WO2023092208A1 - Processo de obtenção de solução polimérica injetável fotoreticulável, solução polimérica injetável fotoreticulável e seus usos - Google Patents

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WO2023092208A1 PCT/BR2022/050458 BR2022050458W WO2023092208A1 WO 2023092208 A1 WO2023092208 A1 WO 2023092208A1 BR 2022050458 W BR2022050458 W BR 2022050458W WO 2023092208 A1 WO2023092208 A1 WO 2023092208A1
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rpm
gelatin
plga
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Daniele Mayara CATORI
Laura Caetano Escobar DA SILVA
Marcelo Ganzarolli de OLIVEIRA
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Universidade Estadual De Campinas
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Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining a doubly photocrosslinkable injectable polymeric solution capable of gelling in situ, under physiological conditions and incidence of visible light, and to release nitric oxide (NO) in a prolonged manner in the intraarticular space , in order to promote cartilage tissue regeneration, as well as provide a chondroprotective and anti-inflammatory effect in individuals affected by osteoarthritis.
  • NO nitric oxide
  • the present invention is inserted in the field of Chemistry, more precisely in the area of Materials.
  • Osteoarthritis is the most common form of arthritis and affects millions of people worldwide. This disease is characterized by progressive degradation of cartilage, decreased joint space, alteration of bone contour and synovial inflammation. Its triggering factors are trauma, excess weight, joint instability, excessive mechanical stress and aging. The pain generated by the inflammatory process limits the movement of individuals, reducing their quality of life. Although people over the age of 60 are most affected, OA also affects people in the 15-60 age group.
  • Hyaluronic acid whose conjugate base is hyaluronate, is one of the main constituents of the extracellular matrix (ECM) of cartilaginous tissue and fluid synovial.
  • ECM extracellular matrix
  • HA supports tissue integrity and interacts with chondrocytes through specific receptors, modulating activities such as cell migration, differentiation and proliferation.
  • synovial fluid it is responsible for rheological, lubricating and shock absorbing properties.
  • Endogenous HA is synthesized by a class of integral membrane proteins called HA synthases. These proteins structure HA through the sequential addition of molecules of D-glucuronic acid and n-acetylglucosamine, and can produce polymeric chains of around 9,000 kDa .
  • HA is depolymerized, which increases its rate of degradation.
  • the half-life of intrasynovial hyaluronate is approximately 20 hours. However, in inflamed joints this time is reduced to 11 hours. This decrease in chain length and, consequently, in the half-life of hyaluronate, reduces the viscoelasticity of the synovial fluid and induces an inflammatory response.
  • Hydrogels are the most used materials for soft tissue regeneration due to the easy modulation of their precursors , which allows the development of structures very similar to native tissues .
  • hybrid hydrogels can be formed by combining HA with other molecules that are also part of cartilage ECM, such as chondroitin sulfate, collagen or gelatin, for example . This combination mimics ECM, enhancing the effects and residence time of the hydrogel in the intra-articular space.
  • ECM chondroitin sulfate
  • collagen or gelatin for example .
  • gelatin obtained by partial collagen hydrolysis, is able to modulate the physicochemical properties of the HA-based hydrogel and, additionally, facilitate cell adhesion through specific bonds with integrins.
  • Hydrogels formed in situ implanted through the injection of a viscous polymeric solution that is subsequently crosslinked in situ have gained prominence due to their minimally invasive delivery and ability to homogeneously encapsulate bioactive molecules , in addition to their ease in filling defects locations .
  • These hydrogels can be formed using thermosensitive polymers, from Michael addition reactions and Schiff base reactions, or through photoinduced radical reactions, in the presence of photoinitiators.
  • the photocrosslinking of polymers containing vinylic and/or sulfhydryl groups in their branches is one of the most promising techniques for the in situ formation of hydrogels in the intra-articular space due to the greater control over the gelation kinetics.
  • These materials can be formed locally by the incidence of light from the insertion of an optical fiber.
  • NSAIDs act by blocking the production of prostaglandins, by inhibiting the activity of cyclooxygenase (COX) enzymes. At the site of inflammation, this inhibition has an analgesic and antipyretic effect.
  • COX cyclooxygenase
  • these Molecules also block the production of prostaglandins essential for the homeostasis of the stomach, kidneys and heart, which can cause serious damage to these organs.
  • corticosteroids is not indicated for people with hypertension or diabetes mellitus.
  • alternative molecules that present therapeutic efficacy with reduced or null side effects can be used to replace these anti-inflammatories, as is the case of nitric oxide (NO) donor molecules.
  • NO nitric oxide
  • NO is a radical molecule endogenously generated from the conversion of L - arginine to L - citrulline by means of enzymes called nitric oxide synthetases ( NOS ) . It is responsible for promoting vasodilation, regulating muscle tone and the process of cell apoptosis.
  • NO is a gaseous molecule with a short half-life, limited solubility in water and is unstable in the presence of oxidizing agents due to its radical nature. These factors hinder its exogenous administration and have motivated the development of devices containing NO donor molecules, capable of releasing it in a local and controlled manner .
  • RSNOs S-nitrosothiols
  • GSNO S-nitrosoglutathione
  • NO can act in the fight against inflammation.
  • the delivery of NO in the intra-articular space presents numerous potential benefits, such as the modulation of enzymatic action and the release of inflammatory mediators, which contribute to the reduction of the inflammatory response of several cell classes, such as, for example, leukocytes, macrophages, mast cells , endothelial cells and platelets .
  • Martins et al. (2016) demonstrated that the release of NO from topical applications of hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) solutions containing GSNO reduced the inflammatory process in periodontal diseases in rats by decreasing oxidative stress in the gingival tissue and levels of cytokines such as TNF-a and IL-lp.
  • Botta et al. presented a study in which molecules containing NO donor groups were able to reduce the expression of the inducible NOS isoform, decreasing the levels of NO generated during the inflammation process.
  • NO donors are photosensitive , being able to release NO upon incidence of light . Furthermore, due to its antioxidant nature, NO, if it is free in the polymeric solution, can react with the homolyzed photoinitiator, increasing the gelation time of the hydrogels. Thus, for controlled NO release to occur from photocrosslinked hydrogels in situ, it is essential to protect NO donors from the action of light during the photocrosslinking process.
  • the hydrogels are manufactured from methacrylated gelatin with methacrylated hyaluronic acid in a radical reaction involving the vinylic groups of both polymers
  • the hydrogel is formed from from methacrylated hyaluronic acid as the major component of the sulfhydryl gelatin matrix, instead of methacrylate.
  • the use of sulfhydryl gelatin leads to hydrogels formed by two different photoreticulation reactions: the radical reaction between the vinylic groups of hyaluronic acid and the thiol-ene reaction of the sulfhydryl groups of gelatin with the methacrylate groups of hyaluronic acid.
  • the present invention contains NO donor nanoparticles that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process , ensuring the controlled release of NO after hydrogel formation .
  • the present invention proposes a double cross-linking strategy involving the formation of vinylic groups of methacrylated hyaluronic acid and thiol-ene bonds between the chains of methacrylated hyaluronic acid and sulfhydryl gelatin. Additionally , said document does not describe compositions containing NO - releasing compounds to aid in the cartilage tissue regeneration process , such as NO - donor nanoparticles that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process, which makes up the present invention.
  • hyaluronic acid is used in combination with sulfhydryl gelatin to manufacture injectable solutions and doubly photocrosslinkable in situ with potential application in regeneration of cartilaginous tissue.
  • the mechanism proposed in the present invention of double crosslinking and, particularly, the use of thiol-ene type bonds between the chains of methacrylated hyaluronic acid and sulfhydryl gelatin is not described in said document.
  • OXIDIZED HIGH MOLECULAR WEIGHT HYALURONIC ACID AND GELATIN FOR NUCLEUS PULPOSUS REGENERATION describes modified hyaluronic acid and gelatin hydrogels formed in situ for regeneration of the nucleus pulposus. presence, in the case of the present invention, of NO donor nanoparticles that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process.
  • the formation of hydrogels occurs through the formation of an amide bond involving pendant primary amines of gelatin and the pendant carboxyl groups of hyaluronic acid, followed by oxidation and reaction with dihydrazine adipic acid, a crosslinking agent. There is no release of NO from the materials described in the referred document.
  • the hydrogel is formed by the double crosslinking of methacrylated hyaluronic acid and sulfhydryl gelatin, generating photoinduced radical reactions between the vinyl groups of the methacrylate and thiol-ene reactions between the vinyl groups of the methacrylate and the thiol groups of the sulfhydryl gelatin.
  • NO donor nanoparticles were incorporated that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process.
  • Document CN109701073A entitled "A KIND OF INJECTABLE CARTILAGE REPAIR HYDROGEL AND PREPARATION METHOD THEREOF” refers to injectable hydrogels of modified hyaluronic acid and gelatin for the treatment and regeneration of cartilage.
  • this document presents some differences in relation to the present invention, such as the composition of the hydrogel matrix, the reactions involved in the formation of the hydrogel and the drug used.
  • the hydrogels are manufactured from methacrylated gelatin, being the major component, and methacrylated hyaluronic acid, using Irgacure 2959 as photoinitiator and ultraviolet light to induce in situ photocrosslinking.
  • Chemical crosslinking is achieved by a radical reaction involving the vinylic groups of both polymers. Furthermore , platelet - rich plasma is added to the hydrogel to accelerate cartilage tissue regeneration .
  • the hydrogel is formed from methacrylated hyaluronic acid, which is the major component of the matrix, and sulfhydryl gelatin.
  • the use of sulfhydryl gelatin results in hydrogels formed by two distinct reactions: the radical reaction of the vinylic groups of hyaluronic acid and the thiol-ene reaction of the sulfhydryl groups of gelatin with the methacrylate groups of hyaluronic acid, which accelerates the process. of gelation.
  • the aforementioned document does not describe the use of NO-donor nanoparticles that promote the protection of NO-donor groups during the radical gelation process, as in the present invention.
  • the hydrogel is formed from hyaluronic acid modified to contain methacrylate groups and gelatin modified to contain sulfhydryl groups.
  • sulfhydryl gelatin leads to hydrogels formed by two distinct reactions: the radical reaction between vinylic groups of hyaluronic acid and the thiol-ene reaction between the sulfhydryl groups of gelatin and the methacrylate groups of hyaluronic acid.
  • the aforementioned document does not mention the use of NO donor nanoparticles that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process.
  • Document EP2353612B1 entitled “INJECTABLE IN-SITU CROSSLINKED HYDROGEL AND THE PREPARATION METHOD AND USE THEREOF” refers to injectable hydrogels crosslinkable in situ comprising, among other components, one or more modified polysaccharides or proteins, for example acid hyaluronic acid and gelatin. Despite this, such document presents considerable differences in relation to the present invention.
  • the gelation process is based exclusively on the oxidation of thiol groups, previously inserted in the chains of hyaluronic acid, chondroitin sulfate and/or gelatin, through oxygen molecules dissolved in the polymeric solution with generation of bonds of the disulfide type, a reaction that is not involved in the present invention.
  • this connection is initiated in the syringe, before the application, and it can take up to 7 days to complete.
  • the hydrogels formed in said document are described as vehicles for the delivery of antibiotics, antitumor drugs, growth factors or corticosteroids.
  • the hydrogel is rapidly formed, in 2 minutes, from methacrylated hyaluronic acid and sulfhydryl gelatin by means of two distinct reactions that occur simultaneously: the radical reaction between vinylic groups of hyaluronic acid and the thiol-ene reaction between sulfhydryl groups of gelatin and hyaluronic acid methacrylate groups.
  • the radical reaction between vinylic groups of hyaluronic acid and the thiol-ene reaction between sulfhydryl groups of gelatin and hyaluronic acid methacrylate groups Furthermore, there is no description in that document about the use of NO donor nanoparticles that promote the protection of NO donor groups during the radical gelation process, as occurs in the present invention.
  • Document US 9980977B2 entitled “MODIFIED HYAIURONIC ACID POIYMER COMPOSITIONS AND REIATED METHODS” refers to an injectable material of cross-linked hyaluronic acid intended for the treatment of osteoarthritis and delivery of triamcinolone acetonide, a corticosteroid.
  • hyaluronic acid was modified with divinyl sulfone for the introduction of pendent vinylic groups , with a degree of substitution of 10 % , and then a hydrogel with a low degree of crosslinking was formed by reacting modified hyaluronic acid with poly (ethylene glycol)dithiol, by forming thiol-ene linkages only.
  • the corticosteroid was previously added to the modified hyaluronic acid solution to be trapped in the hydrogel. Covalent bonds were formed in the absence of photoinitiators and light incidence, due to the high reactivity of the sulfhydryl groups.
  • the material was extruded and mixed with a hyaluronic acid saline solution without chemical modifications to be injected into the intra-articular space as a particulate hydrogel dispersion.
  • the injection of this material as well as other hyaluronic acid materials intended for viscosupplementation , only restores the rheological properties of the synovial fluid .
  • the material is quickly eliminated from the intra-articular space, requiring repeated weekly injections. Corticosteroid release from the hydrogel provides immediate antinociceptive effect, however, its use is not prescribed for all patients due to its side effects.
  • the present invention reports the development of an in situ doubly photocrosslinked hydrogel with a high degree of crosslinking capable of supporting cell adhesion and proliferation, consisting of cartilage ECM components and capable of releasing NO.
  • the material of the present invention has the potential to modulate the release of inflammatory mediators, protecting the cartilage from the degradation process.
  • the present invention has significant advantages over the other technologies already described , since the use of in situ photocrosslinking represents a reduction in the adverse effects of in situ formation of hydrogels , when compared to af Thermoinduced otoreticulation, due to the reduction of the toxicity of the process.
  • the present invention presents an original solution for the protection of NO donors in injectable HA and HA/Gelatin formulations, based on the chemical insertion of NO donors into nanoparticles of PLGA functionalized with GSNO, in order to protect GSNO, both from photodecomposition during photocrosslinking of methacrylated HA and sulfhydryl gelatin, as well as from free radicals generated in the photocrosslinking process, from the photoinitiator, while providing a slow and prolonged release of NO of nanoparticles, governed by the hydrolysis of the PLGA matrix which, in its process, mobilizes the GSNO molecules, leading to their dimerization and release of NO.
  • the photocrosslinkable components of these formulations allow the acceleration of the photocrosslinking process, bringing benefits to hospital procedures.
  • the present invention solves the problem of preserving NO donors during the process of photoreticulation of the HA/Gelatin matrix, enhancing the analgesic, anti-inflammatory and chondroprotective actions associated with the attenuation of cartilage tissue degradation, due to to the potential advantages of localized NO release.
  • the present invention combines totally biodegradable and biocompatible materials for the treatment of osteoarthritis and cartilage tissue regeneration.
  • the present invention relates to a process for the manufacture of a double photocrosslinkable injectable polymeric solution, capable of gelling in situ under physiological conditions and incidence of visible light, and of releasing nitric oxide (NO) in a prolonged manner in the intracellular space.
  • -articular in order to promote cartilage tissue regeneration, as well as provide a chondroprotective and anti-inflammatory effect in individuals affected by osteoarthritis, without causing side effects such as those caused by the usual administration of non-steroidal anti-inflammatory drugs.
  • Said process comprises the following steps:
  • HA hyaluronic acid
  • GMA glycidyl methacrylate
  • the polymeric solution proposed in the present invention consists of hyaluronic acid chemically modified to contain photosensitive vinylic groups, gelatin chemically modified to contain pendant sulfhydryl (SH) groups and PLGA nanoparticles conjugated with GSNO.
  • GSNO-conjugated PLGA nanoparticles provide protection of the GSNO against the attack of radical species generated in the photoreticulation of polymers.
  • SH groups in functionalized gelatin increases the gelling speed.
  • the nanoparticles dispersed in the formed hydrogel matrix begin to release nitric oxide (NO) in a slow and prolonged process, governed by the rate of hydrolysis of the nanoparticles and by the concomitant dimerization reaction of GSNO conjugated to PLGA.
  • NO nitric oxide
  • Figure 1 shows the nuclear magnetic resonance (NMR) spectra of hyaluronic acid (HA) and modified hyaluronic acid (HAM), as well as the polymeric structure of HAM.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • HA hyaluronic acid
  • HAM modified hyaluronic acid
  • Figure 2 shows the Raman spectra of pure gelatin (Gel) and modified gelatin (Gel-SH). In the Gel-SH spectrum, the axial strain band at 2567 cri
  • Figure 3 shows the Fourier transform attenuated total reflectance infrared (FTIR-ATR) spectra of PLGA and PLGA-GSNO.
  • FTIR-ATR Fourier transform attenuated total reflectance infrared
  • Figure 4 shows in (I) a transmission electron cryomicrograph (cryo-TEM) representative of the NP-PLGA-GSNO nanoparticles and in (II) the size distribution curve of the nanoparticles obtained from the cryo analysis -HE HAS.
  • Figure 5 shows the graph of gelling times of hyaluronic acid (HHA) hydrogels, hyaluronic acid containing Gel-SH (HHAG) and hyaluronic acid containing gelatin and PLGA-GSNO nanoparticles (HHAGNP) obtained by the method of tube slope.
  • HHA hyaluronic acid
  • HHAG hyaluronic acid containing Gel-SH
  • HHAGNP hyaluronic acid containing gelatin and PLGA-GSNO nanoparticles
  • Figure 6 shows the HHA, HAG and HAGNP hydrogels during the gelation time assay, before (time 0), during (times 120 and 203 s) and after the incidence of visible light.
  • the right column represents photographs of the hydrogels after their removal from the tube, demonstrating that they are self-supporting materials.
  • Figure 7 shows in (I) the NO release curve in real time, measured by chemiluminescence, from a suspension of lyophilized nanoparticles (NP-PLGA-GSNO) in phosphate buffer (pH 7.4) for 420 minutes and, in (II) the NO cumulative release curve.
  • Figure 8 shows in (I) the real-time NO release curve measured by chemiluminescence of the HHAGNP hydrogel during 40 minutes, and in (II) the cumulative NO release curve for 40 minutes.
  • the present invention refers to a process for obtaining a doubly photocrosslinkable injectable polymeric solution, capable of gelling in situ under physiological conditions and incidence of visible light, and of releasing nitric oxide (NO) in a prolonged manner in the intraarticular space, in order to promote cartilage tissue regeneration, as well as provide a chondroprotective and anti-inflammatory effect in individuals affected by osteoarthritis.
  • a doubly photocrosslinkable injectable polymeric solution capable of gelling in situ under physiological conditions and incidence of visible light, and of releasing nitric oxide (NO) in a prolonged manner in the intraarticular space, in order to promote cartilage tissue regeneration, as well as provide a chondroprotective and anti-inflammatory effect in individuals affected by osteoarthritis.
  • HAM methacrylated hyaluronate
  • Gel-SH sulfhydryl gelatin
  • N-acetylhomocysteine thiolactone a group consisting of N-acetylhomocysteine thiolactone
  • NP-PLGA-GSNO nitric oxide (NO) donor nanoparticles obtained from the nanoprecipitation of poly (lactic-co-glycolic acid) conjugated with S-nitrosoglutathione
  • Said process of obtaining the polymeric solution comprises the following steps:
  • HA hyaluronic acid
  • GMA glycidyl methacrylate
  • HA hyaluronic acid
  • GMA glycidyl methacrylate
  • HA hyaluronic acid
  • ultrapure water a solution with a concentration of 0.5 to 2.0% m/v, preferably 1.0% m/v, using magnetic stirring in the range of 900 to 1500 rpm, preferably 1500 rpm, for a period of 5 to 12 hours, preferably 12 hours.
  • hyaluronic acid (HA) solution was heated to a temperature in the range of 50 to 55 °C, preferably 55 °C, where the pH was adjusted to 3.5 using hydrochloric acid (1 mol IH 1 ) .
  • GMA Glycidyl methacrylate
  • the reaction medium was maintained at a temperature in the range of 50 to 55 °C, preferably 55 °C, under magnetic stirring in the range of 1000 to 1500 rpm, preferably 1500 rpm, for a period of 24 hours, in then transferred to a cellulose dialysis bag (cut off of 12 to 14 kDa) and dialyzed against ultrapure water for a minimum period of 72 h.
  • drying is carried out by rapid freezing in liquid nitrogen, followed by lyophilization for a period of at least 48 h using a pressure in the range of 40 to 60 mTorr (5.33 to 7.99 Pa), preferably 50 mTorr (6.67 Pa).
  • this procedure can be replaced by slow freezing in conventional refrigerator freezers. It should be noted that the use of slow drying methods, or methods that involve heating, such as rotary evaporation, may impair the stability and resolubilization of the HAM.
  • GMA glycidyl methacrylate
  • This reagent is widely used for modifying macromolecules. Reaction with GMA can take place by transesterification or ring opening of the epoxy group. The mechanism is modulated by the pH of the reaction medium, when water is used as a solvent. In the present invention, the reaction was carried out in an acid medium. In this way, the GMA reacted with the pendant hydroxyl and carboxyl groups of the HA structure through the opening of the ring of the epoxy group.
  • gelatin granules were hydrated in carbonate buffer (pH 10.0), for a period of 10 to 12 hours, preferably 12 hours. Then, the paste formed by the hydrated granules was heated to a temperature of 37 to 55 °C, preferably 40 °C, for a period of 3 to 5 hours, preferably 5 hours, or until complete solubilization of the gelatin, generating a solution of gelatin of concentration between 10 and 15% m/v, preferably 10% m/v.
  • ethylenediaminetetraacetic acid was added to the gelatin solution in sufficient quantity to obtain a final EDTA concentration in the range of 0.01 to 0.03% m/v, preferably 0.03% m/v.
  • Cys-SH N-acetyl-homocysteine thiolactone
  • the reaction medium was maintained at a temperature in the range of 40 to 50 °C, preferably 40 °C, under magnetic stirring in the range of 1000 to 1500 rpm, preferably 1500 rpm, for a period of 3 to 5 hours, preferably 3 hours.
  • the reaction medium was diluted using distilled water until the pH of the reaction medium was in the range of 6.0 to 7.0, preferably 7.0, and transferred to a cellulose dialysis bag ( cut off 12 to 14 kDa), where it was dialyzed against ultrapure water for a minimum period of 48 ha one temperature in the range of 37 to 50 °C, preferably 40 °C.
  • the contents of the cellulose dialysis bag were dried, preferably by fast freezing in liquid nitrogen followed by lyophilization for a period of at least 48 h using a pressure in the range of 40 to 60 mTorr (5 .33 to 7.99 Pa), preferably 50 mTorr (6.67 Pa).
  • fast freezing can be replaced by slow freezing in a conventional refrigerator freezer.
  • slow drying methods, or methods that involve heating, such as rotaevaporation can impair the stability and resolubilization of Gel-SH.
  • NP-PLGA-GSNO nitric oxide donor PLGA nanoparticles
  • a solution was prepared in dimethyl sulfoxide (DMSO) solvent containing: poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) in sufficient quantity to obtain a PLGA solution in the range of 16.0 to 17, 0% m/v, preferably 16.6% m/v; hydroxysuccinimide (NHS) in sufficient quantity to obtain an NHS solution in the range of 2.0 to 2.5% m/v, preferably 2.2% m/v; 1-ethyl-3-(3-hydrochloride) dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC) in sufficient quantity to obtain an EDC solution in the range 3.5 to 4.0% m/v, preferably 3.8% m/v, and S-nitrosoglutathione (GSNO), in sufficient quantity to obtain GSNO in the range 6.5 to 7.0% m/v, preferably 6.7% m/v.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • GSNO S-nitrosoglutathione
  • reaction mixture was maintained under magnetic stirring in the range of 300 to 500 rpm, preferably 500 rpm, at room temperature for a period of 20 to 24 hours, preferably 24 hours.
  • the resulting solid (PLGA-GSNO) was separated from the reaction medium by precipitation, through the addition of ice-cold distilled water at a temperature in the range of 4 to 10 °C, preferably 4 °C, followed by centrifugation using a rotation between 3,000 and 5,000 rpm, preferably 5,000 rpm for solid sedimentation. The supernatant was discarded. This procedure was repeated 2 to 5 times, preferably 3 times, to increase the degree of purification of the resulting solid, PLGA-GSNO.
  • the precipitate obtained in centrifugation was dried using liquid nitrogen and lyophilized for a period of at least 24 h using a pressure in the range of 40 to 60 mTorr (5.33 to 7.99 Pa), preferably 50 mTorr ( 6.67 Pa).
  • the resulting PLGA-GSNO was dissolved in dichloromethane (DCM) in order to obtain a solution with a PLGA-GSNO concentration in the range of 2.0 to 2.5% m/v, preferably 2.5% m/v.
  • the PLGA-GSNO solution in DCM previously prepared, was added to the PVA solution at a temperature in the range of 4 to 10 °C, preferably 4 °C, and in the volumetric ratio of 1 volume of PLGA-GSNO solution for each 5 volumes of PVA solution. Then the mixture was sonicated for a period of 60 to 90 s, preferably 90 s.
  • PVA can be replaced by poly(ethylene glycol)-co-poly(propylene glycol)-co-poly(ethylene glycol) block copolymers from the Pluronics class, for example, Pluronic F68 or Poloxamer 188
  • Pluronic F68 or Poloxamer 188 replacing the stabilizer, PVA, can directly affect the particle size and stability of the suspensions. It is known that particle size is inversely proportional to sonication time and amplitude. Excessive sonication can cause GSNO to decompose due to heating.
  • the precipitate obtained from centrifugation was dried by rapid freezing in liquid nitrogen, followed by lyophilization for a period of at least 24 h using a pressure in the range of 40 to 60 mTorr (5.33 to 7.99 Pa ), preferably 50 mTorr (6.67 Pa).
  • sulfhydryl gelatin (Gel-SH) was prepared in phosphate buffer (pH 7.4), at a concentration between 0.01 and 1.2% m/v, preferably 0.6% m/v. v, using agitation magnetic from 900 to 1500 rpm, preferably 1500 rpm and temperature in the range of 37 to 50 °C, preferably 40 °C.
  • HAM methacrylated and lyophilized hyaluronic acid
  • NP-PLGA-GSNO nitrosated nanoparticles
  • phosphate buffer pH 7.4
  • NP-PLGA-GSNO concentration in the range of 0.75 to 1.5% m/v , preferably 1.5% m/v, using an ultrasonic bath at room temperature, for a period of 5 to 10 minutes, preferably 5 minutes.
  • This suspension was immediately added to the Gel-SH and HAM solution under magnetic stirring in the range of 1000 to 1500 rpm, preferably 1500 rpm, in the proportion of 1 volume of suspension (NP-PLGA-GSNO) to 4 volumes of polymer solution ( Gel-SH + HAM). The system was maintained under agitation for a minimum period of 10 minutes.
  • the final concentrations of the Gel-SH, HAM and NP-PLGA-GSNO solution in phosphate buffer solvent (0.01 mol L -1 , pH 7.4) are: 1.0 to 1.5 % m /v, preferably 1.5% m/v methacrylated hyaluronate (HAM); from 0.008 to 1.0% m/v, preferably 0.5% m/v of sulfhydryl gelatin (Gel-SH); from 0.20 to 0.45%, preferably 0.30% m/v of nitric oxide donor nanoparticles (NP-PLGA-GSNO), which corresponds to a proportion of 10 to 30%, preferably 20% m/m of nitrosated nanoparticles in relation to the mass of HAM used.
  • the process of photocrosslinking occurs through a radical mechanism in the presence of a photoinitiator and involves the formation of a three-dimensional network with double crosslinking, where chemical bonds are formed between the vinylic carbons of the branches of the modified HA (HA-HA) and between the vinylic carbons of the modified HA branches and the thiol groups present in the sulfhydryl gelatin (HA-Gel).
  • the bond formed between the vinylic carbon and the thiol group occurs by the thiol-ene reaction, which presents a fast reaction rate due to the low activation energy for the abstraction of hydrogen from the sulfhydryl group (88 kcal mol -1 ), which contributes to the acceleration of the gelation process, which can occur, in the present invention, with only 2 minutes of incidence of visible light.
  • the LAP photoinitiator can be replaced by Irgacure 2959 or any other that undergoes photodecomposition in the range of 365 to 405 nm and is soluble in water.
  • the replacement of the photoinitiator can directly affect the photocrosslinking time.
  • increasing the photoinitiator concentration increases the crosslinking density of the hydrogel, making it mechanically more resistant.
  • the sulfhydryl groups were quantified by colorimetric technique using Ellman's reagent (5, 5'-dithiol-bis(2-nitrobenzoic acid)).
  • Ellman's reagent 5, 5'-dithiol-bis(2-nitrobenzoic acid)
  • a stock solution was initially prepared consisting of 4.0 mg of Ellman's reagent and 1.0 mL of phosphate buffer (pH 8.0) containing 1.0 mmol L -1 of EDTA.
  • phosphate buffer pH 8.0
  • 30.0 mg of the material lyophilized were added in 30.0 mL of ultrapure water, keeping the solution at 40 °C for 2 h under stirring.
  • NP-PLGA-GSNO nanoparticles were determined by dynamic light scattering (DLS) using a light scattering meter (Zetasizer Nano ZS from Malvern), analyzes were performed in triplicate at 25 °C with an equilibration time of 120 s, and also by transmission electron cryomicroscopy using a Talos ⁇ rctica microscope (Thermofisher) operating at 200 kV.
  • Figure 4 (1) shows a representative micrograph of the nanoparticles, obtained by cryo-TEM, and in Figure 4 (11) their size distribution obtained by Transmission Electronic Cryomicroscopy (Cryo-ME or Cryo-EM).
  • the formed nanoparticles had a diameter in the range of 140 to 210 nm.
  • lyophilized nanoparticles (20% by mass in relation to the mass of HAM used) and 1 mL of phosphate buffer (pH 7.40) were added to a 2 mL Eppendorf® microtube.
  • the nanoparticles were dispersed using an ultrasonic bath for 5 min at room temperature.
  • the final concentrations of Gel-SH, HAM and NP-PLGA-GSNO were respectively 0.5% m/v, 1.5% m/v and 0, 30% m/v.
  • 0.5% (w/v) of the LAP photoinitiator lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate
  • the photoinitiator was previously solubilized in 200 ⁇ l of ultrapure water and added to the polymeric solution with the aid of a micropipette.
  • the gelation time of the hydrogels was obtained by the tube inclination method.
  • hydrogels of hyaluronic acid (HHA), hyaluronic acid with gelatin (HHAG) and hyaluronic acid with gelatin and nanoparticles were produced of PLGA-GSNO (HHAGNP).
  • an injectable polymeric solution consisting of 1.5% m/v HAM, 0.5% m/v Gel-SH and 0.3% m/v NP-PLGA-GSNO was irradiated with visible light for 2 minutes, forming a cylindrical hydrogel 1 cm high and 1 cm in diameter.
  • the materials were added to the analyzer's thermal flask, containing 10 mL of phosphate buffer (pH 7.4) and kept at 37 °C.
  • the real-time and cumulative NO release data from the nanoparticles and hydrogel are shown in Figures 7 and 8, respectively. Cumulative NO release values for NP-PLGA-GSNO and HHAGNP were 13 pmol mg -1 and 0.048 pmol mg -1 , respectively.
  • the main innovation of the present invention is the preservation of the ability to release NO of doubly photocrosslinked hydrogels.
  • the use of polymeric nanoparticles that contain NO donors conjugated directly in their chain provided photoprotection to the S-nitrosothiol groups, responsible for promoting the release of NO.
  • the combination of HAM with Gel-SH caused, in addition to the crosslinks formed from the breaking of the vinylic bond, crosslinks of the thiol-ene type to be formed which, due to the low activation energy, allowed the reduction of exposure time to light , aiding in the preservation of clusters

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Abstract

A presente invenção se refere a um processo para fabricação de uma solução polimérica injetável duplamente fotoreticulável, capaz de gelificar in situ sob condições fisiológicas e incidência de luz visível, e de liberar óxido nítrico (NO) de maneira prolongada no espaço intra- articular, de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso, bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inflamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite. A presente invenção se insere no campo da Química, mais precisamente na área de Materiais.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE SOLUÇÃO POLIMÉRICA INJETÁVEL FOTORETICULÁVEL, SOLUÇÃO POLIMÉRICA INJETÁVEL FOTORETICULÁVEL E SEUS USOS
CAMPO DA INVENÇÃO
[1] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de solução polimérica injetável duplamente f otoreticulável capaz de gelificar in situ, sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel, e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intraarticular, de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso, bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite .
[2] A presente invenção se insere no campo da Quimica, mais precisamente na área de Materiais.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[3] A osteoartrite (OA) é a forma mais comum de artrite e afeta milhões de pessoas no mundo todo. Esta doença é caracterizada pela degradação progressiva da cartilagem, diminuição do espaço articular, alteração do contorno ósseo e inflamação sinovial. Seus fatores desencadeantes são traumas, excesso de peso, instabilidade articular, estresse mecânico excessivo e envelhecimento. A dor gerada pelo processo inflamatório limita a movimentação dos indivíduos, reduzindo sua qualidade de vida. Embora pessoas com mais de 60 anos sejam as mais atingidas, a OA também afeta pessoas na faixa etária de 15 a 60 anos.
[4] O ácido hialurônico (HA) , cuja base conjugada é o hialuronato, é um dos principais constituintes da matriz extracelular (MEC) do tecido cartilaginoso e do fluido sinovial. Na MEC o HA suporta a integridade do tecido e interage com os condrócitos por meio de receptores especificos, modulando atividades como migração, diferenciação e proliferação celular. No fluido sinovial, ele é responsável pelas propriedades reológicas, lubrificantes e amortecedoras. O HA endógeno é sintetizado por uma classe de proteínas integrais de membrana denominadas HA sintases. Estas proteínas estruturam o HA por meio da adição sequencial de moléculas de ácido D- glicurônico e n-acetilglucosamina, podendo produzir cadeias poliméricas com cerca de 9.000 kDa .
[5] Em processos inflamatórios, como na osteoartrite, o HA é despolimerizado, o que aumenta a sua taxa de degradação. Em articulações saudáveis, por exemplo, a meia- vida do hialuronato intrassinovial é de aproximadamente 20 horas. No entanto, em articulações inflamadas este tempo é reduzido para 11 horas. Esta diminuição no comprimento das cadeias e, consequentemente, na meia-vida do hialuronato, reduz a viscoelasticidade do fluido sinovial e induz uma resposta inflamatória.
[6] A utilização exógena de HA por meio de injeções intra-articulares é capaz de aumentar a concentração do HA e o comprimento médio das cadeias poliméricas, restaurando dessa maneira a capacidade de lubrificação e as propriedades viscoelásticas do fluido sinovial. Além disso, a inserção de HA exógeno reduz a produção e a atividade de mediadores pró-inflamatórios e metaloproteinases de matriz, propiciando efeito analgésico e condroprotetor .
[7] Diante dos benefícios promovidos pelo uso exógeno de HA no tratamento da OA, diversos estudos já foram reali zados para estabili zar as formulações de HA e aumentar sua meia-vida no espaço articular . Um maior tempo de residência intra-articular pode ser obtido por meio da modi ficação quimica da estrutura do HA para introduzir grupos químicos capazes de formar ligações covalentes entre si , gerando ligações cruzadas entre as cadeias poliméricas . Estas ligações levam à formação de hidrogéis reticulados com alta capacidade de absorção de água e fluidos biológicos .
[ 8 ] Hidrogéis são os materiais mais utili zados para a regeneração de tecidos moles devido à fácil modulação de seus precursores , que permite o desenvolvimento de estruturas muito similares aos tecidos nativos . Para a regeneração de tecido cartilaginoso , hidrogéis hibridos podem ser formados ao combinar HA com outras moléculas que também integram a MEC da cartilagem, como sul fato de condroitina, colágeno ou gelatina, por exemplo . Esta combinação mimeti za a MEC, potenciali zando os efeitos e o tempo de residência do hidrogel no espaço intra-articular . A adição de gelatina, obtida pela hidrólise parcial do colágeno , é capaz de modular as propriedades fisico- quimicas do hidrogel a base de HA e , adicionalmente , facilitar a adesão celular por meio de ligações especi ficas com integrinas .
[ 9 ] Hidrogéis formados in si tu implantados através da inj eção de uma solução polimérica viscosa que subsequentemente é reticulada no local , têm ganhado destaque devido à sua entrega minimamente invasiva e capacidade de encapsulamento homogêneo de moléculas bioativas , além da facilidade no preenchimento de defeitos locais . Estes hidrogéis podem ser formados utili zando polímeros termossensiveis , a partir de reações de adição de Mi chael e de reações de bases de Schiff ou por meio de reações radicalares f otoinduzidas , na presença de f otoiniciadores . A f otoreticulação de polímeros contendo grupos vinilicos e/ou sul fidrila em suas rami ficações , é uma das técnicas mais promissoras para a formação in si tu de hidrogéis no espaço intra-articular devido ao maior controle sobre a cinética de geli ficação . Estes materiais podem ser formados localmente por incidência de luz provinda da inserção de uma fibra ótica .
[ 10 ] Na prática clinica, o tratamento inicial para a osteoartrite é baseado no alivio da dor por meio do uso de anti-inf lamatórios não esteroidais (AINEs ) ou corticosteroides administrados por meio de inj eções intra- articulares . No entanto , este tratamento oferece apenas alivio dos sintomas a curto prazo porque os fármacos são rapidamente eliminados do espaço sinovial . Estudos têm demonstrado que a combinação de anti-inf lamatórios com hidrogéis de HA pode trazer um efeito sinérgico no tratamento da OA. Além disso , a liberação lenta dos anti- inf lamatórios a partir dos hidrogéis pode sustentar seu efeito terapêutico a longo prazo .
[ 11 ] A utili zação de AINEs e corticosteroides gera uma série de efeitos colaterais , principalmente em pessoas com uso recorrente . Os AINES , por exemplo , agem por meio do bloqueio da produção de prostaglandinas , ao inibir a atividade das enzimas ciclo-oxigenases ( COX ) . No local da inflamação , esta inibição tem efeito analgésico e antipirético . Entretanto , com a absorção sistêmica, estas moléculas também bloqueiam a produção de prostaglandinas essenciais para a homeostase do estômago , dos rins e do coração , podendo gerar sérios danos a estes órgãos . Assim, a utili zação de corticosteroides não é indicada para pessoas com hipertensão ou diabetes mellitus . Diante disso , moléculas alternativas que apresentem eficácia terapêutica com efeitos colaterais reduzidos ou nulos podem ser utili zadas em substituição a esses anti-inf lamatórios , como é o caso de moléculas doadoras de óxido nitrico (NO) .
[ 12 ] O NO é uma molécula radicalar gerada endogenamente a partir da conversão de L-arginina a L- citrulina por meio de enzimas denominadas óxido nitrico sintetases (NOS ) . Ele é responsável por promover a vasodilatação , regular o tônus muscular e o processo de apoptose celular . O NO é uma molécula gasosa com curta meia-vida, limitada solubilidade em água e é instável na presença de agentes oxidantes devido ao seu caráter radicalar . Estes fatores di ficultam sua administração exógena e tem motivado o desenvolvimento de dispositivos contendo moléculas doadoras de NO, capazes de liberá-lo de forma local e controlada . Os S-nitrosotióis (RSNOs ) , como a S-nitrosoglutationa ( GSNO) , atuam como armazenadores e doadores de NO devido à sua melhor estabilidade em comparação com o NO livre , podendo ser utili zados como carreadores endógenos de NO ou doadores exógenos . Dessa forma, a incorporação de RSNOs a partir de simples mistura fisica ou através de ligações moleculares com matri zes poliméricas , como hidrogéis , pode proporcionar formas de liberação controlada de NO .
[ 13 ] No tratamento da osteoartrite , o NO pode atuar no combate à inflamação . A entrega de NO no espaço intra-articular apresenta inúmeros benefícios potenciais , tais como a modulação da ação enzimática e da liberação de mediadores inflamatórios , que contribuem para a redução da resposta inflamatória de várias classes celulares , como por exemplo , leucócitos , macrófagos , mastócitos , células endoteliais e plaquetas . Martins et al . ( 2016 ) demonstraram que a liberação de NO, a partir de aplicações tópicas de soluções de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC ) contendo GSNO, reduziu o processo inflamatório em doenças periodontais em ratos por meio da diminuição do estresse oxidativo no tecido gengival e dos niveis de citocinas como TNF-a e IL- l p . Além da inibição destas moléculas , Botta et al . ( 2018 ) apresentaram um estudo no qual moléculas contendo grupos doadores de NO foram capazes de reduzir a expressão da isoforma induzivel da NOS , diminuindo os niveis de NO gerado durante o processo de inflamação .
[ 14 ] Vários doadores de NO são f otossensiveis , podendo liberar NO mediante incidência de luz . Além disso , devido à sua natureza antioxidante , o NO, caso estej a livre na solução polimérica, pode reagir com o f otoiniciador homolisado , aumentando o tempo de geli ficação dos hidrogéis . Desta forma, para que ocorra liberação controlada NO a partir de hidrogéis f otoreticulados in si tu é essencial proteger os doadores de NO da ação da luz durante o processo de f otoreticulação .
ESTADO DA TÉCNICA
[ 15 ] Até o presente momento , o estado da técnica na f otoreticulação in si tu de hidrogéis para regeneração de tecido cartilaginoso inclui hidrogéis de ácido hialurônico e de ácido hialurônico combinado com gelatina, sul fato de condroitina, quitosana, poli ( etileno glicol ) dentre outras combinações poliméricas . Além disso , a produção de hidrogéis de ácido hialurônico para regeneração de tecido cartilaginoso , formados por diversos mecanismos de reticulação é descrita em diversos artigos cientí ficos e documentos patentários , por exemplo :
[ 16 ] O documento de autoria de Lin et al . ( 2019 ) , intitulado " OPTIMIZATION OF PHOTOCROSSIINKED GEIATIN/ HYAIURONIC ACID HYBRID SCAFFOÍD FOR THE REPAIR OF CARTHAGE DEFECT" descreve hidrogéis f otoreticulados formados por ácido hialurônico e gelatina modi ficados , com potencial efeito de regeneração da cartilagem, onde a gelatina é o componente maj oritário . Entretanto , tal documento não apresenta conflito com a presente invenção , visto que os hidrogéis são fabricados a partir de gelatina metacrilada com ácido hialurônico metacrilado em uma reação radicalar envolvendo os grupos vinilicos de ambos os polímeros , enquanto na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico metacrilado como componente maj oritário da matri z e de gelatina sul f idrilada, ao invés de metacrilada . A utili zação de gelatina sul fidrilada leva a hidrogéis formados por duas reações de f otoreticulação distintas : a reação radicalar entre os grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno dos grupos sul fidrila da gelatina com os grupos metacrilato do ácido hialurônico . A ausência de ligação tiol-eno na formação do hidrogel produzido por Lin et al . ( 2019 ) leva a um maior tempo de f otoreticulação . A longa exposição à luz ultravioleta pode causar dano ao tecido cartilaginoso saudável presente no entorno da lesão que está sendo reparada . Além disso , a presente invenção contém nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , garantindo a liberação controlada de NO após a formação do hidrogel .
[ 17 ] O documento de autoria de Li et al . ( 2019 ) , intitulado " THE APPLICATION OF HYALURONIC ACID-BASED HYDROGELS IN BONE AND CARTILAGE TISSUE ENGINEERING" descreve a aplicação de hidrogéis baseados em ácido hialurônico nos ossos e no tecido cartilaginoso . Adicionalmente , vários tipos de modi ficações químicas que levem à reticulação das cadeias de ácido hialurônico são propostos . Entretanto , veri fica-se que tanto a presente invenção , quanto o referido documento apresentam soluções di ferentes para promover a reticulação do ácido hialurônico a partir das modi ficações quimicas das cadeias poliméricas . Enquanto no referido documento são apresentadas inúmeras estratégias para a modi ficação do ácido hialurônico , utili zando metacrilato de glicidila, ácido metacrilico , divinilsul fona, epóxidos poli funcionais , carbodiimida, hidrazina e aldeidos , que levam a formação de reticulações ( ligações cruzadas ) de um único tipo , a presente invenção propõe a estratégia de dupla reticulação envolvendo a formação de ligações grupos vinilicos do ácido hialurônico metacrilado e ligações tiol-eno entre as cadeias de ácido hialurônico metacrilado e de gelatina sul f idrilada . Adicionalmente , o referido documento não descreve composições que contenham compostos liberadores de NO para auxiliar no processo de regeneração do tecido cartilaginoso , tais como as nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação, que compõe a presente invenção .
[18] 0 documento de autoria de Xing et al . (2020) , intitulado "HYALURONIC ACID AS A BIOACTIVE COMPONENT FOR BONE TISSUE REGENERATION: FABRICATION, MODIFICATION, PROPERTIES, AND BIOLOGICAL FUNCTIONS" descreve a utilização de ácido hialurônico como componente bioativo para a regeneração do tecido ósseo, inclusive, propondo sua reticulação com metacrilato de glicidila. Apesar disso, tal documento propõe um método de fabricação e reticulação do material diferente daquele proposto na presente invenção. Enquanto no referido documento se refere à fabricação de dispositivos porosos de ácido hialurônico para a regeneração de tecido ósseo, na presente invenção o ácido hialurônico é utilizado em combinação com a gelatina sulfidrilada para fabricar soluções injetáveis e duplamente f otoreticuláveis in situ com potencial aplicação na regeneração de tecido cartilaginoso. O mecanismo proposto na presente invenção, de dupla reticulação e, particularmente, o uso de ligações do tipo tiol-eno entre as cadeias de ácido hialurônico metacrilado e gelatina sulfidrilada não é descrito no referido documento. Também não é descrita a utilização de compostos bioativos, como as nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação, como ocorre na presente invenção.
[19] O documento de autoria de Chen et al .
(2012) , intitulado "IN SITU FORMING HYDROGELS COMPOSED OF
OXIDIZED HIGH MOLECULAR WEIGHT HYALURONIC ACID AND GELATIN FOR NUCLEUS PULPOSUS REGENERATION" descreve hidrogéis de ácido hialurônico e gelatina modi ficados formados in si tu para regeneração do núcleo pulposo . Entretanto , tanto o referido documento quanto a presente invenção apresentam di ferenças nas estratégias para modi ficar a estrutura polimérica do ácido hialurônico e na presença, no caso da presente invenção , de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação . No referido documento , a formação dos hidrogéis ocorre por meio da formação de ligação amida envolvendo aminas primárias pendentes da gelatina e os grupos carboxila pendentes do ácido hialurônico , seguida de oxidação e reação com ácido adipico dihidrazina, um agente reticulante . Não há liberação de NO dos materiais descritos no referido documento . Já na presente invenção , o hidrogel é formado pela dupla reticulação de ácido hialurônico metacrilado e gelatina sul f idrilada, gerando reações radicalares f otoinduzidas entre os grupos vinilicos do metacrilato e reações tiol-eno entre os grupos vinilicos do metacrilato e os grupos tiol da gelatina sul f idrilada . Na presente invenção foram incorporadas nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação .
[ 20 ] O documento intitulado " INTRA- ARTICULAR DRUG DELIVERY: A FAST GROWING APPROACH (ALY, 2008 ) " faz uma revisão sobre os sistemas de liberação de drogas/ substâncias e cita, entre outras coisas , a utili zação de sistemas baseados no ácido hialurônico contendo nano/micro carreadores , como poli ( ácido láctico- co-ácido glicólico ) ( PLGA) , para a liberação intraarticular de fármacos no tratamento de osteoartrite e artrite reumatoide . Entretanto , são percebidas diversas di ferenças entre tal documento e a presente invenção , como ausência de gelatina na formulação , ausência de grupos metacrilato ou sul fidrila, tanto no ácido hialurônico quanto na gelatina, ausência de uma reação de f otoreticulação e ausência da incorporação de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , que são componentes presentes na presente invenção . Além disso , as soluções à base de ácido hialurônico descritas no referido documento resultam em hidrogéis termossensiveis formados por interações fisicas , enquanto na presente invenção , os hidrogéis formados são reticulados f otoquimicamente .
[ 21 ] O documento CN109701073A intitulado "A KIND OF INJECTABLE CARTILAGE REPAIR HYDROGEL AND PREPARATION METHOD THEREOF" refere-se a hidrogéis inj etáveis de ácido hialurônico e gelatina modi ficados para o tratamento e regeneração da cartilagem . Apesar disso , tal documento apresenta algumas di ferenças em relação a presente invenção , como a composição da matri z do hidrogel , as reações envolvidas na formação do hidrogel e o fármaco utili zado . No referido documento , os hidrogéis são fabricados a partir de gelatina metacrilada, sendo o componente maj oritário , e de ácido hialurônico metacrilado , utili zando o Irgacure 2959 como f otoiniciador e luz ultravioleta para induzir a fotoreticulação in si tu . A reticulação quimica é obtida por uma reação radicalar envolvendo os grupos vinilicos de ambos os polímeros . Além disso , plasma rico em plaquetas é adicionado ao hidrogel para acelerar a regeneração de tecido cartilaginoso . Na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico metacrilado , que é o componente maj oritário da matri z , e de gelatina sul f idrilada . A utili zação de gelatina sul fidrilada resulta em hidrogéis formados por duas reações distintas : a reação radicalar dos grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno dos grupos sul fidrila da gelatina com os grupos metacrilato do ácido hialurônico , o que acelera o processo de geli ficação . Cabe ressaltar ainda que no referido documento não é descrita a utili zação de nanopartí cuias doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , como acontece na presente invenção .
[ 22 ] O documento US 9889226B2 intitulado " PHOTOCROSSLINKED HYALURONIC ACID DERIVATIVES, AND THE PREPARATION PROCESS AND USE THEREOF" refere-se a derivados f otoreticulados de ácido hialurônico (HA) , principalmente na forma de hidrogéis úteis no tratamento intra-articular de osteoartrite e danos à cartilagem . Entretanto , neste documento , a f otoreticulação ocorre por meio da utili zação de um composto fotoreativo derivado de cumarina e propiof enona, que reage com trietilenoglicol , um agente espaçador bi funcional e com os grupos carboxila pendente do ácido hialurônico . Estes compostos modi ficados para conter grupos fotoreativos são posteriormente expostos à luz ultravioleta para a f otoreticulação . Na presente invenção , o hidrogel é formado a partir de ácido hialurônico modificado para conter grupos metacrilato e de gelatina modificada para conter grupos sulfidrila. A utilização de gelatina sulfidrilada leva à hidrogéis formados por duas reações distintas: a reação radicalar entre grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno entre os grupos sulfidrila da gelatina e os grupos metacrilato do ácido hialurônico. Além disso, não há no referido documento a utilização de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de gelificação.
[23] O documento EP2353612B1, intitulado "INJECTABLE IN-SITU CROSSLINKED HYDROGEL AND THE PREPARATION METHOD AND USE THEREOF" refere-se a hidrogéis injetáveis reticuláveis in situ compreendendo, entre outros componentes, um ou mais polissacarideos ou proteínas modificados, por exemplo, ácido hialurônico e gelatina. Apesar disso, tal documento apresenta diferenças consideráveis em relação à presente invenção. Por exemplo, no referido documento o processo de gelificação se baseia exclusivamente na oxidação dos grupos tióis, previamente inseridos nas cadeias de ácido hialurônico, sulfato de condroitina e/ou gelatina, por meio de moléculas de oxigênio dissolvidas na solução polimérica com geração de ligações do tipo dissulfeto, uma reação que não está envolvida na presente invenção. Além disso, essa ligação é iniciada na seringa, antes da aplicação, e pode levar até 7 dias para se completar. Os hidrogéis formados no referido documento são descritos como veiculos para a entrega de antibióticos, drogas antitumorais , fatores de crescimento ou corticosteroides . Na presente invenção, o hidrogel é formado rapidamente, em 2 minutos , a partir de ácido hialurônico metacrilado e de gelatina sul fidrilada por meio de duas reações distintas e que ocorrem simultaneamente : a reação radicalar entre grupos vinilicos do ácido hialurônico e a reação tiol-eno entre grupos sul fidrila da gelatina e grupos metacrilato do ácido hialurônico . Além disso , não há descrição em tal documento sobre a utili zação de nanoparticulas doadoras de NO que promovem a proteção dos grupos doadores de NO durante o processo radicalar de geli ficação , como ocorre na presente invenção .
[ 24 ] O documento US 9980977B2 , intitulado "MODIFIED HYAIURONIC ACID POIYMER COMPOSITIONS AND REIATED METHODS" refere-se a um material inj etável de ácido hialurônico reticulado destinado ao tratamento de osteoartrite e entrega de triancinolona acetonida, um corticosteroide . No referido documento , o ácido hialurônico foi modi ficado com divinil sul fona para introdução de grupos vinilicos pendentes , com grau de substituição de 10 % , e na sequência um hidrogel com baixo grau de reticulação foi formado ao reagir o ácido hialurônico modi ficado com poli ( etileno glicol ) ditiol , mediante a formação de ligações de tiol-eno unicamente . O corticosteroide foi previamente adicionado à solução de ácido hialurônico modi ficado para ser aprisionado no hidrogel . As ligações covalentes foram formadas na ausência de f otoiniciadores e incidência de luz , devido à alta reatividade dos grupos sul fidrila . O material foi extrudado e misturado a uma solução salina de ácido hialurônico sem modi ficações químicas para ser inj etado no espaço intra-articular como uma dispersão de hidrogel particulado . [ 25 ] A inj eção deste material , assim como os demais materiais de ácido hialurônico destinados a viscossuplementação , repõem somente as propriedades reológicas do liquido sinovial . Além disso , devido ao baixo grau de reticulação o material é rapidamente eliminado do espaço intra-articular , sendo necessárias repetidas inj eções semanais . A liberação de corticosteroide do hidrogel proporciona efeito antinociceptive imediato , entretanto , seu uso não é prescrito para todos os pacientes devido aos seus efeitos colaterais . Di ferentemente , a presente invenção relata o desenvolvimento de um hidrogel duplamente f otoreticulado in si tu com alto grau de reticulação capaz de suportar a adesão e proli feração celular, sendo constituído por componentes da MEC da cartilagem e capaz de liberar NO . Dessa forma, o material da presente invenção , tem potencial para modular a liberação de mediadores inflamatórios , protegendo a cartilagem do processo de degradação .
[ 26 ] Em resumo , o desenvolvimento de hidrogéis destinados à regeneração de tecido cartilaginoso por meio da f otoreticulação in si tu, bem como o desenvolvimento de plataformas poliméricas para entrega prolongada de NO por meio da incorporação de doadores exógenos j á são de dominio público . Entretanto , não há ainda na literatura cienti fica e/ou patentária, a descrição de hidrogéis f otoreticuláveis in si tu que sej am capazes de liberar NO no espaço intra- articular após a formação do hidrogel . A presente invenção é a primeira a combinar as duas tecnologias , uma vez que a decomposição fotoquimica dos doadores de NO tem sido , até então , uma barreira para a combinação dos métodos . [ 27 ] Além disso , a presente invenção reúne vantagens signi ficativas sobre as demais tecnologias j á descritas , visto que a utili zação da f otoreticulação ín si tu representa uma redução dos efeitos adversos da formação in si tu de hidrogéis , quando comparada com a f otoreticulação termoinduzida, devido à redução da toxicidade do processo . Em especial , a presente invenção apresenta uma solução original para a proteção de doadores de NO em formulações de HA e HA/Gelatina inj etáveis , baseada na inserção quimica dos doadores de NO no interior de nanoparticulas de PLGA funcionali zado com GSNO, de forma a proteger a GSNO, tanto da f otodecomposição durante a f otoreticulação do HA metacrilado e gelatina sul f idrilada, bem como dos radicais livres gerados no processo de fotoreticulação , a partir do f otoiniciador , ao mesmo tempo em que proporciona uma liberação lenta e prolongada de NO das nanoparticulas , governada pela hidrólise da matri z de PLGA que , em seu processo , mobili za as moléculas de GSNO, levando à sua dimerização e liberação de NO . Além disso , os componentes f otoreticuláveis dessas formulações permitem a aceleração do processo de fotoreticulação trazendo benefícios ao procedimento hospitalar . Desta forma, a presente invenção resolve o problema da preservação dos doadores de NO durante o processo de fotoreticulação da matri z de HA/Gelatina, potenciali zando as ações analgésica, anti-inf lamatória e condroprotetora associadas à atenuação da degradação do tecido cartilaginoso , devido às potenciais vantagens da liberação locali zada de NO . Finalmente , a presente invenção combina materiais totalmente biodegradáveis e biocompativeis para o tratamento da osteoartrite e regeneração do tecido cartilaginoso.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[28] A presente invenção se refere a um processo para fabricação de uma solução polimérica injetável duplamente f otoreticulável , capaz de gelificar in situ sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel, e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intra-articular , de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso, bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite, sem causar efeitos colaterais como aqueles causados pela administração usual de anti- inf lamatórios não esteroidais. O referido processo compreende as seguintes etapas:
(a) modificação quimica do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila (GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HAM) ;
(b) modificação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona (Cys-SH) para obtenção da gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ;
(c) obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO) ; e
(d) obtenção da solução polimérica injetável.
[29] Conforme observado, a solução polimérica proposta na presente invenção é constituída por ácido hialurônico modificado quimicamente para conter grupos vinilicos f otossensiveis , gelatina modificada quimicamente para conter grupos sulfidrila (SH) pendentes e nanoparticulas de PLGA conjugadas com GSNO. As nanoparticulas de PLGA conjugado com GSNO proporcionam proteção da GSNO contra o ataque das espécies radicalares geradas na f otoreticulação dos polímeros. A presença de grupos SH na gelatina funcionalizada proporciona um aumento da velocidade de gelificação.
[30] Após o processo de f otoreticulação e gelificação, a partir da irradiação com luz visível, as nanopartí cuias dispersas na matriz do hidrogel formado passam a liberar óxido nítrico (NO) em um processo lento e prolongado, governado pela velocidade de hidrólise das nanopartí cuias e pela concomitante reação de dimerização da GSNO conjugada ao PLGA.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[31] A Figura 1 apresenta os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) do ácido hialurônico (HA) e do ácido hialurônico modificado (HAM) , bem como a estrutura polimérica do HAM. No espectro do HAM há picos característicos de hidrogénios vinílicos em 5, 68 e 6,10 ppm, que confirmam a incorporação dos grupos metacrilato.
[32] A Figura 2 apresenta os espectros Raman da gelatina pura (Gel) e gelatina modificada (Gel-SH) . No espectro da Gel-SH, a banda de deformação axial em 2567 cri
1 é atribuída à ligação S-H, comprovando a conjugação de homocisteína tiolactona na cadeia da gelatina.
[33] A Figura 3 apresenta os espectros de infravermelho de reflectância total atenuada com transformada de Fourier (FTIR-ATR) de PLGA e PLGA-GSNO. No espectro de PLGA-GSNO, a banda em 1530 cnf1 é atribuída à deformação angular de N-H da amida secundária, o que comprova a incorporação de GSNO na cadeia do PLGA por meio da formação de uma ligação amida. [34] A Figura 4 apresenta em (I) uma criomicrograf ia eletrônica de transmissão (crio-TEM) representativa das nanoparticulas NP-PLGA-GSNO e em (II) a curva de distribuição de tamanho das nanoparticulas obtida a partir da análise de crio-TEM.
[35] A Figura 5 apresenta o gráfico dos tempos de gelificação dos hidrogéis de ácido hialurônico (HHA) , ácido hialurônico contendo Gel-SH (HHAG) e de ácido hialurônico contendo gelatina e nanoparticulas de PLGA-GSNO (HHAGNP) obtidos pelo método de inclinação do tubo. Os hidrogéis contendo gelatina, HHAG e HHAGNP, são formados com um menor tempo de incidência de luz (1,7 vezes menor) em relação ao hidrogel HHA.
[36] A Figura 6 apresenta os hidrogéis HHA, HAG e HAGNP durante o ensaio de tempo de gelificação, antes (tempo 0) , durante (tempos de 120 e 203 s) e após a incidência de luz visivel. A coluna da direita representa as fotografias dos hidrogéis após sua remoção do tubo, demonstrando que são materiais autosuportados .
[37] A Figura 7 apresenta em (I) a curva de liberação de NO em tempo real, medida por quimiluminescência, de uma suspensão de nanoparticulas liofilizadas (NP-PLGA-GSNO) em tampão fosfato (pH 7,4) durante 420 minutos e, em (II) a curva de liberação cumulativa de NO.
[38] A Figura 8 apresenta em (I) a curva de liberação de NO em tempo real medida por quimiluminescência do hidrogel HHAGNP durante 40 minutos e, em (II) a curva de liberação cumulativa de NO por 40 minutos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [ 39 ] A presente invenção se refere a um processo de obtenção de solução polimérica inj etável duplamente f otoreticulável , capaz de geli ficar in si tu sob condições fisiológicas e incidência de luz visivel , e de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intraarticular, de modo a promover a regeneração de tecido cartilaginoso , bem como proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório em indivíduos acometidos por osteoartrite .
[ 40 ] Conforme será observado , a denominação "hialuronato metacrilado" (HAM) se refere ao ácido hialurônico modi ficado quimicamente por metacrilato de glicidila para conter grupos vinilicos pendentes ; a denominação "gelatina sul f idrilada" ( Gel-SH) se refere à gelatina modi ficada quimicamente por N-acetil-homocisteina tiolactona para conter grupos sul fidrila pendentes , capazes de formar ligações do tipo tiol-eno com os grupos vinilicos do HAM; a denominação genérica "nanoparticula nitrosada" (NP-PLGA-GSNO) , se refere às nanoparticulas doadoras de óxido nitrico (NO) obtidas a partir da nanoprecipitação de poli ( ácido láctico-co-glicólico ) conj ugado com S- nitrosoglutationa ( PLGA-GSNO) .
[ 41 ] O referido processo de obtenção da solução polimérica compreende as seguintes etapas :
( a ) modi ficação quimica do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila ( GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HAM) ;
(b ) modi ficação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona ( Cys-SH) para obtenção da gelatina sul fidrilada ( Gel-SH) ; (c) obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nítrico (NP-PLGA-GSNO) ; e
(d) obtenção da solução polimérica injetável.
[42] As referidas etapas serão mais bem detalhadas a seguir.
Modificação química do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila (GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HMA)
[43] Inicialmente, o ácido hialurônico (HA) , cu a massa molar pode variar de 2kDa a 3 MDa, foi dissolvido em água ultrapura para obtenção de uma solução de concentração de 0,5 a 2,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v, utilizando agitação magnética na faixa de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 5 a 12 horas, preferencialmente 12 horas.
[44] Em seguida, a solução de ácido hialurônico (HA) foi aquecida a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, onde o pH foi ajustado para 3,5 utilizando ácido clorídrico (1 mol IH1) .
[45] Metacrilato de glicidila (GMA) foi adicionado à solução de HA para se obter uma concentração de GMA na faixa de 1,0 a 7,0 % m/v, preferencialmente 3,5 % m/v, resultando em uma solução de GMA e HA de razão molar GMA:HA na faixa de 5:1 a 9:1, preferencialmente 9:1, onde o número de mols de HA se refere ao número de mols da unidade repetitiva, ou mero.
[46] O meio reacional foi mantido a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 24 horas, em seguida transferido para saco de diálise de celulose (cut off de 12 a 14 kDa) e dialisado contra água ultrapura por urn periodo minimo de 72 h.
[47] Subsequentemente, foi realizada a secagem do conteúdo do saco de diálise. Preferencialmente, a secagem é realizada por congelamento rápido em nitrogênio liquido, seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando-se uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . Entretanto, tal procedimento pode ser substituído por congelamento lento em congeladores de refrigeradores convencionais. Cabe ressaltar que a utilização de métodos de secagem lenta, ou que envolvam aquecimento, como rotaevaporação, podem prejudicar a estabilidade e a ressolubilização do HAM.
[48] Conforme observado, a inserção de grupos vinilicos na cadeia polimérica do ácido hialurônico é feita utilizando-se o metacrilato de glicidila (GMA) . Este reagente é amplamente empregado para modificação de macromoléculas . A reação com GMA pode acontecer por transesterif icação ou abertura do anel do grupo epóxi . O mecanismo é modulado pelo pH do meio reacional, quando a água é utilizada como solvente. Na presente invenção, a reação foi realizada em meio ácido. Desta forma, o GMA reagiu com os grupos hidroxila e carboxila pendentes da estrutura do HA por meio da abertura do anel do grupo epóxi .
Modificação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona (Cys-SH) para obtenção da gelatina sulfidrilada (Gel-SH)
[49] Inicialmente, grânulos de gelatina, foram hidratados em tampão carbonato (pH 10,0) , por um período de 10 a 12 horas, preferencialmente 12 horas. Em seguida, a pasta formada pelos grânulos hidratados foi aquecida a uma temperatura de 37 a 55 °C, preferencialmente 40 °C, por um período de 3 a 5 horas, preferencialmente 5 horas, ou até a completa solubilização da gelatina, gerando uma solução de gelatina de concentração entre 10 e 15 % m/v, preferencialmente 10 % m/v.
[50] Ainda, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) foi adicionado à solução gelatina em quantidade suficiente para se obter uma concentração final de EDTA na faixa de 0,01 a 0,03 % m/v, preferencialmente 0,03 % m/v. N-acetil-homocisteína tiolactona (Cys-SH) também foi adicionada à solução de gelatina, em quantidade suficiente para se obter uma concentração de Cys-SH na faixa de 1,9 a 17,0 % m/v, preferencialmente 11,5 % m/v, referente a uma razão molar Cys-SH : gelatina na faixa de 1:1 a 6:1, preferencialmente 6:1, onde o número de mols de gelatina se refere ao número de mols da unidade repetitiva, ou mero.
[51] O meio reacional foi mantido a uma temperatura na faixa de 40 a 50 °C, preferencialmente 40 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um período de 3 a 5 horas, preferencialmente 3 horas.
[52] Para a purificação, o meio reacional foi diluído utilizando-se água destilada até que o pH do meio reacional estivesse na faixa de 6,0 a 7,0, preferencialmente 7,0 e transferido para um saco de diálise de celulose (cut off 12 a 14 kDa) , onde foi dialisado contra água ultrapura por um período mínimo de 48 h a uma temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40 °C.
[53] Subsequentemente, foi realizada a secagem do conteúdo do saco de diálise de celulose, preferencialmente por congelamento rápido em nitrogênio liquido seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando- se uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . Cabe ressaltar que o congelamento rápido pode ser substituído por congelamento lento em congelador de refrigerador convencional. Entretanto, a utilização de métodos de secagem lenta, ou que envolvam aquecimento, como rotaevaporação, podem prejudicar a estabilidade e resolubilização da Gel-SH.
Obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO)
[54] Primeiramente, foi preparada uma solução em solvente dimetil sulfóxido (DMSO) contendo: poli (ácido láctico-co-glicólico ) (PLGA) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de PLGA na faixa de 16,0 a 17,0 % m/V, preferencialmente 16, 6 % m/v; hidroxisuccinimida (NHS) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de NHS na faixa de 2,0 a 2,5 % m/v, preferencialmente 2,2 % m/v; l-etil-3- ( 3-cloridrato ) dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de EDC na faixa 3,5 a 4,0 % m/v, preferencialmente 3,8 % m/v, e S-nitrosoglutationa (GSNO) , em quantidade suficiente para a obtenção de GSNO na faixa 6,5 a 7,0 % m/v, preferencialmente 6,7 % m/v.
[55] Em seguida, a mistura reacional foi mantida sob agitação magnética na faixa de 300 a 500 rpm, preferencialmente 500 rpm, à temperatura ambiente por um periodo de 20 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.
[56] O sólido resultante (PLGA-GSNO) foi separado do meio reacional por precipitação, através da adição de água destilada gelada a uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C, seguida de centrifugação utilizando-se uma rotação entre 3.000 e 5.000 rpm, preferencialmente 5.000 rpm para sedimentação do sólido. O sobrenadante foi descartado. Este procedimento foi repetido de 2 a 5 vezes, preferencialmente 3 vezes, para aumento do grau de purificação do sólido resultante, PLGA-GSNO.
[57] O precipitado obtido na centrifugação foi seco utilizando-se nitrogênio liquido e liofilizado por um periodo de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) . O PLGA-GSNO resultante foi dissolvido em diclorometano (DCM) de forma a obter uma solução com concentração de PLGA-GSNO na faixa de 2,0 a 2,5 % m/v, preferencialmente 2,5 % m/v.
[58] Uma solução aquosa de poli (álcool vinilico) (PVA) de massa molar entre 8kDa e 15 kDa preferencialmente lOkDa e grau de hidrólise superior a 80%, preferencialmente 98%, foi preparada com concentração na faixa de 0,5 a 1,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v. A solução de PLGA-GSNO em DCM, preparada anteriormente, foi adicionada à solução de PVA em uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C, e na razão volumétrica de 1 volume de solução de PLGA-GSNO para cada 5 volumes de solução de PVA. Em seguida a mistura foi sonicada por um periodo de 60 a 90 s, preferencialmente 90 s. [59] Cabe ressaltar que o PVA pode ser substituído por copolímeros em bloco de poli (etileno glicol ) -co-poli (propileno glicol ) -co-poli ( etileno glicol) da classe dos Pluronics, por exemplo, Pluronic F68 ou Poloxamer 188. Entretanto, a substituição do estabilizante, PVA, pode afetar diretamente o tamanho das partículas e a estabilidade das suspensões. Sabe-se que o tamanho das partículas é inversamente proporcional ao tempo e amplitude de sonicação. Uma sonicação em excesso pode provocar a decomposição da GSNO devido ao aquecimento.
[60] Após a sonicação, DCM foi removido a vácuo e na sequência a suspensão de nanopartí cuias foi centrifugada a uma rotação de 5.000 a 10.000 rpm, preferencialmente 10.000 rpm, e o sobrenadante descartado. O material sedimentado na centrifugação foi resuspendido em água ultrapura gelada (temperatura entre 4 e 10 °C preferencialmente 4 °C) e novamente centrifugado como descrito acima por 2 vezes para remover o material não reagido .
[61] Por fim, o precipitado obtido na centrifugação foi seco por congelamento rápido em nitrogênio líquido, seguido de liofilização por um período de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .
Obtenção da solução polimérica injetável
[62] Inicialmente, uma solução de gelatina sulfidrilada (Gel-SH) foi preparada em tampão fosfato (pH 7,4) , em uma concentração entre 0,01 e 1,2 % m/v, preferencialmente 0, 6 % m/v, utilizando-se agitação magnética de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm e temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40 °C.
[63] Em seguida, ácido hialurônico metacrilado e liofilizado (HAM) foi adicionado à solução de Gel-SH em quantidade suficiente para obter uma solução com concentração de HAM na faixa de 1,2 a 2,0 % m/v, preferencialmente 2,0 % m/v que foi mantida sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm por um periodo de no minimo 5 horas.
[64] Adicionalmente, uma suspensão de nanoparticulas nitrosadas (NP-PLGA-GSNO) foi preparada em tampão fosfato (pH 7,4) com concentração de NP-PLGA-GSNO na faixa de 0,75 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v, utilizando-se banho de ultrassom à temperatura ambiente, por um periodo de 5 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos. Essa suspensão foi imediatamente adicionada à solução de Gel-SH e HAM sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, na proporção de 1 volume de suspensão (NP-PLGA-GSNO) para 4 volumes de solução de polímeros (Gel-SH + HAM) . O sistema foi mantido sob agitação por um periodo minimo de 10 minutos.
[65] As concentrações finais da solução de Gel- SH, HAM e NP-PLGA-GSNO em solvente tampão fosfato (0,01 mol L-1, pH 7,4) são: de 1,0 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v de hialuronato metacrilado (HAM) ; de 0,008 a 1,0 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/v de gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ; de 0,20 a 0,45 %, preferencialmente 0,30 % m/v de nanoparticulas doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO) , o que corresponde a uma proporção de 10 a 30 %, preferencialmente 20 % m/m de nanoparticulas nitrosadas em relação a massa de HAM utilizada.
[66] O f otoiniciador hidrossolúvel fenil-2,4, 6- trimetilbenzoilfosf inato de litio (LAP) , que sofre homólise sob irradiação com luz de comprimento de onda de 405 nm, foi previamente dissolvido em 200 pL de tampão fosfato (pH 7,4) e adicionado à solução contendo Gel-SH, HAM e NP-PLGA- GSNO em uma concentração de LAP na faixa de 0,1 a 0,5 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/v de modo a obter a solução polimérica injetável final.
[67] O processo de f otoreticulação ocorre através de um mecanismo radicalar na presença de f otoiniciador e envolve a formação de uma rede tridimensional com dupla reticulação, onde são formadas ligações químicas entre os carbonos vinilicos das ramificações do HA modificado (HA- HA) e entre os carbonos vinilicos das ramificações do HA modificado e os grupos tióis presentes na gelatina sulfidrilada (HA-Gel) . A ligação formada entre o carbono vinilico e o grupo tiol ocorre pela reação de tiol-eno que apresenta rápida taxa de reação em virtude da baixa energia de ativação para a abstração do hidrogênio do grupo sulfidrila (88 kcal mol-1) , que contribui para a aceleração do processo de gelificação, que pode ocorrer, na presente invenção, com apenas 2 minutos de incidência de luz visivel. Ressalta-se que o f otoiniciador LAP pode ser substituído por Irgacure 2959 ou qualquer outro que sofra f otodecomposição na faixa de 365 a 405 nm e seja solúvel em água. Entretanto, a substituição do f otoiniciador pode afetar diretamente o tempo de f otoreticulação . Além disso, o aumento da concentração de f otoiniciador aumenta a densidade de reticulação do hidrogel, tornando-o mecanicamente mais resistente.
EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÃO
[68] Para comprovar a obtenção da solução polimérica injetável f otoreticulável , os seguintes experimentos foram realizados.
EXEMPLO 1 - Modificação quimica do ácido hialurônico
[69] Em um balão de fundo redondo de 500 mL foram adicionados 200 mL de água ultrapura e 2,0 g de HA (1,0% m/v) . A solução foi agitada por 6 h a 1500 rpm por meio de um agitador magnético. Após completa solubilização, a temperatura foi elevada para 55 °C e o pH do meio foi ajustado para 3,5 com adição, gota-a-gota, de HC1 (1 mol L~L) . Em seguida, foram adicionados 6,5 mL de metacrilato de glicidila e a reação foi mantida por 24 h sob agitação a 1500 rpm. Decorrido este tempo, o produto foi dialisado em saco de diálise de celulose (cut off 12 a 14 kDa) contra água ultrapura por 72 h. Na sequência, o material foi congelado com nitrogênio liquido e liofilizado por 48 h.
[70] A modificação quimica do HA foi comprovada por análise de RMN de 1H. Na Figura 1 estão os espectros do HA e do HA modificado (HAM) . Os espectros foram obtidos em um espectrômetro Bruker AVANCE operando em 400 MHz . Para as análises, 15 mg de HA em pó e 15 mg de HAM liofilizado foram solubilizados separadamente em 700 pL de D2O. O grau de substituição também foi obtido por meio dos espectros de RMN integrando-se os picos dos hidrogénios vinilicos do grupo metacrilato (6,10 e 5, 68 ppm) e os picos dos hidrogénios metilicos do grupo n-acetil do ácido hialurônico (1,90 ppm) . De acordo com a Equação 1, o grau de substituição encontrado foi de 75%.
Grau de substituição (%) :
[3 (Ig,io + Is,6s) / 2 (li, 9o) J * 100 Equação (1)
EXEMPLO 2 - Modificação quimica da gelatina
[71] Em um balão de fundo redondo de 250 mL, 5 g de grânulos de gelatina foram hidratados em 50 mL de tampão carbonato (pH 10,0) sob agitação, durante a noite. Após a formação de uma pasta homogênea, a temperatura foi elevada para 40 °C para a completa solubilização da gelatina. Adicionou-se 0,015 g de ácido etilenodiaminotetraacético
(EDTA) e 3,81 g de N-acetil-homocisteina tiolactona à solução. A reação foi mantida a 40 °C por 3 h sob agitação magnética a 1500 rpm. Em seguida, a mistura reacional foi diluida em 100 mL de água ultrapura, dialisada em saco de diálise de celulose por 48 h a 40 °C e liofilizada.
[72] A inserção de grupos sulfidrila na cadeia polimérica da gelatina foi comprovada por espectroscopia Raman. Na Figura 2 estão os espectros da gelatina com e sem modificação quimica. As análises foram realizadas em espectrômetro Xplora One 785 nm da Horiba na faixa espectral de 4000-400 cri1. Cada espectro foi obtido com tempo de exposição de 60 s e 2 varreduras, utilizando um laser de 785 nm.
[73] Os grupos sulfidrila foram quantificados por técnica colorimétrica utilizando o reagente de Ellman (ácido 5, 5' -ditiol-bis (2-nitrobenzóico) ) . Para isto, inicialmente preparou-se uma solução estoque composta por 4,0 mg de reagente de Ellman e 1,0 mL de tampão fosfato (pH 8,0) contendo 1,0 mmol L-1 de EDTA. Para o preparo da solução de gelatina sulf idrilada, 30,0 mg do material liofilizado foram adicionadas em 30,0 mL de água ultrapura, mantendo a solução a 40 °C por 2 h sob agitação. Após solubilização, 250 pL desta solução foram incubados por 15 min com 2,5 mL de tampão e 50 pL da solução estoque. Decorrido este tempo, a absorbância foi medida em 412 nm em um espectrof otômetro (Hewlett Packard/ Agilent 8453) .
[74] As análises foram feitas em triplicata. O procedimento realizado para a obtenção da curva de calibração foi semelhante ao descrito acima, apenas substituindo as soluções de gelatina modificada por soluções de cloridrato de cisteina monohidratado em solução
_ C _ -1 tampão com concentrações variando de 8.10 mol L a 11 x 10~4 mol L-1. A concentração de grupos sulfidrila introduzidos na estrutura da gelatina foi de 9,4 pmol mg-1.
EXEMPLO 3 - Modificação quimica do PLGA
[75] Em um balão de fundo redondo de 50 mL foram adicionados 2 g de PLGA, 0,268 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) , 0,452 g de l-etil-3- ( 3-cloridrato ) dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) e 0,8 g de GSNO. Os reagentes foram dissolvidos em 12 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) . A solução foi agitada a 500 rpm em agitador magnético por 24 h à temperatura ambiente. O produto formado (PLGA-GSNO) foi precipitado e purificado pela adição de água ultrapura gelada seguida de centrifugação a 5000 rpm. A GSNO livre foi removida por sucessivas lavagens com água ultrapura gelada seguida de centrifugação. O material modificado foi liofilizado por 24 h. A modificação quimica foi comprovada por análise de FTIR-ATR (Figura 3) . Os espectros de PLGA, GSNO e PLGA-GSNO foram obtidos no espectrômetro Gary 660 da Agilent, entre 4000 e 400 cnf1 com urn total de 64 varreduras e 4 cut1 de resolução.
[76] Após a etapa de liof ilização, 100 mg de PLGA- GSNO foram dissolvidos em 4 mL de diclorometano (DCM) e a solução de PLGA-GSNO foi gotejada em 20 mL de solução gelada de PVA 1,0% (m/v) . A mistura foi sonicada por 90 s com 40 % de amplitude máxima no Sonicador VCX 500 da Sonics Vibra-cell. O solvente DCM foi evaporado a vácuo à temperatura ambiente. Em seguida, a dispersão de nanoparticulas foi centrifugada duas vezes, com remoção do sobrenadante e adição de água gelada, e liofilizadas por 24 h. As nanoparticulas formadas foram denominadas NP-PLGA-GSNO .
[77] A distribuição de tamanho das nanoparticulas de NP-PLGA-GSNO foi determinada por dispersão dinâmica de luz (DLS) utilizando-se um medidor de espalhamento de luz (Zetasizer Nano ZS da Malvern) , as análises foram feitas em triplicata a 25 °C com tempo de equilíbrio de 120 s, e também por criomicroscopia eletrônica de transmissão utilizando um microscópio Talos Árctica ( Thermofísher) operando a 200 kV. Na Figura 4 (1) é apresentada uma micrografia representativa das nanoparticulas, obtida por crio-TEM, e na Figura 4 (11) sua distribuição de tamanho obtida por Criomicroscopia Eletrônica de Transmissão (Crio- ME ou Cryo-EM) . As nanoparticulas formadas apresentaram diâmetro na faixa de 140 a 210 nm.
EXEMPLO 4 - Obtenção da solução polimérica injetável
[78] Em um frasco âmbar de 10 mL adicionou-se gelatina sulfidrilada liofilizada e 4 mL de tampão fosfato (pH 7,4) de forma a obter uma solução de 0, 6 % m/v de Gel- SH. A temperatura foi elevada para 40 °C e a solução foi mantida sob agitação magnética até a completa solubilização . Em seguida, a temperatura da solução foi reduzida até atingir a temperatura ambiente e, na sequência, o HAM liofilizado foi adicionado, de modo a obter uma solução com concentração de 1,9 % m/v de HAM, mantendo-se a agitação. Após a homogeneização da solução, uma suspensão de nanoparticulas de PLGA-GSNO foi adicionada .
[79] Para o preparo da suspensão, em um microtubo Eppendorf® de 2 mL foram adicionadas as nanoparticulas liofilizadas (20% em massa em relação à massa de HAM utilizada) e 1 mL de tampão fosfato (pH 7,40) . As nanoparticulas foram dispersas com auxilio de um banho ultrassónico por 5 min à temperatura ambiente.
[80] Após a inserção das nanoparticulas na solução polimérica, e homogeneização, as concentrações finais de Gel-SH, HAM e NP-PLGA-GSNO foram respectivamente de 0,5 % m/v, 1,5 % m/v e 0,30% m/v. A esta solução adicionou-se, 0,5% (m/v) do f otoiniciador LAP ( f enil-2 , 4 , 6- trimetilbenzoilfosf inato de litio) . O f otoiniciador foi previamente solubilizado em 200 pL de água ultrapura e adicionado à solução polimérica com auxilio de uma micropipeta. O tempo de gelificação dos hidrogéis foi obtido pelo método de inclinação do tubo. Para o ensaio, 0,5 mL de cada solução precursora dos hidrogéis foi adicionado em um tudo de ensaio de 9 mm de diâmetro e o tubo foi irradiado com luz visivel. Nesse teste, o tempo para a conversão da solução em hidrogel foi cronometrado e o tempo de gelificação foi caracterizado pelo exato momento em que não havia mais fluidez da solução pelas paredes do tubo, o ensaio foi realizado em quadruplicata . O tempo médio de gelificação está na Figura 5 e as fotografias das soluções antes e depois da incidência de luz estão na Figura 6. Neste ensaio foram produzidos hidrogéis de ácido hialurônico (HHA) , ácido hialurônico com gelatina (HHAG) e ácido hialurônico com gelatina e nanoparticulas de PLGA- GSNO (HHAGNP) .
EXEMPLO 5 - Liberação de NO
[81] A liberação de NO das nanoparticulas de PLGA-GSNO e dos hidrogéis contendo NP-PLGA-GSNO foi acompanhada por quimiluminescência em um analisador de oxido nitrico Sievers 2801, operando com pressão de nitrogênio de 6,0 psig e pressão de oxigênio de 8,0 torr, a fim de comparar a liberação de NO a partir das nanoparticulas livres e aprisionadas nos hidrogéis. A análise de NP-PLGA-GSNO livre foi realizada a partir de 10 mg de material liofilizado suspenso em tampão fosfato (pH 7,4) . Para a análise do hidrogel, uma solução polimérica injetável constituída por 1,5 % m/v de HAM, 0,5 % m/v de Gel-SH e 0,3 % m/v de NP-PLGA-GSNO foi irradiada com luz visivel por 2 minutos, formando um hidrogel cilíndrico com 1 cm de altura e 1 cm de diâmetro. Os materiais foram adicionados ao frasco térmico do analisador, contendo 10 mL de tampão fosfato (pH 7,4) e mantidos a 37 °C. Os dados de liberação de NO em tempo real e NO cumulativo das nanoparticulas e do hidrogel estão nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Os valores de liberação cumulativa de NO para NP-PLGA-GSNO e HHAGNP foram de 13 pmol mg-1 e 0,048 pmol mg-1, respectivamente.
[82] A principal inovação da presente invenção consiste na preservação da capacidade de liberação de NO dos hidrogéis duplamente f otoreticulados . A utili zação de nanoparticulas poliméricas que contêm doadores de NO conj ugados diretamente em sua cadeia conferiu fotoproteção aos grupamentos S-nitrosotióis , responsáveis por promover a liberação de NO . Além disso , a combinação de HAM com Gel-SH fez com que , além das ligações cruzadas formadas a partir da quebra da ligação vinilica, fossem formadas também ligações cruzadas do tipo tiol-eno que , devido à baixa energia de ativação , permitiram a redução do tempo de exposição à luz , auxiliando na preservação dos grupamentos
S-nitrosotióis .

Claims

36 REIVINDICAÇÕES
1. Processo de obtenção de solução polimérica injetável f otoreticulável , caracterizado por compreender as seguintes etapas:
(a) modificação quimica do ácido hialurônico (HA) com metacrilato de glicidila (GMA) para obtenção do hialuronato metacrilado (HAM) ;
(b) modificação quimica da gelatina com N-acetil- homocisteina tiolactona (Cys-SH) para obtenção da gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ;
(c) obtenção das nanoparticulas de PLGA doadoras de óxido nitrico (NP-PLGA-GSNO) ; e
(d) obtenção da solução polimérica injetável.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) , uma solução de ácido hialurônico (HA) dissolvido em água ultrapura, apresentando concentração de 0,5 a 2,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v, é obtida mediante agitação magnética na faixa de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um periodo de 5 a 12 horas preferencialmente 12 horas, seguido de aquecimento a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, onde o pH foi ajustado para 3,50 utilizando ácido clorídrico (1 mollt1) .
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o metacrilato de glicidila (GMA) é adicionado à solução de ácido hialurônico (HA) para se obter uma concentração de GMA na faixa de 1,0 a 7,0 % m/v, preferencialmente 3,5 % m/v, resultando em uma solução de GMA:HA na faixa de 5:1 a 9:1, preferencialmente 9:1.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, 37 caracterizado pelo fato de que o meio reacional é mantido a uma temperatura na faixa de 50 a 55 °C, preferencialmente 55 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um periodo de 24 horas, o qual é transferido para um saco de diálise de celulose (cut off de 12 a 14 kDa) e dialisado contra água ultrapura por 72 h.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o conteúdo do saco de diálise de celulose é seco preferencialmente por congelamento rápido em nitrogênio liquido seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) grânulos de gelatina foram hidratados em tampão carbonato (pH 10,00) , por um periodo de 10 a 12 horas preferencialmente 12 horas, seguido de aquecimento a uma temperatura de 37 a 55 °C, preferencialmente 40 °C, por um periodo de 3 a 5 horas preferencialmente 5 horas.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracter i zado pelo fato de que o ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) é adicionado à solução de gelatina em quantidade suficiente para se obter uma concentração final na faixa de 0,01 a 0,03 % m/v, preferencialmente 0,03 % m/v, e a N-acetil-homocisteina tiolactona (Cys-SH) é adicionada à solução de gelatina em quantidade suficiente para se obter uma concentração Cys-SH na faixa de 1,9 a 17,0 % m/v, preferencialmente 11,5 % m/v, referente a uma razão molar Cys-SH: gelatina na faixa de 1:1 a 6:1, preferencialmente 6:1, mantendo-se o meio reacional a uma temperatura na faixa de 40 a 50 °C, preferencialmente 40 °C, sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm, por um periodo de 3 a 5 horas, preferencialmente 3 horas.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o meio reacional é diluido utilizando água destilada até que o pH esteja na faixa de 6, 0 a 7,0, preferencialmente 7,0, sendo transferido para um saco de diálise de celulose (cut off de 12 a 14 kDa) , e dialisado contra água ultrapura por 48 h a uma temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40 °C.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o conteúdo do saco de diálise de celulose é seco preferencialmente por congelamento rápido em nitrogênio liquido seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 48 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (c) é preparada uma solução em solvente dimetil sulfóxido (DMSO) contendo: poli (ácido láctico-co-glicólico ) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de PLGA de concentração na faixa de 16,0 a 17,0 % m/v, preferencialmente 16, 6 % m/v; hidroxisuccinimida (NHS) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de NHS de concentração na faixa de 2,0 a 2, % m/v, preferencialmente 2,2 % m/v; l-etil-3- (3- cloridrato) dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de EDC de concentração na faixa de 3,5 a 4,0 % m/v, preferencialmente 3,8 % m/v, e S-nitrosoglutationa (GSNO) em quantidade suficiente para a obtenção de uma solução de GSNO de concentração na faixa de 6,5 a 7,0 % m/v, preferencialmente 6,7 % m/v, em que a mistura reacional é mantida sob agitação magnética na faixa de 300 a 500 rpm, preferencialmente 500 rpm, à temperatura ambiente por um periodo de 20 a 24 horas, preferencialmente 24 horas.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o sólido resultante (PLGA- GSNO) é separado do meio reacional por precipitação, pela adição de água destilada gelada a uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C, centrifugado utilizando uma rotação entre 3.000 e 5.000 rpm, preferencialmente 5.000 rpm, e o sobrenadante descartado, em que o referido procedimento é repetido de 2 a 5 vezes, preferencialmente 3 vezes.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o precipitado obtido na centrifugação é seco utilizando nitrogênio liquido seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma solução de PLGA-GSNO em solvente diclorometano (DCM) com uma concentração na faixa de 2,0 a 2,5 % m/v, preferencialmente 2,5 % m/v é adicionada a uma solução aquosa de poli (álcool vinilico) (PVA) com uma concentração na faixa de 0,5 a 1,0 % m/v, preferencialmente 1,0 % m/v.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que solução de PLGA-GSNO em DCM é adicionada à solução de PVA em uma temperatura na faixa de 4 a 10 °C, preferencialmente 4 °C e na razão volumétrica de 1 volume de solução de PLGA-GSNO para cada 5 volumes de solução de PVA, seguido de sonicação por um periodo de 60 a 90 s, preferencialmente 90 s.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que após a sonicação, o DCM é removido a vácuo, a dispersão de nanoparticulas centrifugada a uma rotação de 5.000 a 10.000 rpm, preferencialmente 10.000 rpm, o sobrenadante é descartado, e o material sedimentado na centrifugação ressuspendido em água destilada gelada a uma temperatura entre 4 e 10 °C, preferencialmente 4 °C, e novamente centrifugado por 2 vezes, em que o precipitado obtido é seco por congelamento rápido em nitrogênio liquido, seguido de liofilização por um periodo de pelo menos 24 h utilizando uma pressão na faixa de 40 a 60 mTorr (5,33 a 7,99 Pa) , preferencialmente 50 mTorr (6, 67 Pa) .
16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (d) , uma solução de gelatina sulfidrilada (Gel-SH) é preparada em tampão fosfato (pH 7,4) , na faixa de concentração de 0,01 a 1,2 % m/v, preferencialmente 0, 6 % m/v, utilizando agitação magnética de 900 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm e temperatura na faixa de 37 a 50 °C, preferencialmente 40
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, 41 caracterizado pelo fato de que ácido hialurônico modificado liofilizado (HAM) é adicionado à solução de Gel-SH para a obtenção de uma solução com concentração de HAM na faixa de 1,2 a 2,0 % m/v, preferencialmente 2,0 % m/v, mantendo a solução sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm por 5 horas.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 16 e 17, caracterizado pelo fato de que uma suspensão de nanoparticulas nitrosadas (NP-PLGA-GSNO) é preparada em tampão fosfato com pH 7,4 a uma concentração na faixa de 0,75 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v, utilizando banho de ultrassom a temperatura ambiente por um periodo de 5 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos, e em seguida, a suspensão é adicionada à solução de Gel-SH e HAM sob agitação magnética na faixa de 1000 a 1500 rpm, preferencialmente 1500 rpm na proporção de 1 volume de suspensão (NP-PLGA-GSNO) para 4 volumes de solução de polímeros (Gel-SH + HAM) , o sistema sendo mantido sob agitação por 10 minutos.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o f otoiniciador fenil-2,4, 6- trimetilbenzoilfosf inato de litio (LAP) é previamente dissolvido em 200 pL de tampão fosfato e adicionado à solução até obtenção de uma solução polimérica injetável final contendo entre 10 e 30 % m/m de nanoparticulas nitrosadas em relação a massa de HAM.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a f otoreticulação ocorre através de um mecanismo radicalar na presença de f otoiniciador envolvendo a formação de uma rede 42 tridimensional com dupla reticulação, em que o processo de gelificação ocorre com apenas dois minutos de incidência de luz visivel de comprimento de onda na faixa de 365 a 405 nm.
21. Solução polimérica injetável obtida conforme o processo definido nas reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que compreende:
- 1,0 a 1,5 % m/v, preferencialmente 1,5 % m/v de hialuronato metacrilado (HAM) ;
- 0, 008 a 1,0 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/vde gelatina sulfidrilada (Gel-SH) ; e
- 0,20 a 0,45 % m/v, preferencialmente 0,3 % m/v de nanoparticulas nitrosadas (NP-PLGA-GSNO) ;
- 0,1 a 0,5 % m/v, preferencialmente 0,5 % m/v de f otoiniciador LAP; e
- solvente tampão fosfato (0,01 mol L-1) , pH 7,4.
22. Uso da solução polimérica conforme definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para promover a regeneração de tecido cartilaginoso, e proporcionar um efeito condroprotetor e anti-inf lamatório durante o tratamento da osteoartrite .
23. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de ser para formação de hidrogel através da f otoreticulação in sítu.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de liberar óxido nitrico (NO) de maneira prolongada no espaço intra-articular .
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