que a composição é
compatível com tecido, otimiza o crescimento de tecido,
otimiza o recrescimento de tecido, ou combinações dos
mesmos.
25. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 24, em que a composição pode ser remodelada em estruturas desejáveis e típicas e incorporada no novo tecido.
26. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 25, em que o ao menos um resíduo contendo sacarídeo permanece solúvel, ou suficientemente solúvel, em água ou solução salina.
27. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 26, em que o ao menos um resíduo contendo sacarídeo é substancialmente solúvel em um meio aquoso ou fisiológico.
28. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 27, em que o ao menos um resíduo de proteína reticulado é substancialmente reticulado de maneira intermolecular.
29. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 28, em que o ao menos um resíduo contendo sacarídeo tem um ou mais dentre as seguintes propriedades: substancialmente biodisponível, substancialmente biodegradável, substancialmente bioabsorvível ou substancialmente biorreabsorvível.
30. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 29, em que o ao menos um resíduo contendo sacarídeo compreende ao menos um resíduo de polissacarídeo, ao menos um resíduo de oligossacarídeo ou combinações dos mesmos.
31. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 30, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo compreende um resíduo de polissacarídeo de peso molecular baixo, médio, alto ou combinações dos mesmos.
32. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 31, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo compreende um peso molecular entre cerca de 50.000 a cerca de 275.000 Daltons.
33. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 32, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo é derivado a partir de ou compreende o resíduo de ácido hialurônico, um derivado de celulose, carboxi celulose, carboximetil celulose, hidroximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, hidroxi-propilcelulosecarboximetil amilose, goma xantana, goma guar, a-glucano, β-glucano, β-1,4glucano, β-l,3-glucano, alginatos, carboximetil dextrano, um derivado de glicosaminoglicano, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina, ácido polilático, ácido poliglicólico, ácido poli(lático-coglicólico), fosfato de tricálcio, 1-hidroxiapatita, sais farmaceuticamente aceitáveis de, derivados de, ou combinações dos mesmos.
34. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 33, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo é derivado a partir de ou compreende o resíduo de ácido hialurônico.
35. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 34, em que o ao menos um resíduo de polissacarídeo é derivado a partir de ou compreende o resíduo de carboximetil celulose.
36. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 35, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende o ao menos um resíduo contendo sacarídeo em uma concentração entre cerca de 0,01% a cerca de 30%.
37. Ά composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 36, em que o ao menos um resíduo de proteína compreende um resíduo de cadeia lateral contendo amina, que compreende ao menos um resíduo de lisina, ao menos uma resíduo de arginina, ou combinações dos mesmos.
38. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 37, em que o ao menos um resíduo de proteína é derivado a partir de ou compreende o resíduo de tropoelastina, elastina, albumina, colágeno, monômeros de colágeno, imunoglobulinas, insulina, derivados de, ou combinações dos mesmos.
39. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 38, em que a quantidade do ao menos um resíduo de proteína é entre cerca de 1 mg/ml a cerca de 200 mg/ml.
40. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 39, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende um resíduo de proteína bioativo.
41. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 40, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada é derivada a partir de ou compreende o resíduo de uma proteína sintética substancialmente idêntica a uma proteína humana de ocorrência natural.
42. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 41, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada é derivada a partir de ou compreende o resíduo de uma proteína estabilizada.
43. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 42, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada é derivada a partir de ou compreende o resíduo de uma proteína extracelular.
44. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 43, em que proteína extracelular consiste em tropoelastina, elastina, colágeno ou um derivado dos mesmos.
45. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 44, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende o ao menos um resíduo contendo sacarídeo em uma concentração entre cerca de 0,1% a cerca de 5%.
46. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 45, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende uma razão de cerca de 0,1% a cerca de 1,5% do ao menos um resíduo contendo sacarídeo a cerca de 0, 1% a cerca de 6% do ao menos um resíduo de proteína.
47. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 46, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende uma razão de cerca de 0,1% a cerca de 1,5% do ao menos um resíduo contendo sacarídeo, que compreende um resíduo de polissacarídeo, a cerca de 0,1% a cerca de 6% do ao menos um resíduo de proteína.
48. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 47, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada é preparada a partir de ao menos uma molécula de reticulação contendo sacarídeo que compreende ao menos 5%, 10%, 20% ou 25% de grupos carboxila e/ou hidroxila ativados, grupos carboxila e/ou hidroxila modificados ou combinações dos mesmos.
49. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 48, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada é preparada a partir de ao menos uma molécula de reticulação contendo sacarídeo que compreende ao menos 5% de grupos carboxila e/ou hidroxila ativados, grupos carboxila e/ou hidroxila modificados ou combinações dos mesmos.
50. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 49, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende menos do que 5% de um resíduo de proteína monomérico.
51. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 50, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende menos do que 1% do resíduo de proteína monomérico.
52. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 51, em que a composição é empregada de maneira terapêutica em ao menos um dentre os seguintes: cirurgia, estética, aumento de volume de tecido, tratamento de incontinência, em produtos de reposição dérmica, dermatologia, cirurgia dermatológica, cosmética ou combinações dos mesmos.
53. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 52, em que a composição é empregada de maneira terapêutica em dermatologia.
54. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 53, em que a composição é empregada de maneira terapêutica em cirurgia dermatológica.
55. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 54, em que a composição é empregada de maneira terapêutica como uma aplicação tópica em cosmetologia, dermatologia ou combinações dos mesmos.
56. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 55, em que a composição é empregada de maneira terapêutica como uma aplicação tópica em dermatologia.
57. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 56, em que a composição é usada para o tratamento de rugas faciais, o preenchimento de rugas faciais, o tratamento de linhas de expressão, o tratamento de pele envelhecida, o tratamento de tecido com cicatriz, o tratamento de depressões da pele ou combinações dos mesmos.
58. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 57, em que a composição é empregada na implantação de um depósito localizado de um resíduo de proteína substancialmente bioativo.
59. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 58, em que a composição é empregada na implantação de um depósito localizado de um resíduo de proteína substancialmente bioativo.
60. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 59, em que a composição é empregada na implantação de depósito de liberação lenta de um resíduo de proteína substancialmente bioativo.
61. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 60, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende ao menos 90%, 95%, 98% ou 99% do ao menos um resíduo de proteína reticulada com uma biomolécula e/ou biopolímero, em que a biomolécula e/ou biopolímero compreende o ao menos um resíduo contendo sacarideo.
62. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 61, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende o ao menos um resíduo de proteína que é substancialmente reticulado com uma biomolécula, biopolímero de reticulação ou combinações dos mesmos.
63. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 62, em que o número de reticulações no ao menos um resíduo de polissacarídeo pode
ser de ao menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% do número de
possíveis locais de reticulação no ao menos um resíduo de
polissacarídeo.
64. A composição de acordo com uma ou mais
dentre as modalidades 1 a 63, em que o número de unidades de proteína não incorporados na ao menos uma matriz de proteína reticulada e deixadas não ligadas pode ser de ao menos 1%, 3%, 5% ou 7%.
65. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 64, em que menos do que 20%, 15%, 10% ou 7% das unidades de proteína não são incorporadas na ao menos uma matriz de proteína reticulada e deixadas não ligadas.
66. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 65, em que o monômero de proteína pode ser reticulado de tal modo que entre cerca de 90% a cerca de 100% do monômero de proteína podem ser incorporados na composição.
67. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 66, em que o ao menos um resíduo de proteína é derivado a partir de uma proteína completa ou uma proteína substancialmente completa e em que a estrutura do resíduo de proteína não é substancialmente mascarada pelo ao menos um resíduo contendo sacarídeo.
68. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 67, em que a composição, que compreende o ao menos um resíduo de proteína que tem uma estrutura que não é substancialmente mascarada pelo ao menos um resíduo contendo sacarídeo, pode ser mais compatível com tecido, otimizar crescimento de tecido, recrescimento, ou combinações dos mesmos.
69. A composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 68, em que a composição, que compreende o ao menos um resíduo de proteína que tem uma estrutura que não é substancialmente mascarada pelo ao menos um resíduo contendo sacarídeo, pode ser remodelada em estruturas mais desejáveis e típicas e/ou incorporada em um novo tecido.
70. Um método de preparação da composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 69, que compreende reticular ao menos uma proteína com ao menos uma molécula contendo sacarídeo solúvel.
Modalidade 71. Um método de preparação da composição, que compreende ao menos uma matriz de proteína reticulada, em que a ao menos uma matriz de proteína reticulada compreende:
i) ao menos um resíduo de proteína; e ii) ao menos um resíduo contendo sacarideo; em que a reticulação compreende:
i) modificar a ao menos uma molécula contendo
sacarideo para compreender ao menos um grupo químico
reativo;
ii) combinar a ao menos uma molécula contendo
sacarideo modificada com a ao menos uma proteína, em que a
ao menos uma proteína compreendem um grupo químico reativo complementar ao grupo reativo na ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada; e iii) formar ao menos uma ligação entre a ao menos uma proteína e a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada.
72. O método de acordo com as modalidades 70 ou
71, em que o ao menos um grupo químico reativo consiste em um grupo químico que é capaz de formar uma ligação covalente, quando combinado com a ao menos uma proteína.
73. 0 método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 72, em que a ao menos uma ligação é uma ligação covalente.
74. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 73, em que a ao menos uma molécula contendo sacarideo modificada é solúvel ou substancialmente solúvel em água e/ou solução salina.
100
75. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 74, em que a ao menos uma molécula contendo sacarídeo modificada permanece solúvel ou substancialmente solúvel em água ou tampão fisiológico.
76. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 70 a 75, em que a ao menos uma molécula contendo sacarídeo compreende um grupo carboxila e/ou hidroxila.
77. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 7 6, em que a ao menos uma molécula contendo sacarídeo é modificada por meio da ativação de um grupo carboxila e/ou hidroxila.
78. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 77, em que o método pode compreender, adicionalmente, purificar a ao menos uma molécula contendo sacarídeo modificada por meio da precipitação e/ou filtração da ao menos uma molécula contendo sacarídeo modificada para remover ou remover substancialmente os reagentes de modificação não reagidos.
79. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 78, em que a ao menos uma molécula contendo sacarídeo modificada é usada como um agente de reticulação quando combinada com a ao menos uma proteína.
80. O método de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 7 0 a 79, em que uma solução da ao menos uma molécula contendo sacarídeo modificada é misturada com a ao menos uma proteína para formar a ao menos uma matriz de proteína reticulada.
101
81. Um método de uso que compreende injetar a composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 69.
82. O método de acordo com a modalidade 81, em que a injeção é usada para aumentar o volume, aumentar tecidos ou combinações dos mesmos em ao menos um dentre os seguintes: medicina humana ou veterinária; cirurgia; cirurgia restauradora; cirurgia estética; estética; aumento de volume de tecido; cirurgia dermatológica; cirurgia de olhos; reumatologia; farmacologia; no campo de cosméticos; controle de hemorragia em cirurgia geral; reconstrução de nervos e vasos em cirurgia reconstrutora, neurocirurgia; cirurgia plástica; fixação de pele, transplantes de cartilagem, vasculares ou enxertos em cirurgia ortopédica; tratamento de osteoartrite de joelho; cirurgia vascular; como veículos para a liberação de células ou moléculas bioativas, tais como fatores de crescimento para estimular reparo focal; liberação local de fatores de crescimento em combinação com as composições de matriz de proteína reticulada para facilitar cicatrização de ferida e regeneração de tecido ou promover formação óssea; estimular o reparo de cartilagem em procedimentos ortopédicos; tratamento de condições patológicas de ferida, tais como úlceras crônicas; serve como um arcabouço para gerar tecidos artificiais através da proliferação de células autólogas em cultura; para aumento de tecido em cirurgia plástica, tal como para o preenchimento de dobras dérmicas ou para a reconstrução de lábios; para a suplementação de uma cavidade do corpo ou um déficit; para medicina estética; tratamento ortopédico; ou restauração de volume
102 efundido durante cirurgia, tal como durante cirurgia de olhos.
83. Um método de uso que compreende: aplicar topicamente uma composição de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 69.
84. O método de acordo com a modalidade 83, em que a aplicação tópica é usada em tecido lesionado ou saudável em ao menos um dentre os seguintes: cosmetologia; dermatologia; preenchimento de rugas faciais; linhas de expressão; tratamento de pele envelhecida; tecido com cicatriz; ou depressões da pele.
85. Um kit para administrar as composições de acordo com uma ou mais dentre as modalidades 1 a 69.
Embora a presente descrição tenha sido descrita em conexão com determinadas modalidades, deve-se compreender que a presente descrição não deve ser limitada às modalidades apresentadas, mas pelo contrário, é destinada a abranger diversas modificações e disposições equivalentes. Além disso, as diversas modalidades descritas no presente documento podem ser implantadas em conjunto com outras modalidades, por exemplo, os aspectos de uma modalidade podem ser combinados com os aspectos de outra modalidade para realizar mais outras modalidades. Adicionalmente, cada característica ou componente independente de uma modalidade pode constituir uma modalidade adicional.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES
1) modificar a uma ou mais moléculas contendo sacarídeo para compreender um ou mais grupos químicos reativos;
1. Composição injetável, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma ou mais matrizes de proteína reticulada, em que uma ou mais matrizes de proteína reticulada compreende:
i) entre 1-250 mg/mL de um ou mais resíduos de proteína derivados de uma ou mais proteínas portadoras de amina; e ii) um ou mais resíduos contendo sacarídeo derivado de uma ou mais moléculas de reticulação contendo sacarídeo compreendendo um ou mais grupos carboxila; e iii) uma ou mais reticulações intermoleculares compreendendo uma ligação amida entre uma amina do um ou mais resíduos de proteína e um grupo carboxila da uma ou mais moléculas de reticulação contendo sacarídeo; em que o um ou mais resíduos de proteína é:
a) uma proteína completa; e
b) desprovido de ligações cruzadas intramoleculares.
2) combinação da umas ou mais moléculas contendo sacarídeo modificadas com uma ou mais proteínas, em que a uma ou mais proteínas compreendem um grupo químico reativo complementar ao grupo reativo na uma ou mais moléculas contendo sacarídeo modificadas; e
2/7 iii) uma ou mais reticulações intermoleculares compreendendo uma ligação amida entre uma amina do um ou mais resíduos de proteína e um grupo carboxila da uma ou mais moléculas de reticulação contendo sacarídeo;
em que a reticulação compreende:
2. Método de preparação de uma composição injetável, CARACTERIZADO por compreender uma ou mais matrizes de proteína reticulada, em que a uma ou mais matrizes de proteína reticulada compreende:
i) um ou mais resíduos de proteína derivados de uma ou mais proteínas portadoras de amina;
ii) um ou mais resíduos contendo sacarídeo derivado de uma ou mais moléculas de reticulação contendo sacarídeo compreendendo um ou mais grupos carboxila; e
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 9/15
3/7
3. Composição injetável, de acordo com a reivindicação 1, ou o método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição injetável é extrudável através de agulhas de 18G a 31G a um comprimento entre 5 cm a 30 cm e a composição extrudada conserva-se sem suporte de superfície e/ou em que a composição injetável é extrudável a um comprimento entre 5 cm a 30 cm, 10 cm a 20 cm; ou 15 cm a 30 cm sem suporte de superfície adicional, quando extrudada através de uma agulha de calibre fino, e em que a composição extrudada é coerente e mantém-se unida.
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 10/15
3) formar uma ou mais ligações entre a uma ou mais proteínas e a uma ou mais moléculas contendo sacarídeo modificadas.
4/7 qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos contendo sacarídeo tem uma ou mais dentre as seguintes propriedades: biodisponível, biodegradável, bioabsorvível ou biorreabsorvível.
8. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 7 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos de polissacarídeo é derivado a partir de ou compreende o resíduo de ácido hialurônico, um derivado de celulose, carboxi celulose, carboximetil celulose, hidroximetil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, hidroxi-propilcelulosecarboximetil amilose, goma xantana, goma guar, α-glucano, β-glucano, p-1,4-glucano, β-1,3-glucano, alginatos, carboximetil dextrano, um derivado de glicosaminoglicano, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina, ácido polilático, ácido poliglicólico, ácido poli(lático-co-glicólico), fosfato de tricálcio, 1-hidroxiapatita, sais farmaceuticamente aceitáveis, derivados ou combinações dos mesmos.
9. Composição injetável ou o método de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos de polissacarídeo é o ácido hialurônico.
10. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 9 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos de proteína é derivado a partir de ou compreende o resíduo de tropoelastina, elastina, albumina, colágeno, monômeros de colágeno, imunoglobulinas, insulina, derivados ou combinações dos mesmos e/ou
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 12/15
4. Composição injetável ou o método de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição injetável retém coesão suficiente após a extrusão de agulha de tal modo que as tiras de composição extrudada não se rompam durante a extrusão.
5/7 em que a quantidade do um ou mais resíduos de proteína é entre 1-200 mg/mL,40-70 mg/mL ou 25-65 mg/mL.
11. Composição injetável ou método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos de proteína reticulada é derivado a partir de ou compreende o resíduo de tropoelastina.
12. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 11 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a quantidade do um ou mais resíduos contendo sacarídeo está entre 1-30 mg/mL; e em que a quantidade do um ou mais resíduos de proteína está entre 25-50 mg/mL.
13. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 12 ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais matrizes de proteína reticulada é derivada de ou compreende o resíduo de uma proteína sintética idêntica a uma proteína humana que ocorre naturalmente; e/ou em que a uma ou mais matrizes de proteína reticulada é preparada a partir de uma ou mais molécula de reticulação contendo sacarídeo compreendendo 5% ou mais de grupos carboxila ativados, grupos carboxil hidroxila modificados ou suas combinações.
14. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 13 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o número de unidades proteicas não
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 13/15
5. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais resíduos de proteína é:
a) uma proteína completa ou 50-99,99% de uma proteína completa; e/ou
b) desprovido de ligações cruzadas intramoleculares.
6/7 incorporadas na uma ou mais matrizes de proteína reticulada e deixadas não ligadas pode ser 1%, 3%, 5% ou 7% ou mais.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificada uma ou mais molécula contendo sacarídeo permanece solúvel ou solúvel em água ou tampão fisiológico.
16. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 14 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição injetável ou a composição injetável preparada é usada para aumentar o volume, aumentar tecidos ou combinações dos mesmos em um ou mais dentre os seguintes: medicina humana ou veterinária; cirurgia; cirurgia restauradora; cirurgia estética; estética; aumento de volume de tecido; cirurgia dermatológica; cirurgia de olhos; reumatologia; farmacologia; no campo de cosméticos; controle de hemorragia em cirurgia geral; reconstrução de nervos e vasos em cirurgia reconstrutora, neurocirurgia; cirurgia plástica; fixação de pele, transplantes de cartilagem, vasculares ou enxertos em cirurgia ortopédica; tratamento de osteoartrite de joelho; cirurgia vascular; como veículos para a liberação de células ou moléculas bioativas, tais como fatores de crescimento para estimular reparo focal; liberação local de fatores de crescimento em combinação com as composições de matriz de proteína reticulada para facilitar a cicatrização de ferida e regeneração de tecido ou promover formação óssea; estimular o reparo de cartilagem em procedimentos ortopédicos; tratamento de condições patológicas de ferida, tais como úlceras crônicas; como um arcabouço para gerar tecidos
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 14/15
6. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 5 ou o método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição injetável possibilita que o um ou mais resíduos de proteína retenha seu comprimento completo, e em que a composição injetável é injetável por agulha, retém uma estrutura coerente e é suficientemente reticulada para reduzir a velocidade da reabsorção da composição in vivo, em que o um ou mais resíduos de proteína é uma proteína completa e/ou em que a composição injetável é compatível com tecido, otimiza o crescimento de tecido, otimiza o recrescimento de tecido, ou combinações dos mesmos.
7. Composição injetável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, e de 3 a 6 ou o método de acordo com
Petição 870190016161, de 18/02/2019, pág. 11/15
7/7 artificiais através da proliferação de células autólogas em cultura; para aumento de tecido em cirurgia plástica, tal como para o preenchimento de dobras dérmicas ou para a reconstrução de lábios; para a suplementação de uma cavidade do corpo ou um déficit; para medicina estética; tratamento ortopédico; ou restauração de volume efundido durante cirurgia, tais como durante cirurgia de olhos.
BR112013012772-4A 2010-11-23 2011-11-22 Preparação e/ou formulação de proteínas reticuladas com polissacarídeos BR112013012772B1 (pt)

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