CN111249532A - 一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种医用材料,具体涉及软骨损伤再生领域,主要公开了一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法。本发明所述透明质酸水凝胶产品主要针对软骨缺损形状不规则和既往再生软骨与宿主软骨结合不良的病例,可注射、可在液体环境下自成胶、且粘附性好,实现了软骨缺损部位与填充材料之间的无缝结合。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用材料,具体涉及软骨损伤再生领域,主要公开了一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法。
背景技术
由创伤或骨病所致关节部位骨软骨缺损在临床较常见,且严重影响患者生活质量,已成为目前肢体残障的主要原因之一。膝部疾病可发生在各个年龄层的人群。膝部软骨缺损可由创伤、扭伤、过度使用膝部、肌肉无力或一般磨损导致。由于关节软骨特殊的组织结构及生物学特性,虽然已知有许多治疗关节软骨缺损的方法,包括但不限于:软骨下骨钻孔,电刺激,激光,药物及细胞注射,基因治疗等等,但是上述方法都达不到满意的修复效果。
近年来,关节软骨损伤再生领域也有很多研究进展,如软骨细胞表型退化与维持、干细胞募集和分化、免疫调控、生物活性材料等,临床上也进行了诸多尝试,但总体效果仍难令人满意。
快速发展的组织工程技术,为软骨的再生修复提供了新策略。组织工程中,组织细胞依附于由生物材料所制备的支架上,植入体内的病损部位,使之最终达到修复重建组织或器官、恢复功能目的。随着细胞增殖,支架材料不断降解,被细胞外基质代替,逐渐形成具有正常功能的组织。
在目前的研究中,用于修复关节软骨的支架材料主要有透明质酸(Hyaluronate,HA),聚乳酸(polylactic,PLA),聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic),PLGA),胶原(collagen),壳聚糖(chitosan)等,或者其中几种材料的复合亦常见。
前述天然活性生物材料中,以胶原、透明质酸等天然软骨成分为代表,可通过纯化工艺提升生物相容性,且保持活性。人工合成材料生物相容性好,便于精确控制和原位成型,但通常来说缺乏生物活性,需加入活性分子。
软骨活性因子的时空调控对软骨功能性再生起到重要作用。目前研究中广泛使用的转化生长因子(TGF-β)和骨形态蛋白(BMP-2)等软骨诱导剂只是启动了干细胞的软骨内成骨分化,不足以诱导出成熟软骨表型,且常有并发症。申请人团队之前通过结构简单的亲和性多肽在体内募集TGF-β来再生软骨也是一种有效策略。小分子化合物虽然显示了明确的干细胞软骨诱导能力,如kartogenin等,但临床尚不能使用。
转化生长因子β家族对细胞的生长、分化和免疫功能及组织修复等方面起重要调节功能,尤其是对间充质来源的细胞起刺激作用,对于软骨损伤修复具有重要作用。一般来说,外源性注射转化生长因子β1存在很多缺点,如成本高、半衰期短等,因此有效利用内源性转化生长因子β1会显著提高安全性,有很高的利用价值。HSNGLP多肽,即组氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-亮氨酸-脯氨酸-亮氨酸多肽是在海洋生物中发现的,其能够吸附转化生长因子β1,原因是其表面有很多转化生长因子β1结合表位,可与转化生长因子β1紧密结合,并保持转化生长因子β的生物活性。
因此,为了能够同时解决目前软骨修复实践中的不足,即生物材料诱导性低、免疫排斥风险高、有效性低和治疗费用高的问题,除了考虑支架仿生材料的选择和制备工艺,也必须考虑对其分子量、交联度、固化性能、降解性能、力学性能等的设计和改进。
发明内容
本发明研究生物医用材料学、细胞生物学、关节外科学等交叉学科,公开了一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶及其制备方法。目的在于创建全新的透明质酸功能性修复材料,通过采用天然易降解的透明质酸开发可注射原位成胶支架产品,解决软骨缺损形状不规则的关键难题;进一步的,针对自身修复能力低的软骨缺损形状不规则的病例,开发TGF-β亲和性多肽增强水凝胶,亲和性多肽的引入可以提高支架对TGF-β的特异性亲和能力,在体内自募集TGF-β,从而提高修复效果。
具体来说,在工艺上通过对透明质酸接枝醛基和氨基改性,达到体内液体条件下原位自成胶;通过化学接枝TGF-β亲和性多肽到透明质酸凝胶,增强其生物活性和体内成软骨能力。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶,所述可注射透明质酸水凝胶包括将透明质酸原液分别改性的组分A和组分B,所述组分A为通过氧化剂经开环改性的透明质酸,所述组分B为通过联氨或二酰肼经氨基改性的透明质酸;所述组分A和组分B注射前储存在并联的容器内,注射后混合成胶;且注射后,所述组分A和组分B通过席夫碱反应,经3-5分钟在软骨缺损表面原位形成透明质酸水凝胶。
所述氧化剂为高碘酸盐、高锰酸盐或氯酸盐;所述二酰肼为己二酸二酰肼。
所述组分A和组分B的体积比为2:1。
所述透明质酸原液经过TGF-β亲和性多肽接枝改性,所述多肽为HSNGLPL。
进一步的,一种可注射透明质酸水凝胶的制备方法,包含以下步骤:
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为0.1%~3%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2向步骤1得到的透明质酸原液中加入氧化剂,所述氧化剂为高碘酸盐、高锰酸盐或氯酸盐,二者摩尔比为10:1~1:10,将体系置于暗处反应0.5~6小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:1~1:10,搅拌0.5小时,加入过量联氨或者二酰肼,所述二酰肼为己二酸二酰肼,反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤4将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
进一步的,在所述步骤1和步骤2之间,将步骤1得到的透明质酸原液加入等质量比的甲基丙烯酸酐,维持体系pH在8~8.5,4℃下反应12小时,得到具备甲基丙烯酸修饰的透明质酸;随后将透明质酸体系调控pH至酸性(6.0左右),向溶液中加入交联剂EDC/NHS,搅拌0.5小时,加入TGF-β亲和性多肽HSNGLPL,反应3h,透析纯化,冷冻干燥,从而得到接枝TGF-β亲和性多肽的透明质酸。
进一步的,所述可注射透明质酸水凝胶在制备软骨修复装置方面的应用。
更进一步的,所述的可注射透明质酸水凝胶的软骨修复装置,包括并联的两支针筒。
在本阶段,材料理化表征和安全性评价:
1)化学性能检测
a)羟基磷灰石的纯度按GB 23101.3测定;
b)胶原的总蛋白含量按凯氏定氮法测定;
c)胶原的羟脯氨酸含量按羟脯氨酸测定法测定;
d)重金属含量按《中国药典2015版第四部》中“0821-重金属检测法”测定;
e)pH值按GB9724测试
f)透明质酸钠的要求按YY/T 0606.9-2007.5测定;
g)葡萄糖醛含量按照YY/T 0606.9-2007附录A测定;
2)物理性能检测
a)尺寸用精度为0.02毫米的游标卡尺测量,颗粒参照GB/T1480测定;
b)压缩强度按GB/T1964检测;
c)气孔率、密度及容重按GB/T1966检测;
d)孔径按GB/T1967电镜扫描法检测。
3)生物安全性评价
a)遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验按GB/T16886.3检验;
b)与血液相互作用试验按GB/T16886.4检验;
c)体外细胞毒性试验按GB/T16886.5检验;
d)植入后局部反应试验按GB/T16886.6检验;
e)降解产物的定性与定量试验按GB/T16886.9和GB/T16886.13检验;
f)刺激与致敏试验按GB/T16886.10检验;
g)全身急性、亚急性、亚慢性和慢性毒性试验按GB/T16886.11检验;
h)降解产物的毒代动力学试验按GB/T16886.16检验;
i)热原反应试验按YY/T 1500-2016检验;
j)无菌试验按GB/T 19973.2检验;
k)细菌内毒素试验按YY/T 1295-2015检验。
(2)材料的有效性评价:
1)体外有效性评价
a)细胞增殖:取材料或材料浸提液,接种骨髓间充质干细胞/软骨细胞(原代分离培养细胞),接种后不同时间点以CCK-8试剂盒测定细胞数量,绘制细胞增殖曲线。同时设PBS处理组为空白对照,未处理组为阴性对照,用SPSS软件统计分析实验结果。对于具有明显增殖活性的材料,利用BrdU标记进一步确证其促增殖活性。
b)细胞趋化:用材料包被孔板底部,加入1×105个骨髓间充质干细胞/软骨细胞。
待细胞长满,用10μL的枪头沿皿底做一个轻微划痕划线,并用PBS清洗干净划痕处的细胞,做好标记,用无血清培养基培养细胞,每隔12h观察并采集图片,统计细胞迁移数量。
c)细胞分化:①qRT-PCR实验:将材料等份放入6孔板,每块材料上接种1×105个骨髓间充质干细胞/,接种后不同时间点移除培养基,加入Trizol试剂,将溶液转移至无RNA酶离心管中,提取RNA,反转录成cDNA。以GAPDH基因为内参,通过qRT-PCR检测干性基因和软骨标志基因在不同时间点mRNA的相对表达水平。②蛋白印迹实验:将多孔材料等份放入6孔板,每块材料上接种1×105个骨髓间充质干细胞,接种后不同时间点消化并收集细胞,加裂解液提细胞总蛋白。用BCA试剂盒对总蛋白定量,确定上样体积,然后电泳、转膜、抗原-抗体反应、显色、测定内参GAPDH及细胞特异性蛋白的条带灰度值,分析细胞特异性蛋白在不同时间点的相对表达水平。
2)体内(动物)实验有效性研究(组织学、影像学、生物力学)
以小型猪作为动物模型,小型猪双侧膝关节均进行制作模型,在小型猪膝关节股骨负重部位,使用软骨打孔装置制作膝关节直径为16毫米的全层软骨缺损,同样使用凝胶填充软骨缺损处,逐层缝合手术切口,允许实验动物在笼内自由活动。于术后3个月、6个月和12个月,抽取实验动物外周血进行生化指标检测;对实验动物膝关节进行核磁共振扫描检测软骨缺损填充情况,修复组织与宿主组织的结合以及修复软骨与软骨下骨的结合情况;处死实验动物取股骨标本,使用微纳米综合力学测试系统分别对软骨缺损区域以及正常软骨区域的正向垂直载荷量、剪切模量、弹性模量、摩擦系数、修复组织边界状态进行分析,以检测修复组织的生物力学特性;使用Micro CT检测软骨下骨重塑情况;并进行组织学切片进行HE染色,甲苯胺蓝染色,番红O染色,采用ICRS组织学评分系统评价修复情况,将切片进行I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、X型胶原蛋白、osteocalcin、Lubricin免疫组织化学染色,使用凋亡检测试剂盒来观察新生组织的退变;获取实验动物肝、肾、脑、心脏等重要器官检测材料降解产物残留。
本发明显示出符合设计目的和要求的理化性能和生物相容性,其体外细胞存活率大于对照的80%,体内研究未见周围组织坏死、明显炎症反应、感染,三月有效促进软骨再生,维持到12月,软骨没有蜕变。
通过关节镜和开放手术在小型猪关节软骨缺损植入材料,术后3个月实现诱导关节软骨形成并维持其表型,术后6个月和一年再生软骨在负重和力学刺激下无退变。
软骨缺损填充达到95%以上,修复组织均为透明软骨组织;修复软骨组织能承载6倍于体重的压力,动力摩擦系数小于0.005,伸展强度达到5-25Mpa;修复组织与宿主组织无缝连接,促进修复组织中软骨层与软骨下骨层无缝连接,现实了软骨下骨再生以及新生软骨与软骨下骨的结合。
本发明上述软骨再生支架材料和技术,其费用预计是目前“细胞”支架市场价的三分之一,临床推广将极大地减少患者病痛,减少手术次数,有显著的社会和经济效益。
综上,本发明的有益效果是:通过优化透明质酸的分子量、交联度,调控材料固化、降解性、组织粘附性及力学性能。通过对透明质酸进行改性,在体内快速充填不规则软骨缺损,并原位固化,满足关节镜手术需求。进一步的,在透明质酸凝胶中接枝TGF-β亲和性多肽,基于体内外生物学效果优化接枝浓度、效率。实现软骨缺损部位与填充材料之间的无缝结合,满足修复能力弱的病人的治疗需求。
附图说明
图1是本发明所述水凝胶结构示意图。
具体实施方式
实施例1
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为0.1%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2向步骤1得到的透明质酸原液中加入高碘酸盐,二者摩尔比为10:1,将体系置于暗处反应0.5小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:1,搅拌0.5小时,加入过量联氨反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤4将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
实施例2
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为3%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2向步骤1得到的透明质酸原液中加入高锰酸盐,二者摩尔比为1:10,将体系置于暗处反应6小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:10,搅拌0.5小时,加入过量己二酸二酰肼,反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤4将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
实施例3
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为0.1%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2在步骤1得到的透明质酸原液加入等质量比的甲基丙烯酸酐,维持体系pH在8,4℃下反应12小时,得到具备甲基丙烯酸修饰的透明质酸;随后将透明质酸体系调控pH至6.0,向溶液中加入交联剂EDC/NHS,搅拌0.5小时,加入TGF-β亲和性多肽HSNGLPL,反应3h,透析纯化,冷冻干燥,从而得到接枝TGF-β亲和性多肽的透明质酸。
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入氯酸盐,二者摩尔比为10:1,将体系置于暗处反应0.5小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤4向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:1,搅拌0.5小时,加入过量联氨反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤5将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
实施例4
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为3%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2在步骤1得到的透明质酸原液加入等质量比的甲基丙烯酸酐,维持体系pH在8.5,4℃下反应12小时,得到具备甲基丙烯酸修饰的透明质酸;随后将透明质酸体系调控pH至6.5,向溶液中加入交联剂EDC/NHS,搅拌0.5小时,加入TGF-β亲和性多肽HSNGLPL,反应3h,透析纯化,冷冻干燥,从而得到接枝TGF-β亲和性多肽的透明质酸。
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入高碘酸盐,二者摩尔比为1:10,将体系置于暗处反应6小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤4向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:10,搅拌0.5小时,加入过量己二酸二酰肼,反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤5将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
上述参照具体实施方式对该一种可注射透明质酸水凝胶及其制备方法与应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于软骨修复的可注射透明质酸水凝胶,其特征在于,所述可注射水凝胶包括将透明质酸原液分别改性的组分A和组分B,所述组分A为通过氧化剂经开环改性的透明质酸,所述组分B为通过联氨或二酰肼经氨基改性的透明质酸;所述组分A和组分B注射前储存在并联的容器内,注射后混合成胶;且注射后,所述组分A和组分B通过席夫碱反应,经3-5分钟在软骨缺损表面原位形成透明质酸水凝胶。
2.一种权利要求1所述的可注射透明质酸水凝胶,其特征在于,所述氧化剂为高碘酸盐、高锰酸盐或氯酸盐;所述二酰肼为己二酸二酰肼。
3.一种权利要求1所述的可注射透明质酸水凝胶,其特征在于,所述组分A和组分B的体积比为2:1。
4.一种权利要求1-3所述的可注射透明质酸水凝胶,其特征在于,所述透明质酸原液经过TGF-β亲和性多肽接枝改性,所述多肽为HSNGLPL。
5.一种权利要求1-3所述的可注射透明质酸水凝胶的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
步骤1将透明质酸钠于室温溶于水中,形成质量分数为0.1%~3%的透明溶液,加入阳离子交换树脂搅拌过夜,过滤得到透明质酸原液;
步骤2向步骤1得到的透明质酸原液中加入氧化剂,所述氧化剂为高碘酸盐、高锰酸盐或氯酸盐,二者摩尔比为10:1~1:10,将体系置于暗处反应0.5~6小时;加入乙二醇除去多余的氧化剂,继续搅拌1小时后终止反应,产物透析纯化,冷冻干燥得到开环的透明质酸;
步骤3向步骤1得到的透明质酸原液中加入交联剂EDC/NHS,摩尔比1:1~1:10,搅拌0.5小时,加入过量联氨或者二酰肼,所述二酰肼为己二酸二酰肼,反应24h;透析纯化,冷冻干燥得到接枝酰肼的透明质酸;
步骤4将上述两种改性透明质酸分别溶解在PBS溶液,按照体积比2:1分别储存在并联的两支针筒内,并采取无菌包装。
6.一种权利要求5所述的可注射透明质酸水凝胶的制备方法,其特征在于:在所述步骤1和步骤2之间,将步骤1得到的透明质酸原液加入等质量比的甲基丙烯酸酐,维持体系pH在8~8.5,4℃下反应12小时,得到具备甲基丙烯酸修饰的透明质酸;随后将透明质酸体系调控pH至酸性,向溶液中加入交联剂EDC/NHS,搅拌0.5小时,加入TGF-β亲和性多肽HSNGLPL,反应3h,透析纯化,冷冻干燥,从而得到接枝TGF-β亲和性多肽的透明质酸。
7.一种权利要求1-4所述的可注射透明质酸水凝胶在制备软骨修复装置方面的应用。
8.一种包括权利要求1-4所述的可注射透明质酸水凝胶的软骨修复装置,所述装置包括并联的两支针筒。
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