CN115317672B - 仿生骨软骨一体化修复植入体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种仿生骨软骨一体化修复植入体，由成型多孔磷酸钙生物陶瓷和成型透明软骨样块状组织组成；成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化结构。本发明还提供了上述植入体的制备方法及其在骨软骨修复领域中的应用。该植入体可成功仿生天然骨软骨的结构与组成特点，可避免因引入其他高分子材料来构建植入体而带来的降解产物毒性、材料降解速率难以与新生组织的生长速率相匹配，以及不能形成透明软骨等问题。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程骨软骨修复领域，涉及一种仿生骨软骨一体化修复植入体及其制备方法与应用。
背景技术
创伤、衰老和疾病容易导致关节软骨缺损，通常伴有软骨下骨缺损。骨软骨缺损的修复一直是临床实践中的棘手问题。成人骨软骨组织的厚度约为3mm，由软骨、钙化软骨层和软骨下骨组成，三者的比例分别为90％、5％和5％。软骨-骨界面的复杂性以及软骨和软骨下骨层之间不同的愈合能力阻碍了骨软骨病变的成功再生治疗。骨和软骨的生理环境、生物力学特性、代谢率和细胞组成的差异对骨软骨再生有着深远的影响。具体而言，骨软骨再生面临的主要挑战可以概括为以下几个方面：(1)关节软骨由于其无血管特性、低细胞性和软骨细胞增殖能力差等特点，在损伤或退行性疾病后的自我修复能力较差，使得软骨修复在临床上面临着巨大的挑战；(2)与迅速的骨整合不同的是，透明软骨的粘合性质排除了整合；(3)骨软骨单元中的组织在生理和病理条件下作为一个单一的功能单元共存，软骨与骨骼之间存在着密切的相互作用，关节软骨对于承重关节的关节至关重要，用于分配负载、吸收冲击和促进运动，因此，与骨骼的愈合能力相比，软骨需要更强大的外源性方法来实现令人满意的再生；(4)天然骨软骨在纵向层面上细胞和胶原的排布呈现差异，其异质性是基于生物材料修复策略的主要挑战。
临床上对骨软骨缺损的修复与再生治疗方法主要有微骨折、自体软骨细胞移植及自体骨软骨移植等。然而，这些治疗方法因缺乏足够的自体移植物、存在组织整合性较差等缺陷而导致最终的修复效果十分有限。组织工程为骨软骨缺损的治疗提供了一个新的方向，它结合了细胞、支架材料和活性因子，用于开发能够恢复、维持或再生受损组织以改善组织功能的生物替代物。目前，作为软骨层的支架材料主要包括胶原及其衍生物明胶、壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、丝蛋白、纤维蛋白以及醋酸纤维素等天然大分子，还包括PLGA、PLA、PLG、PCL以及合成多肽自组装水凝胶等人工材料。虽然它们可以在一定程度上解决软骨缺损修复的一些问题，例如为缺损处提供力学支撑，为种子细胞提供增殖、分泌软骨相关基质的环境，但是也带来了许多难以解决的问题，例如，材料降解产物的毒性，材料的降解速率难以与新生组织的生长速率相匹配，部分材料促进软骨细胞的铺展粘附以至于促使其分泌的是纤维软骨而不是透明软骨。目前尚不能制备出具有仿生天然骨软骨成分和天然关节组织相似界面的理想双层支架。
要解决上述问题，关键的挑战之一是制备出理想的双层支架。这种双层支架应同时满足以下要求：(1)具有支持软骨再生的仿生软骨微环境和软骨层结构；(2)具有支持骨再生的仿生成骨微环境和骨层结构；(3)软骨层与骨层之间的仿生界面应类似于天然骨软骨界面；(4)具有与天然骨软骨组织接近的机械强度；(5)具有与骨软骨缺损相匹配的仿生三维形态。目前，制备可满足上述多重要求的双重支架是非常困难的。
因生物材料所带来的上述问题难以解决，不使用支架的细胞三维培养方法应用于软骨层应运而生，传统的离心成团法(pellet法)、悬滴培养法虽然能培育出透明软骨样块状组织，但存在着培育效率低和组织块尺寸和形态不可控等问题，制备的透明软骨样块状组织仅适用于作为研究软骨组织工程相关生物机理的模型，却无法应用在临床实践中。因此，目前迫切需要开发出更高效、尺寸和形状可以自由调节的仿生软骨组织的体外培育方法，若能以此为基础开发出无需引入天然高分子或人工合成材料的仿生骨软骨一体化修复植入体，对于解决现有骨软骨缺损的组织工程材料存在的问题和改善其性能将产生积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种仿生骨软骨一体化修复植入体及其制备方法与应用，以解决现有用于骨软骨修复支架材料存在的仿生骨软骨微环境差和骨软骨界面差的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种仿生骨软骨一体化修复植入体，该一体化修复植入体由成型多孔磷酸钙生物陶瓷和成型透明软骨样块状组织组成；成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化结构。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，成型透明软骨样块状组织具有与成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面基本匹配的形状。
在实际软骨缺损或损伤修复时，成型多孔磷酸钙生物陶瓷的一端端面是靠近待修复部位的骨的，另一个端面是靠近待修复部位的软骨的，上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面是指，在骨缺损或损伤修复时，成型多孔磷酸钙生物陶瓷上靠近软骨的端面。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，所述成型透明软骨样块状组织的制备方法如下：
根据成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的形状，将琼脂糖凝胶制备成3D模具，将软骨细胞悬液加入3D模具中培养至软骨细胞形成成型细胞团，将成型细胞团转移至低粘附的培养板中，加入培养基悬浮培养3～4天，即得。
进一步地，所述培养基是在Hycloneα-MEM基础培养基的基础上添加45～55μg/mL的抗坏血酸、1wt.％～1.5wt.％的青霉素和链霉素混合液和9wt.％～11wt.％的胎牛血清得到的。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，在制备成型透明软骨样块状组织时，将软骨细胞悬液加入3D模具中之后，培养4～24h，即得成型细胞团。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，在制备成型透明软骨样块状组织时，软骨细胞悬液的制备方法为：将哺乳动物来源的软骨细胞在体外二维平面培养扩增至P2代后，用不含EDTA的胰酶消化并配制成软骨细胞悬液，软骨细胞悬液的浓度为(1～9)×107cells/mL。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，所述3D模具是根据成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的形状来制备的，3D模具具有与成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面相匹配的形状。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，包覆成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的成型透明软骨样块状组织的厚度通常为0.5～1.5mm，在实际应用中，该厚度根据具体的修复对象待修复处的软骨厚度进行确定，覆盖成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的成型透明软骨样块状组织的厚度以接近待修复处的软骨厚度为原则。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，所述成型磷酸钙生物陶瓷的孔隙率优选为50％～80％，成型磷酸钙生物陶瓷的孔径优选为200～400μm。
上述仿生骨软骨一体化修复植入体的技术方案中，所述成型磷酸钙生物陶瓷包括成型BCP多孔陶瓷。
本发明还提供了上述仿生骨软骨一体化修复植入体的制备方法，将成型多孔磷酸钙生物陶瓷灭菌，在无菌环境下将成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，使成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，且部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化的结构，即得仿生骨软骨一体化修复植入体。
在实际应用中，上述仿生骨软骨一体化修复植入体中的成型多孔磷酸钙生物陶瓷作为软骨下骨修复层，能促进软骨下骨层的修复，并且能在修复前期为软骨修复提供力学支撑；上述仿生骨软骨一体化修复植入体中的成型透明软骨样块状组织作为软骨修复层，促使软骨细胞快速增殖并分泌软骨相关基质。在将上述仿生骨软骨一体化修复植入体植入体内一段时间后，成型透明软骨样块状组织会演变成透明软骨，成型多孔磷酸钙生物陶瓷中有明显的血管和神经形成，也有大量新生骨组织形成，最终会形成软骨下骨；在软骨下骨与透明软骨之间还会形成明显的界面层。即本发明提供的仿生骨软骨一体化修复植入体在植入体内后，可仿生天然骨软骨的结构与成分，起到良好的修复效果。
本发明通过动物实验证实，本发明提供的仿生骨软骨一体化修复植入体具有良好的生物相容性和安全性，在植入裸鼠体内一个月后，成型透明软骨样块状组织会转变成透明软骨，在透射电镜下可以看到形成的透明软骨的细胞表面有许多微小突起，细胞质内粗面内质网和高尔基体明显扩大；在成型多孔磷酸钙生物陶瓷中，有明显的血管和神经形成，有大量新生骨组织的形成，修复形成了软骨下骨层；在透明软骨与软骨下骨修复层之间，形成了形态不同于透明软骨和软骨下骨层的界面层。该结构与天然骨软骨的界面区域的结构非常相似，各部分的组成也与天然骨软骨界面区域的组成相似。本发明提供的一体化修复植入体成功仿生了天然骨软骨的结构与组成特点。
基于以上实验结果，本发明还提供了上述仿生骨软骨一体化修复植入体在骨软骨修复领域中的应用，可用于骨软骨缺损的重建以及其他骨损伤的修复。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了一种仿生骨软骨一体化修复植入体，该一体化修复植入体由成型多孔磷酸钙生物陶瓷和成型透明软骨样块状组织组成；成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化结构。该一体化修复植入体仅由成型多孔磷酸钙生物陶瓷和成型透明软骨样块状组织组成，可仿生天然骨软骨微环境和天然关节组织的界面结构。相对于现有技术，无需借助于其他天然或人工合成高分子材料来构建修复植入体，因而可以避免因引入其他高分子材料而带来的高分子材料降解产物的毒性、高分子材料降解速率难以与新生组织的生长速率相匹配，以及不能形成透明软骨等问题。
2.本发明为了实现仿生骨软骨一体化修复植入体的制备，设计了成型透明软骨样块状组织的制备方法，该方法不仅可以实现成型透明软骨样块状组织的制备，解决了现有方法无法实现对透明软骨样块状组织任意赋形的问题，而且可以有效提高透明软骨样块状组织的制备效率，能将明软骨样块状组织的制备时间由现有技术的2～4星期缩短至3～4天。制备的透明成型软骨样块状组织具有与天然关节透明软骨相接近的组成、结构和性质，宏观观察呈现半透明状，经手接触发现表面摩擦系数较低，并具有较好的弹性模量。采用组织切片染色证实了本发明透明软骨样块状组织含有丰富的粘多糖和二型胶原，软骨细胞呈现球状或椭圆状均匀地镶嵌在由细胞外基质构成的陷窝中。制备成型透明软骨样块状组织所需细胞数量少且无需使用支架材料，在临床病人自体软骨细胞供应数量有限的情况下具有潜在的应用价值。
3.本发明提供的仿生骨软骨一体化修复植入体中的成型多孔磷酸钙生物陶瓷作为软骨下骨修复层，不但能促进软骨下骨层的修复，而且能在修复前期为软骨修复提供力学支撑；其中的成型透明软骨样块状组织作为软骨修复层，促使软骨细胞快速增殖并分泌软骨相关基质。本发明通过动物实验证实，该一体化修复植入体具有良好的生物相容性和安全性，在植入裸鼠体内一个月后，成型透明软骨样块状组织会转变成透明软骨，在透射电镜下可以看到形成的透明软骨的细胞表面有许多微小突起，细胞质内粗面内质网和高尔基体明显扩大；在成型多孔磷酸钙生物陶瓷中，有明显的血管和神经形成，有大量新生骨组织的形成，修复形成了软骨下骨层；在透明软骨与软骨下骨修复层之间，形成了形态不同于透明软骨和软骨下骨层的界面层。该结构与天然骨软骨的界面区域的结构非常相似，各部分的组成也与天然骨软骨界面区域的组成相似。该一体化修复植入体成功仿生了天然骨软骨的结构与组成特点，可在骨软骨修复领域中的应用，用于骨软骨缺损的重建以及其他骨损伤的修复。
附图说明
图1是实施例1制备的成型透明软骨样块状组织的照片。
图2是对比例1制备的透明软骨样块状组织的照片。
图3是实施例2制备的仿生骨软骨一体化修复植入体的照片。
图4是植入术后1个月的裸鼠的照片，其中，A图是植入体植入1个月后的裸鼠的背部的照片、B图是植入体植入一个月后剖开裸鼠背部的照片、C图是将植入体从裸鼠背部取下后的照片。
图5是植入术后1个月和2个月后取出的植入体的大体观图，其中的A、D图展示的是软骨面，B、E图展示的是软骨下骨面，C、F图展示的剖面。
图6是植入术后1个月和2个月的植入体的CT测试结果，其中的A、B图是植入术后1个月和2个月的植入体的3D重建图，C图是植入术前的植入体的3D重建图，D图是骨体积分数(BV/TV)测试结果。
图7是植入术后1个月的植入体的透视电镜(TEM)测试结果，其中，A1、A2图为软骨层的细胞结构，B1、B2图为骨软骨的界面的结构，C1、C2图为软骨下骨的结构。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的仿生骨软骨一体化修复植入体及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中，制备成型透明软骨样块状组织，步骤如下：
(1)根据成型磷酸钙生物陶瓷形状，利用琼脂糖凝胶制作3D模具，具体操作为：
本实施例中采用的成型磷酸钙生物陶瓷为成型BCP多孔陶瓷，呈圆柱状，其直径为4mm、高度为2mm。以该成型BCP多孔陶瓷的其中一个底面作为软骨修复端面。
将琼脂糖用热水溶解形成琼脂糖溶液，将琼脂糖溶液加入6孔板中，加入量为5mL/孔，琼脂糖溶液稍微冷却后转变成琼脂糖凝胶，用直径为4mm的圆柱形模具插入琼脂糖凝胶中制成具有直径为4mm的圆柱形凹坑，即得3D模具。
(2)提取1～3天的幼兔软骨细胞，用培养皿在37℃、0.5％CO2的细胞培养箱中培养并传至P2代，用不含EDTA的胰酶消化并收集软骨细胞，加入培养基制成浓度为5×107cells/mL的软骨细胞悬液。
将软骨细胞悬液加入3D模具中，每个3D模具中的加入量为30μL，培养24h，软骨细胞形成成型细胞团，将成型细胞团转移至低粘附六孔板中，加入培养基悬浮培养4天，培养至第3天时更换一次培养基，培养4天后，经细胞微团自聚集形成成型透明软骨样块状组织。
该步骤中，所使用的培养基是在Hycloneα-MEM基础培养基的基础上添加50μg/mL的抗坏血酸、1wt.％的青霉素和链霉素混合液和10wt.％的胎牛血清得到的。
本实施例制备得了一系列相同的成型透明软骨样块状组织，其照片如图1所示，由图1可知，成型透明软骨样块状组织的形态接近呈椭圆形，其一面基本为平面，该平面可完全覆盖成型BCP多孔陶瓷的一个端面，基本与成型BCP多孔陶瓷的一个端面的形状匹配，另一面上软骨细胞自然生长形成了凹坑结构。宏观观察，该成型透明软骨样块状组织呈现半透明状，经手接触发现表面摩擦系数较低，并具有较好的弹性。采用组织切片染色证实了该成型透明软骨样块状组织，包括细胞外基质和均匀镶嵌在其中的软骨细胞，细胞外基质中含有丰富的天然软骨成分的粘多糖和二型胶原，具有与天然软骨相接近的成分和结构，软骨细胞呈现球状或椭圆状，均匀地镶嵌在由细胞外基质构成的陷窝中。
对比例1
本对比例中，采用CN106943630A中的方法制备透明软骨样块状组织，步骤如下：
(1)提取1～3天的幼兔软骨细胞，用培养皿在37℃、0.5％CO2的细胞培养箱中培养并传至P2代，用不含EDTA的胰酶消化并收集软骨细胞，加入培养基制成浓度为4×105cells/mL的细胞悬液。将所得软骨细胞悬液接种于384孔的悬滴培养板上，每孔接种体积为30μL。
(2)在悬滴培养板中培养1天后，补加50μL磷酸盐缓冲液将悬滴培养板中的细胞微团收集于50mL离心管中，并以300×g的离心力离心5min，然后将收集到的细胞微团以2.3×106cells/孔的浓度接种于低黏附六孔板中培养，培养期间，每个3天更换一次培养基，培养3周后，得到透明软骨样块状组织。
步骤(1)(2)中，所使用的培养基是在Hycloneα-MEM基础培养基的基础上添加50μg/mL的抗坏血酸、1wt.％的青霉素和链霉素混合液和10wt.％的胎牛血清得到的。
本对比例制备得到的透明软骨样块状组织的照片如图2所示，由图2可知，透明软骨样块状组织具有不规则的形状，呈多孔珊瑚样。
结合实施例1和对比例1可知，采用本发明所述方法在体外培养透明软骨样块状组织，仅需4天即可制备得到成型透明软骨样块状组织，而对比例1的方法需要培养3周，因而本发明所述方法的培养效率更高，可有效缩短培养时间。同时，采用本发明的方法制备得到的是成型透明软骨样块状组织，可根据待修复的骨软骨缺损的形状，制备出任意形状的成型透明软骨样块状组织，而对比例1的方法制备得到的是不规则的多孔珊瑚状透明软骨块状组织，无法控制其成型形状制备出所需形状的成型透明软骨样块状组织，因而本发明的方法更有利于在真实的骨软骨修复场景中应用。
实施例2
本实施例中，制备仿生骨软骨一体化修复植入体，步骤如下：
(1)本实施例采用的成型磷酸钙生物陶瓷为成型BCP多孔陶瓷，呈圆柱状，其直径为4mm、高度为2mm，孔隙率约为60％，平均孔径约为300μm。
将成型BCP多孔陶瓷高温灭菌，在无菌环境下，将实施例1制备的成型透明软骨样块状组织组装在成型BCP多孔陶瓷上，使成型透明软骨样块状组织组基本呈平面的一面(非凹坑面)贴合成型BCP多孔陶瓷的软骨修复端面(其中的一个圆形底面)并且部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖，得到仿生骨软骨一体化修复植入体。
(2)重复步骤(1)的操作，制备出一系列仿生骨软骨一体化修复植入体，用于后续实验。
本实施例制备的仿生骨软骨一体化修复植入体的照片(从组装了成型透明软骨样块状组织的一端拍摄)如图3所示。
实施例3
本实施例中，通过动物实验考察实施例2制备的仿生骨软骨一体化修复植入体的修复效果。
(1)选取4～6周龄的雄性裸鼠12只。将浓度为10mg/mL的戊巴比妥钠按照10μL/g的量，通过腹腔注射的方式缓慢地注射入裸鼠体内，对裸鼠进行麻醉，注射后将裸鼠放回笼内。
(2)待麻醉生效后，将裸鼠从笼中取出铺放在洞巾上。用小弯镊轻轻夹起裸鼠背部皮肤，用眼科剪将裸鼠内侧皮肤切开，直至可见皮下肌肉组织，然后沿着切口往上下切开1cm长的切口，注意切开过程避开动脉血管。用生理盐水冲洗皮肤表面血渍，用医用纱布初步止血，用生理盐水再次冲洗干净创面。用一次性无菌弯镊将实施例2制备的仿生骨软骨一体化修复植入体从培养基中取出，小心塞入皮下切口中，切忌在塞入过程中导致仿生骨软骨一体化修复植入体出现破碎，在每只裸鼠背部左右两侧皮下分别植入2个仿生骨软骨一体化修复植入体。之后小心地将皮肤复位，注意复位过程不要将植入的植入体挤出切口处，随后将皮肤用手术线缝合，伤口擦拭碘伏，放回笼内观察。
(3)植入术后，给裸鼠换垫料，加水和饲料。将裸鼠继续在原先的笼子中饲养，使其可以自由活动。分别在植入术后1个月和2个月取出植入的植入体进行检测。
植入术后1个月的裸鼠的照片如图4所示。将实施例3植入术后1个月和2个月的植入体从裸鼠背部取出，用体式显微镜拍照，结果如图5所示。从图5可以观察到仿生骨软骨一体化修复植入体植入体内1个月后，可以明显观察到软骨层透明的软骨组织，在植入的仿生骨软骨一体化修复植入体的软骨下骨周围有丰富的血管分布，软骨层与骨层之间的界面明显，证实了仿生骨软骨一体化植入体的仿生特点。
实施例4
在实施例3植入术后1个月，分别从裸鼠的眼球采集1～2mL血液，进行血液生化检测。检测仪器为兽用生化分析仪，型号为BS-240VET，血液生化检测指标及检测结果如表1所示。
表1血液生化检测指标及检测结果
由表1可知，在仿生骨软骨一体化植入体植入裸鼠背部后1个月(n＝3)，裸鼠的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶等都在正常值范围以内，其他血液指标未见异常，表明仿生骨软骨一体化植入体在裸鼠体内具有良好的生物相容性和安全性。
实施例5
将实施例3植入术后1个月和2个月的植入体从裸鼠背部取出，将取出的样品固定在样品管的海绵中，在Micro-CT机中进行扫描成像，体积像素设为15μm。扫描得到的dicom格式数据并用mimics 17.0软件进行处理，重建对应样品的3D图像。同时对植入前的仿生骨软骨一体化修复植入体在Micro-CT机中进行扫描成像。计算骨体积分数，骨体积分数(BV/TV)＝成骨体积/样品体积×100％。结果如图6所示。
由图6的A图可以看到，在植入术后4周，仿生骨软骨一体化植入体中有部分新生骨形成。由图6的B图可知，在植入术后8周，仿生骨软骨一体化植入体中的新生骨组织厚度和骨量进一步增加。从图6的D图Micro-CT定量分析结果可以看到，在植入术后4周，仿生骨软骨一体化植入体中的新生骨体积占比(BV/TV)为32.57±3.0％，在植入术后8周，仿生骨软骨一体化植入体中的新生骨体积占比为41.9±9.5％。相比于植入前的植入体，植入体在植入裸鼠体内1个月和两个月后，植入体中的新生骨体积明显更高。说明本发明提供的仿生骨软骨一体化植入体在植入体内后，可有效促进新生骨组织的形成。
实施例6
将实施例3植入术后1个月的仿生骨软骨一体化修复植入体从裸鼠背部取出，将取出的样品进行固定、脱水、渗透、包埋，然后进行超薄切片和切片染色，采用透射电镜进行观察，结果如图7所示。
由图7可知，仿生骨软骨一体化植入体植入裸鼠背部1个月后，植入体形成了三层结构，成型透明软骨样块状组织转变成了透明软骨(图7中的软骨层，A1、A2图)，在透射电镜下看到细胞表面有许多微小突起，细胞质内粗面内质网和高尔基体明显扩大。在成型多孔磷酸钙生物陶瓷中(图7中的下骨层，C1、C2图)，在透射电镜下看到有明显的血管和神经形成。在软骨层与下骨层之间形成了明显的界面(图7中的界面层，B1、B2图)。以上结果证实本发明提供的仿生骨软骨一体化植入体在植入体内后，可成功仿生骨软骨结构，有望用于骨软骨缺损的重建以及其他软骨损伤的修复。
Claims (6)
1.一种仿生骨软骨一体化修复植入体，其特征在于，该一体化修复植入体由成型多孔磷酸钙生物陶瓷和成型透明软骨样块状组织组成；成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化结构；包覆成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的成型透明软骨样块状组织的厚度为0.5~1.5 mm；
所述成型透明软骨样块状组织的制备方法如下：
根据成型多孔磷酸钙生物陶瓷软骨修复端面的形状，将琼脂糖凝胶制备成3D模具，将软骨细胞悬液加入3D模具中，培养4~24 h，即得成型细胞团，将成型细胞团转移至低粘附的培养板中，加入培养基悬浮培养3~4天，即得；
所述软骨细胞悬液的制备方法为：将哺乳动物来源的软骨细胞在体外二维平面培养扩增至P2代后，用不含EDTA的胰酶消化并配制成软骨细胞悬液，软骨细胞悬液的浓度为（1~9）×107 cells/mL。
2.根据权利要求1所述仿生骨软骨一体化修复植入体，其特征在于，所述培养基是在Hyclone α-MEM基础培养基的基础上添加45~55 μg/mL的抗坏血酸、1 wt.%~1.5 wt.%的青霉素和链霉素混合液和9 wt.%~11 wt.%的胎牛血清得到的。
3.根据权利要求1或2所述仿生骨软骨一体化修复植入体，其特征在于，所述成型多孔磷酸钙生物陶瓷的孔隙率为50%~80%，成型多孔磷酸钙生物陶瓷的孔径为200~400 μm。
4.根据权利要求1或2所述仿生骨软骨一体化修复植入体，其特征在于，所述成型多孔磷酸钙生物陶瓷包括成型BCP多孔陶瓷。
5.权利要求1至4中任一权利要求所述仿生骨软骨一体化修复植入体的制备方法，其特征在于，将成型多孔磷酸钙生物陶瓷灭菌，在无菌环境下将成型透明软骨样块状组织组装在成型多孔磷酸钙生物陶瓷上，使成型透明软骨样块状组织贴合成型多孔磷酸钙生物陶瓷的软骨修复端面，且部分成型透明软骨样块状组织进入所述软骨修复端面的孔隙结构中，成型透明软骨样块状组织将所述软骨修复端面完全覆盖形成一体化的结构，即得仿生骨软骨一体化修复植入体。
6.权利要求1至4中任一权利要求所述仿生骨软骨一体化修复植入体在制备骨软骨修复材料中的应用。
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