CN101934092A

CN101934092A - 用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及使用方法

Info

Publication number: CN101934092A
Application number: CN2010102642921A
Authority: CN
Inventors: 王富友; 杨柳; 张颖; 段小军; 戴刚; 宁志刚; 崔运利
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2011-01-05

Abstract

本发明公开了一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及其使用方法，选取与正常关节软骨细胞外基质主要成分相同的材料作为原料，通过溶解及pH调节，制得低温条件下为溶胶态、体温为凝胶态的注射型软骨仿生基质材料；以其为载体于低温条件下与种子细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使注入材料相变为凝胶，从而将种子细胞固定于缺损发挥再生修复作用，该方法简单易行，产品使用方便、手术损伤小、缺损部位修复效果好；原料具有良好的生物相容性和安全性，各组份可在本发明制备条件下发生分子间键合，解决单一仿生材料降解过快问题；种子细胞直接与材料混合，无需体外培养，缩短了种子细胞在体外滞留时间，临床应用更安全。

Description

用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及使用方法

技术领域

本发明涉及再生医学技术领域，特别涉及一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及使用方法。

背景技术

由创伤或骨病所致关节部位软骨缺损临床常见，现有治疗措施均存在明显缺陷，快速发展的组织工程学技术为其再生修复提供了新技术。1984年瑞典医学家Peterson等首次报道在兔关节软骨缺损模型中，用可吸收缝合线将自体骨膜缝合于软骨缺损周缘，然后将自体软骨细胞悬液注入缺损中，术后16周检测证实关节软骨缺损被透明软骨修复。1987年瑞典歌德堡医疗中心Brittberg等报道采用该技术成功治疗人关节软骨缺损，这为随后深入开展的软骨组织工程推广应用创造了有利条件。1995年美国Genzyme公司改良该技术用于制备较原始的软骨组织工程产品，并注册为

产品，1997年通过美国FDA批准后逐渐在临床推广应用，2000年瑞典Sahlgrenska医院Peterson等报告了101例膝关节软骨缺损的患者接受ACT技术的治疗情况，其中94例经过2～9年随访，临床有效率达87.5％。至今已有上万名患者受益于该技术。该技术的基本过程为，在关节镜下采集患者关节非负重区少量软骨(约黄豆大小)，进行软骨细胞分离、培养及增殖，然后将软骨细胞种植在生物膜(I/III胶原膜)上构建组织工程软骨，这个过程约一月。

在组织工程中，支架材料起到细胞外基质的作用，有利于细胞的黏附、增殖乃至分化，为植入细胞新陈代谢提供适宜的生产微环境，因此支架材料一直是组织工程组织研究的重点内容。针对组织工程软骨的支架材料，目前主要有两种策略，即可注射型支架和三维多孔支架。可注射型支架一般是将细胞与流动性和生物相容性好的材料复合，然后直接注射到软骨缺损部位，注入的材料原位形成一种具有一定形状、机械强度的支架，体液可在支架内交换并为支架内的细胞提供生长所需要的营养，进而细胞进行生长、分化和增殖并形成组织。相对于三维多孔支架而言，可注射型支架因注射植入，手术难度低，创面小，是目前组织工程支架研究的重要方向之一。

近年来，水凝胶作为可注射支架材料广泛用于软骨组织工程，它即可以直接植入体内作为软骨组织的替代材料，也可以在水凝胶凝胶化之前与细胞悬液混合以形成水凝胶与细胞的复合体，此类复合体或者在体外进行软骨细胞的三维立体培养，或者注入体内软骨缺损处，并通过条件改变在体内原位交联，进而修复受损的软骨组织。水凝胶类可注射支架主要包括温敏型和交联型。交联型水凝胶需要添加交联剂或者引发剂，然后通过适当条件使分子链之间交联，形成水凝胶。交联型水凝胶的凝胶化时间可通过加入物质的量来调节，其强度相对较高，但引发剂及交联剂具有的生物毒性会对细胞成活及生长造成不利影响。温敏型水凝胶无需添加任何助剂，植入后生物相容性及安全性更高。

温敏型水凝胶具体又分为升温型水凝胶(如聚氧化乙烯水凝胶)和降温型水凝胶(如琼脂凝胶)，而升温型水凝胶因凝胶过程为从低温到高温，操作易控，更适宜用于可注射软骨支架的制备。升温型水凝胶中，合成水凝胶相对于天然水凝胶具备性能稳定、强度高和易操作的优点，但生物相容性较低，细胞粘附效果差。合成温敏型水凝胶及天然水凝胶改性获得温敏型水凝胶均为现今研究的热点。例如王东武、杨柳等向壳聚糖酸性溶液中加入甘油磷酸钠得到软骨组织工程用可注射温固化支架，用于修复兔膝关节面缺损，12周后可见较好的修复效果。李石保、杨维东等采用丙二醇及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯三嵌段共聚物制得合成温固化水凝胶，注射入裸鼠背部皮下组织后12周可见有大量成熟的软骨组织。

研究表明，正常关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，两者协调配合，保证了关节软骨的正常生理功能。软骨细胞占整个组织体积的5％，主要功能为分泌胞外基质，保持基质的更新。细胞外基质70％由水构成，其余由胶原和蛋白多糖组成，主要负责承载软骨细胞，调节细胞的增殖和分化，缓冲关节应力。胶原占软骨干重的60％-80％，其中95％为II型胶原。蛋白多糖聚合物占透明软骨干重的20％-40％，主要包括硫酸软骨素和透明质酸，两者结合形成蛋白多糖聚合物。聚合物中的氨基葡聚糖残基带有负电荷，分子间相互排斥，具有强烈的亲水性，这是软骨基质保持大量水分的重要原因。硫酸软骨素和胶原纤维之间的键连接，避免了基质过度水化，进而防止软骨软化。

综上所述，用三维多孔支架方式构建软骨，接种细胞后需要进行体外培养，且使用不方便，必须事先塑形使之与软骨缺损相匹配且以往研究所用生物材料多为人工合成的高分子材料，与正常的软骨基质成分存在显著的差异，生物相容性和安全性较差。

有必要克服所述缺陷，提供一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，该材料在低温条件下呈溶胶态、具有流动性，近似体温条件下(36-38℃)发生相变呈凝胶状；可作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的自体骨髓间充质干细胞或软骨细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使溶胶发生相变，从而将种子细胞固定于缺损处发挥再生修复作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及其使用方法，该材料在低温条件下(0-4℃)呈溶胶态、具有流动性，近似体温条件下(36-38℃)发生相变呈凝胶状、不具流动性，可作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的自体骨髓间充质干细胞或软骨细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使溶胶发生相变，从而将种子细胞固定于缺损处发挥再生修复作用，具有使用方便、操作简单、手术损伤小、修复作用好等优点。

本发明所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，是通过如下步骤制得：

a.按质量百分比取65～75％的II型胶原蛋白、20～30％的硫酸软骨素和1～5％的透明质酸作为原料；

b.于0～4℃无菌条件下，将步骤a所取原料用浓度为0.01mol/L～0.1mo l/L的冰醋酸或盐酸溶解，得原料质量分数为10％～30％酸性溶液；

c.于0～4℃无菌条件下，将所述酸性溶液用浓度为1mol/L～2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中和至pH为7.0～7.5，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，于0～4℃温度下保存。

进一步，所述原料中各成分的质量百分比为：68～73％的II型胶原蛋白、24～29％的硫酸软骨素和1～3％的透明质酸；

进一步，步骤b中所用冰醋酸或盐酸的浓度为0.03-0.08mol/L，所述酸性溶液中原料的质量分数为12-18％。

使用所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料的方法，包括如下步骤：

1)将分离所得自体或异体的骨髓间充质干细胞或软骨细胞于0-4℃无菌条件下与所述注射型软骨仿生基质材料混合，制得细胞浓度为5×10⁶-5×10⁷个/ml的细胞材料复合物；

2)将所述复合物于0-4℃无菌条件下注入软骨缺损部位，并保持所述部位的温度在36-38℃直至注射入所述部位的复合物相变为凝胶。

本发明的有益效果在于：所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料可作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的干细胞或软骨细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使溶胶-细胞复合物发生相变，从而将种子细胞固定于缺损处发挥再生修复作用，与固态三维支架相比，具有使用方便、操作简单、手术损伤小、修复作用好的优点；原料所用成分均为动物源性仿生生物材料，具有良好的生物相容性和安全性；各种仿生材料以不同比例进行混合，并在本发明提供的制备条件下发生分子之间的键合，解决单一仿生材料降解过快问题；将种子细胞可以直接与材料混合后，无需体外培养，即可注入软骨缺损，缩短了种子细胞在体外滞留时间，提高了临床应用的安全性。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。

附图说明

图1为实施例5所得产品用于修复猪膝关节股骨内髁软骨缺损16周后标本；

图2为对照组标本；

图3为图1标本石蜡包埋切片的组织显微观察照片；

图4为图2标本石蜡包埋切片的组织显微观察照片。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实验材料：

II型胶原蛋白、硫酸软骨素和透明质酸均购自美国sigma公司。

实施例1

本实施例的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料通过如下步骤制得：

a.按质量百分比取70％的II型胶原蛋白、28％的硫酸软骨素和2％的透明质酸作为原料；

b.于0℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.05mol/L的冰醋酸溶解，得到原料质量分数为10％酸性溶液；当然，本步骤中酸性溶液的原料质量分数可在10％～30％范围之内；

c.于0℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液滴定中和至pH为7.0后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料；此处所用氢氧化钠也可采用氢氧化钾替代，氢氧化钠或氢氧化钾的浓度在1mol/L～2mol/L均可；

步骤b和步骤c均于0-4℃条件下操作，利于溶液保持溶胶状态。

所得用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料于0-4℃条件下密封保存备用。

实施例2

a.按质量百分比取75％的II型胶原蛋白、24％的硫酸软骨素和1％的透明质酸作为原料；

b.于4℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.1mol/L的盐酸溶解，得到原料质量分数为15％酸性溶液；

c.于4℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为1mol/L的氢氧化钾水溶液滴定中和至pH为7.5后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料。

所得用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料于低温(0-4℃)条件下密封保存备用。

实施例3

本实施例的的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料通过如下步骤制得：

a.按质量百分比取65％的II型胶原蛋白、30％的硫酸软骨素和5％的透明质酸作为原料；

b.于0℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.01mol/L的盐酸溶解，得到原料质量分数为20％酸性溶液；

c.于4℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为2mol/L的氢氧化钾水溶液滴定中和至pH为7.3后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料。

实施例4

a.按质量百分比取75％的II型胶原蛋白、20％的硫酸软骨素和5％的透明质酸作为原料；

实施例5

a.按质量百分比取68％的II型胶原蛋白、29％的硫酸软骨素和3％的透明质酸作为原料；

b.于4℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.03mol/L的盐酸溶解，得到原料质量分数为12％酸性溶液；

c.于0℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为1.5mol/L的氢氧化钾水溶液滴定中和至pH为7.5后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料。

实施例6

a.按质量百分比取73％的II型胶原蛋白、26％的硫酸软骨素和1％的透明质酸作为原料；

b.于0℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.08mol/L的盐酸溶解，得到原料质量分数为18％酸性溶液；

c.于0℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为1mo l/L的氢氧化钾水溶液滴定中和至pH为7.5后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料。

实施例7

d.按质量百分比取73％的II型胶原蛋白、24％的硫酸软骨素和3％的透明质酸作为原料；

e.于0℃条件下在超净台上将步骤a所取原料用浓度为0.05mol/L的盐酸溶解，得到原料质量分数为15％酸性溶液；

f.于0℃条件下在超净台上将步骤b所得酸性溶液用浓度为2mol/L的氢氧化钾水溶液滴定中和至pH为7.5后，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料。

考察上述各实施例所得产品用于修复软骨组织缺损的效果，操作如下：

1、按常规操作方法分离、获取猪骨髓间充质干细胞，分别与上述各实施例所得注射型软骨仿生基质材料于低温条件下(0～4℃)混合，制备得到细胞材料复合物，与各实施例所得基质材料对应的细胞复合物浓度见表1。

表1

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

实施例5

实施例6

实施例7

复合物中细胞浓度个/ml

5×10⁶

5×10⁷

2.5×10⁷

1×10⁷

5×10⁶

5×10⁷

2×10⁷

2、取8头6-12月龄猪(体重30-40kg)，全麻下于每只猪的一个猪膝关节股骨内髁制造1个直径为6mm的圆形全厚软骨缺损，其中1个缺损作为空白对照，再向其余7个缺损中一一注入与各实施例所得基质材料对应的细胞材料复合物，然后用37℃温水湿纱布遮盖缺损区域，于纱布上方10-15cm处放置升温装置(如台灯或烤灯)使缺损区域的温度保持37℃直至注入材料发生相变形成凝胶，当然，缺损区域温度在36-38℃内均可。

需要说明的是，注入猪膝关节软骨缺损部位的各复合物中的种子细胞均为异体骨髓间充质干细胞，当然，细胞为自体骨髓间充质干细胞、同体软骨细胞或异体的软骨细胞同样可以实现本发明的目的。

各复合物注入软骨缺损后，发生相变形成凝胶的时间如下表2：

表2

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7
								凝胶形成时间/min	10	9	9	8	7	6	7

根据上表数据可见，实施例5、实施例6和实施例7所得材料的相变形成凝胶的时间较短。

术后16周处死猪取材，进行大体观察及组织学观察。

大体观察可见：再生修复组关节面较光滑，修复组织与周围软骨整合良好，色泽相近；空白对照组：缺损处凹陷，边界清晰，缺损边缘有少量修复。

组织学观察可见：再生修复组为透明软骨样修复，修复组织表面平整，与周围软骨整合紧密、厚度相近，细胞密度稍大；空白对照组：所得修复组织为纤维样组织，表面毛糙，细胞外基质排列紊乱。

具体修复结果对照如下：

结论：利用本发明研制的可注射软骨仿生基质材料作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的骨髓间充质干细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使溶胶一细胞复合物发生相变，从而将种子细胞固定于缺损处发挥再生修复作用，此材料具有使用方便、操作简单、手术损伤小、疗效确切等优点。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在于：通过如下步骤制得：

b.于0～4℃无菌条件下，将步骤a所取原料用浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的冰醋酸或盐酸溶解，制得原料质量分数为10％～30％酸性溶液；

c.于0～4℃无菌条件下，将所述酸性溶液用浓度为1mol/L～2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中和至pH为7.0～7.5，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，于0～4℃温度下密封保存。

2.根据权利要求1所述的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在于：所述原料中各成分的质量百分比为：68～73％的II型胶原蛋白、24～29％的硫酸软骨素和1～3％的透明质酸。

3.根据权利要求2所述的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在于：步骤b中所用冰醋酸或盐酸的浓度为0.03-0.08mol/L，所述酸性溶液中原料的质量分数为12-18％。

4.使用权利要求1所述的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：