JP6648142B2 - グリコサミノグリカンおよびタンパク質を含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は全体として、化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンと、例えばコラーゲンなど、化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドとを含む組成物に関する。

化学修飾されているまたはされていない、高親水性グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンと、化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドとを含む均質な組成物の製剤は、限定された機械的特性および限定された生物学的、薬理学的または医薬的使用の特性を有する粘弾性の固形物または半固形物を形成する。

前章で述べた課題は、本発明による組成物を用いて解決することができる。

こうした趣旨で、本発明による組成物は、ポリヒドロキシウレタン、化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミン、および化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドを含む。ポリヒドロキシウレタンは、環式カーボネート（ＣＣ）化学的官能基とポリアミン（ＰＡ）化学的官能基との共有結合によって得られる。

好ましくは、組成物は、環式ポリカーボネート官能基を有する分子、および化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンを含有する調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）と、ポリアミン官能基を有する分子、化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドを含有する調製物との重合または共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｕｎｄ）形成によって得られる。グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミン、および部分加水分解もしくはされていないタンパク質、またはペプチドは、ポリヒドロキシウレタンの構成要素で化学修飾することができる。

ポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマーで化学修飾されている、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンを、ポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマーで化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドと共有結合させて、革新的な物理的、生物学的、薬理学的または医薬的特性を有する新たな組成物を生成することができる。

本発明による組成物は、薬学的活性物質を送達するもしくは生細胞を支持するためのミクロゲルもしくはミクロ粒子の製造、または生体物質と接触している表面の処理、または多糖、タンパク質、部分加水分解タンパク質およびペプチドに対する特定の親和性を表面に付与するためもしくはタンパク質、部分加水分解タンパク質およびペプチドを化学修飾して、それらに新規な物理的、生物学的、薬理学的もしくは医薬的特性を付与するための表面処理、または細胞外マトリックスのインビトロまたはインビボにおける再構築および置換などのいくつかの用途で使用することができる。

細胞外マトリックスは、すべての組織および器官中に存在する非細胞部分である。その機能は本質的にその構造およびその物理的特性に関連しているが、その生化学的組成およびその必須構成要素およびそれらの生体力学的機能にも関連している。

基本的に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は水、タンパク質および多糖からなる。各ＥＣＭは、コラーゲンの線維性構造などの様々な立体配座を示すタンパク質および水和ゲルを形成するグリコサミノグリカンが本質的に存在している点で共通している独特な生化学的組成を有する。コラーゲンおよび他の線維性タンパク質はＥＣＭの止血条件で本質的に疎水性であるが、グリコサミノグリカンは強い親水性である。それら２つの必須の物質ファミリーに基づいた、生体適合条件で適切な機械的特性を有するＥＣＭのインビトロおよびインビボにおける再構築は、この革新的な製剤の用途の１つである。

ＥＣＭが様々な疾患もしくは外傷によって損傷もしくは破壊されるとき、または加齢、外傷、もしくはびらんに関連したプロセスによって変形、もしくは部分もしくは完全消失したとき、ＥＣＭを再構築または置換する技法が現在存在している。

それらの技法は、３つの一般的ファミリーに分類することができる。
− ＥＣＭの元の組成と全く関係がなく、生細胞を含まない、移植片および生体適合性人工器官の使用。
− ＥＣＭの元の組成との関係が限定された組成に基づいているが、疑似ＥＣＭにおいて生細胞の増殖を可能にする、移植片および生体適合性機械的足場の使用。
− 患者の健常で機能するＥＣＭを損傷部分の再構築のために摘出することに基づいた自己移植。

それらの技法は広く使用されているが、それらにはすべて、下記のような周知の特有の欠点がある。
− 生細胞を含まない人工器官を置換するための重い手術外傷および困難さ。
− 機能化足場と隣接するＥＣＭの弱い組込みおよび取り込み。
− 自己移植片において適切な健常ＥＣＭを見出すことの限界。

本発明は、ポリヒドロキシウレタンならびに元のＥＣＭの必須構成要素であるタンパク質およびグリコサミノグリカンからなる生体適合性ＥＣＭの再構築を可能にする。このＥＣＭは、可溶化を支援するポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマー官能基の重合、および化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドと化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンとの生体適合条件における密接な接触または共有結合の創製によってインビトロまたはインビボにおいて形成される。

いくつかの実施形態において、本発明による組成物は、本明細書で「調製物ａ」および「調製物ｂ」と呼ばれる２つの調製物によって得られる。

調製物ａ
調製物ａにおけるその意図した使用のための必須構成要素は、コンドロイチン硫酸；ヒアルロン酸；ヘパラン硫酸；デルマタン硫酸；ケラタン硫酸；アグリカンなどのグリコサミノグリカン；それらの加水分解画分またはそれらのグリコサミンおよびポリグリコサミン構成要素である。上記の構成要素は、ポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマー単位の１つまたはそれ以上およびそれらの物質の混合物で化学修飾することができ、以降「ＧＡＧブレンド」と呼ばれる。

調製物ａの「ＧＡＧブレンド」は１％を超える濃度で、許容される溶媒を含み、かつ「ＧＡＧブレンド」に共有結合していないポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマー、例えば５〜８個の原子の環を有する環式ポリカーボネートを場合により含む連続媒体に分散または溶解される。

さらに詳細には、少なくとも３つの第一級または第二級の非芳香族ヒドロキシル官能基を有するポリヒドロキシル化分子の環式ポリカーボネート。

例えば、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、リビトール、ソルビトール、ズルシトール、マンニトール、マルチトール、イソマルチトール、ラクチトール、またはポリエーテルポリオールの環式ポリカーボネートおよび上記の混合物、ならびに（１，２−ジヒドロキシエチル）、または（２，３−ジヒドロキシプロピル）エーテル、エステル、ケトン、アミド、ホスフェート、スルフェート、スルフィド、ジスルフィド、アルカン、シクロアルカン、アルケン、シクロアルケン、アリールおよび１つもしくはそれ以上の酸素原子を含むヘテロ環、または１つもしくはそれ以上の窒素もしくは硫黄原子を含む芳香族ヘテロ環の環式カーボネートおよびポリカーボネート。

調製物ａの非商業的な環式ポリカーボネートは、文献および先行技術に記述されている方法、例えばＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社による１９６３年１月８日付の米国特許第３，０７２，６１３号に記載されている方法に従って得られる。

例えば、ジグリセリンの非商業的なモノマーである環式ポリカーボネートは、ジグリセリン、過剰量の炭酸ジエチルおよび触媒量の炭酸ナトリウムを含む混合物を１３０℃の温度までゆっくりと加熱することによって得られる。収率は非常に高い。

重合度３〜２００，０００、好ましくは３〜２０，０００のポリヒドロキシウレタンのプレポリマーは、文献および先行技術に記述されている方法、例えばＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社による１９６３年１月８日付の米国特許第３，０７２，６１３号に記載されている方法に従って得られる。調製物ａのポリヒドロキシウレタンのプレポリマーは、それらの末端部（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄｉｎｇ）が確実に環式カーボネート官能基となるようにする方式により配合され、製造される。

ポリヒドロキシウレタンの成分を有する化学修飾されているグリコサミノグリカンは、文献および先行技術に記述されている方法に従って得られる。例えば、「ＧＡＧブレンド」の修飾されているヒアルロン酸は、苛性媒体中におけるその脱アセチル化、続いてジグリセリンの環式ポリカーボネートによるそのエステル化、続いてｐＨを８から５の間に調整した後同じまたは別の環式ポリカーボネートによるそのカルバメート化によって得られる。上述のポリカーボネートのいずれか１つで化学修飾されているグリコサミノグリカンを、本発明において記述されているジアミンまたはポリアミンでさらに修飾することができる。修飾されているヒアルロン酸の側鎖のカルバメート化反応は、例えば限定されるものではないが水などの許容される溶媒の存在下に０から１５０℃の間、好ましくは１５から８０℃の間の温度で実施される。得られた化学修飾ヒアルロン酸を、上述の条件で環式ポリカーボネートでさらにカルバメート化することができる。修飾ヒアルロン酸の逐次カルバメート化をさらに行って、環式カーボネートを末端基とする３〜２５個のモノマー単位（ｍｏｎｏｍｅｒ ｅｎｔｉｔｙ）の修飾ヒアルロン酸にポリヒドロキシウレタン側鎖を構築することができる。同じ手順を、本発明において記載された部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンに適用することができる。

さらに、調製物ａは、環式カーボネート官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのプレポリマーまたはポリヒドロキシウレタンで化学修飾されている「タンパク質のブレンド」である、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドを含有することができる。

化学修飾されている「タンパク質のブレンド」は、例えば、コラーゲンのビス（１，４−アミノプロピル）ピペラジン中における溶解、続いてカルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合物によるそのアミド化、続いて修飾されているコラーゲンのＴＢＭＥ（ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（Ｔｅｒ−ＢｕｔｙｌＭｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ））中における沈殿、続いて湿った沈殿物の、４％の酢酸を含む無水エタノールの溶液中における溶解および中和、続いて修飾されているコラーゲンの酢酸エチル中における沈殿、遠心、真空下における乾燥によって得られる。上述の「ＧＡＧブレンド」の化学修飾と同様に、この化学修飾されている「タンパク質のブレンド」をアミド化した後、許容される溶媒の存在下に０から１５０℃の間、好ましくは１５から８０℃の間の温度で、本発明において記述されている環式ポリカーボネートの１つでさらにカルバメート化することができる。得られた化学修飾されているタンパク質を、本発明において記述されているジアミンまたはポリアミンの１つでさらにカルバメート化することができる。「タンパク質のブレンド」の逐次カルバメート化をさらに行って、環式カーボネート官能基を末端基とする２〜２６個のモノマー単位のポリヒドロキシウレタン側鎖を「タンパク質のブレンド」に構築することができる。

調製物ａは、非反応環式カーボネートを末端基として有する本発明の構成要素を含む。調製物ａのすべての構成要素に由来する非反応環式カーボネート官能基の量は、調製物ｂのすべての構成要素に由来する非反応第一級または第二級アミン官能基に重合または共有結合して、ポリヒドロキシウレタンと、化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンと、化学修飾されているまたはされていない、タンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドとを含む組成物から所望の特性を得るのに十分な程度である。

調製物ｂ
調製物ｂにおける所期の使用のための必須構成要素は、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニンなどのタンパク質、それらの加水分解画分またはペプチドである。上記の構成要素は、ポリヒドロキシウレタンの１つまたはそれ以上の成分およびそれらの物質の混合物で化学修飾することができ、以降「タンパク質のブレンド」と呼ばれる。

ポリヒドロキシウレタンの成分で化学修飾されているタンパク質またはペプチドは、文献および先行技術に記述されている方法に従って得られる。例えば、「タンパク質のブレンド」の修飾されているコラーゲンは、コラーゲンのビス（１，４−アミノプロピル）ピペラジン中における溶解、続いてカルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合物によるアミド化、続いて修飾されているコラーゲンのＴＢＭＥ（ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）中における沈殿、続いて湿った沈殿物の、４％の酢酸を含む無水エタノールの溶液中における溶解および中和、続いて修飾されているコラーゲンの酢酸エチル中における沈殿、遠心ならびに真空下における乾燥によって得られる。調製物ａにおいて記述された「ＧＡＧブレンド」の化学修飾と同様に、化学修飾されているタンパク質またはペプチドをアミド化した後、許容される溶媒の存在下に０から１５０℃の間、好ましくは１５から８０℃の間の温度で、本発明において記述されている環式ポリカーボネートの１つでさらにカルバメート化することができる。得られた化学修飾されているタンパク質を、本発明において記述されているジアミンの１つでさらにカルバメート化することができる。「タンパク質のブレンド」の逐次カルバメート化をさらに行って、第一級および第二級アミン官能基を末端基とする１〜２５個のモノマー単位のポリヒドロキシウレタン側鎖を「タンパク質のブレンド」に構築することができる。

「タンパク質のブレンド」は、１％を超える濃度で例えば限定されるものではないが水などの許容される溶媒を含み、かつ「タンパク質のブレンド」に共有結合していないポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマー、例えば第一級または第二級ポリアミンを場合により含む調製物ｂの連続媒体に分散または溶解される。

本発明において有用な第一級または第二級ポリアミンは、ヒドロキシル官能基で置換されているまたはされていない、エーテル、エステル、ケトン、アミド、ホスフェート、スルフェート、スルフィド、ジスルフィド、アルカン、シクロアルカン、アルケン、シクロアルケン、アリールの第一級もしくは第二級ポリアミン；または１つもしくはそれ以上の酸素、窒素もしくは硫黄原子を含むヘテロ環の第一級もしくは第二級ポリアミンおよび第一級もしくは第二級ポリアルキルアミン；またはエチレングリコールおよびプロピレングリコールの単一もしくは混成ポリエーテルアミン；またはそれらの化合物の混合物である。

重合度３〜２００，０００、好ましくは３〜２０，０００のポリヒドロキシウレタンのプレポリマーは、文献および先行技術に記述されている方法、例えばＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社による１９６３年１月８日付の米国特許第３，０７２，６１３号に記載されている方法に従って得られる。調製物ｂのポリヒドロキシウレタンのプレポリマーは、それらの末端部が確実に第一級または第二級アミン官能基となるようにする方式により配合され、製造される。さらに、調製物ａは、第一級または第二級アミン官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのプレポリマーまたはポリヒドロキシウレタンで化学修飾されている「ＧＡＧブレンド」である、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンを含有することができる。

さらに、調製物ａは、別法としてアミド化により得られた第一級または第二級アミン官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのモノマーまたはプレポリマーまたはポリヒドロキシウレタンで化学修飾されている「ＧＡＧブレンド」である、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンを含有することができる。例えば、「ＧＡＧブレンド」の修飾されているコンドロイチン硫酸は、室温でカルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを触媒とし、限定されるものではないが１，３−ジアミノ−２−プロパノールなどのジアミンまたはポリアミンでアミド化することによって得られる。アミド化度は触媒量で制御される。得られた部分または完全アミド化されているコンドロイチン硫酸は、極性および低極性溶媒における逐次的な洗浄、沈殿および再懸濁によって精製される。部分アミド化コンドロイチン硫酸を、第一級または第二級アミン官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのプレポリマーまたはポリヒドロキシウレタンでさらにアミド化することができる。反応は、０から８０℃、好ましくは２０から６０℃の間の温度で、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドの触媒系を用いて実施される。修飾されているグリコサミノグリカンは、極性および低極性溶媒における逐次的な洗浄、沈殿および再懸濁によって単離される。

調製物ｂは、ジアミンおよびポリアミンに由来する非反応第一級または第二級アミン官能基を末端基として有する本発明の構成要素を含む。調製物ｂのすべての構成要素に由来するジアミンおよびポリアミンの非反応第一級または第二級アミン官能基の量は、調製物ａのすべての構成要素に由来する非反応環式カーボネート官能基に重合または共有結合して、ポリヒドロキシウレタンと、化学修飾されているまたはされていない、グリコサミノグリカン、部分加水分解グリコサミノグリカンまたはグリコサミンと、化学修飾されているまたはされていないタンパク質、部分加水分解タンパク質またはペプチドとを含む組成物から所望の機能を得るのに十分な程度である。

調製物ａおよびｂからの組成物
調製物ａとｂのブレンドによって、本発明の構成要素、すなわちポリヒドロキシウレタンと組み合わせたまたはポリヒドロキシウレタンと共有結合している「ＧＡＧブレンド」、「タンパク質のブレンド」を含有する均質な組成物の創製が可能になる。

ブレンド組成物のための調製物ａとｂの有用な割合は、所望の最終用途に関連している。環式カーボネートとアミン官能基のモル比は０．０２と５０の間に設定されている。ＥＣＭの置換または再構築の例において、調製物ａもしくはｂに由来する環式カーボネート官能基の数が調製物ｂもしくはａに由来する第一級および第二級アミン官能基の数と等しいまたはそれより若干多いなど、それらの割合が算出される。

調製物ａまたはｂに由来する環式カーボネート官能基と調製物ｂまたはａに由来する第一級および第二級アミン官能基を重合または共有結合により反応させて、様々なポリヒドロキシウレタンを形成する。２つの調製物のこのような混合中において、温度は、相ａおよびｂの構成要素、それらの濃度および公知技術から選択された混合技術のタイプに応じて、１５から１５０℃の間の温度に上昇することがある。様々なポリヒドロキシウレタンを形成するための重合または共有結合は、重合および共有結合形成の速度を制御するための亜鉛、マグネシウム、ビスマス、アルミニウム塩または共有結合化合物または赤外線フォトニック供給源などの触媒によってさらに制御することができるが、これらに限定されるものではない。

ポリヒドロキシウレタンとグリコサミノグリカンとタンパク質を含む得られた組成物は、例えば、薬学的活性物質を送達するもしくは生細胞を支持するためのミクロゲルもしくはミクロ粒子の製造、または生体物質と接触している表面の処理、または多糖、タンパク質、部分加水分解タンパク質およびペプチドに対する特定の親和性を表面に付与するためもしくはタンパク質、部分加水分解タンパク質およびペプチドを化学修飾して、それらに新規な物理的、生物学的、薬理学的もしくは医薬的特性を付与するための表面処理、または細胞外マトリックスのインビトロまたはインビボにおける再構築および置換にとって有用である。

調製物ａおよびｂの混合物によって得られた革新的な組成物は、生理溶液、細胞およびそれらの増殖因子制御因子、鉱物、特にリン酸塩、ならびにＥＣＭ環境中に通常存在しているまたは適用のための他の何らかの成分によって補完される。

この革新的な組成物は、例えば、結合、上皮、神経、筋、骨、軟骨、または皮膚、動物もしくはヒト細胞外マトリックスの置換および再構築にとって有用である。

この革新的な組成物は、永久的なまたは一時的な期間にわたって、生体に移植された異物の表面を被覆するにも有用である。

本発明は、いくつかの実施例および以下の図面によって本章においてより理解されるであろう。

本発明の第１の実施例による組成物の粘弾性レオロジー特性を示すグラフである。 本発明の第２の実施例による組成物の粘弾性レオロジー特性を示すグラフである。 本発明の第３の実施例による組成物の粘弾性レオロジー特性を示すグラフである。

［実施例１］
調製物ａ
機械的撹拌装置を備えた反応器において、トリグリセリン（ポリグリセリン−３；Ｓｏｌｖａｙ社）２０部、炭酸ジエチル５０部および微粉砕された炭酸ナトリウム０．５部を添加した。

撹拌下におけるブレンドを、混合物が均質のようにみえるまで１時間にわたって９０℃に加熱した。次いで、それを１〜２時間で１３０℃にゆっくりと加熱し、次いでその温度でさらに１〜２時間維持した。反応中において形成されたエチルアルコールを蒸留により除去した。３時間後、混合物を約１５ｍｂａｒの真空下に置いて、エチルアルコールおよび炭酸ジエチルの残留物を除去した。

混合物を熱濾過して、触媒を除去し、コンドロイチン−４−硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１．５部を添加した。

調製物ｂ
ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）１．５部を１，３−ジアミノ−２−プロパノール２０部に添加した。調製物ｂを撹拌下に室温で維持して、粘性の均質液体を得た。

調製物ａおよびｂからの組成物
調製物ａ ２０部を約５０℃で予熱した。調製物ｂ ６．５部を添加し、通常の高せん断混合装置でブレンドした。組成物の温度は急速に８０℃に上昇した。組成物を約４５℃に冷却し、ＰＢＳ緩衝液中の５％ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液４．８部を添加し、上記と同じ装置で混合した。

得られた組成物は細胞外マトリックスの代替物として有用であり、図１に示す粘弾性レオロジー特性を示した。

［実施例２］
調製物ａ
機械的撹拌装置を備えた反応器において、トリグリセリン（ポリグリセリン−３；Ｓｏｌｖａｙ社）２０部、ソルビトール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１２部、炭酸ジエチル１００部および微粉砕された炭酸ナトリウム１部を添加した。

撹拌下におけるブレンドを、混合物が均質のようにみえるまで１時間にわたって１１５℃に加熱した。次いで、それを約１時間で１３０℃にゆっくりと加熱し、次いでその温度でさらに１〜２時間維持した。反応中において形成されたエチルアルコールを蒸留により除去した。３時間後、混合物を約１５ｍｂａｒの真空下に置いて、エチルアルコールおよび炭酸ジエチルの残留物を除去した。

混合物を熱濾過して、触媒を除去し、コンドロイチン−４−硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）３．２部を添加した。

調製物ｂ
牛肉アキレス腱由来の不溶性Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．７部を、１，３−ジアミノ−２−プロパノール７部、３，６−ジオキサオクタメチレンジアミン（ＪＥＦＦＡＭＩＮ ＥＤＲ １４８、Ｈｕｎｔｓｍａｎ社）４．９部、およびヘキサメチレンジアミン２．１部に溶解した。約４０℃に予熱された混合物において、ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）２．１部を添加して、調製物ｂを得た。

調製物ａおよびｂからの組成物
調製物ａ ２０部を約５０℃で予熱した。調製物ｂ １５．８部を添加し、通常の高せん断混合装置でブレンドした。組成物の温度は急速に上昇して、８０℃を超えた。

得られた組成物は、例えば、永久的なまたは一時的な期間にわたって、生体に移植された異物の表面を被覆するのに有用である。組成物２は、図２に示す粘弾性レオロジー特性を示す。

［実施例３］
調製物ａ
機械的撹拌装置を備えた反応器において、トリグリセリン（ポリグリセリン−３；Ｓｏｌｖａｙ社）２３．３部、ジグリセリン（ＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅ Ｎ．Ｖ社）６．７部、炭酸ジエチル７５部および微粉砕された炭酸ナトリウム１．５部を添加した。撹拌下におけるブレンドを、混合物が均質のようにみえるまで１時間にわたって９０℃に加熱した。次いで、それを約１時間で１３０℃にゆっくりと加熱し、次いでその温度でさらに１〜２時間維持した。反応中において形成されたエチルアルコールを蒸留により除去した。３時間後、混合物を約１５ｍｂａｒの真空下に置いて、エチルアルコールおよび炭酸ジエチルの残留物を除去した。混合物を熱濾過して、触媒を除去し、コンドロイチン−４−硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２部を添加した。

調製物ｂ
牛肉アキレス腱由来の不溶性Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）１部を１，３−ジアミノ−２−プロパノール１０部に溶解した。約５０℃に予熱された混合物において、ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）１部を添加して、調製物ｂを得た。

調製物ａおよびｂからの組成物
調製物ａ １５部を約５０℃で予熱した。調製物ｂ ７．２５部を添加し、通常の高せん断混合装置でブレンドした。組成物の温度は急速に上昇して、８０℃を超えた。得られた組成物は、例えば細胞外マトリックスの代替物として有用であり、または永久的なもしくは一時的な期間にわたって、生体に移植された異物の表面を被覆するのに有用であった。組成物３は、図３に示す粘弾性レオロジー特性を示す。

［実施例４］
調製物ａ
０．２５Ｍ ＮａＯＨを含む水中において、５重量％のヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を導入し、生成物を室温で１２時間、脱アセチル化した。５０％アセトン溶液中で上述のように製造されたジグリセリンジカーボネートを混合物に添加した。添加量をヒアルロン酸の遊離カルボン酸の量として算出した。２０から７５℃の間の温度で１〜１２時間後、反応媒体を１Ｍ ＨＣｌ水溶液で中和し、ＣＯ_２が消耗された。組成物に、５０％アセトン中のジグリセリンジカーボネートを、２０から７５℃までの間の温度における以前の量と同量添加した。混合物を１０分〜１０時間撹拌し、真空下で濃縮して、化学修飾されたグリコサミノグリカンを得た。

調製物ｂ
酢酸エチル中において、１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン５重量％および環式ジグリセリンジカーボネート６重量％を添加した。反応媒体を５０℃から沸点の間で２〜１５時間加熱して、アミン官能基を末端基とする対応するポリヒドロキシウレタンを得た。酢酸エチルを減圧蒸留により除去し、ポリヒドロキシウレタンを、例えば限定されるものではないが、水などの許容される溶媒に再溶解した。ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）１％をポリヒドロキシウレタンのプレポリマーに添加した。

ａとｂのブレンド
調製物ａおよびｂを、環式カーボネート官能基が、確実にアミン官能基と等しくなるようにまたはアミン官能基を若干超えるようにする割合で混合した。得られた組成物は透明な固体生成物であった。

［実施例５］
調製物ｂ
ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）１０ｇを１，４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン４００ｍｌに添加した。混合物を、室温で溶解するまで撹拌した。さらに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１７．５ｇおよびカルボジイミド（ＥＤＣ）２６．７５ｇを少量ずつ添加し、室温で１２時間撹拌して、タンパク質をアミド化した。

アミド化されたタンパク質を反応混合物から、その２倍の体積のｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）を用いて沈殿させた。

ＴＢＭＥ相からの湿った沈殿物９０ｍｌをその６倍の体積の無水ＥｔＯＨ／酢酸４％で中和した。中和された有機溶液中で再溶解したアミド化コラーゲンを、その２．５倍の体積の酢酸エチルで沈殿させ、遠心し、真空乾燥した。

実施例４の調製物ａと、調製物ｂとのブレンド
実施例４の調製物ａと、ｂを、環式カーボネート官能基が、確実にアミン官能基と等しくなるようにまたはアミン官能基を若干超えるようにする割合で混合した。得られた組成物は透明な粘弾性生成物であった。

［実施例６］
調製物ｂ
修飾されているタンパク質である実施例５の調製物ｂ（「タンパク質のブレンド」）１０部、アミン官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンプレポリマーおよびコラーゲンである実施例４の調製物ｂ ５部、および実施例３の調製物ｂ ３５部を使用した。このプレブレンドは、アミン官能基を含む組成物であった。

調製物ａ
修飾されているグリコサミノグリカンである実施例４の調製物ａ（「ＧＡＧブレンド」）２０部に、４５から６５℃の間の温度で、実施例１に記述のように製造されたトリグリセリンのビス（環式カーボネート）１５部を添加し、溶解した。これによって、環式カーボネート官能基を有する組成物が得られた。

ａとｂのブレンド
それら２つのプレブレンドを混合すると、ポリヒドロキシウレタンと、修飾されているグリコサミノグリカンと、タンパク質と、修飾されているタンパク質とを含む組成物が得られ、弾性の白色半固体発泡体を生じた。

［実施例７］
調製物ａ
実施例４の調製物ａ

調製物ｂ
牛肉アキレス腱由来の不溶性Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）０．７部を１，３−ジアミノ−２−プロパノール７部、３，６−ジオキサオクタメチレンジアミン（ＪＥＦＦＡＭＩＮ ＥＤＲ １４８、Ｈｕｎｔｓｍａｎ社）４．９部、およびヘキサメチレンジアミン２．１部を溶解した。約４０℃に予熱された混合物に、ブタ起源の化学的に加水分解ＩＩ型コラーゲン（Ｍｅｉｔｅｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｑｉｎｑｄａｏ Ｃｏ．Ｌｔｄ社）２．１部を添加して、調製物ｂを得た。

ポリヒドロキシウレタンのモノマー中におけるコラーゲンのこの調製物ｂ １０部に、実施例４の調製物ｂにおいて製造された、アミン官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのプレポリマー５部を添加した。

ａとｂのブレンド
そうしたアミン官能基を含む調製物ｂ １５部に、実施例４の調製物ａ ２０部を添加し、混合して、ポリヒドロキシウレタンと、化学修飾されているグリコサミノグリカンと、タンパク質を有する３７℃で透明なヒドロゲルを得た。

Claims (24)

1. 第１、第２および第３の構成要素を含む組成物であって、
   − 前記第１の構成要素は、化学修飾されているもしくはされていない、グリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミン、または化学修飾されているもしくはされていない、異なるグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミンのブレンドであり、
   − 前記第２の構成要素は、タンパク質、ペプチドまたは異なるタンパク質もしくはペプチドのブレンドであり、
   − 前記第３の構成要素は、ビスまたはポリ環式カーボネート（ＣＣ）分子とジまたはポリアミン（ＰＡ）分子とを共有結合させてなるポリヒドロキシウレタン（ＰＨＵ）である
   前記組成物。
2. 前記タンパク質は、加水分解、化学修飾、フィブリル化されているまたはされていない、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチドまたはそれらのタンパク質もしくはペプチドのブレンドである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物は、２つの調製物ａおよびｂの構成要素間の重合または共有結合形成によって得られ、
   − 該調製物ａは、少なくとも１％のグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミン、または環式ポリカーボネートでもしくは環式カーボネート官能基を末端基とするポリヒドロキシウレタンのプレポリマー（ＰＲＥ−ＣＣ）で化学修飾されているグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミン、またはそれらの異なる構成要素のブレンドを、許容される溶媒を含みかつ調製物ａが確実に環式カーボネート官能基を含むようにＰＨＵのＣＣモノマーもしくはＰＲＥ−ＣＣまたはＰＲＥ−ＣＣとＣＣのブレンドを場合により含むブレンド中に有し、
   − 該調製物ｂは、少なくとも１％の、加水分解、フィブリル化されているもしくはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチド、またはＰＡでもしくはアミン官能基を末端基とするポリヒドロキ
   シウレタンのプレポリマー（ＰＲＥ−ＰＡ）で化学修飾されている、加水分解、フィブリル化されているもしくはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチド、またはそれらの構成要素のブレンドを、許容される溶媒を含みかつ調製物ｂが確実にポリアミン由来のアミン官能基を含むようにＰＨＵのＰＡモノマーもしくはＰＲＥ−ＰＡまたはＰＲＥ−ＰＡとＰＡのブレンドを場合により含むブレンド中に有する、
   請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記組成物は、２つの調製物ａおよびｂの構成要素間の重合または共有結合形成によって得られ、
   − 該調製物ａは、少なくとも１％のグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミン、またはＣＣでもしくはＰＲＥ−ＣＣで化学修飾されているグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミン、またはそれらの異なる構成要素のブレンド、およびＣＣ官能基を末端基とする、加水分解、フィブリル化されているまたはされていない、化学修飾されているコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチド、またはそれらの構成要素のブレンドを、許容される溶媒を含みかつ調製物ａが確実にＣＣ官能基を含むようにＰＨＵのＣＣモノマーもしくはＰＲＥ−ＣＣまたはＰＲＥ−ＣＣとＣＣのブレンドを場合により含むブレンド中に有し、
   − 該調製物ｂは、ＰＨＵのＰＡモノマーもしくはＰＲＥ−ＰＡ、またはＰＲＥ−ＰＡとＰＡのブレンドを、場合により、調製物ｂが確実にポリアミン由来のアミン官能基を含むように許容される溶媒中に含む、
   請求項１または２に記載の組成物。
5. 前記組成物は、２つの調製物ａおよびｂの構成要素間の重合または共有結合形成によって得られ、
   − 該調製物ａは、ＰＨＵのＣＣモノマーもしくはＰＨＵのＰＲＥ−ＣＣ、またはＰＲＥ−ＣＣとＣＣのブレンドを、場合により、調製物ａが確実にＣＣ官能基を含むように許容される溶媒中に含み、
   − 該調製物ｂは、アミン官能基を末端基とする、化学修飾されている、グリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミンまたはそれらの構成要素のブレンド、および少なくとも１％の加水分解、フィブリル化されているもしくはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチド、またはＰＡでもしくはＰＲＥ−ＰＡで化学修飾されている、加水分解、フィブリル化されているもしくはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチド、またはそれらの構成要素のブレンドを、許容される溶媒を含みかつ調製物ｂが確実にＰＡ由来のアミン官能基を含むようにＰＨＵのＰＡモノマーもしくはＰＲＥ−ＰＡまたはＰＲＥ−ＰＡとＰＡのブレンドを場合により含むブレンド中に含む、
   請求項１または２に記載の組成物。
6. ＣＣモノマーは、少なくとも３つの第一級または第二級の非芳香族ヒドロキシル官能基を含むポリヒドロキシル化分子から得られた５〜８個の原子を有する環の環式ポリカーボネートであり、ＰＡモノマーは第一級または第二級のＰＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. ＰＲＥ−ＣＣは、ＣＣモノマーを末端基とする、１〜２００，０００個、好ましくは１〜２０，０００個のＣＣおよびＰＡモノマーのＰＨＵであり、ＰＲＥ−ＰＡは、ＰＡモノマーを末端基とする、１〜２００，０００個、好ましくは１〜２０，０００個のＣＣおよびＰＡモノマーのＰＨＵである、請求項５に記載の組成物。
8. グリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミン、または異なるグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミンのブレンドの化学修飾は、エステル化、または脱アセチル化とその後に続くエステル化およびＣＣまたはＰＲＥ−ＣＣによるカルバメート化、または脱アセチル化とその後に続くＣＣまたはＰＲＥ−ＣＣによるカルバメート化である、請求項１、３または４のいずれか１項に記載の組成物。
9. 第１の構成要素は、モノマーＰＡもしくはＰＲＥ−ＰＡまたは両方の組合せを用いたアミド化により化学修飾されている、請求項１または５に記載の組成物。
10. 第１の構成要素は化学修飾され、モノマーＰＡまたはＰＲＥ−ＰＡでカルバメート化されている、請求項１、３、４または８のいずれか１項に記載の組成物。
11. さらにＣＣおよびＰＡで逐次カルバメート化して、グリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミン、または異なるグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミンのブレンド上に化学的にグラフトしたＣＣまたはＰＡを末端基とするＰＨＵを得る、請求項１、３〜５または８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. ＣＣモノマーは、エリスリトール、キシリトール、アラビトール、リビトール、ソルビトール、ズルシトール、マンニトール、マルチトール、イソマルチトール、ラクチトール、またはポリエーテルポリオールの環式ポリカーボネートおよびそれらの混合物である、請求項１、３〜８または１０もしくは１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. ＣＣモノマーは、（１，２−ジヒドロキシエチル）、または（２，３−ジヒドロキシプロピル）エーテル、エステル、ケトン、アミド、ホスフェート、スルフェート、スルフィド、ジスルフィド、アルカン、シクロアルカン、アルケン、シクロアルケン、アリール、または１つもしくはそれ以上の酸素原子を含むヘテロ環、または１つもしくはそれ以上の窒素もしくは硫黄原子を含む芳香族ヘテロ環の環式ポリカーボネートである、請求項１、３〜８または１０もしくは１１のいずれか１項に記載の組成物。
14. 環式ポリカーボネートモノマー（ＣＣ）は請求項１２または１３に記載の環式ポリカーボネートの混合物である、請求項１、３〜８または１０もしくは１１のいずれか１項に記載の組成物。
15. 第１の構成要素は、以下の物質のリスト：
    − コンドロイチン硫酸；
    − ヒアルロン酸；
    − ヘパラン硫酸；
    − デルマタン硫酸；
    − ケラタン硫酸；
    − アグリカン
    から選択された、化学修飾されているもしくはされていない、グリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミン、または化学修飾されているもしくはされていない、異なるグリコサミノグリカン、加水分解グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンのグリコサミンのブレンドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 加水分解、フィブリル化されているまたはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラ
    チン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチドまたはそれらのタンパク質もしくはペプチドのブレンドの化学修飾は、ＰＡもしくはＰＲＥ−ＰＡまたはＰＡとＰＲＥ−ＰＡのブレンドを用いたアミド化またはＰＡおよびＰＲＥ−ＰＡを用いた逐次アミド化である、請求項２または３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 加水分解、フィブリル化されているまたはされていない、化学修飾されているコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチドまたはそれらのタンパク質もしくはペプチドのブレンドは、ＣＣモノマーまたはプレポリマーＰＲＥ−ＣＣでカルバメート化されている、請求項２または３〜５または１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. さらにＰＡおよびＣＣで逐次カルバメート化して、加水分解、フィブリル化されているまたはされていないコラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、アクチン、ミオシン、ラミニン、ペプチドまたはそれらのタンパク質もしくはペプチドのブレンド上に化学的にグラフト化したＰＡまたはＣＣを末端基とするＰＨＵを得る、請求項２または３〜５、１６または１７のいずれか１項に記載の組成物。
19. 第一級および第二級のＰＡモノマーは、ヒドロキシル官能基で置換されているまたはされていない、エーテル、エステル、ケトン、アミド、ホスフェート、スルフェート、スルフィド、ジスルフィド、アルカン、シクロアルカン、アルケン、シクロアルケン、アリールの第一級もしくは第二級ポリアミン；またはヒドロキシル官能基で置換されているもしくはされていない、１つもしくはそれ以上の酸素、窒素もしくは硫黄原子を含むヘテロ環の第一級もしくは第二級ポリアミンおよび第一級もしくは第二級ポリアルキルアミン；またはエチレングリコールおよびプロピレングリコールの単一もしくは混成ポリエーテルアミン；またはそれらの化合物の混合物である、請求項１〜１１または１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. ＣＣモノマー、ＰＲＥ−ＣＣおよび化学修飾されている第１および第２の構成要素に由来する重合していないまたは共有結合しているカーボネート環式官能基の数とＰＡモノマー、ＰＲＥ−ＰＡおよび化学修飾されている第１および第２の構成要素に由来する重合していないまたは共有結合している第一級および第二級アミン官能基の数の比は５０から０．０２の間である、請求項１および３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
21. Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｚｎ、ＢおよびＡｌのイオン型もしくは共有結合型または赤外線フォトニック供給源から選択された触媒または触媒のブレンドを使用して、環式カーボネートと第一級または第二級アミン官能基の間の重合または共有結合形成を制御する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 結合、上皮、神経、筋、骨、軟骨、または皮膚、動物またはヒト細胞外マトリックスの置換または再構築のための請求項１または３から１４または１６〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、ＣＣモノマー、ＰＲＥ−ＣＣおよび化学修飾されている第１および第２の構成要素に由来する重合していないまたは共有結合しているカーボネート環式官能基の数とＰＡモノマー、ＰＲＥ−ＰＡおよび化学修飾されている第１および第２の構成要素に由来する重合していないまたは共有結合している第一級および第二級アミン官能基の数の比は２から０．５の間である、前記組成物。
23. 永久的なまたは一時的な期間にわたって、生体に移植された異物の表面を被覆するための請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
24. 生細胞、生物学的および薬理学的な材料および物質の担体、改質剤または保護剤として
    の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。

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