JP2003534792A - 軟骨代替物の培養方法及びその方法により製造されるバイオマトリックス - Google Patents

軟骨代替物の培養方法及びその方法により製造されるバイオマトリックス

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、軟骨細胞の培養方法、脱分化した軟骨細胞の再分化方法及び軟骨移植体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は分化軟骨細胞及び脱分化軟骨細胞の培養方法、軟骨代替物、バイオマ
トリックス、細胞−基質−軟骨系並びにそれらの製造方法に関する。
【０００２】 関節疾患は、広く発病がみられ、罹患した者に多くの苦しみをもたらす病気で
ある。例えば骨や軟骨の欠損は、関節症の発症、さらには外傷後症状や内在人工
骨頭の弛緩において中心的役割を果たす。このような欠損は自家若しくは同種の
骨又は軟骨あるいは適当な代替材料を用いて治療することができる。自家材料は
無制限に利用できる訳でなく、同種移植体の場合は感染症学的観点を考慮しなけ
ればならない。
【０００３】 変性又は外傷性関節疾患の主たる問題は、損傷した関節軟骨が再生能力をほと
んど示さないことである。このような軟骨欠損を、生物学的治療法として自家軟
骨細胞移植（ＡＣＴ）によって治療することが知られている。この治療法により
関節軟骨欠損におけるガラス軟骨の新規形成が初めて示された。
【０００４】 この方法の原理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した患者の軟骨細胞を、変性軟骨
の切除の後に、欠損部に縫着した骨膜葉の下に注入することに基づくものである
（Peterson法）。この方法は技術的に面倒であり、方法上の問題が生じる。例え
ば欠損部に軟骨細胞が長期的に残留することが保証されない。また培養した軟骨
細胞が、持続的な欠損充填に必要な基質を移植の時期に形成することができるか
否かがはっきりしない。移植される細胞はたいてい脱分化状態であり、線維芽細
胞との間で形態学的及び生理学的に共通性を有する。
【０００５】 それ自体公知の材料の特殊な構造を特徴とする新規な材料を骨又は軟骨の代替
物用として使用することは、ドイツ特許出願公開ＤＥ１９７２１６６１Ａ１によ
り公知である。その使用は、部分的又は完全に生体吸収性の材料からなる多数の
規則的に配列された棒状物質で本質的に構成されている三次元格子に基づく骨又
は軟骨移植体に関する。棒状物質は幾何学的三次元構造を形成し、この構造の弾
力性と強度は患者の体内で代替させようとする組織に合わせて調整される。棒状
物質はポリ−Ｄ−ラクチド、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−ＤＬ−ラクチド、ヒド
ロキシアパタイト、リン酸カルシウム、又はリン酸カルシウム若しくはヒドロキ
シアパタイトを本質的に含むそれらの物質の混合物、あるいはコラーゲン、寒天
又はゼラチンからなる。
【０００６】 ＷＯ９９／０８７２８はナノスフェアに埋め込まれた骨誘導性因子又は軟骨誘
導性因子の混合物を開示する。また例えばＩ型又はＩＩ型コラーゲンと、それに
植込まれた、ナノスフェアによって包み込まれた因子とを含有する生分解性基質
を含む系が開示される。ナノスフェアはポリマー粒子として形成されている。
【０００７】 コラーゲンでの三次元構造の作製、及びその間隙空間の例えば線維芽細胞又は
軟骨細胞による架橋、並びにこの網状構造の培養を培地中で行うこと、がＷＯ９
５／３３８２１に開示されている。上記細胞をこの三次元網状構造において培養
すること、及びその人工組織を軟骨代替物として使用することが、この公報に記
載されている。
【０００８】 ＷＯ９８／１７７９１には、軟骨前駆細胞の分離と使用が記述されている。こ
の軟骨前駆細胞を秩序をもつように増殖して、治療用の軟骨組織として使用する
ことができる。この公報には、三次元網状構造での軟骨細胞の培養と、その構造
における間隙の軟骨細胞による架橋が、記載されている。
【０００９】 ＷＯ９９／００１５２は生体性人工移植体の製造方法を開示する。その方法に
おいては、自家又は異種組織からすべての抗原反応性細胞を酵素的又は化学的処
理によって除去し、こうして得た細胞を含まない未変性材料に所望の自家細胞を
植込む。それによって直ちに使用可能な移植体が得られる。
【００１０】 公知の方法では、移植又は培養した軟骨細胞が本来の合成能力を再び示さない
ことが欠点である。
【００１１】 その原因は、軟骨の細胞間質に埋め込まれた軟骨の細胞（軟骨細胞）が、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ培養条件下で培養期間の経過とともに脱分化することにある。一次
軟骨細胞（Ｐ０培養）は軟骨組織から分離した後もなお軟骨細胞特有の合成能力
、例えばＩＩ型、ＩＸ型及びＸＩ型コラーゲンの生成を示すが、培養した細胞は
その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ継代（Ｐ１−ＰＸ）の間にこの典型的な性質を失う。
【００１２】 しかも軟骨細胞は、他の細胞とは対照的に培養しにくい。培養した軟骨細胞は
脱分化状態にあり、形態学的・生理学的に線維芽細胞と類似している。一方で、
とりわけ欠損が大きい場合は、少ない試料から十分な量の移植材料を製造するた
めに、培養と継代により自家軟骨細胞を増殖することが必要である。
【００１３】 これまで軟骨細胞の脱分化は追加的な成長刺激剤の添加によって阻止するしか
なかった。このことはｉｎ ｖｉｖｏでのこの培養の使用をより困難にする。成
長刺激剤が受容生物の免疫系との間で不都合な相互作用を生じる可能性があるか
らである。また公知の方法では、細胞が培養状態での数回の継代の後も天然の又
はほぼ天然の物質代謝を維持することが保証されない。
【００１４】 また軟骨細胞を培養するための公知の三次元構造は、軟骨欠損毎に特異的に適
合させることができない。さらに、移植した軟骨細胞が欠損部位にて持続的に分
化状態で残留し、それによって軟骨の再生を可能にすることは保証されない。
【００１５】 移植した軟骨細胞の欠損部位への持続的な残留とそれに伴う軟骨の再生を保証
する移植法は、事実上未だ存在しない。
【００１６】 そこで本発明の根底にある技術的課題は、軟骨疾患の治療の改良、特に治療さ
れる軟骨欠損の治癒又は再生の改善を可能にする軟骨移植体、並びにその製造方
法及び手段を提供することである。
【００１７】 本発明は、特に、脱分化した軟骨細胞を三次元ゲル状バイオマトリックスで培
養し、そこで該細胞を再分化させ、その細胞特有の代謝能力を回復させる脱分化
軟骨細胞の再分化及び／又は増殖方法を提供することによって、本発明の根本的
課題を解決するものである。本発明のバイオマトリックスは、とりわけ、新鮮な
コラーゲン溶液から新たに構成されたコラーゲン基質を、少なくとも１．５ｍｇ
コラーゲン／ｍｌバイオマトリックス濃度、とりわけ１．５〜４ｍｇコラーゲン
／ｍｌバイオマトリックス濃度で含む。このコラーゲン基質は、２〜１０℃とり
わけ４℃で調製して保存した、とりわけｐＨ値が０．１〜６．９、とりわけ２．
０〜５．０、好ましくは３．０〜４．５、特に３．２〜４．２、特に好ましくは
３．８であるとりわけ細胞不含の酸性コラーゲン溶液から得られる。細胞不含の
バイオマトリックスを製造するために、このコラーゲン溶液を、培地（特に慣用
の細胞培地）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）及び血清（特にヒト自家血清
）からなる溶液と、２〜１０℃とりわけ４℃で混合し、次いで温度を例えば室温
又は３７℃に高めることによってゲル化させる。細胞を含むバイオマトリックス
を製造するには、とりわけ予備培養した細胞、例えば軟骨細胞又は軟骨前駆細胞
を培地、緩衝液及び血清からなる溶液に加え、次に２〜１０℃とりわけ４℃で、
同じく２〜１０℃とりわけ４℃に温度調整したコラーゲン溶液と混合する。次に
、こうしてバイオマトリックスに植込まれた細胞を培養し、場合によっては再び
分離することができる。続いてそれを例えば室温又は３７℃でゲル化し、バイオ
マトリックスを細胞培地で覆う。本発明の方法は、本発明に基づくバイオマトリ
ックスで細胞の中間培養を行うことにより、例えばＰ２培養の軟骨細胞を刺激し
て、三次元バイオマトリックス中で細胞特有の基質タンパク質、特にＩＩ型コラ
ーゲンを新たに合成させることができるという利点がある。これに対して公知の
培養ではコラーゲンの生成を検出することができない。続いて細胞を再びバイオ
マトリックスから分離して、培養することが好ましい。本発明に基づく脱分化軟
骨細胞の再分化によって、細胞が軟骨形成に必要な特有の合成能力を失うことが
ないように、軟骨細胞を長期間にわたって培養及び／又は増殖することができる
。このことは、軟骨組織の初期量が少なくても、軟骨移植体の製造のために十分
な細胞材料を提供できることが利点であることを意味する。
【００１８】 本発明に関連して「細胞培養」の概念は、適当な環境で例えば代謝産物及び生
成物を供給及び除去することによって、細胞の生存機能をとりわけｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで維持しながら、特に細胞を増殖させることを意味する。
【００１９】 本発明に関連して軟骨の細胞又は軟骨細胞とは、天然の又は遺伝子工学的に操
作した、動物又はヒト起源でありうる軟骨細胞若しくはその前駆細胞を意味する
。
【００２０】 本発明の別の実施形態では、分化した軟骨細胞を、特にその分化を維持しつつ
前述の特徴を有する三次元バイオマトリックスで培養することが示される。分化
した軟骨細胞の脱分化が起こることなく、一次培養物の代謝能力が維持される利
点がある。また本発明は再分化の抑制を含む軟骨細胞の培養法を提供する。
【００２１】 本発明の別の有利な実施形態では、機能、形態及び／又は分化状態について試
験すべき軟骨細胞を上記の三次元バイオマトリックス中に入れて培養し、同時に
及び／又はその後で試験することが示される。このようにして、軟骨細胞をｉｎ
ｖｉｖｏに埋め込む前に、例えば軟骨細胞の物質代謝をｉｎ ｖｉｔｒｏで調
べることができる。前記試験は例えば代謝能力の測定及び形態又は機能試験であ
る。
【００２２】 そこで本発明は軟骨細胞を上記の方法で培養し、同時に又はその後に例えば生
理学的、形態学的及び／又は分子生物学的パラメーターを試験する、スクリーニ
ング及び診断方法に関する。それにより、特に変性若しくは外傷性関節疾患又は
それらの疾患ではないことを判定することができる。この方法に関連して、潜在
的薬剤及び／又は病原体、抗原等が培養細胞に及ぼす影響を、例えば薬物スクリ
ーニング法で調べることができる。その場合、好ましい実施形態では、細胞を被
検因子の存在下及び不在下で培養し、観察される影響を互いに比較する。
【００２３】 本発明の別の有利な実施形態では、三次元バイオマトリックスでの培養に続い
て軟骨細胞をこのバイオマトリックスから分離し（例えばコラゲナーゼ処理及び
続く濃縮により）、従来の二次元又は三次元細胞培養で引き続き培養する。こう
して二次元培養と三次元培養の利点を有利な形で組み合わせることができる。
【００２４】 本発明の特に有利な実施形態では軟骨細胞を本発明の三次元バイオマトリック
スに入れ、移植可能な軟骨細胞（軟骨移植体ともいう）が続いて得られるように
このバイオマトリックス中で培養する。好ましい実施形態ではこの軟骨代替物は
関節軟骨代替物である。すなわちバイオマトリックスは、例えば細胞培養段階で
すでに軟骨欠損の形状に適合させることができる利点がある。
【００２５】 また有利な実施形態において、本発明は軟骨代替物、特に関節軟骨代替物を製
造するための上記方法に関し、軟骨細胞を三次元バイオマトリックスで培養した
後、とりわけコラゲナーゼ処理と遠心分離によりそのバイオマトリックスから分
離し、さらに、従来の二次元又は三次元細胞培養にて、好ましくは高い細胞密度
で、引き続き培養し、その結果移植可能な軟骨代替物、特に関節軟骨代替物を得
る方法に関する。
【００２６】 また本発明は、本発明に係る方法、並びに場合によりその後に続くか又は／及
び先に従来タイプの培養方法を行うことにより製造される、軟骨代替物、特に関
節軟骨代替物に関する。
【００２７】 また本発明は、上記の培養方法を実施することができる好ましくはゲル状のバ
イオマトリックス、即ち軟骨細胞を含まないバイオマトリックスと軟骨細胞を含
むバイオマトリックスの両方に関する。後者の場合は、バイオマトリックスとそ
こで培養された分化又は再分化軟骨細胞との組合せを、細胞−基質−軟骨系又は
バイオトランスプラントとも称する。このバイオトランスプラントを軟骨疾患又
は欠損の治療のために直接使用することができる。
【００２８】 本発明において「バイオマトリックス」とは、コラーゲン、細胞培地、血清及
び緩衝液（特にＨＥＰＥＳ緩衝液）を含むゲル構造を意味する。バイオマトリッ
クスの製造のために使用されるコラーゲン溶液は、特にｐＨ値が０．１〜６．９
、とりわけ２．０〜５．０、特に３．０〜４．５、好ましくは３．２〜４．２、
特に好ましくは３．８の酸性水性媒体、例えば酢酸、特に０．１％酢酸溶液中に
、高含量の未変性天然コラーゲンを含む溶液である。高含量とは、溶液中の全コ
ラーゲンに対する未変性コラーゲンの割合が５０％以上、特６０％以上、７０％
以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上、特に９９％以上であることを意
味する。好ましい実施形態では凍結乾燥したコラーゲンを使用しない。溶液のコ
ラーゲン含量は、３ｍｇコラーゲン／ｍｌ溶液〜８ｍｇ／ｍｌ溶液、とりわけ６
ｍｇコラーゲン／ｍｌ溶液であることが好ましい。好ましい実施形態では、例え
ばラットの尾から分離した後、０．１％酢酸中で４℃で３〜１４日間攪拌しつつ
インキュベートし、不溶のコラーゲン分を遠心分離して除去したコラーゲンを、
使用することが好ましい。細胞培地としてＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル
培地）を使用することが好ましい。しかし軟骨細胞の培養が可能な他のあらゆる
細胞培地も使用することができる。好ましい実施形態では、血清として自家ヒト
血清、緩衝液として例えばＨＥＰＥＳを使用するのがよい。好ましい実施形態で
は、この溶液のＨＥＰＥＳ濃度を３Ｍに調整する。細胞培地、緩衝液及び血清か
らなる溶液のｐＨ値は、好ましい実施形態では７．５〜８．５、例えば７．６〜
８．２、特に７．８である。もちろんバイオマトリックスは他の因子、例えば成
長因子、接着剤、抗生物質、選択薬剤等を含んでもよい。
【００２９】 そこで本発明はまた、細胞を含有するバイオマトリックスの製造方法に関する
。その方法の第１工程ではコラーゲン含有組織から分離したコラーゲン線維を緩
衝溶液中に集め、アルコールで表面消毒し、続いて緩衝溶液で洗浄し、さらにそ
れをｐＨ値０．１〜６．９、とりわけ２．０〜５．０、特に好ましくは３．０〜
４．０、特に３．３である酸性溶液、例えば０．１％酢酸溶液に移すことにより
、例えばラットの尾から新鮮なコラーゲンを調製する。次にさらなる工程として
、溶液中のコラーゲンを２〜１０℃、特に４℃で数日間例えば３〜１４日間攪拌
し、不溶のコラーゲン分を遠心分離して除去し、コラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜
８ｍｇ／ｍｌのこの最終的なコラーゲン溶液を、２〜１０℃、例えば４℃で保存
する。もちろんこの溶液を、例えば−１０℃〜−８０℃、特に−２０℃で、冷凍
状態で保存することが可能である。第３工程では、このコラーゲン溶液と、２倍
濃縮細胞培地、血清及び緩衝液を含むｐＨ値７．５〜８．５、好ましくは７．６
〜８．２、特に７．８の溶液とを好ましくは１：１の割合で混合し、ｐＨ値７．
０〜７．８、好ましくは７．４のバイオマトリックスを得る。バイオトランスプ
ラントを製造するために、２倍濃縮細胞培地、血清及び緩衝液からなる溶液と、
予備培養し遠心分離した軟骨細胞とを混合し、その際１ｍｌ当りに特に２×１０4 〜２×１０7個、好ましくは２×１０6個の細胞を使用する。ｐＨ値７．５〜８
．５、好ましくは７．６〜８．２、特に７．８のこの溶液を、次に上記のコラー
ゲン溶液と１：１の割合で、２〜１０℃、特に４℃で混合する。続いてゲル溶液
を培養容器にピペットで移し、３７℃でゲル化した後に培地で覆う。次にバイオ
トランスプラントを３〜８日間培養し、その後、移植のために利用する。
【００３０】 バイオトランスプラントは培養容器に入ったまま手術室へ運ばれ、そこで医師
が、例えばメスで機械的処理を行って大きさ、厚さ及び形状を欠損部に適合させ
る。続いてバイオトランスプラントは、例えば組織接着剤、特にフィブリン接着
剤によって、欠損部に固定される。約５分後にはバイオトランスプラントは欠損
部に固着されている。バイオトランスプラントは柔軟であるから、手術を関節鏡
視下にて行うこともできる。
【００３１】 バイオトランスプラントの別の使用例は、本発明に基づくバイオマトリックス
移植体と骨との組合わせである。その場合はバイオトランスプラントを例えばフ
ィブリン接着剤を用いて、例えば骨盤稜から得た自家骨円柱体に付着させる。本
発明によれば特に離断性骨軟骨症の治療、及び脳性麻痺に起因する股関節脱臼で
生じた寛骨頭欠損の治療、並びに膝関節の外傷性及び変性損傷の改善が可能にな
る。本発明に基づき新規な方法により早期の根治的治療によって外傷又は変性に
起因する関節疾患の進行を止めることができる。若年者の関節症の治療のための
、内在人工骨頭型関節代替物の使用をかなり遅らせて、場合によっては不要にす
る、独特かつ新規な治療法が本発明により提供される。本発明の方法の応用とし
て、炎症に起因する関節疾患の治療も可能である。
【００３２】 自家細胞を正確に所定の様式で植込むことができる本発明のゲル状バイオマト
リックスの開発によって、機械的に成形可能かつ負荷可能な基質における所定量
の軟骨細胞の移植が初めて可能になる。本発明に基づくバイオマトリックスと軟
骨細胞とで構成された本発明に係る細胞−基質−軟骨系は、任意の大きさと厚さ
で製造し、機械的処理によって欠損部に正確に適合させることができる。また本
発明に係るバイオトランスプラントは、ＡＣＴ（自家軟骨移植）とは対照的に、
患者の脛骨からさらなる骨膜採取を必要としないという利点をもたらす。本発明
に係る細胞−基質−軟骨系のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により、移植の前に基質産生
について軟骨細胞を試験することが可能である。このことは軟骨移植体の製造、
その機能性の試験及び品質保証のために重要な条件である。こうして移植体の一
次安定性に役立つ代表的な軟骨タンパク質、例えばＩＩ型コラーゲンの新たな合
成がｉｎ ｖｉｔｒｏにて基質中の自家軟骨細胞から生成されることを示すこと
ができた。本発明に基づき、ミニブタの膝関節での試験により、軟骨細胞を含ま
ないブランク基質又はPeterson法に従う軟骨細胞懸濁液を移植したブランク欠損
と比較して、本発明の細胞−基質−軟骨系は関節軟骨を極めてよく治癒させ、欠
損を完全に埋め、しかも圧力に対して安定であることが示された。
【００３３】 最後に本発明は上記の方法のいずれか１つで使用するためのバイオマトリック
スに関する。
【００３４】 また本発明は軟骨疾患又は欠損、特に変性、炎症性及び／又は外傷性関節疾患
の治療方法に関する。その方法において、本発明に基づき製造された軟骨代替物
、バイオトランスプラント及び／又は本発明に基づき培養された軟骨細胞は、罹
患若しくは損傷した組織又は軟骨若しくは骨領域に埋め込まれるか、あるいは罹
患領域又は欠損領域と取り替えられる。
【００３５】 本発明を実施例に基づき詳述する。
【００３６】 実施例１： コラーゲンの調製 コラーゲン溶液の調製のためにコラーゲン含有組織、例えばラットの尾の腱を
使用する。すべての作業は無菌条件下で無菌の材料を使用して行う。このために
ラットの尾を−２０℃で保存した後、７０％アルコールで５分間表面消毒する。
続いてラットの尾の皮膚を剥がして、個々のコラーゲン線維を分離する。他の出
発組織を使用するときは、場合によって存在する細胞を機械的、酵素的又は化学
的処理により入念に除去する。コラーゲン線維をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）（ｐＨ７．２）中に集め、７０％アルコールで１０分間表面消毒し、次いで
ＰＢＳで洗浄する。コラーゲン線維の重量を測定し、その線維を０．１％酢酸溶
液に移す（約８〜１２ｍｇ／ｍｌ）。この調製物を４℃で３〜１４日間攪拌し、
続いて不溶のコラーゲン分を遠心分離により除去する（１０００ｒｐｍ、１時間
、８℃）。好ましい実施形態では、最終的なコラーゲン溶液は３ｍｇ／ｍｌ〜８
ｍｇ／ｍｌのコラーゲン含量を有する。この結果、コラーゲンは出発材料として
前述のように高含量で、先に記載のように溶液として存在しており、線維、網状
構造又は基質の形態では存在しない。得られるコラーゲン溶液は、細胞を含まず
、凍結乾燥しない新鮮なコラーゲンから調製したものであることが好ましい。
【００３７】 実施例２： バイオマトリックス又はバイオトランスプラントの製造 すべての作業は無菌条件下で無菌の材料を使用して行う。 コラーゲン溶液： 少なくとも３ｍｇ／ｍｌの酢酸中溶液 緩衝液： ２倍濃縮培地（例えばＤＭＥＭ） ７７．５ｍｌ 血清２０ｍｌ ＨＥＰＥＳ溶液 ２．５ｍｌ（３Ｍ、ｐＨ７．８）
【００３８】 両方の溶液は４℃で保存する。
【００３９】 バイオマトリックスは０．１％酢酸中のコラーゲン溶液からなり（ラットの尾
から得たコラーゲン、コラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌ、好ましくは
６ｍｇ／ｍｌ）、緩衝液は２倍濃縮培地、血清及びＨＥＰＥＳ溶液からなる。こ
の２つの成分をとりわけ１：１の割合で混合した直後に、４℃より高い温度、例
えば室温でゲル化すれば、新規に構成された三次元コラーゲン構造となる。
【００４０】 バイオトランスプラント、即ち細胞を含むバイオマトリックスの製造のために
、常法により予備培養し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分、室温）した１ｍ
ｌにつき２×１０4〜２×１０7個、好ましくは２×１０6個の軟骨細胞を緩衝液
中に入れて懸濁させ、等量のコラーゲン溶液と４℃で混合する。このゲル溶液を
培養容器中にピペットで移し、３７℃でゲル化して、軟骨細胞が植込まれた新規
に構成されたコラーゲン構造としてから、培地で覆う。次に３〜８日の培養期間
の後、この材料を移植のために利用することができる。
【００４１】 必要ならば、細胞を、コラゲナーゼ処理とそれに続く遠心分離によってバイオ
マトリックスから再び遊離させ、さらに回収することができる。得た分化細胞は
別の培養の出発点とすることができる。
【００４２】 実施例３： 隙間の開いた関節への移植及び関節鏡視下への適用 隙間の開いた関節への移植の場合も関節鏡視下への適用の場合も、まず細胞−
基質−軟骨を、大きさと形状について軟骨欠損に機械的に適合させる。続いて移
植体を欠損部に入れ、フィブリン接着剤でそこに固定する。上記の細胞−基質−
軟骨系は柔軟である一方、形状安定性を有する材料であるため、このバイオトラ
ンスプラントをシリンダー状の関節鏡器具にいわば丸め込ませて、欠損部に導入
することが可能である。移植体は形状安定性により目的の場所で再び元の形をと
り、次いでフィブリン接着剤で欠損部に固定されるようにすることができる。
【００４３】 実施例４： ＰＣＲ試験の結果 下記の表にＰＣＲ試験の結果が示されている。この試験の目的は実施例１及び
２で製造された本発明のバイオマトリックスでの本発明に基づく培養が、軟骨細
胞の再分化をもたらすことを実証することであった。下の表により明らかなよう
に、Ｐ０培養から出発して、その後常法により行われた継代Ｐ１及びＰ２の過程
では、軟骨細胞のＩＩ型コラーゲンを生成する能力が失われる。その細胞はこの
継代の過程で脱分化するのである。これに対して本発明のバイオマトリックスで
のＰ２継代は、脱分化した軟骨細胞の再分化をもたらす。このことはＩＩ型コラ
ーゲンを生成する能力が回復したことにより証明される。
【００４４】
【表１】
【００４５】 適切なプライマーによるＰＣＲ増幅とそれに続くゲル電気泳動によって、軟骨
細胞特異的遺伝子の発現（転写）を試験した。 −β２ミクログロブリンは構成的に発現される遺伝子であって、正の対照として
用いている。 −ＩＩ型及びＸＩ型コラーゲンは軟骨特異的な種類のコラーゲンである。 −骨形態形成タンパク質（Ｂｍｐ）２、４及び７は、軟骨組織の分化において重
要な役割を果たす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 グラエヴァ，トーマス ドイツ連邦共和国 70372 シュツットガ ルト，ナウハイマーシュトラーセ 17 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ08 QR81 QS31 4B065 AA90X BB25 BB34 BB38 BC46 CA44 4C097 AA01 AA03 BB01 CC01 DD15 EE19 MM01 SC10

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血清を含む緩衝化細胞培地中に少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌ
    のコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックスに、脱分化軟骨細胞を植込
    んで培養する、脱分化軟骨細胞の再分化及び／又は増殖方法。
  2. 【請求項２】 血清を含む緩衝化細胞培地中に少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌ
    のコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックスに、分化した軟骨細胞を植
    込んでその分化を維持しつつ培養する、分化軟骨細胞の増殖方法。
  3. 【請求項３】 血清を含む緩衝化細胞培地中に少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌ
    のコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックス中に、試験すべき軟骨細胞
    を入れてそこで培養し、同時に又はその後に試験する、軟骨細胞の機能、形態及
    び／又は分化状態の試験方法。
  4. 【請求項４】 三次元ゲル状バイオマトリックスでの培養に続いて、軟骨細
    胞をこのバイオマトリックスから分離し、従来の培養法、とりわけ二次元培養法
    で引き続き培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 血清を含む緩衝化細胞培地中に少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌ
    のコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックス中に軟骨細胞を入れて、移
    植可能な軟骨代替物が得られるようにそこで培養する、軟骨代替物の製造方法。
  6. 【請求項６】 軟骨細胞を、三次元ゲル状バイオマトリックスで培養した後
    でそのバイオマトリックスから分離し、移植可能な軟骨代替物が得られるように
    高い細胞密度で引き続き培養する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 バイオマトリックスが１．５ｍｇ／ｍｌ〜４ｍｇ／ｍｌのコ
    ラーゲンを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 組織から分離したコラーゲン線維を酸性溶液中で２〜１０℃
    、とりわけ４℃で３〜１４日間攪拌し、不溶のコラーゲン分を遠心分離して除去
    し、コラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの最終的なコラーゲン溶液を得
    て、それを細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液と、２〜１０℃、とりわけ４℃
    で混合し、続いてより高い温度即ち室温〜３７℃でゲル化することによって、バ
    イオマトリックスを製造する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法により製造される
    軟骨代替物。
  10. 【請求項１０】 コラーゲンを含む組織を分離し、コラーゲンを含む組織を
    酸性溶液に移し、溶液に移したコラーゲン組織を２〜１０℃とりわけ４℃でイン
    キュベートし、不溶のコラーゲン分を遠心分離して除去し、得たコラーゲン溶液
    を、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液と２〜１０℃とりわけ４℃で混合し、
    加温によりその混合溶液をゲル化することを含む、細胞培養、特に軟骨細胞の培
    養のためのバイオマトリックスの製造方法。
  11. 【請求項１１】 酸性溶液が酢酸溶液、特に０．１％酢酸溶液である請求項
    １０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とコラーゲン含有溶
    液を１：１の割合で混合する、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液に、コラーゲン溶液
    との混合の前に軟骨細胞を加える、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造
    されるバイオマトリックス。
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