KR20160135957A - 3차원 프린팅을 이용한 융비술 재료 및 이의 제조방법 - Google Patents

3차원 프린팅을 이용한 융비술 재료 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3차원 프린팅을 이용한 융비술 재료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 연골세포 및 피브린이 코팅된, 3차원 다공성 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 융비술 재료는 3D 프린팅을 이용하여 연골세포 및 피브린이 코팅된 생분해성 고분자, 특히 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드로 제조됨으로써 간단하고 경제적이고 환자 맞춤형이며 우수한 생체적합성 및 생분해성을 나타내는 효과가 있다.

Description

3차원 프린팅을 이용한 융비술 재료 및 이의 제조방법{Augmentation rhinoplasty material using three-dimensional printing and method for preparing the same}
본 발명은 3차원 프린팅을 이용한 융비술 재료 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 연골세포 및 피브린이 코팅된, 3차원 다공성 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
코 성형술에 사용되는 기존 융비술(augmentation rhinoplasty) 재료는 개별 환자의 코 치수을 고려하지 않고, 표준 길이 및 높이로 생산되어 왔다. 따라서, 의사들은 각 환자의 특정 요구에 따라 재료를 설계하고 조각하는데 많은 시간을 소비해 왔다. 종래, 줄기세포 연구을 기반으로 한 조직공학 기술이 고유의 기능을 유지하면서도 손상된 조직과 장기를 대체할 수 있는 가능성을 보여줬으나, 성형술에서 조직공학 기술의 적용은 상대적으로 드문 형편이다. 즉, 성형술에서 주 목적을 달성하기 위해 적절한 재료를 사용하는 것은 대부분의 경우 필수적으로 요구된다. 따라서, 종래 재료를 대체하거나 보완할 수 있는 신규 재료가 요구되며, 이러한 방법은 성형술에서 조직공학 기술을 적용하기 위한 기초가 될 수 있다. 또한, 조작된 조직이 기능을 필요로 하지 않기 때문에, 성형술에서 조직공학 기술을 적용하기가 더 쉬울 것이다. 따라서, 기능적인 면보다는 형태 및 안정성이 고려될 필요가 있다.
최근, 3차원(3D) 프린팅이 다양한 임상 문제에 적용되어 왔으며, 3D 프린팅을 이용하여 3차원 형상의 고체 스캐폴드를 제조할 수 있다. 그러나, 종래 어떠한 연구도 3D 프린팅을 코 성형술이나 코 수술에 적용하지 않았다. 또한, 융비술(augmentation rhinoplasty)에 포함된 절차 중, 코의 배등면(nasal dorsum)을 올리기 위해 적절한 재료를 선택하는 것은 성공적인 수술을 보장하는데 매우 중요하다. 이상적인 융비술 재료는 (1) 충분한 양, (2) 생체적합성, (3) 조작 및 설계의 손쉬움 및 (4) 융비술 수준의 유지와 같은 특징을 가져야한다. 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL)은 생체적합성 및 생분해성을 갖는 생합성 고분자로서 적절한 기계적 강도 및 내구성을 가질 뿐만 아니라 소수성 특징으로 인해 현재의 3D 프린팅 시스템에 사용되는데 적합한 재료이다. 또한, 혈액 응고 단계에 관여하는 섬유 단백질인 피브린은 연골 조직공학을 위한 유용한 세포 전달 매트릭스로서 생체적합성 및 생분해성을 갖는다. 그러나, 연골세포 및 피브린이 코팅된 생분해성 고분자 스캐폴드가 융비술 재료로 사용된 적은 없다.
따라서, 융비술 재료로서, 생체적합성을 갖는 3D 프린팅을 이용한 연골세포 및 피브린으로 코팅된 생분해성 고분자 스캐폴드에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.
KR 10-2008-0096153
본 발명자들은 융비술 재료에 대해 탐색하던 중, 3D 프린팅을 이용한 연골세포 및 피브린이 코팅된 생분해성 고분자 스캐폴드가 간단하고 경제적이고 환자 맞춤형이며 우수한 생체적합성 및 생분해성을 나타내는것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 3D 프린팅을 이용한 연골세포 및 피브린이 코팅된 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은
(1) 3차원(3D) 프린팅으로 생분해성 고분자가 적층된 다공성 스캐폴드를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 다공성 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을 코팅하는 단계;를 포함하는, 융비술 재료의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 연골세포 및 피브린으로 코팅된, 3차원 다공성 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료를 제공한다.
또한, 본 발명은 융비술 재료를 포함하는, 융비술 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) 3차원(3D) 프린팅으로 생분해성 고분자가 적층된 다공성 스캐폴드를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 다공성 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을 코팅하는 단계;를 포함하는, 융비술 재료의 제조방법을 제공한다.
상기 (1) 단계는 3차원(3D) 프린팅 기술을 이용하여 생분해성 고분자가 적층된 다공성 스캐폴드를 제조하는 단계이다.
본 발명자들은 규격화된 기존 융비술(augmentation rhinoplasty) 재료의 한계를 극복하고자 3차원(3D) 프린팅 기술을 이용하여 간단하고 경제적으로 환자 맞춤형 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료를 제조하였다.
상기 3D 프린팅은 바이오플로터(bio-plotter)를 이용하여 생분해성 고분자를 노즐로부터 압출하여 스테이지에 적층함으로써 수행될 수 있다. 상기 바이오플로터는 노즐이 형성된 플로터 본체, 상기 플로터 본체에 생분해성 고분자를 공급하는 저장용기 및 플로터 본체의 3차원 이동을 제어하는 제어부를 포함할 수 있다. 상기 저장용기로부터 공급받은 생분해성 고분자를 노즐을 통해 스테이지로 압출하고, 이 과정에서 제어부의 구동에 의해 노즐이 이동한다.
상기 스캐폴드는 생체내에서 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하며 이들의 기능을 보완 또는 대체할 수 있는 구조체를 의미하며, 스캐폴드가 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 고분자 소재로 제조되는 것이 바람직하다. 구체적으로는 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리(L-락티트)(poly(L-lactide), PLA), 폴리(락티트-코-글리콜라이드(poly(lactide-co-glycolide), PLGA), 폴리스티렌(polystyrene, PS) 등일 수 있고, 폴리카프로락톤인 것이 바람직하다.
상기 스캐폴드는 세포 또는 조직 배양 등에 일반적으로 사용되는 것일 수 있으며, 바이오플로터 등의 바이오조형머신을 이용하여 제조되는 것일 수 있다. 또한, 상기 스캐폴드는 격자구조로 적층된 형태일 수 있고, 구체적으로 사각 기둥 또는 원통형의 적층구조일 수 있다. 상기 스캐폴드는 환자의 특정 요구에 따라 다양한 크기로 제작 가능하며, 가로 3~7 cm × 세로 1~3 cm × 높이 0.5~1.5 cm의 크기로 제작하는 것이 바람직하고, 가로 5 cm × 세로 1.5 cm × 높이 1 cm의 크기로 제작하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 스캐폴드는 연골세포 및 피브린이 고분자 지지체의 공극 내로 잘 주입되기 위해서 고분자 지지체가 일정한 크기의 공극을 갖고 공극간 상호연결성이 높은 구조를 가져야 하며, 체내의 하중을 견디기에 충분한 수준의 기계적 강도를 가져야 한다. 상기 스캐폴드는 평균 지름 200~700 μM의 공극을 포함하는 것이 바람직하며, 400~600 μM의 공극을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 공극 크기가 200 μM 미만이면 지지체 내부의 상호연결성이 양호하지 않은 반면, 공극 크기가 700 μM를 초과하면 지지체의 기계적 강도가 약해지는 문제점이 있다.
상기 (2) 단계는 상기 (1) 단계의 다공성 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을코팅하는 단계이다.
본 발명에 적용가능한 세포 또는 조직은 특별히 한정되지 않으며, 동물세포 또는 식물세포이거나, 동물 또는 식물의 조직일 수 있다.
상기 연골세포는 연골조직으로부터 분리된 것 또는 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것일 수 있다. 상기 연골세포는 초대배양 연골세포, 계대배양 연골세포, 지방조직유래 연골세포, 골수유래 연골세포일 수 있으며, 환자맞춤형 자가연골세포인 것이 바람직하다.
상기 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 성체 골수에 있는 다능성 비조혈 전구 세포로서, 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부, 신경 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 의미하며, 본 발명에서는 연골세포로 분화될 수 있다.
상기 연골세포의 분리 및 배양은 (1') 채취된 연골조직을 인삼염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 수세한 후, 0.1~1% 콜라게나아제를 함유한 PBS 용액에 부유하고, 30~40℃에서 3~7시간 정치시켜 연골세포를 분리하는 단계; 및 (2') 상기 분리된 연골세포를 나일론 필터로 여과하고 원심분리한 후, 5~13% 소 태아 혈청, 80~120 U/mL 페니실린 G, 및 80~120 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 배지로 부유하고, 3~7％ 이산화탄소 농도에서 35~40℃로 배양하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 준비될 수 있다. 상기 배지는 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium, DMEM)일 수 있다.
상기 피브린은 생체 적합성, 생분해성, 연골 하골과의 접합성 등이 우수한 천연 고분자로서, 피브리노겐(fibrinogen) 용액에 트롬빈(thrombin)을 혼합하여 고형화시켜 제조할 수 있으며, 상기 피브리노겐 용액은 아프로티닌, 피브린 안정 인자 XIII 및 염화칼슘(CaCl2)을 더 포함 할 수 있다. 이러한, 상기 피브린은 연골재생에 있어서도 연골세포의 표현형을 유지시키면서 세포외 기질 분비에 효과적인 환경을 제공하여 연골조직 형성에 도움을 줄 수 있다.
상기 아프로티닌은 피브린 분해억제제로 사용될 수 있으며, 100~120 KIU/mL의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 농도보다 낮은 농도로 첨가되면 피브린 분해억제능이 상실되며 상기 농도보다 높은 농도로 첨가되면 세포 독성을 나타낼 우려가 있다.
상기 융비술 재료는 환자맞춤형인 것이 바람직하다. 서로 다른 환자의 요구 및 코 형태에 따라서 개별적으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1") 흰 토끼에 틸레타민(tiletamine) 4.0 mg/kg 및 올라제팜(olazepam) 4.0 mg/kg의 마취제를 투여한 후, 무릅 연골조직을 멸균 해부하여 수거하는 단계; (2") 상기 채취된 토끼의 무릅 연골조직을 인삼염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 수세한 후, 0.2% 콜라게나아제를 함유한 PBS 용액에 부유하고, 37℃에서 5시간 정치시켜 연골세포를 분리하는 단계; (3") 상기 분리된 연골세포를 100 μm 나일론 필터로 여과하고 1700rpm에서 10분 동안 원심분리하여 연골세포 펠렛을 수득하는 단계; (4") 상기 수득된 연골세포 펠렛을 PBS로 2회 세척한 후, 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 G, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 배지로 부유하는 단계; (5") 상기 배지에 부유된 연골세포를 1.5 × 105 세포/cm2의 밀도로 평판배지에 분주하고, 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하여 연골세포를 준비하는 단계; (6") 상기 준비된 연골세포를 원심분리하여 펠렛화한 후, 9-18 mg/mL의 인간 유래 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 용액에 재현탁하는 단계; (7") 상기 재현탁된 연골세포(5 × 106 세포/mL)을 포함하는 피브리노겐 용액을 110 KIU/mL 아프로티닌, 60 U/mL 트롬빈, 50 U 피브린 안정 인자 XIII, 및 50 mM CaCl2와 균일하게 혼합하여 연골세포 및 피브린을 형성하는 단계; (8") 폴리카프로락톤(PCL) 고분자 펠렛을 가열 실린더를 이용하여 100-130℃에서 녹인 후, 바이오플로터(bioplotter) 시스템을 이용하여 가로 5 cm × 세로 1.5 cm × 높이 1 cm의 크기를 갖는 스틱 모양의 3D 프린팅 스캐폴드를 제조하는 단계; (9") 상기 (7")단계의 연골세포 및 피브린을 상기 (8")단계의 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅하는 단계;를 포함하는, 융비술 재료의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 연골세포 및 피브린으로 코팅된, 3차원 다공성 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융비술 재료를 인간을 제외한 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 융비술 방법을 제공한다.
상기 "개체"란 코의 연골이 손상된 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명의 스캐폴드를 개체에게 투여함으로써, 손상된 코의 연골을 효과적으로 재생시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 융비술 재료를 포함하는, 융비술 키트를 제공한다.
본 발명의 융비술 재료는 3D 프린팅을 이용하여 연골세포 및 피브린으로 코팅된 생분해성 고분자 스캐폴드로 제조됨으로써 간단하고 경제적이고 환자 맞춤형이며 우수한 생체적합성 및 생분해성을 나타내는 효과가 있다.
본 발명에 따른 융비술 재료는 3D 프린팅을 이용하여 연골세포 및 피브린이 코팅된 생분해성 고분자, 특히 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드로 제조됨으로써 간단하고 경제적이고 환자 맞춤형이며 우수한 생체적합성 및 생분해성을 나타내는 효과가 있다.
도 1은 실시예 1 및 2에 따른 3D 프린팅을 이용한 폴리카프로락톤(PCL) 스캐폴드의 (a) 등(dorsal), 및 (b) 측면(later) 형태를 나타내는 도이다.
도 2는 연골세포 및 피브린을 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅하기 (a) 전, 및 (b) 후의 3D 프린팅 스캐폴드의 주사전자현미경 이미지를 나타내는 도이다.
도 3은 3D 프린팅 PCL 스캐폴드에 코팅된 연골세포의 LIVE/DEAD 평가 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 시험관 내 배양 4 주 및 8 주 후의 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드에 대한 H&E 염색의 광학 현미경 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 시험관 내 배양 4 주 및 8 주 후의 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드에 대한 사프라닌-O 염색의 광학 현미경 결과를 나타내는 도이다. 여기서 (c) 및 (d)는 2mm 스케일 바, 및 (e) 및 (f)는 1mm 스케일 바의 상세 이미지이다.
도 6은 (a) 3D 프린팅 PCL 스캐폴드의 골 막하 이식 형태 및 이식 후 (b) 4 주, 및 (c) 12 주 후의 전체적인 형태를 나타내는 도이다.
도 7은 이식 12 주 후의 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드 구조체에 대한 방사선학적 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 이식 4 주 및 12 주 후의 피부 및 연부 조직 외피(soft tissue envelopes)를 포함하는 3D 프린팅 스캐폴드의 조직 평가 결과를 나타내는 도이다.여기서, (a)~(d)는 H&E 염색 결과를 나타내고, (c)~(d)는 사프라닌-O 염색 결과를 나타내며, (a), (b), (e) 및 (f)는 2mm 스케일 바, 및 (c), (d), (g) 및 (h)는 1mm 스케일 바의 이미지이다.
도 9는 합병성 염증 및 감염의 존재 여부에 대한 항-토끼 대식세포 항체(RAM 11)를 이용한 평가 결과를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연골세포의 분리
토끼의 무릅 연골조직으로부터 연골세포를 분리하여 이용하였다. 먼저, 흰 토끼에 틸레타민(tiletamine) 4.0 mg/kg 및 올라제팜(olazepam) 4.0 mg/kg의 마취제를 투여한 후, 무릅 연골을 멸균 해부하여 수거하였다. 수거된 연골을 미세하게 갉은 후, 인삼염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 수세하고, 0.2% (w/v) 콜라게나아제(collagenase)가 용해된 PBS 용액으로 37℃에서 5시간 동안 처리하였다. 상기 처리가 끝난 세포를 함유한 용액을 100 μm 나일론 필터를 이용하여 여과한 후, 1700rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 수득된 세포 펠렛을 PBS로 2회 세척한 후, 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 G, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에 재-현탁하였다. 그 후, 세포를 1.5 × 105 세포/cm2의 밀도로 평판배지에 분주하였고, 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하였다. 배양배지는 매일 교환하였고, 실험에 사용하기 전에 주요 연골세포를 두 번 계대배양하였다.
실시예 2. 연골세포 및 피브린 코팅된 PCL 스캐폴드의 제조
먼저, 토끼 코 배등면(nasal dorsum)의 컴퓨터 단층촬영 자료를 기반으로 스캐폴드의 캐드(computeraided designing, CAD) 작업을 수행하였다. 폴리카프로락톤(PCL) 고분자 펠렛을 가열 실린더를 이용하여 100-130℃에서 녹인 후, 바이오플로터(bioplotter) 시스템을 이용하여 3D 프린팅 스캐폴드를 제조하였다. 실험 조건으로는 200 μM의 노즐 크기 및 300 μM의 가닥(strand) 사이의 거리를 이용하였고, 용융된 PCL을 층상 증착으로 플로팅하여 가로 5 cm × 세로 1.5 cm × 높이 1 cm의 크기를 갖는 스틱 모양의 3D 프린팅 스캐폴드를 제조하였다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 연골세포를 원심분리를 이용하여 펠렛화한 후, 9-18 mg/mL의 인간 유래 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 용액에 재현탁하였다. 그 후, 5 × 106 세포/mL의 연골세포을 포함하는 피브리노겐 용액을 110 KIU/mL 아프로티닌, 60 U/mL 트롬빈(1000 U/mg 단백질), 50 U 피브린 안정 인자 XIII, 및 50 mM CaCl2 와 균일하게 혼합하였다, 상기 연골세포 및 피브린을 포함하는 용액을 상기 3D 프린팅 PCL 스캐폴드에 코팅함으로써 연골세포 및 피브린 코팅된 PCL 스캐폴드를 제조하였다.
상기 실시예 1 및 2에 따른 3D 프린팅을 이용한 PCL 스캐폴드의 (a) 등(dorsal), 및 (b) 측면(later) 형태를 도 1에 나타내었다.
실험예 1. 3D 프린팅 스캐폴드에 이식된 연골세포의 생존 평가
상기 실시예 1 및 2에 따른 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅된 연골세포의 생존 평가를 LIVE/DEAD 생존/세포 독성 키트 및 칼세인(calcein) 아세토메톡시(acetomethoxy)-(AM), 에티디움 호모다이머-1(EthD-1)을 이용하여 수행하였다. 먼저, 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅된 연골세포를 2μM 칼세인-AM 및 1μM 에티디움 브로마이드 호모다이머-1에서 30분 동안 37℃로 배양한 후, FluorSave를 포함하는 슬라이드 위에 고정시켰다. 그 후, Microphot FXA 디지탈 형광 현미경을 이용하여 형광이미지를 측정하였다. 세포 생존율은 총 세포의 양에 대한 살아 있는 세포의 양의 비율로 정량화하였고, 측정 및 계산은 이미지 J 프로그램을 이용하여 수행하였다. 연골세포를 포함하는 피브린을 3D 프린팅 스캐폴드에 이식하기 (a) 전, 및 (b) 후의 3D 프린팅 스캐폴드의 주사전자현미경 이미지를 도 2에 나타내었고, 3D 프린팅 PCL 스캐폴드에 이식된 연골세포의 LIVE/DEAD 평가 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 3D 프린팅 PCL 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을 코팅한 (b)의 경우, 3D 스캐폴드의 기공 내에 연골세포가 존재하는 것을 알 수 있다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅된 연골세포의 90% 이상이 이식 4 주 및 8 주 후에도 생존한 것으로 나타났다.
실험예 2. 생체 외(in vitro) 조직학적 평가
상기 실시예 1 및 2에 따른 3D 프린팅 PCL 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을코팅한 후, 스캐폴드의 시험관 내 배양을 4 주 및 8 주 동안 수행하였다. 배양을 위해 500 mL DMEM-저 포도당, 인슐린-트랜스페린-셀레니윰 G 보충제 5 mL, 1mg 덱사메타손, 100mL 피루브산 나트륨, 100g BSA, 5g 아스코빅산, 25g L-프롤린 및 10 μg TGF-β를 포함하는 배지를 이용하였다. 배양 기간 후, 면역 염색을 위해 시료를 준비하고, 10% 중성-완충 포르말린으로 24 시간 동안 고정한 후, 조직을 파라핀에 매립하고, 4μM 두께로 절단하였다. H&E(hematoxylin-eosin) 및 사프라닌-O로 염색한 후, 시료를 광학 현미경으로 관찰하였다. 4 주 및 8 주의 시험관 내 배양 후, 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드에 대한 H&E 염색의 광학 현미경 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, H&E 염색 결과, 각각 4 주 및 8 주의 배양 후에 연골세포가 생존한 것으로 나타났다. 또한, 8 주 배양 후에 더욱 확연한 빈틈의 생성 및 연골세포의 표면형 성숙이 관찰되었다. 또한, 4 주 및 8 주의 시험관 내 배양 후, 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드에 대한 사프라닌-O 염색의 광학 현미경 결과를 도 5에 나타내었다. 여기서 (c) 및 (d)는 2mm 스케일 바, 및 (e) 및 (f)는 1mm 스케일 바의 상세 이미지이다.
도 5에 나타난 바와 같이,사프라닌-O 염색 결과, 각각 4 주 및 8 주의 배양 후에 스캐폴드의 측부를 따라서 연골 조직이 더욱 두드러지게 형성된 것을 알 수 있다. 또한, 새로 생성된 연골은 기존 연골에 비해 완전히 성숙된 형태를 나타내지 않았으나, 세포외 기질 생성은 8 주 배양 후 더욱 두드러지게 나타났다.
실험예 3. 전체적인 형태, 방사선학적 평가 및 생체 내(in vivo) 평가
12 주 연령 및 2.5-3.0 kg 무게의 뉴질랜드 흰 토끼를 이용하여 생체 내 실험을 수행하였다. 토끼를 21 ± 1℃의 우리(cage)에 보관하고, 음식 및 물에 자유로운 접근을 허용하였다. 조명을 오전 8시에서 오후 8시까지 켜 놓았고, 상기 토끼를 마취하기 쉬운 위치에 위치시켰다. 수직 절개는 No. 15 블레이드를 사용하여 코 피부에 만들어졌으며 코 뼈 및 상부 측면의 연골을 노출하고 골막을 완전히 올린 후, 본 발명의 3D 프린팅 스캐폴드를 코 등(dorsum) 부분에 삽입하였다. 삽입 후에는, 피부 및 피하 조직을 꼼꼼히 봉합하였다.
3-1 전체적인 형태 및 방사선학적 평가
3D 프린팅 스캐폴드의 이식 4 주 및 12 주 후, 토끼 코 등 부분을 면도한 후, 이식 위치의 전체적인 모습을 평가하였다. 코 등 쪽의 융비 정도, 피부 절개의 상태 및 수술 후 합병증의 여부를 육안으로 관찰하였다. 또한, 이식된 물질의 상태를 확인하기 위하여 이식 12 주 후, 토끼를 마취한 후에 CT 스캐너 시스템을 이용한 컴퓨터 단층촬영(CT)를 수행하였다. 측면 및 관상 이미지를 1 mm 컷으로 기록하였다. (a) 3D 프린팅 스캐폴드의 골 막하 이식 형태 및 이식 후 (b) 4 주, 및 (c) 12 주 후의 전체적인 형태를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 총 6 마리의 토끼 중, 어떤 토끼도 관찰 기간 동안 스캐폴드 이식체와 관련된 합병증이 발견되지 않았다. 또한, 이식체 및 토끼의 배등면의 전체적인 형태는 3달 동안 변하지 않고 유지되었다. 이식 12 주 후, CT를 이용한 연골세포 코팅된 PCL 스캐폴드 구조체에 대한 방사사학적 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 3D 프린팅 스캐폴드의 초기 형상이 이식 12 주 후까지도 어떠한 이상 없이 유지되는 것을 알 수 있다.
3-2 생체 내(in vivo) 평가
상기 이식 4 주 및 12 주의 각각 토끼 3마리를 희생시키고, 코 뼈, 상부 측면의 연골, 비중격(nasal septum), 임플란트 위치 및 전체 구조물을 포함하는 코의 배등면을 절개하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 10% 중성-완충 포르말린으로 24시간 동안 고정한 후, 조직을 파라핀에 매립하고, 4μM 두께로 절단하였다. H&E(hematoxylin-eosin) 및 사프라닌-O로 염색한 후, 시료를 광학 현미경으로 관찰하였다. 이식 4 주 및 12 주 후의 피부 및 연부 조직 외피(soft tissue envelopes)를 포함하는 3D 프린팅 스캐폴드의 조직 평가 결과를 도 8에 나타내었다. 여기서, (a)~(d)는 H&E 염색 결과를 나타내고, (c)~(d)는 사프라닌-O 염색 결과를 나타내며, (a), (b), (e) 및 (f)는 2mm 스케일 바, 및 (c), (d), (g) 및 (h)는 1mm 스케일 바의 이미지이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 스캐폴드 구조물 및 연부 조직 외피는 어떠한 이상 없이 유지된 것을 알 수 있고, 스캐폴드 구조체의 중앙부에 새로운 혈관이 형성된 것을 알 수 있다(화살표로 표시). 또한, 합병성 염증 및 감염의 존재 여부에 대한 항-토끼 대식세포 항체(RAM 11)를 이용한 평가 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 이식 구조물과 관련된 염증성 세포 침윤 분석은 이식 4 주 및 12 주 후의 모든 경우에, 스캐폴드 구조체의 중앙부에 대식세포에 대한 최소한의 양성 염색을 나타내었다.

Claims (14)

  1. (1) 3차원(3D) 프린팅으로 생분해성 고분자가 적층된 다공성 스캐폴드를 제조하는 단계; 및
    (2) 상기 다공성 스캐폴드에 연골세포 및 피브린을 코팅하는 단계;를 포함하는, 융비술 재료의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서, 3D 프린팅은 바이오플로터(bio-plotter)를 이용하여 생분해성 고분자를 노즐로부터 압출하여 스테이지에 적층함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서, 생분해성 고분자는 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리(L-락티트)(poly(L-lactide), PLA), 폴리(락티트-코-글리콜라이드(poly(lactide-co-glycolide), PLGA) 또는 폴리스티렌(polystyrene, PS)의 생합성 고분자인 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서, 스캐폴드는 가로 3~7 cm × 세로 1~3 cm × 높이 0.5~1.5 cm의 크기인 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서, 스캐폴드는 평균 지름 200~700 μM의 공극을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 연골세포는 연골조직으로부터 분리된 것 또는 중간엽 줄기세포로부터 분화된 것인 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 연골세포는 자가연골세포인 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 연골세포는 (1') 채취된 연골조직을 인삼염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 수세한 후, 0.1~1% 콜라게나아제를 함유한 PBS 용액에 부유하고, 30~40℃에서 3~7시간 정치시켜 연골세포를 분리하는 단계; 및 (2') 상기 분리된 연골세포를 나일론 필터로 여과하고 원심분리한 후, 5~13% 소 태아 혈청, 80~120 U/mL 페니실린 G, 및 80~120 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 배지로 부유하고, 3~7％ 이산화탄소 농도에서 35~40℃로 배양하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 준비된 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 피브린은 피브리노겐 용액에 트롬빈을 혼합하여 형성된 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 피브리노겐 용액은 아프로티닌, 피브린 안정 인자 XIII 및 염화칼슘(CaCl2)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 융비술 재료는 환자맞춤형인 것을 특징으로 하는, 융비술 재료의 제조방법.
  12. (1") 흰 토끼에 틸레타민(tiletamine) 4.0 mg/kg 및 올라제팜(olazepam) 4.0 mg/kg의 마취제를 투여한 후, 무릅 연골조직을 멸균 해부하여 수거하는 단계; (2") 상기 채취된 토끼의 무릅 연골조직을 인삼염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 수세한 후, 0.2% 콜라게나아제를 함유한 PBS 용액에 부유하고, 37℃에서 5시간 정치시켜 연골세포를 분리하는 단계; (3") 상기 분리된 연골세포를 100 μm 나일론 필터로 여과하고 1700rpm에서 10분 동안 원심분리하여 연골세포 펠렛을 수득하는 단계; (4") 상기 수득된 연골세포 펠렛을 PBS로 2회 세척한 후, 10% 소 태아 혈청, 100 U/mL 페니실린 G, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 배지로 부유하는 단계; (5") 상기 배지에 부유된 연골세포를 1.5 × 105 세포/cm2의 밀도로 평판배지에 분주하고, 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하여 연골세포를 준비하는 단계; (6") 상기 준비된 연골세포를 원심분리하여 펠렛화한 후, 9-18 mg/mL의 인간 유래 피브리노겐(fibrinogen)을 포함하는 용액에 재현탁하는 단계; (7") 상기 재현탁된 연골세포(5 × 106 세포/mL)을 포함하는 피브리노겐 용액을 110 KIU/mL 아프로티닌, 60 U/mL 트롬빈, 50 U 피브린 안정 인자 XIII, 및 50 mM CaCl2와 균일하게 혼합하여 연골세포가 혼합된 피브린을 형성하는 단계; (8") 폴리카프로락톤(PCL) 고분자 펠렛을 가열 실린더를 이용하여 100-130℃에서 녹인 후, 바이오플로터(bioplotter) 시스템을 이용하여 가로 5 cm × 세로 1.5 cm × 높이 1 cm의 크기를 갖는 스틱(stick) 모양의 3D 프린팅 스캐폴드를 제조하는 단계; (9") 상기 (7")단계의 연골세포 및 피브린을 상기 (8")단계의 3D 프린팅 스캐폴드에 코팅하는 단계;를 포함하는, 융비술 재료의 제조방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된, 연골세포 및 피브린이 코팅된, 3차원 다공성 생분해성 고분자 스캐폴드를 포함하는, 융비술 재료.
  14. 제 13항의 융비술 재료를 포함하는, 융비술 키트.
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