KR20230008668A - 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 연골화 유도물질을 포함함에 따라 상기 바이오잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 연골조직 구조체에서 연골세포 분화율을 현저히 증가시켜 연골 결손부의 연골조직 형성을 효과적으로 유도하며, 별도의 광가교 단계가 필요하지 않아 의료산업 전반에서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물 및 이를 이용한 연골조직 제조방법에 관한 것이다.
3D 프린팅이 본격적으로 의료분야에 접목되면서 의료기술의 대대적인 변화를 주도하고 있다. 대표적으로, 정형외과, 신경외과, 성형외과 및 치과를 중심으로 골절합용판, 추간체유합보형재, 인공관절, 두개골성형재료 및 의료용 가이드 등 환자 맞춤형 의료기기 제작에 3D 프린팅이 활용된다.
이와 같은 의료용 3D 프린팅은 의료용 맞춤형 제품의 임상 효용성이 크게 부각되어 시장 수요가 급격히 증가 중이다. 구체적으로는 2015년 기준 474억원 규모에서 2020년까지 연평균 23%의 고성장이 예측되고 있다.
그 중에서도, 3D 세포 프린팅 기술은 살아있는 세포와 생체적합성 재료를 이용해 실제 조직과 유사한 외형과 구조를 가진 기능성 인공조직을 제작하는 기술이다. 3D 세포 프린팅 기술의 핵심재료인 바이오잉크는 인쇄적성 (printability), 젤화 (gelation) 특성, 생분해성 (biodegradability), 세포적합성 (cell-compatibility), 세포 성장 (proliferation)과 분화 (differentiation)를 조절할 수 있는 특성을 가져야 한다.
그러나, 현재까지 이와 같은 조건들을 완벽하게 만족하는 바이오잉크는 존재하지 않는다. 특히, 현재 상용화된 대부분의 바이오잉크 재료들은 광경화성으로 경화를 위해 광개시제 및 후처리 공정이 필요하며, 이와 같은 후처리 공정은 생물학적 기능성에 제약으로 작용한다.
최근에는 광경화성 바이오잉크의 광개시제로 수용액에서 용해도가 향상되고 가시광선에서도 개시가 되는 Eosin Y (5% 미만 용해도) 또는 405 nm에서 경화되는 LAP (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate, 8.5% 미만 용해도)를 사용하기도 한다. 그러나, 아직까지 별도의 광가교 공정 없이 유효한 기계적 물성을 가지면서도, 인체 적용 시 조직 손실 부위에서 정확하게 손실부를 복원시키는 바이오잉크는 보고된 바가 없다.
한편, 관절 연골은 연골 세포 (chondrocyte)의 밀도가 낮아 상대적으로 세포 외 기질이 차지하는 부분이 많고, 관절 연골이 손상된 후 그 주변에 있는 연골 세포의 이동이 제한적이다. 따라서, 관절 연골의 회복능력은 다른 조직에 비하여 상대적으로 낮다고 알려져 있다.
이러한 관절 연골 손상의 치료를 위하여 중간엽 줄기세포를 이용한 연골의 재생치료법이 급속히 발전하고 있다. 그러나, 중간엽 줄기세포는 단독으로 이식할 경우 세포가 생착이 일어나기 이전에 이식 부위에서 이탈되는 단점이 지속적으로 지적되어왔다. 따라서, 이식 부위에 중간엽 줄기세포를 효율적으로 전달하면서도, 전달 후 연골 형성을 효율적으로 유도할 수 있는 조직공학 기술이 절실한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 연골조직 형성용 바이오잉크를 개발하고자 노력한 결과, 하이드로겔, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell; 이하, MSC), 및 연골화 유도물질 (chondrogenic inducer)로서 TGF-β (Transforming growth factor beta) 또는 PPARδ (Peroxisome proliferator-activated receptor delta) 작용제 (agonist)를 포함하는 바이오잉크 조성물을 사용하여 3D 프린팅을 하는 경우, 광가교제를 사용한 별도의 광경화 과정이 필요하지 않아 생물학적 기능성을 높은 수준으로 유지하면서도, 연골세포로의 분화율이 우수하여 연골 결손부의 연골조직 형성 효과가 현저함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물을 이용한 연골조직 제조방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물 및 이를 이용한 연골조직 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 명세서에서 용어 "바이오잉크"는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 용어이다.
본 발명에 일 예는하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 바이오잉크 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 콜라겐, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 모두 포함함에 따라 프린팅된 연골조직 구조체에서 연골세포 분화율을 현저히 증가시켜, 연골 결손부의 연골조직 형성을 효과적으로 유도하며, 별도의 광가교 단계가 필요하지 않음을 기술적 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 연골화 유도물질은 TGF-β 및 PPARδ 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 PPARδ (peroxisome proliferator-activated receptor delta) 작용제는 GW0742 (Cayman社 또는 biorbyt社), GW610742 (GlaxoSmithKline), GSK-0660 (CAS 1014691-61-2), GSK 3787 (CAS 188591-46-0) 및 GW 501516 (CAS 317318-70-0)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, GW0742일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 세포 배양 배지, 성장인자 및 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 개념이다. 세포 배양 배지는 예를 들어, 둘베코 인산 완충 식염수, 얼 균형화 염, 행크 균형화 염, 티로드 염, 알시버 용액, 게이 균형화 염 용액, 크랩-헨젤라이트 변성 완충제, 크랩-링거 중탄산 완충제, 퍽 식염수, 둘베코 변성 이글 배지, 둘베코 변성 이글 배지/영양소 F-12 Ham, 영양소 혼합물 F-10Ham(Ham's F-10), 배지 199, 이글 최소 필수 배지, RPMI-1640 배지, 에임즈 배지, BGJb 배지(Fitton-JacksonModification), 클릭 배지, CMRL-1066 배지, 피셔 배지, 글라스코우 최소 필수 배지(GMEM), 이스코브 변성 둘베코 배지(IMDM), L-15 배지(Leibovitz), 맥코이 5A 변성 배지, NCTC 배지, 스윔 S-77 배지, 웨이마우스 배지, 윌리엄 배지 E, 또는 이의 조합을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 성장인자는 세포에 의해 생성되고 그 자체 및/또는 여러 가지의 다른 인접한 또는 동떨어진 세포에게 영향을 줄 수 있는 사이토카인을 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다.
본 발명에 있어서 세포 배양 배지는 알부민, 셀레늄, 트랜스페린, 페투인, 슈가, 아미노산, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항생물질, 지질, 지질 담체 및 시클로덱스트린로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 연골화 유도물질은 세포 배양 배지에 포함된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 연골화 유도물질 + 중간엽 줄기세포:콜라겐은 1:1 내지 5, 1:1 내지 4, 1:1 내지 3, 1:2 내지 5, 1:2 내지 4, 1:2 내지 3의 부피비로 혼합된 것일 있으며, 예를 들어, 1:3의 부피비로 혼합된 것일 수 있다.본 발명에 있어서 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 알지네이트 (alginate), 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 기반의 하이드로겔일 수 있으며, 예를 들어, 콜라겐 또는 젤라틴 기반의 하이드로겔일 수 있다.
본 발명에 있어서 젤라틴은 젤라틴 메타아크릴레이티드, 사이올레이티드 젤라틴 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 히알루론산은 메타아크릴레이티드 히알루론산, 사이올레이티드 히알루론산 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 하이드로겔은 바이오잉크 조성물 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10 %(v/v), 0.1 내지 9 %(v/v), 0.1 내지 8 %(v/v), 0.1 내지 7 %(v/v), 0.1 내지 6 %(v/v), 0.1 내지 5 %(v/v), 0.1 내지 4 %(v/v), 0.5 내지 10 %(v/v), 0.5 내지 9 %(v/v), 0.5 내지 8 %(v/v), 0.5 내지 7 %(v/v), 0.5 내지 6 %(v/v), 0.5 내지 5 %(v/v), 0.5 내지 4 %(v/v), 1 내지 10 %(v/v), 1 내지 9 %(v/v), 1 내지 8 %(v/v), 1 내지 7 %(v/v), 1 내지 6 %(v/v), 1 내지 5 %(v/v), 1 내지 4 %(v/v) , 2 내지 10 %(v/v), 2 내지 9 %(v/v), 2 내지 8 %(v/v), 2 내지 7 %(v/v), 2 내지 6 %(v/v), 2 내지 5 %(v/v), 2 내지 4 %(v/v) 포함될 수 있으며, 예를 들어, 3 %(v/v)로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 골수, 피부, 지방, 편도, 제대혈 및 와튼 젤리(Wharton's jelly)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것일 수 있으며, 예를 들어, 와튼 젤리 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 와튼 젤리 유래 중간엽 줄기세포와 연골화 유도물질을 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물에 콜라겐을 첨가하여 바이오잉크 조성물을 제조하였다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 1 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 3 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 5 x 105 내지 1 x 107 cells/ml, 1 x 106 내지 1 x 107 cells/ml, 2 x 106 내지 1 x 107 cells/ml, 1 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 3 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 5 x 105 내지 5 x 106 cells/ml, 1 x 106 내지 5 x 106 cells/ml, 2 x 106 내지 5 x 106 cells/ml, 1 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 3 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 5 x 105 내지 3 x 106 cells/ml, 1 x 106 내지 3 x 106 cells/ml, 2 x 106 내지 3 x 106 cells/ml로 포함될 수 있으며, 예를 들어, 2 x 106 cells/ml로 포함된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 세포들은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney(1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 바이오잉크를 사용한 3D 프린팅에 통상적으로 사용되는 겔화 고분자를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 푸코이단, 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 실크, 폴리이미드 (polyimides), 폴리아믹스산 (polyamix acid), 폴리카프로락톤 (polycarprolactone), 폴리에테르이미드 (polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드 (polyaramid), 폴리비닐알콜 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트 (poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드 (polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린 (polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴 (polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드 (polyethylene oxide), 폴리스티렌 (polystyrene), 셀룰로오스 (cellulose), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate), 폴리락산 (polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산 (polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체 (PLGA), 폴리 {폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트} (PEOT/PBT), 폴리포스포에스터 (polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠 (PPA), 폴리안하이드라이드 (Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA} 및 폴리에틸렌글라이콜디아크릴레이트 {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 조성물의 기계적 물성 또는 프린팅 경향성을 조절하기 위해 임의의 점성 증강제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 히알루론산 및/또는 덱스트란 (dextran)을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 전단률을 최소화하고, 분배 속도를 개선하기 위해 임의의 윤활제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 글리세롤 (glycerol)을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 세포 접착을 촉진하는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 피브린 글루 (Fibrin glue) 등의 혈액 응고제를 응용한 제품 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 산화방지제를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 에리소르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르브산 및 그 염, L-아스코르브산팔미테이트, L-아스코르브산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈릭산트리아밀, 갈릭산프로필 또는 에틸렌디아민4아세트산나트륨 (EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 바이오잉크 조성물은 세포사 (예를 들어, 괴사, 세포사멸, 또는 자율흡수작용)를 억제하는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 소분자, 항체, 펩티드, 펩티바디, 항-TNF 물질, 인터류킨의 활성을 억제하는 물질, 인터페론의 활성을 억제하는 물질, GCSF (과립구 콜로니-자극 인자)의 활성을 억제하는 물질, 대식세포 염증성 단백질의 활성을 억제하는 물질, MMP(매트릭스 메탈로프로티나제)의 활성을 억제하는 물질, 카스페이스의 활성을 억제하는 물질, MAPK/JNK 신호전달 캐스케이드의 활성을 억제하는 물질, Src 키나아제의 활성을 억제하는 물질, JAK(야누스 키나아제)의 활성을 억제하는 물질, 또는 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 하기의 단계를 포함하는 연골조직 제조방법에 관한 것이다.
하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅하여 연골조직을 제조하는 프린팅 단계.
본 발명에 있어서 연골조직 제조방법은 하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린터에 충전하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바이오잉크 조성물에 대한 기재는 기 상술한 바와 동일하여 중복 기재를 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 예는 다음의 단계를 포함하는 연골조직 제조방법에 관한 것이다.
하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅하여 제1 하이드로겔 층을 프린팅하는 제1 하이드로겔 층 프린팅 단계; 및
하이드로겔 및 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅하여 제2 하이드로겔 층을 제1 하이드로겔 층 위에 프린팅하는 제2 하이드로겔 층 프린팅 단계.
본 발명에 있어서 제조방법은 제1 하이드로겔 층 프린팅 단계 및 제2 하이드로겔 프린팅 단계를 적어도 1회 이상 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제조방법은 연골조직을 인큐베이터에서 배양하여 젤화하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 젤화하는 단계는 광경화를 통한 젤화가 아닌 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 연골조직 제조방법은 광가교 공정 없이도 유효한 기계적 물성을 가지면서, 인체 적용 시 연골 손실 부위에서 정확하게 손실부를 복원시킬 수 있어 임상 적용성이 현저히 우수한 연골조직 유사기관을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 제조방법은 프린팅된 제1 하이드로겔 층의 일면에 생체적합성 접착제를 고정시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제1 하이드로겔 층의 일면은 제2 하이드로겔 층이 적층되지 않은 면을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 생체적합성 접착제는 피브린 글루 (Fibrin glue), 폴리도파민 시아노아크릴레이트, 단백질 글루, 폴리우레탄 및 PEG 함유 실란트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 피브린 글루를 사용할 수 있으나, 생체적합성 접착제는 인공관절을 주위의 뼈와 고정시키는 접착제를 의미하며, 인공관절 이식 시 접착력을 증가시킬 수 있는 물질이면 제한 없이 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서 용어 "피브린 글루"는 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘 등을 주요성분으로 포함하는 제품을 의미한다. 피브린 글루는 접착이 빠르고 열이나 압력이 불필요하며 접착부위의 환경에 크게 영향을 받지 않고 생체적합하며 생분해 특성 등의 생물학적 장점을 가져 현재 다양한 용도로 사용되고 있는데, 유럽 등에서는 피브린의 조직 교착작용을 이용하여 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘, 및 선용 효소의 저해제를 조직접착제로서 말초신경의 봉합, 미소 혈관의 봉합 등에 적용하여 봉합의 대용 또는 보강을 위한 임상응용이 실시되고 있다. 또한, 일본에서는 수술용 접착제로서 혈관 외과 영역을 비롯해 뇌신경 외과수술, 뼈의 접착 등 정형외과 수술, 열상 환자의 지혈 등에 이용되고 있다.
본 발명의 또 다른 일예는 본 발명의 연골조직 제조방법에 따라 제조된 연골조직에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 연골화 유도물질 (chondrogenic inducer)로서 TGF-β 또는 GW0742를 중간엽 줄기세포에 첨가하고, 상기 혼합물과 콜라겐을 최적의 비율로 혼합하여 제조한 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물을 사용하여 3D 프린팅을 통해 연골조직을 제조하고, 상기 프린팅된 연골조직은 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화능이 우수함을 확인하였다.
본 발명에 따른 바이오잉크를 사용하여 프린팅된 연골조직은 연골 구조물 내 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화하도록 유도하는 연골화 유도물질을 함께 포함하여 자연 연골 구조와 구조 및 기능이 매우 유사한 연골 형성이 가능하다.
따라서 본 발명에 따라 제조된 연골조직은 이식 부위에 중간엽 줄기세포를 효과적으로 전달하여 연골결손과 관련된 질환의 효과적인 치료가 가능할 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물은 연골화 유도물질을 포함하므로, 상기 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 연골조직 구조체에서의 연골세포 분화율이 현저히 증가되어, 연골 결손부의 연골조직 형성을 효과적으로 유도하며, 별도의 광가교 단계가 필요하지 않아 의료산업 전반에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오잉크 조성물을 이용하여 제조한 연골조직을 적용하는 모습을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직을 도식화한 그림이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직에서의 콜라겐의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 PPARδ를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직에서의 콜라겐의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 시안 블루 (Alcian blue) 염색을 수행하기 위해 프린팅 후 14일째 프린팅된 디스크 형태의 연골조직을 2% 히알루론산 내에 위치시킨 모습을 보여주는 그림이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 사용하여 제조한 하이드로겔에서 알시안 블루(Alcian blue) 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 2종의 연골조직의 알시안 블루 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 2종의 연골조직의 알시안 블루 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직을 도식화한 그림이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직에서의 콜라겐의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 PPARδ를 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시켜 제조한 연골조직에서의 콜라겐의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 시안 블루 (Alcian blue) 염색을 수행하기 위해 프린팅 후 14일째 프린팅된 디스크 형태의 연골조직을 2% 히알루론산 내에 위치시킨 모습을 보여주는 그림이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골화 유도물질로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크 조성물을 사용하여 제조한 하이드로겔에서 알시안 블루(Alcian blue) 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 2종의 연골조직의 알시안 블루 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 2종의 연골조직의 알시안 블루 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물의 제조
본 실험은 삼성의료원의 연구 심사위원회 (Institutional Review Board; IRB)의 승인을 받았으며, 모든 샘플은 사전 동의를 얻어 수집하였다.
구체적으로, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells from Wharton's jelly; 이하, WJ-MSC) 5 x 105 cells/ml 와 3%(v/v) 콜라겐 (DeCelluid® Bone Bio-ink; T&R Biofab, Korea)을 혼합하여 준비하였다. 중간엽 줄기세포의 분리는 종래 알려진 방법으로 제대혈, 골수, 지방을 기증 받아 분리하거나, 삼성서울병원 미래의학연구원 줄기세포재생의학연구소의 GMP시설에서 생산하는 중간엽 줄기세포를 구입하여 사용하였다. 분리된 세포들은 10% FBS (fetal bovine serum, Invitrogen-Gibco) 및 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen-Gibco)이 포함되어 있는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen-Gibco, Rockville, MD) 배지를 이용해 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
혼합은 37℃ 이하의 온도에서 수행하여 콜라겐이 젤화 (gelation)되는 것을 방지하였다. 배지에 포함된 중간엽 줄기세포에 연골화 유도물질 (chondrogenic inducer)로서 TGF-β (Sigma-Aldrich, R&D, Sinobio) 또는 GW0742 (PPARδ 작용제; Cayman社 또는 biorbyt社)를 각각 1μM의 농도로 첨가하고 콜라겐과 혼합하여 최종 혼합비가 연골화 유도물질 + 중간엽 줄기세포:콜라겐 = 1:3 (v/v)이 되도록 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물을 제조하였다. 중간엽 줄기세포 및 콜라겐 혼합물만을 포함하는 대조군의 경우 연골화 유도물질 대신 동량의 PBS를 혼합하였다. 바이오잉크 조성물의 제조 시 각 성분의 함량 및 혼합 비율을 하기 표 1에 나타내었다(디스크 1개 기준의 양).
| 성분 | 대조군 | (10mm x 1 mm) |
| 1 | 3% Collagen | 60 uL |
| 2 | PBS + MSC | 20 uL |
| Ratio (No.1: No.2) | 3:1 | |
| MSC concentration | 20 X 10^5/mL MSC | |
| 성분 | 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물 | (10mm x 1 mm) |
| 1 | 3% Collagen | 60 uL |
| 2 | 연골화 유도물질(TGF-β 또는 GW0742) + MSC | 20 uL |
| Ratio (No.1: No.2) | 3:1 | |
| MSC concentration | 20 X 10^5/mL MSC |
실시예 2. 3D 프린팅을 통한 연골조직의 제조
실시예 1에서 준비한 바이오잉크 조성물을 클린룸 내에 설치된 3D 프린터 (3DX-Printer, T&R Biofab, Korea)의 시린지에 충진하여 프린팅하였다. 프린팅 시 250 ㎛ 직경을 갖는 노즐을 사용하였으며, 한 층의 적층 높이는 250 ㎛로 하여 총 4번의 적층을 통해 두께 1 mm, 지름 10 mm의 하이드로겔 (hydrogel)을 제작하였다. 프린팅은 10 내지 15 ℃에서 공압 조건 30 내지 70 kPa으로 수행하였다. 프린팅된 디스크 (disc) 타입의 하이드로겔은 젤화를 위하여 37 ℃의 세포배양 인큐베이터에서 2시간 동안 두었다. 동일한 방법으로, 연골화 유도물질 대신 PBS (25%, v/v)를 동량으로 첨가한 콜라겐 및 중간엽 줄기세포 혼합물을 사용하여 프린팅하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
실시예 3. 3D 프린팅을 통한 연골조직의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 프린팅하되, 2종류의 연골화 유도물질을 각각 포함하는 바이오잉크 조성물을 차례로 사용하여 적층시킨 연골조직을 제조하였다.
먼저, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells from Wharton's jelly, WJ-MSC) 5 x 105 cells/ml 와 3%(v/v) 콜라겐 (DeCelluid® Bone Bio-ink; T&R Biofab, Korea)을 혼합한 후, 0.5μM TGF-β를 첨가하여 제조한 바이오잉크 조성물을 3D 프린터의 시린지에 충진하여 250 ㎛ 높이의 제1 하이드로겔 층을 제작하였다.
그 다음, 연골화 유도물질의 첨가 없이 중간엽 줄기세포 5 x 105 cells/ml 와 3%(v/v) 콜라겐을 혼합하여 제조한 바이오잉크 조성물을 시린지에 충진하여 중간엽 줄기세포와 콜라겐으로만 구성된 제2 하이드로겔 층을 제1 하이드로겔 층 위에 프린팅하였다.
그 후, 중간엽 줄기세포 5 x 105 cells/ml 와 3%(v/v) 콜라겐을 혼합한 후, 0.5 μM GW0742를 첨가하여 제조한 바이오잉크 조성물을 시린지에 충진하여 제2 하이드로겔 층 위에 다시 제1 하이드로겔 층을 프린팅하였다.
마지막으로, 연골화 유도물질의 첨가 없이 중간엽 줄기세포 5 x 105 cells/ml 와 3%(v/v) 콜라겐을 혼합하여 제조한 바이오잉크 조성물을 제1 하이드로겔 위에 다시 한 번 프린팅하여 제1 하이드로겔, 제2 하이드로겔, 제1 하이드로겔 및 제2 하이드로겔이 교대로 적층된 두께 1 mm, 지름 10 mm의 하이드로겔을 제작하였다.
그 다음, 프린팅된 하이드로겔은 젤화를 위하여 37 ℃의 세포배양 인큐베이터에서 2시간 동안 두었다. 이를 도 1에 나타내었다.
시험예 1. 제조된 연골조직의 콜라겐 (type II collagen) 발현 확인
실시예 2의 방법에 따라, TGF-β를 포함하는 하이드로겔 및 GW0742를 포함하는 하이드로겔의 두 종류의 하이드로겔을 제조하였다. 제조된 하이드로겔에서 중간엽 줄기세포가 연골세포로 성공적으로 분화되었는지 확인하기 위하여, 자연 연골에 들어있는 연골세포 특이적 분화인자인 II형 콜라겐 (type II collagen)의 유전자 발현양을 측정하였다.
구체적으로, 10% SDS-PAGE 겔을 이용하여 면역블롯팅 분석법 (immunoblotting analysis)을 수행하고, 항-콜라겐 (type II) 항체를 이용하여 연골화 유도물질이 콜라겐 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 대조군으로는 프린팅 전 배양 중인 상태의 중간엽 줄기세포 (Vehicle), 연골화 유도물질 대신 PBS를 첨가한 콜라겐 및 중간엽 줄기세포 혼합물로 프린팅된 하이드로겔 (Collagen), 배양 상태의 중간엽 줄기세포에 GW0742를 첨가하여 배양한 세포 (PPARδ)를 사용하였다. 그 결과를 도 3a 내지 도 3b 및 표 2에 나타내었다.
| Type II Col/b-actin | |||
| Vehicle | 0.5464 | 0.4888 | 0.5641 |
| Collagen | 0.3942 | 0.4253 | 0.3970 |
| PPAR δ | 0.4027 | 0.4620 | 0.3806 |
| Collagen+PPAR δ | 1.0393 | 0.9282 | 1.0430 |
도 3a 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 연골화 유도인자로 TGF-β를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 프린팅한 하이드로겔에서 콜라겐이 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다.
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 연골화 유도인자로 PPARδ 작용제인 GW0742를 포함하는 바이오잉크를 사용하여 프린팅한 하이드로겔에서도대조군과 비교하여 콜라겐 발현량이 현저히 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물은 연골화 유도인자로 TGF-β 또는 GW0742를 포함시킴에 따라 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화에 큰 영향을 미침을 확인하였다.
시험예 2. 알시안 블루 염색
실시예 2에서 프린팅한 연골조직에 대하여 알시안 블루 (Alcian blue) 염색을 수행하여 연골세포로의 분화를 통한 연골 특이적 기질 합성을 평가하였다. 평가를 위해, 도 4a와 같이 프린팅 후 14일째 프린팅된 디스크 형태의 연골조직을 2% 히알루론산 내에 위치시키고 실험을 수행하였다.
구체적으로, 프린팅된 연골조직을 3.7% 포름알데하이드 용액 (Formaldehyde solution)에 고정시켰다. 그 다음, 조직을 증류수로 5회 세척하였다. 1% 알시안 블루 (Alcian Blue solution in 3% acetic acid, pH 2.5)를 이용해 실온에서 10분간 염색하였다. 그 다음, 조직을 흐르는물에 색소 부유물이 표본에 점착되지 않도록 3분간 세척한 후, 염색된 정도를 관찰하였다. 알시안 블루는 연골 특이적 기질 중 글리코사미노글리칸 (Glycosaminoglycan, GAG)을 파란색으로 염색시키며, 이를 현미경(100x)으로 관찰한 측정 결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, PBS를 사용한 대조군과 비교할 때 TGF-β를 첨가하여 제조한 바이오잉크 조성물로 프린팅한 하이드로겔에서 파란색으로 염색된 GAG가 다량 확인되었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물로 프린팅된 연골조직은 연골화 유도물질을 포함함에 따라 연골 특이적 기질을 효과적으로 생성시키며, 이로부터 중간엽 줄기세포가 자연 연골 세포와 유사한 기능성을 가지는 연골 세포로 분화되어 연골조직 이식부위에서 연골형성을 효과적으로 유도시킬 수 있음을 확인하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, TGF-β 3 ng/ml와 PPAR δ agonist GW0742 1 μM에서 가장 높은 연골세포 분화율을 보임을 확인하였다
시험예 4. TGFb와 PPARD 비교
WIESLAB® sGAG quantitative kit 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 각 바이알에 50 μL의 8 M GuHCl을 첨가하고 15 분 동안 실온에서 혼합 및 배양하였다. 그 다음, 각 바이알에 50 μL의 SAT 용액을 넣고 RT에서 15 분간 혼합 및 배양하였다. 그 다음, 각 바이알에 750 μL의 Alcian Blue 작업 용액을 넣고 실온에서 15 분 이상 혼합 및 배양하였다. 그 다음, 12 000 x g에서 15 분 동안 원심 분리하고, 주사기로 흡입하여 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 그 다음, 펠릿에 500 μL의 DMSO 용액을 첨가한 후 교반하하고, 실온에서 진탕 기에서 15 분 동안 혼합하였다. 그 다음, 12 000 x g에서 15 분 동안 원심 분리하여, 부유물을 제거하였다. 그 다음, 펠릿에 500 μL Gu-Prop 용액을 추가하고, 15 분 동안 섞어주었다. 펠렛이 완전히 용해되었는지 확인한 다음, 평평한 바닥 마이크로 플레이트 웰에 2 x 240 μl을 분배하였다. 그 다음, 마이크로 플레이트 리더에서 620nm의 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 6 및 표 3에 나타내었다.
| Control | |||
| Positive | 89.6434 | 93.3543 | 90.9478 |
| Negative | 16.7142 | 12.9894 | 20.6715 |
| TGF-β | |||
| 9 ng/ml | 57.0457 | 54.618 | 52.3492 |
| 3 ng/ml | 34.2684 | 32.4596 | 34.4241 |
| 1 ng/ml | 28.525 | 22.8991 | 21.335 |
| GW0742 | |||
| 10 μM | 45.2793 | 43.2054 | 42.7462 |
| 1 μM | 67.731 | 64.9189 | 65.6283 |
| 0.5 μM | 35.721 | 32.0222 | 30.131 |
*:statistically significant difference compared to the negative control group (p < 0.01). #:statistically significant difference compared to the negative control group (p < 0.05).
도 5 내지 도 6 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 바이오잉크 조성물은 연골화 유도물질을 포함함에 따라 상기 바이오잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 연골조직 구조체에서 연골세포 분화율을 현저히 증가시킴을 alcian blue 염색을 통해 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 연골화 유도물질을 포함함에 따라 상기 바이오잉크 조성물을 사용하여 프린팅된 연골조직 구조체에서 연골세포 분화율을 현저히 증가시켜, 연골조직 재생 또는 형성이 필요한 관절 연골손실 부위에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 바이오잉크 조성물은 별도의 광가교 단계가 필요하지 않아 의료산업 전반에서 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
Claims (13)
- 하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물로서,
상기 연골화 유도물질은 바이오잉크 조성물 전체 대비 0.5 내지 10 μM의 PPARδ (peroxisome proliferator-activated receptor delta) 작용제인 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 알지네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜 기반의 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 바이오잉크 조성물 총 중량을 기준으로 0.1 내지 10 %(v/v)로 포함되는 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 피부, 지방, 편도, 제대혈 및 와튼 젤리 (Wharton's jelly)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 1 x 105 내지 1 x 107 cells/ml로 포함되는 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 세포 배양 배지, 성장인자 및 사이토카인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가적으로 포함하는 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 연골화 유도물질 및 중간엽 줄기세포:콜라겐은 1:1 내지 5의 부피비로 혼합된 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 겔화 고분자, 점성 증가제, 윤활제, 세포 접착을 촉진하는 물질, 산화방지제 및 세포사를 억제하는 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것인, 연골조직 형성용 바이오잉크 조성물.
- 하기의 단계를 포함하는 연골조직 제조방법:
하이드로겔, 중간엽 줄기세포 및 연골화 유도물질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅하여 제1 하이드로겔 층을 포함하는 연골조직을 제조하는 제1 하이드로겔 층 프린팅 단계로서,
상기 연골화 유도물질은 바이오잉크 조성물 전체 대비 0.5 내지 10 μM의 PPARδ (peroxisome proliferator-activated receptor delta) 작용제인 것인, 제1 하이드로겔 층 프린팅 단계. - 제9항에 있어서, 상기 제조방법은 하기의 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법:
하이드로겔 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 바이오잉크 조성물을 3D 프린팅하여 제2 하이드로겔 층을 제1 하이드로겔 층 위에 프린팅하는 제2 하이드로겔 층 프린팅 단계. - 제10항에 있어서, 상기 제조방법은 제1 하이드로겔 층 프린팅 단계 및 제2 하이드로겔 프린팅 단계를 적어도 1회 이상 수행하는 것인, 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 제조방법은 하이드로겔이 콜라겐인 경우 연골조직을 인큐베이터에서 배양하여 젤화하는 단계를 더 포함하는 것인, 연골조직 제조방법.
- 제9항에 따라 제조된 연골조직.
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